JP2888985B2 - プロテアーゼ含有クリーニング組成物 - Google Patents

プロテアーゼ含有クリーニング組成物

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JP2888985B2
JP2888985B2 JP7512131A JP51213195A JP2888985B2 JP 2888985 B2 JP2888985 B2 JP 2888985B2 JP 7512131 A JP7512131 A JP 7512131A JP 51213195 A JP51213195 A JP 51213195A JP 2888985 B2 JP2888985 B2 JP 2888985B2
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レイ ボット，リチャード
ジーン ウイルソン，ロリー
フレデリック ザ、サード ブロード，フィリップ
リー バーネット，ボビー
ネルトン ラビン，ドン
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Description

【発明の詳細な説明】 この出願は1993年10月14日付で出願された米国出願第
08/136,797号および1994年５月２日付で出願された米国
出願第08/237,938号の一部継続出願であり、双方ともそ
れら全体で引用することにより本明細書の開示の一部と
される。
技術分野 本発明はカルボニルヒドロラーゼ変種である新規プロ
テアーゼ酵素を含んでなる様々なクリーニング組成物に
関する。
背景 酵素は最大クラスの天然タンパク質である。各種の酵
素は通常異なる種類の化学反応を触媒する（すなわち、
消費されずに反応を促進する）。プロテアーゼとして知
られる酵素は、他のタンパク質を加水分解する（開裂さ
れる化学結合のいずれかの側における水分子のＨおよび
OH部分の取込みで化合物を２以上のより簡単な化合物に
分解する）ものとして知られている。タンパク質を加水
分解するこの能力は、天然タンパク質工学処理プロテア
ーゼを洗濯洗剤製品への添加剤として配合することによ
り利用されてきた。衣類上の多くの汚れはタンパク質性
であり、広い特異性を有するプロテアーゼはこのような
汚れの除去性を実質的に改善するものである。
残念ながら、これらタンパク質の天然細菌環境下にお
ける効力レベルは比較的に非天然の洗浄環境中にしばし
ば移行されていない。特に、熱安定性、pH安定性、酸化
安定性および基質特異性のようなプロテアーゼの特徴
は、酵素の天然環境外での利用のためには必ずしも最適
化されていない。
プロテアーゼ酵素のアミノ酸配列がプロテアーゼの特
徴を決定している。プロテアーゼのアミノ酸配列の変化
は、酵素の性質を様々な程度に変えたり、あるいはアミ
ノ酸配列における変化の位置、性質および／または大き
さに応じて酵素を不活化させることさえある。洗浄環境
下のようなクリーニング用途でプロテアーゼの効力を増
加させることを目標として、それらの性質を改善する試
みに際し、プロテアーゼのアミノ酸配列を変えるいくつ
かの試みが行われてきた。これらの試みには、全く多様
な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するため
に、アミノ酸配列を変えることも含まれる。
当業界で記載された様々な試みにもかかわらず、様々
な表面をクリーニングする上で有用なプロテアーゼの新
たに有効な変種に関する必要性が依然として存在してい
る。したがって、改善されたタンパク質分解活性、基質
特異性、安定性および／または高性能特徴を有したカル
ボニルヒドロラーゼ変種であるプロテアーゼ酵素を含有
するクリーニング組成物を提供することが本発明の目的
である。これらのおよび他の目的は、以下の詳細な記載
から容易に明らかとなるであろう。
発明の要旨 本発明は （ａ）有効量のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテ
アーゼ酵素は、天然でみられないアミノ酸配列を有する
カルボニルヒドロラーゼ変種であり、異なるアミノ酸に
より前駆カルボニルヒドロラーゼの複数アミノ酸残基を
置換して誘導されたものであり、前駆酵素で置換された
上記複数のアミノ酸残基は＋76位と、以下の残基：＋9
9、＋101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋27、＋10
5、＋109、＋126、＋128、＋135、＋156、＋166、＋19
5、＋197、＋204、＋206、＋210、＋216、＋217、＋21
8、＋222、＋260、＋265および／または＋274のうち１
以上とに相当し、その番号位置はBacillus amyloliquef
aciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニルヒド
ロラーゼまたはズブチリシン（例えば、Bacillus lentu
sズブチリシン）の相当アミノ酸残基に対応する）、お
よび （ｂ）プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のクリーニ
ング組成物物質を含んでなるクリーニング組成物に関す
る。
本発明は、本明細書に記載されたカルボニルヒドロラ
ーゼ変種であるプロテアーゼ酵素と物品を接触させるこ
とからなる、クリーニングの必要な物品のクリーニング
方法にも関する。したがって、本発明には、好ましくは
撹拌下で上記布帛を上記プロテアーゼ酵素含有水性液と
接触させることからなる、布帛クリーニング方法も含ん
でなる。その方法は約60℃以下の温度で行えるが、もち
ろん沸騰までの洗濯温度でればかなり有効である。本発
明は、クリーニングの必要な皿を本明細書に記載された
ようなプロテアーゼ酵素と接触させることからなる、皿
のクリーニング方法にも関する。本発明の方法には身体
の洗浄方法も含まれ、その方法はクリーニングの必要な
ヒトまたはそれより下等の動物身体の部分を本明細書に
記載されたようなプロテアーゼ酵素と接触させることか
らなる。
図面の簡単な説明 図1A−ＣはBacillus amyloliquefaciensズブチリシン
のDNAおよびアミノ酸配列と、この遺伝子の部分制限地
図について示す（Seq.ID No.6）。
図２はBacillus amyloliquefaciens（BPN）′およびB
acillus lentus（野生型）のズブチリシンの中に保存さ
れたアミノ酸残基について示す。
図3Aおよび3Bは４種ズブチリシンのアミノ酸配列につ
いて示す。最上列はBacillus amyloliquefaciensのズブ
チリシン（ズブチリシンBPN′ともしばしば称される）
のアミノ酸配列について表す（Seq.ID No.7）。第二列
はBacillus subtillisのズブチリシンのアミノ酸配列に
ついて示す（Seq.ID No.8）。第三列はB.licheniformis
のズブチリシンのアミノ酸配列について示す（Seq.ID N
o.9）。第四列はBacillus lentusのズブチリシン（PCT
WO89/06276ではズブチリシン309とも称されている）の
アミノ酸配列について表す（Seq.ID No.10）。記号＊は
ズブチリシンBPN′と比較した特定アミノ酸残基の不存
在について示す。
図４はプラスミドGGA274の作成について示す。
図５はこの出願で用いられるある発現プラスミドへの
中間体であるGGT274の作成について示す。
図6Aおよび6BはBacillus lentusのズブチリシンのDNA
およびアミノ酸配列について示す（Seq.ID No.11）。成
熟ズブチリシンタンパク質はAlaに対応するコドンGCG
（334−336）で始まるコドンによりコードされている。
図7Aおよび7Bは本発明の好ましい態様のDNAおよびア
ミノ酸配列について示す（N76D/S103A/V1041）（Seq.ID
No.12）。この図面におけるDNAは76位でアスパラギン
酸、103位でアラニンおよび104位でイソロイシンについ
てコードするように記載された方法で修飾されている。
成熟ズブチリシン変種タンパク質はAlaに対応するコド
ンGCG（334−336）で始まるコドンによりコードされて
いる。
図８はベクターpBCDAICATの作成について示す。
図９はベクターpUCCATFNAの作成について示す。
図10は液体洗剤処方中において野生型と比較した好ま
しい成熟酵素の安定性について示す。
発明の具体的説明 1.プロテアーゼ酵素： 本発明には、非天然カルボニルヒドロラーゼ変種であ
るプロテアーゼ酵素が含まれ、この酵素はそれが誘導さ
れる前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して、異なるタ
ンパク質分解活性、安定性、基質特異性、pHプロフィル
および／または性能特徴を有する。前駆カルボニルヒド
ロラーゼは天然カルボニルヒドロラーゼでもまた組換え
ヒドロラーゼであってもよい。このカルボニルヒドロラ
ーゼ変種は天然でみられないアミノ酸配列を有してお
り、異なるアミノ酸による前駆カルボニルヒドロラーゼ
の「複数アミノ酸残基」の置換により誘導されている。
前駆酵素の「複数アミノ酸残基」は＋76位と、以下の残
基：＋99、＋101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋2
7、＋105、＋109、＋126、＋128、＋135、＋156、＋16
6、＋195、＋197、＋204、＋206、＋210、＋216、＋21
7、＋218、＋222、＋260、＋265および／または＋274の
うち１以上とに相当し、その番号位置はBacillus amylo
liquefaciensの天然ズブチリシンあるいは他のカルボニ
ルヒドロラーゼまたはズブチリシン、例えばBacillus l
