MXPA02010469A - Variantes de enzima que tienen uan o mas sustituciones de d-aminoacido. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a variantes de enzima que tienen inmunogenicidad disminuida con respecto a sus correspondientes enzimas de tipo silvestre; mas particularmente, la presente invencion se refiere a variantes de enzima que tienen una secuencia de aminoacidos modificada de una secuencia de aminoacidos de tipo silvestre, en donde la secuencia de aminoacidos modificada comprende una sustitucion de una o mas posiciones de aminoacido con al menos un D-aminoacido; la invencion se refiere ademas a genes mutantes que codifican dichas variantes de enzima, y composiciones limpiadoras y de cuidado personal que comprenden dichas variantes de enzima.

Description

VARIANTES DE ENZIMA QUE TIENEN UNA O MAS SUSTITUCIONES DE D-AMINOACIDO INTERREFERENCIA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U. No. 60/199,415, presentada el 24 de abril de 2000.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente ¡nvención se refiere a variantes de enzima que tienen inmunogenicidad disminuida con respecto a sus correspondientes enzimas de tipo silvestre, así como a composiciones que comprenden las variantes, secuencias de ADN que codifican las variantes y métodos de uso de las variantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enzimas constituyen la clase más grande de proteínas naturales y son responsables de la catálisis de varías reacciones. Por ejemplo, una clase de enzimas incluye proteasas, que catalizan la hidrólisis de otras proteínas. Esta capacidad para hidrolizar proteínas ha sido aprovechada incorporando proteasas naturales y construidas por ingeniería en composiciones limpiadoras, particularmente las relevantes para aplicaciones de lavandería. Otras enzimas, por ejemplo amilasas, también son útiles para su incorporación en varias composiciones limpiadoras para muchos propósitos, incluyendo la hidrólisis de almidón y lípidos. En el campo de la limpieza, las proteasas utilizadas más ampliamente son las serina proteasas. La mayoría de estas serina proteasas son producidas por organismos bacterianos, aunque algunas son producidas por otros organismos tales como hongos. Véase Siezen Rolland J. y otros, "Homology and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Protein Engineering, Vol. 4 No.7, pp. 719-737 (1991 ). Una característica similar de todas estas enzimas se refiere a la eficacia de las enzimas de tipo silvestre en su entorno natural, con respecto al entorno no natural de la composición limpiadora. Típicamente, las eficacias en el entorno natural no se traducen al entorno no natural, haciendo menos útil a la enzima. Por ejemplo, características de la proteasa tales como por ejemplo estabilidad térmica, estabilidad al pH, estabilidad oxidativa y especificidad de substrato, no están necesariamente optimizadas para su utilización fuera del entorno natural de la enzima. Se han empleado varios enfoques para alterar la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de las enzimas, con la finalidad de aumentar la eficacia de la enzima en el entorno no natural de lavado. Estos enfoques incluyen el rediseño genético de las enzimas, por ejemplo para incrementar su estabilidad térmica y para mejorar su estabilidad de oxidación bajo condiciones muy diversas. Sin embargo, debido a que dichas enzimas construidas genéticamente son ajenas a los mamíferos, poseen antígenos potenciales. Como antígenos, estas enzimas causan respuestas inmunológicas y/o alérgicas (descritas aquí colectivamente como respuestas alergénicas o alérgicas por simplicidad) en mamíferos. De hecho, se ha observado sensibilización a enzimas en entornos en donde los humanos están expuestos regularmente a las enzimas. Estos entornos incluyen instalaciones de fabricación, en donde los empleados están expuestos a las enzimas a través de vehículos tales como polvo no controlado o aerosolización. La aerosolización puede resultar por la introducción de la enzima al pulmón, que es la vía de exposición a enzima que ocasiona la respuesta más peligrosa. También puede ocurrir sensibilización a las enzimas en el medio mercantil, en donde el uso repetido por los consumidores de los productos que contienen enzimas, puede ocasionar una reacción alérgica. Además, aunque que la ingeniería genética ha sido prominente en la búsqueda continua de enzimas mucho más efectivas para usar en aplicaciones de lavandería, las enzimas construidas por ingeniería genética se han utilizado mínimamente en composiciones de cuidado personal y detergentes de trabajo ligero. Una razón principal de la ausencia de enzimas construidas por ingeniería en productos tales como por ejemplo cosméticos, lociones y/o cremas de mano/cuerpo, jabones, geles, lavados corporales y champús, se debe al problema antes mencionado de sensibilización humana que conduce a respuestas alérgicas indeseables. Por lo tanto, sería muy ventajoso proveer una composición de cuidado personal que provea las propiedades limpiadoras de las enzimas construidas por ingeniería, con provocación mínima de respuestas alérgicas. Un enfoque para mitigar la actividad alergénica de una enzima es a través del rediseño de uno o más epítopes de la enzima. Los epítopes son aquellas regiones de aminoácido de un antígeno que evocan una respuesta inmunológica mediante la unión de anticuerpos o la presentación de antígenos procesados a células T, a través de una proteína del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC). Los cambios en los epítopes pueden afectar su eficacia como un antígeno. Véase Walsh B.J. y M.E.H. Howden, "A Method for the Detection of IgE Binding Sequences of Allergens Based on a Modification of Epitope Mapping", Journal of Immunological Methods, Vol. 121 , pp. 275-280 (1989). Se ha descubierto que la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos en la enzima de tipo silvestre con uno o más dobles de aminoácido (referidos aquí como "D-aminoácidos" por simplicidad), particularmente cuando la sustitución se hace en una región de epítope, provee una variante de enzima que, sofrendentemente, exhibe una respuesta alergénica y/o inmune disminuida, pero también retiene la eficacia de la enzima. Para referencia, los aminoácidos existen en la conformación levógira ("L-aminoácidos") y doble ("D-aminoácidos"). Los L-aminoácidos ocurren naturalmente en la mayoría de los sistemas biológicos. Además, los polipéptidos naturales están comprendidos de L-aminoácidos y por lo tanto pueden ser referidos como L-polipéptidos. Los D-aminoácidos son las "imágenes especulares" de sus contrapartes de L-aminoácido. Aunque los D-polipéptidos (polipéptidos comprendidos completamente de D-aminoácidos) no ocurren naturalmente, estos polipéptidos se pueden fabricar sintéticamente para formar una estructura de proteína tridimensional. Los presentes inventores han descubierto que la inclusión de por lo menos un D-aminoácido, preferiblemente en una región epítope de una enzima, hace la enzima menos alergénica con respecto a la enzima de tipo silvestre. Sin desear limitarse por teoría, se cree que los sistemas biológicos no reconocerán la región epítope que contiene el D-aminoácido como una región epítope verdadera. De esta manera, no ocurre la respuesta alergénica que se origina normalmente. Sin embargo, de manera interesante, se mantiene la función biológica y la eficacia de la enzima. Por consiguiente, se proveen en la presente enzimas que provocan una respuesta alergénica disminuida y mantienen la eficacia enzimática. Así, la presente invención está dirigida a variantes de enzima que tienen una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido en una o más posiciones de aminoácido. Por consiguiente, las presentes enzimas son adecuadas para usar en varios tipos de composiciones que incluyen, sin limitación, composiciones de lavandería, de lavado de vajillas, de limpieza de superficies duras, para cuidado de la piel, para cuidado del cabello, para cuidado de la belleza, orales, y de limpieza de lentes de contacto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a variantes de enzima que tienen inmunogenicidad disminuida con respecto a sus correspondientes enzimas de tipo silvestre. Más particularmente, la presente invención se refiere a variantes de enzima que tienen una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, en donde la variante de enzima comprende una sustitución con D-aminoácido en una o más posiciones del aminoácido. Por lo menos un aminoácido de la variante de enzima es un L-aminoácido. La invención se refiere además a genes mutantes que codifican dichas variantes, y composiciones limpiadoras y de cuidado personal que comprenden dichas variantes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aquí se describen los componentes esenciales de la presente invención. También se incluyen descripciones no limitativas de varios ingredientes opcionales y preferidos en las modalidades de la presente invención.

La presente invención puede comprender, consistir, o consistir esencialmente de cualquiera de los componentes y/o limitaciones requeridos u opcionales aquí descritos. Todos los porcentajes y proporciones están calculadas en base al peso, a menos que se indique de otra manera. Todos los porcentajes están calculados en base a la composición total, a menos que se indique de otra manera. Todos los niveles de componente o composición son en referencia al nivel de agente activo de ese componente o composición, y son exclusivos de impurezas, por ejemplo solventes residuales o subproductos, que pueden estar presentes con fuentes disponibles comercialmente. Todos los documentos referidos en la presente, que incluyen todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones, se incoforan aquí en su totalidad como referencia. Se hace aquí referencia a nombres comerciales de materiales que incluyen, sin limitación proteínas, y más particularmente enzimas. Los presentes inventores no consideran limitada la invención por los materiales bajo un cierto nombre comercial. Materiales equivalentes (por ejemplo los obtenidos de una fuente diferente bajo un nombre o número de catálogo (referencia) diferente al referido por nombre comercial) pueden sustituir a dichos materiales y usarse en las presentes composiciones. Como se usa aquí, se usarán abreviaciones para describir aminoácidos, incluyendo aminoácidos levógiros ("L-aminoácidos") y dobles de aminoácido ("D-aminoácidos"). El cuadro 1 provee una lista de abreviaciones usadas en la presente.

CUADRO 1 Como se usa aquí, una variante puede ser designada haciendo referencia a las posiciones de aminoácidos sustituidos que caracterizan la variante. Las sustituciones se indican aquí suministrando el residuo de aminoácido de tipo silvestre, seguido por el número de posición, seguido por el residuo de aminoácido sustituyente. Cuando el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier D-aminoácido permitido en esa posición particular, se provee el símbolo "D-*". Sustituciones múltiples que comprenden una variante están separadas por el símbolo "+". Para ilustrarlo, una sustitución de glicina con D-valina en la posición 70 es designada como Gly70D-Val o G70D-V. Un ejemplo de una variante que tiene una sustitución con un D-aminoácido en ambas posiciones, 70 y 72, puede ser designado como Gly70D-Val + Val72D-Ala o G70D-V + V72D-A. Un ejemplo de una variante en la que la sustitución es con cualquier D-aminoácido en la posición 76, es designada como N76D-*.

Definiciones Como se usa aquí, el término "mutación" se refiere a alteraciones en las secuencias de genes y las secuencias de aminoácidos producidas por esas secuencias de genes. Las mutaciones pueden ser supresiones, sustituciones o adiciones de residuos de aminoácido, a la secuencia de proteína de tipo silvestre. Como se usa aquí, el término "tipo silvestre" se refiere a una enzima producida por organismos no mutantes. Como se usa aquí, el término "variante" significa una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la correspondiente enzima de tipo silvestre. 0 Variantes de enzima de la presente invención Los presentes inventores han identificado ciertas variantes de enzima que exhiben una respuesta alergénica disminuida con respecto a la enzima de tipo silvestre. Se ha descubierto que la sustitución de uno o más residuos de aminoácido en la enzima de tipo silvestre con uno o más dobles de aminoácido (referidos aquí como "D-aminoácidos" por simplicidad), provee una variante de enzima que, sofrendentemente, exhibe una respuesta alergénica disminuida mientras retiene también la eficacia de la enzima, particularmente en medios de limpieza artificial y limpieza personal. De esta manera, se proveen variantes de enzima que contienen por lo menos un D-aminoácido, composiciones que comprenden las variantes, secuencias de ADN que codifican las variantes, y métodos de uso de las variantes, particularmente en las técnicas de limpieza y de cuidado personal. Para referencia, los aminoácidos existen tanto en la conformación levógira ("L-aminoácidos") como doble ("D-aminoácidos"). Los L-aminoácidos ocurren en la naturaleza y la mayoría de los sistemas biológicos. Adicionalmente, los polipéptidos naturales están comprendidos de L-aminoácidos y por lo tanto pueden ser referidos como L-polipéptidos. Los D-aminoácidos son las "imágenes especulares" de sus contrapartes de L-aminoácido. Aunque los D-polipéptidos (polipéptidos comprendidos completamente de D-aminoácidos) no ocurren naturalmente, estos polipéptidos se pueden fabricar sintéticamente para formar una estructura de proteína tridimensional.