entusズブチリシンの相当アミノ酸残基に対応する。
本発明による組成物で有用なプロテアーゼ酵素である
カルボニルヒドロラーゼ変種は、アミノ酸残基＋76位の
置換を、一以上の追加修飾と共に有する。好ましくは、
本発明において有用な変種プロテアーゼ酵素は下記組合
せ:76/99;76/101;76/103;76/104;76/107;76/123;76/99/
101;76/99/103;76/99/104;76/101/103;76/101/104;76/1
03/104;76/104/107;76/104/123;76/107/123;76/99/101/
103;76/99/101/104;76/99/103/104;76/101/103/104;76/
103/104/123;76/104/107/123;76/99/101/103/104;76/99
/103/104/123;76/99/101/103/104/123;76/103/104/128;
76/103/104/260;76/103/104/265;76/103/104/197;76/10
3/104/105;76/103/104/135;76/103/104/126;76/103/104
/107;76/103/104/210;76/103/104/126/265および／また
は76/103/104/222においてアミノ酸残基の置換、欠失ま
たは挿入を有する。最も好ましくは、本発明において有
用な変種酵素は残基の下記組合せ:B.amyloliquefaciens
ズブチリシンの76/99;76/104;76/99/104;76/103/104;76
/104/107;76/101/103/104;76/99/101/103/104および76/
101/104においてアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
を有する。
このようなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシ
ン変種をコードする変種DNA配列は、天然または組換え
前駆酵素をコードする前駆DNA配列から誘導される。変
種DNA配列は、Bacillus amyloliquefaciensにおいて7
6、99、101、103、104、107、123、27、105、109、12
6、128、135、156、166、195、197、204、206、210、21
6、217、218、222、260、265および／または274位ある
いはそのいずれかの組合せに相当する前駆DNA配列によ
りコードされる１以上の特定アミノ酸残基の置換につい
てコードするように前駆DNA配列を修飾することにより
誘導される。ここで修飾について特定されたアミノ酸残
基は（すべてのズブチリシンで残基位置を特定する上で
常法になった）B.amyloliquefaciensに適用しうる番号
付けに従い特定されているが、本発明において有用な好
ましい前駆DNA配列は図６で示されたようなBacillus le
ntusのDNA配列である（Seq.ID No.11）。
これらの変種DNA配列は、１以上の追加修飾と共にア
ミノ酸残基76の挿入または置換についてコードしてい
る。好ましくは、変種DNA配列は下記組合せ： 76/99;76/101;76/103;76/104;76/107;76/123;76/99/10
1;76/99/103;76/99/104;76/101/103;76/101/104;76/103
/104;76/104/107;76/104/123;76/107/123;76/99/101/10
3;76/99/101/104;76/99/103/104;76/101/103/104;76/10
3/104/123;76/104/107/123;76/99/101/103/104;76/99/1
03/104/123;76/99/101/103/104/123;76/103/104/128;76
/103/104/260;76/103/104/265;76/103/104/197;76/103/
104/105;76/103/104/135;76/103/104/126;76/103/104/1
07;76/103/104/210;76/103/104/126/265および／または
76/103/104/222でアミノ酸残基の置換または挿入につい
てコードしている。最も好ましくは、変種DNA配列は残
基の下記組合せ:76/99;76/104;76/99/104;76/103/104;7
6/104/107;76/101/103/104;76/99/101/103/104および76
/101/104の修飾についてコードしている。これらの組換
えDNA配列は、一般的に前駆カルボニルヒドロラーゼDNA
配列によりコードされる酵素の同性質とは実質的に異な
る少くとも１つの性質と、新規アミノ酸配列を有する、
カルボニルヒドロラーゼ変種についてコードしている。