Los presentes inventores han descubierto que la inclusión de por lo menos un D-aminoácido, preferiblemente en una región epítope de una enzima, hace la enzima menos alergénica con respecto a la enzima de tipo silvestre. Sin desear limitarse por teoría, se cree que los sistemas biológicos no reconocerán la región epítope que contiene el D-aminoácido como una región epítope verdadera. De esta manera, no ocurre la respuesta alergénica que se origina normalmente. Sin embargo, de manera interesante, se mantiene la función biológica y la eficacia de la enzima. Por consiguiente, se proveen en la presente enzimas que provocan una respuesta alergénica disminuida y mantienen la eficacia enzimática. Las presentes enzimas son adecuadas para usar en varios tipos de composiciones que incluyen, sin limitación, composiciones de lavandería, de lavado de vajilla, superficies duras, para cuidado de la piel, cuidado del cabello, cuidado de belleza y composiciones para lentes de contacto. Así, la presente invención está dirigida a variantes de enzima que tienen una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido en una o más posiciones de aminoácido. Puesto que se deben evitar enzimas completamente comprendidas de D-aminoácidos, por lo menos un aminoácido de la variante es un L-aminoácido. Preferiblemente, por lo menos una de las sustituciones ocurre en una región de epítope de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre. Las regiones epítopes incluyen regiones epítopes de células B y regiones epítopes de células T; sin embargo, se prefiere introducir una sustitución con un D-aminoácido en al menos una región epítope de células T. Preferiblemente, la variante de enzima de la presente es una enzima de tipo silvestre modificada, seleccionada de proteasas, celulasas, lipasas, amilasas, peroxidasas, microperoxidasas, hemicelulasas, xilanasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipooxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, • -glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, lacasas, transferasas, isomerasas, liasas, sintetasas y enzimas basadas en frutas. Muy preferiblemente, la variante de enzima de la presente es una enzima de tipo silvestre modificada, seleccionada de proteasas, celulasas, lipasas, amilasas, peroxidasas, microperoxidasas, fosfoiipasas, esterasas, pectinasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, •-glucanasas, transferasas, liasas, sintetasas y enzimas basadas en fruta. Más preferiblemente, la variante de enzima de la presente es una enzima de tipo silvestre modificada seleccionada de proteasas, celulasas, lipasas, amilasas, peroxidasas, fosfolipasas, esterasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, •-glucanasas, transferasas y enzimas basadas en fruta. De preferencia, la variante de enzima de la presente es una proteasa de tipo silvestre modificada. Como un ejemplo no limitativo, la enzima fosfolipasa A2, que contiene 134 aminoácidos, contiene varias regiones de epítope de células T. Estas regiones epítopes ocurren en las posiciones de aminoácido números 71-92, 101-118, 104-121 y 108-125. Véanse, por ejemplo, Specht y otros, "The Murine (H-2k) T-Cell Epitopes of Bee Venom Phospholipase A2 Lie Outside the Active Site of the Enzyme", Int. Arch. Allergy Immunol. Vil. 112, pp. 226-230 (1997), y Blaser, "Allergen Dose Dependent Cytokine Production Regulates Specific IgE and IgG Antibody Production", New Horizons in Allergy Immunotherapy, p. 295 (1996). De conformidad con la presente invención, se pueden introducir uno o más D-aminoácidos dentro de cualquiera de estas regiones epítopes para disminuir la respuesta alergénica. Se puede utilizar cualquier D-aminoácido, preferiblemente los que son "imágenes especulares" de los L-aminoácidos naturales como se indica en el cuadro 1 de la presente. Preferiblemente, cuando la enzima es una proteasa, las variantes de la presente invención son variantes de serina proteasa. Como se usa aquí, el término "serina proteasa" significa una proteasa que tiene por lo menos 50%, y preferiblemente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de una o más serina proteasas similares a subtilisina. Se puede encontrar una exposición sobre serina proteasas similares a subtilisina y sus homólogos en "Homology Modeling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", de Siezen y otros, Protein Engineering, vol. 4, No.7, pp. 719-737 (1991 ). Serina proteasas preferidas para sustitución con uno o más D-aminoácidos incluyen subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 309, proteinasa K y termitasa. Serina proteasas más preferidas para sustitución con uno o más D-aminoácidos incluyen subtilisina BPN' y subtilisina 309. La serina proteasa más preferida para sustitución con uno o más D-aminoácidos es la subtilisina BPN'. Se ha descubierto que existen regiones epítopes en serina proteasas que corresponden a las posiciones 70-84, 103-126 y 217-252 de subtilisina BPN'. Los presentes inventores han descubierto además que una o más sustituciones de aminoácido dentro de una o más de estas regiones epítopes, con un D-aminoácido sustituyente, proveen variantes que evocan una respuesta alérgica disminuida con respecto a la serina proteasa correspondiente de tipo silvestre. Con respecto a notaciones de posición de serina proteasas, y aunque las variantes de la presente ¡nvención no están limitadas a las de subtilisina BPN', toda la numeración de aminoácidos es con referencia a la secuencia de aminoácidos para subtilisina BPN', que está representada por SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos de subtilisina BPN' también la describen Wells J.A., E. Ferrari, D.J. Henner, D.A. Estell y E.Y. Chen en Nucleic Acids Research, Vol. II, 7911-7925 (1983). Se han identificado otras regiones epítopes en serina proteasas, incluyendo las descritas en la patente de E.U.A. No. 5,766,898 de Loevborg, para Novo Nordisk A/S, expedida el 16 de junio de 1998. De esta manera, una modalidad particularmente preferida de la presente invención se refiere a variantes de enzima que tienen sustituciones en una o más, de tres regiones epítopes con uno o más D-aminoácidos sustituyentes, en donde la variante de enzima es una variante de serina proteasa. Se puede utilizar cualquier D-aminoácido, preferiblemente los que son "imágenes especulares" de los L-aminoácidos naturales como se indica en el cuadro 1 de la presente. Las variantes preferidas tienen una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos tipo silvestre, en donde la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre comprende una primera región epítope, una segunda región epítope y una tercera región epítope, en donde la secuencia de aminoácidos modificada comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más posiciones en una o más de las regiones epítopes, en donde: (i) cuando ocurre una sustitución en la primera región epítope, la sustitución ocurre en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 70-84 de subtilisina BPN'; (ii) cuando ocurre una sustitución en la segunda región epítope, la sustitución ocurre en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 103-126 de subtilisina BPN'; y (iii) cuando ocurre una sustitución en la tercera región epítope, la sustitución ocurre en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 217-252 de subtilisina BPN'. De esta manera, las variantes de la presente invención pueden ser variantes de serina proteasas que tienen una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente, en donde las sustituciones son en una o más de las posiciones 70, 71 , 72, 63, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 y 84 (70-84); 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121 , 122, 123, 124, 125 y 126 (103-126); y 217, 218, 219, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241 , 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251 y 252 (217-252) correspondientes a subtilisina BPN'. Muy preferiblemente, la secuencia de aminoácidos modificada comprende una sustitución de una o más de estas posiciones con dos o más D-aminoácidos; más preferiblemente, tres o más de estas posiciones con tres o más D-aminoácidos. Las sustituciones en estas posiciones se hacen reemplazando el residuo de aminoácido de tipo silvestre con un D-aminoácido. Preferiblemente, el aminoácido utilizado para la sustitución está en la conformación D de un aminoácido natural, y así, se hace reemplazando el residuo de aminoácido de tipo silvestre con un residuo de D-aminoácido como los que se dan en el cuadro 1. Más específicamente, las variantes tienen una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más posiciones que corresponden a las posiciones 70-84 de subtilisina BPN', en donde: (a) cuando ocurre una sustitución en la posición 70, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (b) cuando ocurre una sustitución en la posición 71, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Trp, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Cys, D-Gly, D-Phe, D-His, D-lle, D-Lys, D-Leu, D-Met, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (c) cuando ocurre una sustitución en la posición 72, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf y D-Tyr; (d) cuando ocurre una sustitución en la posición 73, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-Phe, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (e) cuando ocurre una sustitución en la posición 74, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-Phe, D-His, D-lle, D-Lys, D-Leu, D-Met, D-Gln, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (f) cuando ocurre una sustitución en la posición 75, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-Phe, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Gln, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (g) cuando ocurre una sustitución en la posición 76, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Ala, D-Arg, D-Cys, D-lle, D-Leu, D-Met, D-Gln, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (h) cuando ocurre una sustitución en la posición 77, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Ala, D-Arg, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-Phe, D-His, D-lle, D-Lys, D-Leu, D-Met, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (i) cuando ocurre una sustitución en la posición 78, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; muy preferiblemente D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-Phe, D-His, D-lle, D-Lys, D-Leu, D-Met, D-Pro, D-Gln, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (j) cuando ocurre una sustitución en la posición 79, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Vai; muy preferiblemente D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Cys, D-Gly, D-Phe, D-His, D-Lys, D-Leu, D-Met, D-Pro, D-Gln, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (k) cuando ocurre una sustitución en la posición 80, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (I) cuando ocurre una sustitución en la posición 81 , el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf y D-Tyr; (m) cuando ocurre una sustitución en la posición 82, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (n) cuando ocurre una sustitución en la posición 83, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; y (o) cuando ocurre una sustitución en la posición 84, el aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, y D-Tyr. Más preferiblemente, las variantes de la presente ¡nvención comprenden una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más de las posiciones 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83 (73-83) correspondientes a subtilisina BPN', más preferiblemente una o más de las posiciones 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82 (75-82) correspondientes a subtiiisina BPN'. Las variantes pueden tener una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 103-126 de subtilisina BPN', en donde: (a) cuando ocurre una sustitución en la posición 103, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (b) cuando ocurre una sustitución en la posición 104, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf y D-Val; (c) cuando ocurre una sustitución en la posición 105, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (d) cuando ocurre una sustitución en la posición 106, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tyr y D-Val; (e) cuando ocurre una sustitución en la posición 107, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (f) cuando ocurre una sustitución en la posición 108, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (g) cuando ocurre una sustitución en la posición 109, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (h) cuando ocurre una sustitución en la posición 110, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (i) cuando ocurre una sustitución en la posición 111, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; G) cuando ocurre una sustitución en la posición 112, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (k) cuando ocurre una sustitución en la posición 113, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tyr y D-Val; (I) cuando ocurre una sustitución en la posición 114, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (m) cuando ocurre una sustitución en la posición 115, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (n) cuando ocurre una sustitución en la posición 116, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (o) cuando ocurre una sustitución en la posición 117, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (p) cuando ocurre una sustitución en la posición 118, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (q) cuando ocurre una sustitución en la posición 119, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (r) cuando ocurre una sustitución en la posición 120, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (s) cuando ocurre una sustitución en la posición 121 , el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf y D-Ty? (t) cuando ocurre una sustitución en la posición 122, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (u) cuando ocurre una sustitución en la posición 123, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (v) cuando ocurre una sustitución en la posición 124, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His,, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (w) cuando ocurre una sustitución en la posición 125, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; y (x) cuando ocurre una sustitución en la posición 126, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val. Las variantes pueden tener una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 217-252 de subtilisina BPN', en donde: (a) cuando ocurre una sustitución en la posición 217, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp y D-Val; (b) cuando ocurre una sustitución en la posición 218, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (c) cuando ocurre una sustitución en la posición 219, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (d) cuando ocurre una sustitución en la posición 220, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (e) cuando ocurre una sustitución en la posición 221 , el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (f) cuando ocurre una sustitución en la posición 222, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (g) cuando ocurre una sustitución en la posición 223, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D- Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (h) cuando ocurre una sustitución en la posición 224, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (i) cuando ocurre una sustitución en la posición 225, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (j) cuando ocurre una sustitución en la posición 226, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (k) cuando ocurre una sustitución en la posición 227, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf y D-Tyr; (I) cuando ocurre una sustitución en la posición 228, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (m) cuando ocurre una sustitución en la posición 229, el D- 7 aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (n) cuando ocurre una sustitución en la posición 230, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (o) cuando ocurre una sustitución en la posición 231 , el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (p) cuando ocurre una sustitución en la posición 232, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (q) cuando ocurre una sustitución en ia posición 233, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (r) cuando ocurre una sustitución en la posición 234, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (s) cuando ocurre una sustitución en la posición 235, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (t) cuando ocurre una sustitución en la posición 236, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (u) cuando ocurre una sustitución en la posición 237, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (v) cuando ocurre una sustitución en la posición 238, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (w) cuando ocurre una sustitución en la posición 239, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (x) cuando ocurre una sustitución en la posición 240, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (y) cuando ocurre una sustitución en la posición 241 , el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tyr y D-Val; (z) cuando ocurre una sustitución en la posición 242, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Trp, D-Tyr y D-Val; (aa) cuando ocurre una sustitución en la posición 243, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (bb) cuando ocurre una sustitución en la posición 244, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (cc) cuando ocurre una sustitución en la posición 245, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (dd) cuando ocurre una sustitución en la posición 246, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf y D-Tyr; (ee) cuando ocurre una sustitución en la posición 247, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (ff) cuando ocurre una sustitución en la posición 248, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (gg) cuando ocurre una sustitución en la posición 249, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (hh) cuando ocurre una sustitución en la posición 250, el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; (ii) cuando ocurre una sustitución en la posición 251 , el D-aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D-Arg, D-Asn, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Tf, D-Tyr y D-Val; y (jj) cuando ocurre una sustitución en la posición 252, el D- aminoácido sustituyente se selecciona del grupo que consiste de D-Ala, D- Arg, D-Asp, D-Cys, D-Gln, D-Glu, D-Gly, D-His, D-lle, D-Leu, D-Lys, D-Met, D-Phe, D-Pro, D-Ser, D-Thr, D-Trp, D-Tyr y D-Val. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, un D-aminoácido sustituye al aminoácido de tipo silvestre en una o más de las posiciones 70-84 correspondientes a subtilisina BPN', de preferencia en las posiciones 73-83 correspondientes a subtilisina BPN', de preferencia en las posiciones 70 y 75-82 correspondientes a subtilisina BPN', y es muy preferido en las posiciones 75-82 correspondientes a subtilisina BPN'. En una modalidad particularmente más preferida de la presente invención, un D-aminoácido sustituye al aminoácido de tipo silvestre en una o más de las posiciones 70-84 correspondientes a subtilisina BPN' (primera región epítope), y en una o más de las posiciones 103-126 correspondientes a subtilisina BPN' (segunda región epítope). En otra modalidad particularmente preferida de la presente invención, un D-aminoácido sustituye al aminoácido de tipo silvestre en una o más de las posiciones 70-84 correspondientes a subtilisina BPN' (primera región epítope) y una o más de las posiciones 217-252 correspondientes a subtilisina BPN' (tercera región epítope). En otra modalidad preferida de la presente invención, un D-aminoácido sustituye al aminoácido de tipo silvestre en una o más de las posiciones 70-84 correspondientes a subtilisina BPN' (primera región epítope), en una o más de las posiciones 103-126 correspondientes a subtilisina BPN' (segunda región epítope), y en una o más de las posiciones 217-252 correspondientes a subtilisina BPN' (tercera región epítope). Los siguientes cuadros 2 y 3 ejemplifican variantes preferidas no limitativas de la presente ¡nvención, en donde se utilizan serina proteasas para esta ejemplificación. Aunque no se ilustra específicamente, pueden hacerse sustituciones triples, cuádruples, quíntuplas, séxtuplas, héptuplas, óctuplas, nónuplas, e incluso casos de sustituciones aún más altas para formar la variante. Con respecto a estos cuadros, al describir las sustituciones específicas, primero se da el residuo de aminoácido de tipo silvestre, en segundo lugar el número de posición (correspondiente a subtilisina BPN'), y en tercer lugar el D-aminoácido sustituyente. Los cuadros 2 y 3 delinean variantes preferidas que tienen dos o tres sustituciones. Para ilustrarlos, el primer ejemplo del cuadro 3 dice "VAL 81 D-THR LEU 82 D-PHE". Este ejemplo significa la variante Val81 D-Thr+Leu82D-Phe.