このような性質にはタンパク質分解活性、基質特異性、
安定性、変化したpHプロフィルおよび／または向上した
性能特徴が含まれる。
ここで有用なプロテアーゼ酵素は、表示されたアミノ
酸残基位置で19種天然Ｌ−アミノ酸のうちいずれかの置
換を有している。このような置換はいかなる前駆ズブチ
リシン（原核、真核、哺乳動物など）においても行え
る。この出願全般にわたり、共通１および３文字コード
で様々なアミノ酸を表している。このようなコードはDa
le,J.W.（1989）,Molecular Genetics of Bacteria,Joh
n Wiley ＆ Sons,Ltd.,Appendix Bと同じである。
好ましくは、特定アミノ酸残基位置の各々で行われる
置換には、76位におけるＤ、Ｈ、Ｅ、Ｇ、Ｆ、Ｋ、Ｐお
よびＮを含めた置換;99位におけるＤ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ
およびＳを含めた置換;101位におけるＧ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、
Ａ、Ｅ、ＳおよびＲを含めた置換;103位におけるＱ、
Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｋ、Ｇ、Ｒ、ＳおよびＡを含めた置
換;104位における全19種天然アミノ酸を含めた置換;107
位におけるＶ、Ｌ、Ｍ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｆ、Ｔ、Ｓ、Ａ、
ＮおよびＩを含めた置換;123位におけるＮ、Ｔ、Ｉ、
Ｇ、Ａ、ＣおよびＳを含めた置換;27位におけるＫ、
Ｎ、Ｃ、ＶおよびＴを含めた置換;105位におけるＡ、
Ｄ、Ｇ、ＲおよびＮを含めた置換;107位におけるＡ、
Ｌ、Ｖ、Ｙ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、ＳおよびＡを含めた置換;109
位におけるＳ、Ｋ、Ｒ、Ａ、ＮおよびＤを含めた置換;1
26位におけるＡ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＧを含めた置換;128
位におけるＧ、ＬおよびＡを含めた置換;135位における
Ａ、Ｆ、Ｉ、ＳおよびＶを含めた置換;156位における
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、ＱおよびＫを含めた置換;166位におけ
る全19種天然アミノ酸を含めた置換;195位におけるＥを
含めた置換;197位におけるＥを含めた置換;204位におけ
るＡ、Ｇ、Ｃ、ＳおよびＤを含めた置換;206位における
Ｌ、Ｙ、Ｎ、ＤおよびＥを含めた置換;210位における
Ｌ、Ｉ、Ｓ、ＣおよびＦを含めた置換;216位における
Ｖ、Ｅ、ＴおよびＫを含めた置換;217位における全19種
天然アミノ酸を含めた置換;218位におけるＳ、Ａ、Ｇ、
ＴおよびＶを含めた置換;222位における全19種天然アミ
ノ酸を含めた置換;260位におけるＰ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｓ、
Ｃ、ＫおよびＤを含めた置換;265位におけるＮ、Ｇ、
Ａ、Ｓ、Ｃ、Ｋ、ＹおよびＨを含めた置換;274位におけ
るＡおよびＳを含めた置換があるが、これらに制限され
ない。このような各位置で置換される特に好ましいアミ
ノ酸は下記表Ｉで表示されている。特定のアミノ酸が表
Ｉで示されているが、いかなるアミノ酸も特定残基で置
き換わっていてよいことが理解されるべきである。
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの＋76に相
当するアミノ酸残基において、B.lentusズブチリシンで
インビトロ変異を有するこれらのプロテアーゼ酵素は、
前駆ズブチリシンにはない変化した安定性（例えば、修
正された自己タンパク質分解安定性）を示すズブチリシ
ン変種を生じる（表IVおよびVI参照）。
しかも、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンに
おいて＋99、＋101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋2
7、＋105、＋109、＋126、＋128、＋135、＋156、＋16
6、＋195、＋197、＋204、＋206、＋210、＋216、＋21
7、＋218、＋222、＋260、＋265および／または＋274に
相当する残基のインビトロ変異は、単独でまたは互いの
組合せで、＋76変異と一緒になって、変化したタンパク
質分解活性、変化した熱安定性、変化したpHプロフィ
ル、変化した基質特異性および／または変化した性能特
徴を示すズブチリシン変種を生じる。
カルボニルヒドロラーゼは、Ｃ（Ｏ）−Ｘ結合（Ｘは