CUADRO 2 Variantes de una sola sustitución GLY 83 D-VAL LEU 82 D-PHE LEU 82 D-HIS LEU 82 D-TYR LEU 82 D-ALA VAL 81 D-THR VAL 81 D-ALA GLY 80 D-VAL ILE 79 D-LEU ILE 79 D-MET ILE 79 D-THR ILE 79 D-VAL ILE 79 D-ALA SER 78 D-ASN 10 SER 78 D-THR SER 78 D-ARG SER 78 D-GLN SER 78 D-HIS SER 78 D-LYS SER 78 D-TYR SER 78 D-ALA ASN 77 D-ALA ASN 76 D-ALA 15 LEU 75 D-ILE LEU 75 D-MET LEU 75 D-VAL LEU 75 D-ALA ALA 74 D-VAL ALA 73 D-VAL VAL 72 D-ALA THR 71 D-ALA GLY 70 D-VAL CUADRO 3 Variantes de sustitución doble VAL 81 D-THR LEU 82 D-PHE VAL 81 D-THR LEU 82 D-HIS VAL 81 D-THR LEU 82 D-TYR ILE 79 D-LEU LEU 82 D-PHE ILE 79 D-LEU LEU 82 D-HIS ILE 79 D-LEU LEU 82 D-TYR ILE 79 D-MET LEU 82 D-PHE ILE 79 D-MET LEU 82 D-HIS ILE 79 D-MET LEU 82 D-TYR ILE 79 D-THR LEU 82 D-PHE ILE 79 D-THR LEU 82 D-HIS I LE 79 D-THR LEU 82 D-TYR ILE 79 D-VAL LEU 82 D-PHE 10 ILE 79 D-VAL LEU 82 D-HIS I LE 79 D-VAL LEU 82 D-TYR ILE 79 D-LEU VAL 81 D-THR ILE 79 D-MET VAL 81 D-THR ILE 79 D-THR VAL 81 D-THR ILE 79 D-VAL VAL 81 D-THR SER 78 D-ASN LEU 82 D-PHE SER 78 D-ASN LEU 82 D-HIS SER 78 D-ASN LEU 82 D-TYR SER 78 D-THR LEU 82 D-PHE 15 SER 78 D-THR LEU 82 D-HIS SER 78 D-THR LEU 82 D-TYR SER 78 D-ARG LEU 82 D-PHE SER 78 D-ARG LEU 82 D-HIS SER 78 D-ARG LEU 82 D-TYR SER 78 D-ASP LEU 82 D-PHE SER 78 D-ASP LEU 82 D-HIS SER 78 D-ASP LEU 82 D-TYR SER 78 D-GLN LEU 82 D-PHE SER 78 D-GLN LEU 82 D-HIS SER 78 D-GLN LEU 82 D-TYR 20 SER 78 D-HIS LEU 82 D-PHE SER 78 D-HIS LEU 82 D-HIS SER 78 D-HIS LEU 82 D-TYR SER 78 D-LYS LEU 82 D-PHE SER 78 D-LYS LEU 82 D-HIS SER 78 D-LYS LEU 82 D-TYR SER 78 D-TYR LEU 82 D-PHE CUADRO 3 (Continuación) SER 78 D-TYR LEU 82 D-HIS SER 78 D-TYR LEU 82 D-TYR SER 78 D-ASN VAL 81 D-THR SER 78 D-THR VAL 81 D-THR SER 78 D-ARG VAL 81 D-THR 5 SER 78 D-ASP VAL 81 D-THR SER 78 D-GLN VAL 81 D-THR SER 78 D-HIS VAL 81 D-THR SER 78 D-LYS VAL 81 D-THR SER 78 D-TYR VAL 81 D-THR SER 78 D-ASN ILE 79 D-LEU SER 78 D-ASN ILE 79 D-MET SER 78 D-ASN ILE 79 D-THR SER 78 D-ASN ILE 79 D-VAL SER 78 D-THR ILE 79 D-LEU 10 SER 78 D-THR ILE 79 D-MET SER 78 D-THR ILE 79 D-THR SER 78 D-THR ILE 79 D-VAL SER 78 D-ARG ILE 79 D-LEU SER 78 D-ARG ILE 79 D-MET SER 78 D-ARG ILE 79 D-THR SER 78 D-ARG ILE 79 D-VAL SER 78 D-ASP ILE 79 D-LEU SER 78 D-ASP ILE 79 D-MET SER 78 D-ASP ILE 79 D-THR 15 SER 78 D-ASP ILE 79 D-VAL SER 78 D-GLN ILE 79 D-LEU SER 78 D-GLN ILE 79 D-MET SER 78 D-GLN ILE 79 D-THR SER 78 D-GLN ILE 79 D-VAL SER 78 D-HIS ILE 79 D-LEU SER 78 D-HIS ILE 79 D-MET SER 78 D-HIS ILE 79 D-THR SER 78 D-HIS ILE 79 D-VAL SER 78 D-LYS ILE 79 D-LEU 20 SER 78 D-LYS ILE 79 D-MET SER 78 D-LYS ILE 79 D-THR SER 78 D-LYS ILE 79 D-VAL SER 78 D-TYR ILE 79 D-LEU SER 78 D-TYR ILE 79 D-MET SER 78 D-TYR ILE 79 D-THR SER 78 D-TYR ILE 79 D-VAL CUADRO 3 (continuación) ASN 76 D-HIS LEU 82 D-PHE ASN 76 D-HIS LEU 82 D-HIS ASN 76 D-HIS LEU 82 D-TYR ASN 76 D-HIS VAL 81 D-THR ASN 76 D-HIS ILE 79 D-LEU ASN 76 D-HIS ILE 79 D-MET ASN 76 D-HIS ILE 79 D-THR ASN 76 D-HIS ILE 79 D-VAL ASN 76 D-HIS SER 78 D-ASN ASN 76 D-HIS SER 78 D-THR ASN 76 D-HIS SER 78 D-ARG ASN 76 D-HIS SER 78 D-ASP ASN 76 D-HIS SER 78 D-GLN ASN 76 D-HIS SER 78 D-HIS ASN 76 D-HIS SER 78 D-LYS ASN 76 D-HIS SER 78 D-TYR 10 LEU 75 D-ILE LEU 82 D-PHE LEU 75 D-ILE LEU 82 D-HIS LEU 75 D-ILE LEU 82 D-TYR LEU 75 D-MET LEU 82 D-PHE LEU 75 D-MET LEU 82 D-HIS LEU 75 D-MET LEU 82 D-TYR LEU 75 D-VAL LEU 82 D-PHE LEU 75 D-VAL LEU 82 D-HIS LEU 75 D-VAL LEU 82 D-TYR LEU 75 D-ILE VAL 81 D-THR 15 LEU 75 D-MET VAL 81 D-THR LEU 75 D-VAL VAL 81 D-THR LEU 75 D-ILE ILE 79 D-LEU LEU 75 D-ILE ILE 79 D-MET LEU 75 D-ILE ILE 79 D-THR LEU 75 D-ILE ILE 79 D-VAL LEU 75 D-MET ILE 79 D-LEU LEU 75 D-MET ILE 79 D-MET LEU 75 D-MET ILE 79 D-THR LEU 75 D-MET ILE 79 D-VAL 20 LEU 75 D-VAL ILE 79 D-LEU LEU 75 VAL ILE 79 D-MET LEU 75 D-VAL ILE 79 D-THR LEU 75 D-VAL I LE 79 D-VAL LEU 75 D-ILE SER 78 D-ASN LEU 75 D-ILE SER 78 D-THR CUADRO 3 (Continuación) LEU 75 D-ILE SER 78 D-ARG LEU 75 D-ILE SER 78 D-ASP LEU 75 D-ILE SER 78 D-GLN LEU 75 D-ILE SER 78 D-HIS LEU 75 D-ILE SER 78 D-LYS LEU 75 D-ILE SER 78 D-TYR LEU 75 D-MET SER 78 D-ASN LEU 75 D-MET SER 78 D-THR LEU 75 D-MET SER 78 D-ARG LEU 75 D-MET SER 78 D-ASP LEU 75 D-MET SER 78 D-GLN LEU 75 D-MET SER 78 D-HIS LEU 75 D-MET SER 78 D-LYS LEU 75 D-MET SER 78 D-TYR LEU 75 D-AL SER 78 D-ASN LEU 75 D-VAL SER 78 D-THR LEU 75 D-VAL SER 78 D-ARG LEU 75 D-VAL SER 78 D-ASP LEU 75 D-VAL SER 78 D-GLN LEU 75 D-VAL SER 78 D-HIS LEU 75 D-VAL SER 78 D-LYS LEU 75 D-VAL SER 78 D-TYR LEU 75 D-ILE ASN 76 D-HIS LEU 75 D-MET ASN 76 D-HIS LEU 75 D-VAL ASN 76 D-HIS Además, se pueden hacer una o más sustituciones adicionales ("sustituciones estabilizadoras") con uno o más L-aminoácidos o D-aminoácidos, preferiblemente L-aminoácidos, en donde la sustitución se hace dentro o fuera de la región epítope de la enzima. Dichas sustituciones estabilizadoras pueden reestabilizar la enzima tras la sustitución en la región epítope con el D-aminoácido, o incrementar la actividad enzimática de la variante. Muchas sustituciones estabilizadoras son bien conocidas en la técnica. Ejemplos no limitativos de dichas mutaciones estabilizadoras (en serina proteasas, por ejemplo) se describen por ejemplo en WO 95/10591 , Baeck y otros, publicada el 20 de abril de 1995; la patente de E.U.A. No. 4,914,031 , Zukowski y otros, expedida el 3 de abril de 1990; la patente de E.U.A. No. 5,470,733, Bryan y otros, expedida el 28 de noviembre de 1995; la patente de E.U.A. No. 5,567,601 , Bryan y otros, expedida el 22 de octubre de 1996; WO 89/07642; la patente de E.U.A. No. 5,707,848, Bryan y otros, expedida el 13 de enero de 1998; Van Eekelen y otros, publicada el 24 de agosto de 1989; WO 87/04461 , Stabinsky y otros, publicada el 30 de julio de 1987; la patente de E.U.A. No. 4,760,025, Estell y otros, expedida el 26 de julio de 1988; WO 92/11348, Branner y otros, publicada el 9 de julio de 1992; EP 0,405,901 , Casteleijn y otros, publicada el 2 de enero de 1991 ; WO 91/00345, Branner y otros, publicada el 10 de enero de 1991; y WO 94/10020, Brode y otros, publicada el 23 de marzo de 1995. Sustituciones estabilizadoras preferidas para serina proteasas incluyen una o más de I107V; K213R; Y217L; Y217K; N218S; G169A; M50F; Q19E; P5A; S9A; 131 L; E156S; G169A; N212G; S188P; T254A; S3C + Q206C; y Q271 E; en donde (en todas partes) la numeración de la posición es con respecto a la subtilisina BPN'. Entre estas, las mutaciones estabilizadoras más preferidas incluyen una o más de P5A; S9A, 131 L; E156S; G169A; N212G; S188P; T254A; S3C +Q206C; Q271 E; Y217L; y Y217K. Las mutaciones estabilizadoras más preferidas para serina proteasas incluyen Y217L y Y217K.

Método de preparación Las presentes variantes se pueden preparar por medio de construcción sintética de la enzima que contiene una o más sustituciones de D-aminoácido específicas de sitio. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica; uno de dichos métodos se expone más adelante, usando Bacillus subtilis como un ejemplo no limitativo. Otros métodos de preparación de las presentes variantes serán conocidos para la persona con conocimientos medios en la materia, y se pueden utilizar aquí. Se usan técnicas normales de fase sólida para construir segmentos de subtilisina BPN' que son de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Los segmentos deben abarcar la secuencia de aminoácidos de la secuencia guía del propéptido, así como la secuencia de la forma procesada final de la proteasa. Los aminoácidos son incoforados en el segmento de péptido apropiado sustituyendo con el D-aminoácido precursor el correspondiente L-aminoácido. Los péptidos deben tener un grupo saliente reactivo en los extremos C (excepto el segmento C-terminal de la proteína) y un grupo protector removible en el extremo amino terminal (excepto el segmento N-terminal de la proteína). La síntesis es similar a la que exponen Abrahmsen y otros, WO 94/18329, de Genentech, Inc. La subtilisina modificada se usa para ligar secuencialmente los segmentos de péptido sintéticos en el orden apropiado para crear la proteína entera, incluyendo el péptido guía. La proteína se pliega y procesa autocatalíticamente para liberar el propéptido y obtener la proteasa activa (véase, por ejemplo, Strausberg y otros, "Catalysis of a Protein Folding Reaction: Thermodynamic and Kinetic Analysis of Subtilisin BPN' Interactions with its Propeptide Fragment", Biochemistry, Vol. 33, pp. 8112-8119 (1993).

Métodos analíticos Se puede probar la actividad enzimática y la respuesta alérgica de las presentes variantes usando los siguientes métodos, ambos conocidos para la persona con conocimientos medios en la materia. Alternativamente se pueden usar otros métodos bien conocidos en la técnica.

Actividad de la variante de la enzima La actividad enzimática de una variante de la presente invención se puede probar por medio de métodos bien conocidos en la técnica. Se indican abajo dos de estos métodos, particularmente en donde la enzima es una proteasa: Método de actividad en escamas de la piel Este método es particularmente útil para determinar la eficacia de variantes de enzima utilizadas en composiciones de cuidado personal. Usando cinta Scotch® #3750G, se desprenden repetidamente escamas de piel humana de las piernas de un sujeto hasta que la cinta está sustanciaimente opaca con las escamas. Después, la cinta se corta en cuadrados de 2.5 x 2.5 centímetros y se pone aparte. En una caja petri de 10 mm por 35 mm, se ponen 2 ml de una enzima de control, 0.75 mg/ml (por ejemplo subtilisina BPN') o la variante a probar, en amortiguador de KH2PO4 0.01 M, pH 5.5. A esta solución se le agrega 1 ml de solución de laurato de sodio al 2.5%, pH 8.6. La solución se mezcla suavemente en un agitador de plataforma. El cuadrado de cinta preparado previamente se remoja en la solución (el lado de las escamas hacia arriba) durante diez minutos continuando con la agitación suave. El cuadrado de cinta se enjuaga entonces suavemente en agua de la llave durante quince segundos. Se coloca con pipeta colorante Stevenel Blue Stain (3 ml, disponible comercialmente de Sigma Chemical Co., St. Louis Missouri) en una caja petri limpia. El cuadrado de cinta enjuagado se coloca en el colorante durante tres minutos (el lado de las escamas hacia arriba) con mezclado suave. El cuadrado de la cinta se retira del colorante y se enjuaga consecutivamente en dos matraces de 300 ml de agua destilada, durante quince segundos por enjuague. El cuadrado de cinta se deja secar al aire. La intensidad de color entre el cuadrado de cinta de enzima de control y el cuadrado de cinta de variante, se compara visualmente o usando un colorímetro. Con respecto al cuadrado de la cinta con enzima de control, un cuadrado de cinta con variante que muestra menos intensidad de color es indicativo de que una variante tiene mayor actividad.

Método de actividad de colágeno coloreado Este método es particularmente útil para determinar la eficacia de variantes de enzima utilizadas en composiciones limpiadoras. Se combinan 50 ml de amortiguador tris 0.1 M (tris-hidroximetil-aminometano) conteniendo CaCI2 0.01 M para dar pH 8.6, y 0.5 g de azocoll (colágeno impregnado con colorante azo, disponible comercialmente de Sigma Chemical, St. Louis Missouri). Se incuba esta mezcla a 25°C mientras se agita suavemente con un agitador de plataforma. Se filtran 2 ml de la mezcla a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras y se lee la absorbancia de la mezcla a 520 nm a cero en un espectrofotómetro. Se agrega 1 ppm de una enzima de control (por ejemplo subtilisina BPN') o la variante a probar a los 48 ml restantes de la mezcla tris/azocoll. Se filtran 2 ml de la solución que contiene control/variante a través de un filtro de jeringa de 0.2 mieras cada dos minutos durante un total de diez minutos. Para cada muestra filtrada, se lee inmediatamente la absorbancia a 520 nm. Se grafican los resultados contra el tiempo. Las pendientes del control y la variante de prueba son indicativas de las actividades relativas de las muestras. Una pendiente más alta es indicativa de actividad más alta. La actividad de la variante de prueba (pendiente) puede expresarse como un porcentaje de la actividad del control (pendiente).

Prueba de inmunoqenicidad intranasal en ratón El potencial alergénico de las enzimas de la presente invención puede ser determinado usando un método conocido en la técnica, o por medio de la prueba de alergenicidad intranasal en ratón presentada aquí más adelante. La prueba es similar a las pruebas descritas por Robinson y otros, "Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg (Alcalase) ¡n Mice: Development of an Intranasal Exposure Model" Fundamental and Appplied Toxicology, Vol. 34 pp. 15-24 (1996) y Robinson y otros, "Use of the Mouse Intranasal Test (MINT) to Determine the Allergenic Poteney of Detergent Enzymes: Comparison to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test", Toxicological Science, Vol. 43, pp. 39-46 (1998), ambas pruebas se pueden utilizar en lugar de la prueba indicada más abajo en la presente. Se utilizan en la prueba ratones BDF1 hembras (Charles River Laboratories, Portage, Michigan) pesando aproximadamente de 18 a 20 gramos. Los ratones se ponen en cuarentena una semana antes de la dosificación. Los ratones se alojan en jaulas con camas de virutas de madera en cuartos controlados de humedad (30-70%), temperatura (19.4°C-25°C) y ciclos de 12 horas de luz y oscuridad. Los ratones se alimentan con alimento para ratones Purina® (Purina Mills, Richmond, Indiana) y agua a voluntad. La enzima a probar se dosifica en un grupo de cinco ratones. Antes de la dosificación, cada ratón se anestesia por medio de una inyección ¡ntraperitoneal (i.p.) de una mezcla de Ketaset (88.8 mg/kg) y Rompun (6.67 mg/kg). El animal anestesiado se mantiene en la palma de la mano boca arriba, y se dosifica intranasalmente con 5 ml de enzima en solución amortiguadora (KH2PO4 0.01 M, pH 5.5). Aunque cada grupo recibe la misma dosis, se pueden probar varias dosificaciones. Las soluciones dosificadas se colocan poco a poco en el exterior de cada fosa nasal y son inhaladas por el ratón. La dosificación se repite los días 3, 10, 17 y 24. Se recolectan muestras de suero el día 29. Se miden los anticuerpos específicos de antígeno como se describe abajo, usando metodología ELISA.