酸素または窒素である）を有した化合物を加水分解する
プロテアーゼ酵素である。それらには天然カルボニルヒ
ドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼがあ
る。天然カルボニルヒドロラーゼには主としてヒドロラ
ーゼ、例えばズブチリシンまたはメタロプロテアーゼの
ようなペプチドヒドロラーゼがある。ペプチドヒドロラ
ーゼとしてはα−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、
ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロ
ラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボ
キシペプチダーゼ、チオールプロテイナーゼ、カルボキ
シプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼがある。
セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼと、エ
ンドおよびエキソプロテアーゼが含まれる。
“組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは、天然カルボ
ニルヒドロラーゼをコードするDNA配列が、カルボニル
ヒドロラーゼアミノ酸配列において１以上のアミノ酸の
置換、挿入または欠失についてコードする変異DNA配列
を生じるように修飾されてなる、カルボニルヒドロラー
ゼを意味する。適切な修飾法は本明細書、ならびに米国
特許第4,760,025号（RE34,606）、米国特許第5,204,015
号および米国特許第5,185,258号明細書に開示されてお
り、それらの開示は引用することにより本明細書の開示
の一部とされる。
ズブチリシンは、タンパク質またはペプチドのペプチ
ド結合を開裂するように通常作用する細菌または真菌カ
ルボニルヒドロラーゼである。ここで用いられる“ズブ
チリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブチリ
シンを意味する。天然ズブチリシンのシリーズは様々な
微生物種により産生されて、しばしば分泌されることが
知られている。このシリーズのメンバーのアミノ酸配列
は完全に相同的ではない。しかしながら、このシリーズ
のズブチリシンは同一または類似タイプのタンパク質分
解活性を示す。この種のセリンプロテアーゼは、それら
とキモトリプシン関連のセリンプロテアーゼとを区別す
る触媒三残基（catalytic triad）を規定する共通アミ
ノ酸配列を有している。ズブチリシンおよびキモトリシ
ン関連セリンプロテアーゼの双方はアスパラギン酸、ヒ
スチジンおよびセリンからなる触媒三残基を有してい
る。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これらア
ミノ酸の相対順序は、アミノからカルボキシ末端にかけ
て読取ると、アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンであ
る。しかしながら、キモトリプシン関連プロテアーゼで
は、相対順序がヒスチジン−アスパラギン酸−セリンで
ある。このため、本ズブチリシンはズブチリシン関連プ
ロテアーゼの触媒三残基を有するセリンプロテアーゼに
関する。例には本図３で特定されたズブチリシンがある
が、それに限定されない。
“組換えズブチリシン”とは、ズブチリシンをコード
するDNA配列が天然ズブチリシンアミノ酸配列で１以上
のアミノ酸の置換、欠失または挿入についてコードする
変種（または変異）DNA配列を生じるように修飾された
ズブチリシンを意味する。このような修飾を生じて、本
明細書において開示されたものと組み合わせてもよい適
切な方法には、米国特許第4,760,025号（RE34,606）、
米国特許第5,204,015号および米国特許第5,185,258号明
細書に開示されものがある。
“非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびそれらをコ
ードするDNAは、多くの原核および真核生物から得られ
る。原核生物の適切な例には、E.coliまたはPseudomona
sのようなグラム陰性生物と、MicrococcusまたはBacill
usのようなグラム陽性細菌がある。カルボニルヒドロラ
ーゼおよびそれらの遺伝子が得られる真核生物の例に
は、Saccharomyces cerevisiaeのよな酵母、Aspergillu
s sp.のような真菌と、非ヒト哺乳動物源、例えばカル
ボニルヒドロラーゼキモシンついてコードする遺伝子が
得られるウシsp.がある。ズブチリシンの場合のよう
に、カルボニルヒドロラーゼシリーズは、そのシリーズ
のメンバー間で完全に相同的ではないアミノ酸配列を有
するが、それでもなお同一または類似タイプの生物活性