Medición de laE total Se cubren placas de microtítulo de 96 pozos con anticuefo anti-lgE de ratón (Pharmingen). Después de bloquear con BSA en PBS, se incuban en los pozos diluciones del suero de ratón. Después de lavar, la IgE de suero es capturada usando anti-lgE de ratón biotinilado con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano. Se usa desarrollo de enzima con tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno inactivado con ácido sulfúrico. Las placas se leen a 450 nm. Se comparan los valores de DO450 de diluciones apropiadas con una curva patrón generada por medio de estándares de IgE de murino para determinar la concentración de IgE.

Medición de laE específica de antíqeno Se cubrieron placas de microtítulo de 96 pozos con un anticuefo anti-lgE de ratón (Pharmingen). Después de bloquear con BSA en PBS, se incubaron en los pozos diluciones del suero de ratón. Después de lavar, la IgE específica de enzima de suero se captura usando antígeno monobiotinilado con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano. Se usa desarrollo de enzima con tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno inactivado con ácido sulfúrico. Las placas se leen a 450 nm. Los valores de DO450 de diluciones apropiadas se comparan entre sí para determinar las cantidades relativas de IgE específica de antígeno.

Prueba de proliferación de células T El potencial alergénico de las variantes de la presente invención puede ser determinado usando una prueba de proliferación de células T, tal como la prueba presentada aquí mas adelante. Esta prueba es una variación de la prueba descrita por Bungy Poor Fard y otros, "T Cell Epitopes of the Major Fraction of Rye Grass Lolium perenne {Lol p I) Defined Using Overlapping Peptides in vitro and in vivo", Clinical Experimental Immunology, Vol. 94, pp. 111-116 (1993), usando subtilisina BPN' para fines de ejemplificación. En esta prueba se usa sangre de sujetos alérgicos a subtilisina BPN' (prueba de pinchazo positiva) y de sujetos de control (prueba de pinchazo negativa). Se extrae la sangre (-60 mL) de cada sujeto y las células mononucleares se cultivan usando ficoll-hypaque (que se puede obtener de Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Las células se lavan dos veces en RPMl 1640 (que se puede obtener de Gibco, Grand Island, New York), y después se resuspenden en medio RPMl completo suplementado con suero AB humano al 10%, L-glutamina 2 mM y gentamicina 25 mg/mL (que se puede obtener de Gibco). Las células se cultivan a una concentración de 2x105 células / pozo en 0.2 mL de medio completo, en las placas de microtítulo de 96 pozos con fondo en forma de U. El antígeno potencial a probar (BPN' inactivado como control positivo, o una variante de la presente invención) se agrega en una concentración final de hasta de aproximadamente 40 mg/mL. Los cultivos se incuban a 37 °C en CO2 5%. Después de cinco días, se agrega 1 mCi/pozo de metil-3H-timidina y 18 horas después se cosechan las células. Se determina la incorporación de 3H-timidina en las células como una medición de la proliferación de células T por medio de conteo de escintilación de líquidos.

Composiciones de la presente ¡nvención Las variantes de la presente se pueden usar en cualquier aplicación que sea adecuada para la enzima respectiva de tipo silvestre. Uno de estos ejemplos incluye composiciones limpiadoras. Debido a las propiedades convenientes de alergenicidad y/o inmunogenicidad reducida de las presentes variantes, las variantes se pueden usar también en aplicaciones que se benefician mínimamente del uso de enzimas. Ejemplos de dichas aplicaciones incluyen aquellas en que necesariamente la variante entra en contacto estrecho con la piel humana, tal como sucede con el uso de composiciones para el cuidado personal.

Composiciones limpiadoras Las variantes se pueden utilizar en composiciones limpiadoras que incluyen, sin limitación, composiciones de lavandería, composiciones limpiadoras de superficies duras, composiciones limpiadoras de trabajo ligero que incluyen composiciones limpiadoras de vajilla y composiciones detergentes para lavado automático de vajilla. Las composiciones limpiadoras de la presente comprenden una cantidad efectiva de una o más variantes de la presente invención y un vehículo para composición limpiadora. Como se usa aquí, "cantidad efectiva de variante" o similar, se refiere a la cantidad de variante necesaria para lograr la actividad proteolítica necesaria en la composición limpiadora específica. Dichas cantidades efectivas son determinadas fácilmente por el experto en la materia, y se basan en muchos factores, tal como por ejemplo la variante particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición limpiadora, y de si se desea una composición líquida o seca (por ejemplo granulada, en barra), y similares. Preferiblemente, las composiciones limpiadoras comprenden de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de preferencia de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 1%, y de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.1% de una o más variantes de la presente invención. A continuación se exponen con detalle varios ejemplos de varias composiciones limpiadoras en las cuales se pueden emplear las variantes. Además de las variantes presentes, las composiciones limpiadoras de la ¡nvención comprenden también un vehículo de composición limpiadora que comprende uno o más materiales de composición limpiadora compatibles con la variante. El término "material de composición limpiadora", como se usa aquí, significa cualquier material seleccionado para el tipo particular de composición limpiadora deseada y la forma del producto (por ejemplo líquido, granulado, barra, aerosol, pasta, gel); dichos materiales también son compatibles con la variante usada en la composición. La selección específica de materiales de composición limpiadora se hace fácilmente considerando el material por limpiar, y la forma deseada de la composición para la condición de limpieza durante el uso. El término "compatible", como se usa aquí, significa que los materiales de la composición limpiadora no reducen la actividad proteolítica de la variante a tal grado que la variante no sea tan efectiva como se busca durante situaciones de uso normal. Materiales específicos de composición limpiadora son ejemplificados en detalle más adelante en la presente. - Las variantes de la presente invención se pueden usar en una variedad de composiciones detergentes en donde se desea alta formación de espuma y buena actividad limpiadora. De esta manera, las variantes se pueden usar con varios ingredientes convencionales para proveer limpiadores completamente formulados de superficies, composiciones de lavado de vajilla, composiciones de lavado de telas y similares. Dichas composiciones pueden estar en la forma de líquidos, granulos, barras y similares. Dichas composiciones se pueden formular como detergentes "concentrados" que contienen hasta aproximadamente de 30% a 60% en peso de agentes tensioactivos.

Las composiciones limpiadoras de la presente pueden contener opcionalmente y preferiblemente varios agentes tensioactivos (por ejemplo agentes tensioactivos aniónicos, no iónicos o zwitteriónicos). Dichos agentes tensioactivos están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 5% a aproximadamente 35% de las composiciones. Ejemplos no limitativos de agentes tensioactivos útiles en la presente incluyen los alquilbencenosulfonatos y alquilsulfatos primarios y aleatorios convencionales de CI I -C<| 8> los alquilsulfatos (2,3) secundarios de C-10-C18 de las fórmulas CH3(CH2) (CHOS?3)-M+)CH3 y CH3(CH2) (CHOS?3-M+)CH2CH3, en donde x y (y + 1 ) son enteros de por lo menos alrededor de 7, preferiblemente por lo menos 9, y M es un catión de solubilización en agua, especialmente sodio; los alquilalcoxisulfatos de CI Q- C18 (especialmente etoxisulfatos de 1-5 EO); alquilalcoxicarboxilatos de C-IQ- C<|8 (especialmente los etoxicarboxilatos de 1-5 EO); los alquilpoliglicósidos de C10-C18 y sus poliglicósidos sulfatados correspondientes, y esteres de ácido graso alfa-sulfonados de C12-C1 ; alquil- y alquilfenol-alcoxilatos (especialmente etoxilatos y etoxi/propoxi mixtos), betaínas y sulfobetaínas ("sultaínas") de C12-C 8. óxidos de amina de C-jo-C-iß. y similares. Se prefieren en la presente los alquilalcoxisulfatos (AES) y alquilalcoxicarboxilatos (AEC). También se prefiere el uso de tales agentes tensioactivos en combinación con tensioactivos de óxido de amina y/o betaína o sultaína, dependiendo de las necesidades del formulador. Otros agentes tensioactivos útiles se enlistan en los textos normales. Los agentes tensioactivos particularmente útiles incluyen las N-metil-glucamidas de C10-C18 que se describen en la patente de E.U.A. No. 5,194,639, de Connor y otros, expedida el 16 de marzo de 1993. Se puede incluir una amplia variedad de otros ingredientes útiles en composiciones limpiadoras detergentes en las composiciones de la presente, incluyendo por ejemplo otros ingredientes activos, vehículos, hidrótropos, auxiliares de tratamiento, colorantes o pigmentos, y solventes para formulaciones líquidas. Si se desea un incremento adicional de espuma, se pueden incorporar en las composiciones refuerzos de espumación tales como alcanolamidas de C10-C16, típicamente a niveles de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%. Las monoetanol- y dietanolamidas de C10-C14 ilustran una clase típica de dichos refuerzos de espumación. También es ventajoso el uso de dichos refuerzos de espumación con agentes tensioactivos auxiliares de alta espumación tales como los óxidos de amina, betaínas y sultaínas anteriormente señalados. Si se desea, pueden agregarse sales de magnesio solubles tales como MgCI2, MgSO4 y similares, a niveles típicamente de alrededor de 0.1% a alrededor de 2%, para proveer espumación adicional. Las composiciones detergentes líquidas de la presente pueden contener agua y otros solventes como vehículos. Son adecuados los alcoholes primarios y secundarios de peso molecular bajo, ilustrados por metanol, etanol, propanol e isopropanol. Los alcoholes monohídricos se prefieren para solubilizar agentes tensioactivos, pero también se pueden usar polioles tales como los que contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono, y de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 grupos hidroxilo (por ejemplo, 1 ,3-propanodiol, etilenglicol, glicerina y 1 ,2-propanodiol). Las composiciones pueden contener de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, por lo regular de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% de dichos vehículos. Las composiciones detergentes de la presente preferiblemente se formularán de tal manera que durante su uso en operaciones de limpieza acuosas el agua de lavado tenga un pH de entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 11. Los productos terminados se formulan típicamente en esta escala. Las técnicas para controlar el pH a los niveles de uso recomendados incluyen el uso, por ejemplo, de amortiguadores, álcalis, y ácidos. Dichas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Cuando se formulan las composiciones limpiadoras de superficies duras y las composiciones limpiadoras de telas de la presente invención, el formulador puede desear emplear varios mejoradores de detergencia a niveles de aproximadamente 5% a aproximadamente 50% en peso. Los mejoradores típicos incluyen las zeolitas de 1-10 mieras, policarboxilatos tales como citrato y oxidisuccinatos, silicatos estratificados, fosfatos y similares. Otros mejoradores convencionales se listan en formularios estándares. Asimismo, el formulador puede desear emplear varias enzimas adicionales tales como celulasas, lipasas, amilasas y proteasas en dichas composiciones; típicamente a niveles de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1% en peso. Varias enzimas detersivas y de cuidado de la tela son bien conocidas en la técnica de detergentes de lavandería. Se pueden usar en dichas composiciones varios compuestos blanqueadores, tales como los percarbonatos, perboratos y similares, típicamente a niveles de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% en peso. Si se desea, dichas composiciones pueden contener también activadores de blanqueo tales como tetraacetiletilendiamina, nonanoiloxibencensulfonato y similares, que también son conocidos en la técnica. Los niveles de uso varían típicamente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10% en peso. Se pueden usar en dichas composiciones agentes removedores de suciedad, especialmente del tipo de oligoéster aniónico, agentes quelantes, especialmente los aminofosfonatos y etilendiaminadisuccinatos, agentes de remoción de suciedad de lodo, especialmente tetraetilenpentamina etoxilada, agentes dispersantes, especialmente poliacrilatos y poliaspartatos, abrillantadores, especialmente abrillantadores aniónicos, supresores de espuma, especialmente silicones y alcoholes secundarios, suavizantes de telas, especialmente arcilla esmectita y similares, a niveles que varían de aproximadamente 1% a aproximadamente 35% en peso. Los formularios estándares y las patentes publicadas contienen descripciones múltiples y detalladas de dichos materiales convencionales.

También se pueden usar estabilizadores de enzima en las composiciones limpiadoras. Dichos estabilizadores de enzima incluyen propilenglicol (preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%), formiato de sodio (de preferencia de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1%) y formiato de calcio (de preferencia de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 15). Las presentes variantes son útiles en composiciones limpiadoras de superficies duras. Como se usa aquí, "composición limpiadora de superficies duras" se refiere a composiciones detergentes líquidas y granulares para limpiar superficies duras tales como pisos, paredes, azulejo del baño, y similares. Las composiciones limpiadoras de superficies duras de la presente invención comprenden una cantidad efectiva de una o más variantes de la presente invención, de preferencia de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 10%, de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5%, de preferencia de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 1 % en peso de la variante de la composición. Además de comprender una o más de las variantes, las composiciones limpiadoras de superficies duras comprenden típicamente un agente tensioactivo y un mejorador de detergencia secuestrante soluble en agua. Sin embargo, en ciertos productos especializados tales como limpiadores en aerosol para ventanas, algunas veces no se usan los agentes tensioactivos, puesto que pueden producir un residuo de película y/o de rayas sobre la superficie de vidrio.

El componente tensioactivo, cuando está presente, puede comprender desde 0.1 % de las composiciones de la presente, pero típicamente las composiciones contendrán de aproximadamente 0.25% a aproximadamente 10%, de preferencia de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% de agente tensioactivo. Típicamente, las composiciones contendrán de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 50% de un mejorador de detergencia, de preferencia de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%. Preferiblemente, el pH debe estar en la escala de aproximadamente 7 a aproximadamente 12. Se pueden usar agentes de ajuste de pH convencionales tales como hidróxido de sodio, carbonato de sodio y ácido clorhídrico, si fuera necesario un ajuste. Se pueden incluir solventes en las composiciones. Los solventes útiles incluyen, sin limitación, éteres de glicol tales como éter monohexílico de dietilenglicol, éter monobutílico de dietilenglicol, éter monobutílico de etilenglicol, éter monohexíiico de etilenglicol, éter monobutílico de propilenglicol, éter monobutílico de propilenglicol; y dioles tales como 2,2,4-trimetil-1 ,3-pentanodiol y 2-etil-1 ,3-hexanodiol. Cuando se usan, dichos solventes están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 15%, de preferencia de aproximadamente 3% a aproximadamente 11 %. Adicionalmente, se pueden usar en las presentes composiciones solventes altamente volátiles tales como iso-propanol o etanol para facilitar una evaporación más rápida de la composición de las superficies cuando estas no se enjuagan después de la aplicación en forma "completamente concentrada" de la composición. Cuando se usan, los solventes volátiles están presentes típicamente a niveles de aproximadamente 2% a aproximadamente 12% en las composiciones. Las composiciones limpiadoras de superficie duras de la presente invención se ilustran por medio de los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS 1-6 Composiciones líquidas limpiadoras de superficies duras Todas las fórmulas se ajustan a pH 7 En los ejemplos 1-6, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustituciones con G70D-* + S78D-* + I79D-*, con resultados sustancialmente similares.

En otra modalidad de la presente invención, composiciones de lavado de vajillas comprenden una o más variantes de la presente invención. Como se usa aquí, "composición de lavado de vajillas" se refiere a todas las formas de composiciones para limpiar vajillas incluyendo, sin limitación, formas granulares y líquidas. Las composiciones de lavado de vajillas de la presente invención se ilustran por medio de los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS 7-10 Detergente líquido para vajillas Todas las fórmulas se ajustan a pH 7 En los ejemplos 7-10, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustituciones con G70D-* + L75D-* + N76D-* + N77D-* + S78D-* + I79D-* + G80D-* + V81D-* + L82D-*, con resultados sustancialmente similares.

Las composiciones líquidas para limpieza de telas de la presente invención se ilustran por medio de los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS 11-13 Composiciones líquidas limpiadoras de telas En los ejemplos 11-13, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustitución con G70D-*, con resultados sustancialmente similares.

Composiciones de cuidado personal Las presentes variantes son particularmente adecuadas para usar en composiciones para cuidado personal, tales como por ejemplo acondicionadores del cabello de enjuagar y de dejar sin enjuagar, champús, composiciones para el acné de enjuagar y de dejar sin enjuagar, leches y acondicionadores faciales, geles para baño, jabones, limpiadores faciales espumosos y no espumosos, cosméticos, lociones y humectantes de mano, faciales y de cuerno, humectantes faciales de dejar sin enjuagar, almohadillas cosméticas y limpiadoras, composiciones para el cuidado oral, y composiciones para el cuidado de lentes de contacto. Las composiciones para cuidado personal presentes comprenden una o más variantes de la presente invención y un vehículo de cuidado personal. Para ilustrarlo, las presentes variantes son adecuadas para su inclusión en las composiciones descritas en las siguientes referencias: patente de E.U.A. No. 5,641479, Linares y otros, expedida el 24 de junio de 1997 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5,599,549, Wivell y otros, expedida el 4 de febrero de 1997 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5,585,104, Ha y otros, expedida el 17 de diciembre de 1996 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5,540,852, Kefauver y otros, expedida el 30 de julio de 1996 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5,510,050, Dunbar y otros, expedida el 23 de abril de 1996 (limpiadores para la piel); patente de E.U.A. No. 5,612,324, Guang Lin y otros, expedida el 18 de marzo de 1997 (preparaciones contra el acné); patente de los E.U.A No. 5,587,176, Warren y otros, expedida el 24 de diciembre de 1996 (preparaciones contra el acné); patente de E.U.A. No. 5,549,888, Venkateswaran, expedida el 27 de agosto de 1996 (preparaciones contra el acné); patente de E.U.A. No. 5,470,884, Corless y otros, expedida el 28 de noviembre de 1995 (preparaciones contra el acné); patente de E.U.A. No. 5,650,384, Gordon y otros, expedida el 22 de julio de 1997 (geles para el baño); patente de E.U.A. No. 5,607,678, Moore y otros, expedida el 4 de marzo de 1997 (geles para el baño); patente de E.U.A. No. 5,624,666, Coffindaffer y otros, expedida el 29 de abril de 1997 (acondicionadores y/o champús para cabello); patente de E.U.A. No.5,618,524, Bolich y otros, expedida el 8 de abril de 1997 (acondicionadores y/o champús para cabello); patente de E.U.A. No. 5,612,301, Inman, expedida el 18 de marzo de 1997 (acondicionadores y/o champús para cabello); patente de E.U.A. No.5, 573, 709, Wells, expedida el 12 de noviembre de 1996 (acondicionadores y/o champús para cabello); patente de E.U.A. No.5,482,703, Pings, expedida el 9 de enero de 1996 (acondicionadores y/o champús para cabello); patente de E.U.A. No.Re. 34,584, Grote y otros, reexpedida el 12 de abril de 1994 (acondicionadores y/o champús para cabello); patente de E.U.A. No.5,641 ,493, Date y otros, expedida el 24 de junio de 1997 (cosméticos); patente de E.U.A. No.5.605, 894, Blank y otros, expedida el 25 de febrero de 1997 (cosméticos); patente de E.U.A. No.5, 585,090, Yoshioka y otros, expedida el 17 de diciembre de 1996 (cosméticos); patente de E.U.A. No.4,939,179, Cheney y otros, expedida el 3 de julio de 1990 (lociones para mano, cara y/o cuefo); patente de E.U.A. No. 5,607, 980, McAtee y otros, expedida el 4 de marzo de 1997 (lociones para mano, cara y/o cuefo); patente de E.U.A. No. 4,045,364, Richter y otros, expedida el 30 de agosto de 1977 (almohadillas cosméticas y limpiadoras); solicitud de patente Europea EP 0 619 074, Touchet y otros, publicada el 12 de octubre de 1994 (almohadillas cosméticas y limpiadoras); patente de E.U.A. No.4,975,217, Brown-Skrobot y otros, expedida el 4 de diciembre de 1990 (almohadillas cosméticas y limpiadoras); patente de E.U.A. No.5,096,700, Seibel, expedida el 17 de marzo de 1992 (composiciones limpiadoras orales); patente de E.U.A.