を示す、様々な関連種から得られる。このため、ここで
用いられるような非ヒトカルボニルヒドロラーゼは、原
核および真核源と直接または間接的に関連したカルボニ
ルヒドロラーゼに関する機能的規定を有する。
“カルボニルヒドロラーゼ変種”は、“前駆カルボニ
ルヒドロラーゼ”のアミノ酸配列から誘導されたアミノ
酸配列を有する。前駆カルボニルヒドロラーゼ（例えば
ズブチリシン）には天然カルボニルヒドロラーゼ（ズブ
チリシン）および組換えカルボニルヒドロラーゼ（ズブ
チリシン）がある。カルボニルヒドロラーゼ変種のアミ
ノ酸配列は、前駆アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置
換、欠失または挿入により、前駆ヒドラーゼアミノ酸配
列から“誘導”される。このような修飾は、前駆カルボ
ニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）の酵素自体の操作よ
りもむしろ、前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシ
ン）のアミノ酸配列をコードする“前駆DNA配列”にお
いてなされるものである。前駆DNA配列のこのような操
作に適した方法には本明細書において開示された方法
と、当業者に公知の方法がある（例えば、EP O 32829
9、WO89/06279とそこで既に参照された米国特許および
出願参照）。
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの下記位
置：＋99、＋101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋2
7、＋105、＋109、＋126、＋128、＋135、＋156、＋16
6、＋195、＋197、＋204、＋206、＋210、＋216、＋21
7、＋218、＋222、＋260、＋265および／または＋274の
うち１以上と共に＋76位に相当する特定残基が本発明に
おいては変異のために特定されている。好ましくは、修
飾される残基は下記組合せ76/99;76/101;76/103;76/10
4;76/107;76/123;76/99/101;76/99/103;76/99/104;76/1
01/103;76/101/104;76/103/104;76/104/107;76/104/12
3;76/107/123;76/99/101/103;76/99/101/104;76/99/103
/104;76/101/103/104;76/103/104/123;76/104/107/123;
76/99/101/103/104;76/99/103/104/123;76/99/101/103/
104/123;76/103104/128;76/103/104/260;76/103/104/26
5;76/103/104/197;76/103/104/105;76/103/104/135;76/
103/104/126;76/103/104/107;76/103/104/210;76/103/1
04/126/265および／または76/103/104/222、最も好まし
くは76/99;76/104;76/99/104;76/103/104;76/104/107;7
6/101/103/104;76/99/101/103/104および76/101/104か
ら選択される。これらのアミノ酸位置番号は、図１で表
された成熟Bacillus amyloliquefaciensズブチリシン配
列に当てはめられた場合に関する。しかしながら、本発
明において有用なプロテアーゼ酵素はこの具体的ズブチ
リシンの変異に制限されず、Bacillus amyloliquefacie
nsズブチリシンの具体的な特定残基に、“相当”する位
置でアミノ酸残基を有する前駆カルボニルヒドロラーゼ
にもおよぶ。好ましくは、前駆ズブチリシンはBacillus
lentusズブチリシンであり、置換、欠失または挿入は
上記場合に対応するB.lentusの相当アミノ酸残基におい
て行われる。
前駆カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は、
それが相同的である（即ち、一次または三次構造の位置
に対応する）ならばBacillus amyloliquefaciensズブチ
リシンの残基に対応するか、あるいはBacillus amyloli
quefaciensズブチリシンにおける特定残基またはその残
基の一部と類似している（即ち、化学的に化合、反応ま
たは相互作用する上で同一または類似した機能的能力を
有する）。
一次構造とのホモロジーを確立するために、前駆カル
ボニルヒドロラーゼのアミノ酸配列はBacillus amyloli
quefaciensズブチリシン一次配列、特に配列が公知であ
るズブチリシンにおいて非変種であることが知られた残