No.5,028,414, Sampathkumar, expedida el 2 de julio de 1991 (composiciones limpiadoras orales); patente de E.U.A. No. 5,028,415, Benedict y otros, expedida el 2 de julio de 1991 (composiciones limpiadoras orales); patente de E.U.A. No. 5,028,415, Benedict y otros, expedida el 2 de julio de 1991 (composiciones limpiadoras orales); patente de E.U.A. No. 4,863,627, Davies y otros, 5 de septiembre de 1989 (soluciones limpiadoras de lentes de contacto); patente de E.U.A. No. Re. 32,672, Huth y otros, reexpedida el 24 de marzo de 1988 (soluciones limpiadoras de lentes de contacto); y patente de E.U.A. No. 4,609,493, Schafer, expedida el 2 de septiembre de 1986 (soluciones limpiadoras de lentes de contacto). Para ilustrar adicionalmente las composiciones limpiadoras orales de la presente invención, una cantidad farmacéuticamente efectiva de una o más variantes de la presente se incluye en composiciones útiles para remover manchas proteináceas de dientes o dentaduras. Como se usa aquí, "composiciones limpiadoras orales" se refiere a dentífricos, pastas dentales, geles dentales, polvos dentales, enjuagues bucales, aerosoles bucales, geles bucales, gomas de mascar, pastillas, sachets, tabletas, biogeles, pastas de profilaxis, soluciones para tratamiento dental, y similares. Preferiblemente, las composiciones limpiadoras orales comprenden aproximadamente de 0.0001% a aproximadamente 20% de una o más variantes de la presente invención, de preferencia de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 10%, de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5% en peso de la composición, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, "farmacéuticamente aceptable" significa que los fármacos, medicamentos o ingredientes inertes que el término describe, son adecuados para usar en contacto con tejidos humanos y de otros animales inferiores sin mayor toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuesta alérgica y similares, junto con una proporción razonable de beneficio/riesgo. Típicamente, los excipientes farmacéuticamente aceptables de los componentes limpiadores orales de las composiciones limpiadoras orales, comprenderán por lo regular de aproximadamente 50% a aproximadamente 99.99%, de preferencia de aproximadamente 65% a aproximadamente 99.99%, de preferencia de aproximadamente 65% a aproximadamente 99%, en peso de la composición. Los excipientes farmacéuticamente aceptables y los componentes opcionales que se pueden incluir en las composiciones limpiadoras orales de la presente invención, son bien conocidos para el experto en la materia. En las referencias citadas anteriormente en la presente se describe una amplia variedad de tipos de composición, excipientes y componentes opcionales, útiles en las composiciones limpiadoras orales. En otra modalidad de la presente invención, composiciones limpiadoras de dentadura para limpiar dentaduras fuera de la cavidad oral, comprenden una o más variantes de la presente invención. Dichas composiciones limpiadoras de dentadura comprenden una cantidad efectiva de una o más de las variantes, preferiblemente de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 50% de una o más de las variantes; de preferencia de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 35%, de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 20% en peso de la composición, y un excipiente de limpiador de dentadura. Son bien conocidas en la técnica varias composiciones limpiadoras de dentadura tales como tabletas efervescentes y similares (véase por ejemplo la patente de E.U.A. No. 5,055,305, Young), y generalmente son apropiadas para incorporar una o más de las variantes para remover manchas proteináceas de las dentaduras. En otra modalidad de la presente invención, composiciones limpiadoras de lentes de contacto comprenden una o más variantes de la presente invención. Dichas composiciones limpiadoras de lentes de contacto comprenden una cantidad efectiva de una o más de las variantes, de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 50% de una o más de las variantes, de preferencia de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 20%; de preferencia de aproximadamente 1% a aproximadamente 5% en peso de la composición, y un excipiente de limpiador de lentes de contacto. Son bien conocidos en la técnica varios formatos de composiciones limpiadoras de lentes de contacto, tales como tabletas, líquidos y similares, y generalmente son apropiados para incoforar una o mas variantes de la presente invención para remover manchas proteináceas de los lentes de contacto. La modalidad de composición limpiadora de lentes de contacto de la presente invención se ¡lustra por medio de los ejemplos 14-17.

EJEMPLOS 14-17 Solución limpiadora de lentes de contacto En los ejemplos 14-17, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustitución con N76D-*, con resultados sustancialmente similares. Los ejemplos 18-21 ilustran el uso de las presentes variantes en productos para lavado corporal: EJEMPLOS 18-21 Productos para lavado corporal EJEMPLOS 18-21 (Continuación) En los ejemplos 18-21, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustituciones con L75D-* + N76D-* + N77D-* + S78D-* + I79D-* + G80D-* + V81 D-* + L82D-*. con resultados sustancialmente similares. Los ejemplos 22-25 ilustran el uso de las presentes variantes en productos para lavado de la cara: EJEMPLOS 22-25 Productos para lavado de la cara EJEMPLOS 22-25 (Continuación) En los ejemplos 22-25, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustitución con L75D-*, con resultados sustancialmente similares. Los ejemplos 26-27 ilustran el uso de las presentes variantes en composiciones humectantes para la piel de dejar sin enjuagar: EJEMPLOS 26-27 Composición humectante para la piel de dejar sin enjuagar En los ejemplos 26-27, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustitución con L82D-*, con resultados sustancialmente similares. El ejemplo 28 ilustra el uso de las presentes variantes en composiciones de almohadilla limpiadora: EJEMPLO 28 Composición de almohadilla limpiadora La composición anterior se impregna sobre una hoja absorbente tejida comprendida de celulosa y/o poliéster, a aproximadamente 250% en peso de la hoja absorbente. En el ejemplo 28, las variantes citadas en los cuadros 2-3, y las variantes preferidas aquí citadas, entre otras, son sustitución con S78D-*. con resultados sustancialmente similares.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una variante de enzima caracterizada porque dicha variante tiene una secuencia de aminoácidos modificada de una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre, que comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más posiciones de aminoácido, en donde por lo menos un aminoácido de la variante de enzima es un L-aminoácido.

2.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una de las sustituciones ocurre en una región de epítope de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre.

3.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque es una variante de enzima seleccionada del grupo que consiste de proteasas, celulasas, lipasas, amilasas, peroxidasas, microperoxidasas, hemicelulasas, xilanasas, fosfolipasas, esterasas, cutinasas, pectinasas, queratinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas, lipooxigenasas, ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas, malanasas, • -glucanasas, arabinosidasas, hialuronidasas, condroitinasas, lacasas, transferasas, isomerasas, liasas, sintetasas y enzimas basadas en frutas.

4.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la enzima es una proteasa.

5.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre comprende una primera región de epítope, una segunda región de epítope y una tercera región de epítope, en donde la secuencia de aminoácidos modificada comprende una sustitución con un D-aminoácido sustituyente en una o más posiciones, en una o más de las regiones epítopes, en donde: (i) cuando ocurre una sustitución en la primera región epítope, la sustitución ocurre en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 70-84 de subtilisina BPN'; (ii) cuando ocurre una sustitución en la segunda región epítope, la sustitución ocurre en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 103-126 de subtilisina BPN'; y (iii) cuando ocurre una sustitución en la tercera región epítope, la sustitución ocurre en una o más posiciones correspondientes a las posiciones 217-252 de subtilisina BPN'.

6.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque es una serina proteasa seleccionada del grupo que consiste de subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg, subtilisina DY, subtilisina 309, proteinasa K y termitasa.

7.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque ocurre por lo menos una sustitución en la primera región epítope.

8.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque por lo menos una sustitución está en una o más de las posiciones 70 y 75-82 correspondientes a subtilisina BPN'.

9.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque ocurre por lo menos una sustitución en la segunda región epítope.

10.- La variante de enzima de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque ocurre por lo menos una sustitución en la 5 tercera región epítope.

11.- Una composición caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de composiciones limpiadoras y composiciones de cuidado personal, en donde dicha composición comprende una variante de enzima como la que se reclama en la reivindicación 1, y un vehículo. 10

12.- Un gen mutante caracterizado porque dicho gen codifica la variante de enzima que se reclama en la reivindicación 1. ^ *