基セットと直接比較される。図２は、amyloliquefacien
sズブチリシンとB.lentusズブチリシンとの間における
保存残基について示している。保存残基を並べて、並び
を維持する（即ち、予定にない欠失および挿入による保
存残基の除去を避ける）ために必要な挿入および欠失を
行った後、Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの
一次配列にある特定アミノ酸に相当する残基が明らかに
される。保存残基の並びは、好ましくはこのような残基
の100％を保存しているべきである。しかしながら、保
存残基の75％以上または50％もの少ない並びでも、相当
残基を明らかにする上で十分である。触媒三残基Asp32/
His64/Ser221の保存は維持されているべきである。
例えば、図３において、Bacillus amyloliquefacien
s、Bacillus subtillis、Bacillus licheniformis（car
isbergensis）およびBacillus lentusのズブチリシンの
アミノ酸配列はアミノ酸配列間で最大のホモロジー量を
与えるように並べられている。これら配列の比較では、
各配列に多くの保存残基が含まれていることを示してい
る。これらの保存残基は（BPN′およびB.lentus間）は
図２で特定されている。
このため、これらの保存残基は、Bacillus lentusの
ズブチリシン（1989年７月13日付で公開されたPCT公開N
o.WO89/06279）、ここで好ましいズブチリシン前駆酵
素、または好ましいBacillus lentusズブチリシンと高
度に相同的であるPB92として称されるズブチリシン（EP
O 328299）のような他のカルボニルヒドロラーゼで、B
acillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応する相
当アミノ酸残基を明らかにするために用いられる。これ
らズブチリシンのうちあるもののアミノ酸配列が、保存
残基の最大ホモロジーを生じるBacillus amyloliquefac
iensズブチリシンの配列と共に、図3Aおよび3Bにおいて
並べられている。この図にみられるように、Bacillus a
myloliquefaciensズブチリシンと比較してBacillus len
tusの配列にいくつかの欠失がある。このため、例え
ば、他のズブチリシンにおいてBacillus amyloliquefac
iensズブチリシンのVal165に相当するアミノ酸は、B.le
ntusおよびB.licheniformisの場合にイソロイシンであ
る。
このため、例えば、＋76位のアミノ酸はB.amylolique
faciensおよびB.lentusズブチリシン双方でアスパラギ
ン（Ｎ）である。しかしながら、本発明において有用な
好ましいズブチリシン変種において、Bacillus amyloli
quefaciensズブチリシンで＋76に相当するアミノ酸はア
スパラギン酸（Ｄ）で置換されている。ここで置換につ
いて特定されたすべてのアミノ酸残基vs.このような各
位置で好ましい置換の比較は、説明目的で表IIに示され
ている。
相当残基は、三次構造がＸ線結晶学で決定された前駆
カルボニルヒドロラーゼの三次構造レベルでホモロジー
を調べることにより明らかにしてもよい。相当残基は、
前駆カルボニルヒドロラーゼおよびBacillus amyloliqu
efaciensズブチリシンの特定アミノ酸残基の２以上の主
鎖原子（ＮとＮ、CAとCA、ＣとＣ、およびＯとＯ）の原
子座標が並べた後にデルがBacillus amyloliquefaciens
ズブチリシンに対して問題のカルボニルヒドロラーゼの
非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップ
を与えるように配向および配置された後で、並びが実現
される。ベストモデルは利用できる最高解像能で実験回
折データについて最低Ｒ因子を与える結晶学モデルであ
る。
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの特定残基
と機能的に類似した相当残基とは、それらがBacillus a
myloliquefaciensズブチリシンの特定残基に限られかつ
属するやり方でタンパク質構造、基質結合性または触媒
作用を変更、修飾またはそれに寄与するようなコンホメ
ーションをとる前駆カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸
として規定される。更に、それらは、所定残基の主鎖原
子が相同位置を占めることに基づく一致性の基準を満た
さないが、残基の側鎖原子の少くとも２つの原子座標が
Bacillus amyloliquefaciensズブチリシンの対応側鎖原
子の0.13nm内に存在する程度まで類似した位置を占める
（三次構造がＸ線結晶学で得られた）前駆カルボニルヒ
ドロラーゼの残基である。Bacillus amyloliquefaciens
ズブチリシンの三次元構造の座標はEPO公開No.0 251
446（米国特許出願第08/212,291号に相当する、その開
示は引用することにより本明細書の開示の一部とされ
る）に示され、三次構造のレベルで相当残基を決めるた
めに上記のように使用できる。
置換、挿入または欠失について特定された残基の一部
は保存残基であるが、その他はそうではない。保存され
ていない残基の場合、１以上のアミノ酸の置換は天然で
みられるものに相当しないアミノ酸配列を有する変種を
生じる置換に限定される。保存残基の場合、このような
置換は天然配列で起こらないはずである。本発明におい
て有用なカルボニルヒドロラーゼ変種には、カルボニル
ヒドロラーゼ変種の成熟形とこのようなヒドロラーゼ変
種のプロおよびプレプロ形がある。プレプロ形は、これ
がカルボニルヒドロラーゼ変種の発現、分泌および成熟
を促進することから、好ましい構造である。
“プロ配列”とは、除去されたときにカルボニルヒド
ロラーゼの“成熟”形を出現させる、カルボニルヒドロ
ラーゼの成熟形のＮ末端部分に結合されたアミノ酸配列
に関する。多くのタンパク質分解酵素が翻訳プロ酵素産
物として天然でみられ、翻訳後プロセッシングがないと
このまま発現される。カルボニルヒドロラーゼ変種、特
にズブチリシン変種を生じる好ましいプロ配列はBacill
us amyloliquefaciensズブチリシンの推定プロ配列であ
るが、他のズブチリシンプロ配列も用いてよい。例で
は、Bacillus lentus（ATCC 21536）のズブチリシンの
推定プロ配列が用いられる。
“シグナル配列”または“プロ配列”とは、カルボニ
ルヒドロラーゼのＮ末端部分、あるいはヒドロラーゼの
成熟またはプロ形の分泌に関与するプロヒドロラーゼの
Ｎ末端部分に結合されたアミノ酸の配列に関する。シグ
ナル配列のこの定義は機能的なもので、天然条件下でズ
ブチリシンまたは他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の
実施に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌性カ
ルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分によりコードされる
すべてのアミノ酸配列を含めた意味である。本発明で有
用なプロテアーゼ酵素は、ここで記載されたカルボニル
ヒドロラーゼ変種の分泌を行うためにこのような配列を
利用する。例で用いられる好ましいシグナル配列は、Ba
cillus lentus（ATCC 21536）ズブチリシンのシグナル
配列の残部に融合されたBacillus amyloliquefaciensズ
ブチリシンからのシグナル配列の初めの７アミノ酸残基
を含んでなる。
カルボニルヒドロラーゼ変種の“プレプロ”形は、ヒ
ドロラーゼのアミノ末端に作動的に結合されたプロ配列
と、プロ配列のアミノ末端に作動的に結合された“プ
レ”または“シグナル”配列とを有する、ヒドロラーゼ
の成熟形からなる。
“発現ベクター”とは、適切な宿主でDNAの発現を行
える適切な制御配列に作動的に結合されたDNA配列を含
むDNA組立体に関する。このような制御配列には、転写
を行うプロモーター、このような転写を制御する任意オ
ペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位につい
てコードする配列と、転写および翻訳の終結を制御する
配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒
子または単純に可能なゲノムインサートである。適切な
宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムから独
立して複製および機能するか、あるいは一部の場合には
ゲノム自体の中に組み込まれる。本明細書において、
“プラスミド”および“ベクター”は時々互換的に用い
られるが、プラスミドが現在最も常用される形のベクタ
ーである。しかしながら、相当する機能を発揮して、当
業界で知られるかまたは知られるようになった、このよ
うな他の形の発現ベクターにもこおに含まれる。
本発明で用いられる“宿主細胞”は、通常それらを酵
素的に活性なエンドプロテアーゼ分泌しないように操作
された、好ましくは米国特許第4,760,025号（RE34,60
6）で開示された方法により操作された、原核または真
核宿主である。ズブチリシンを発現させる上で好ましい
宿主細胞は、酵素的に活性な天然プロテアーゼおよびア
ルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠くBacillus株
BG2036である。株BG2036の作成は米国特許第5,264,366
号明細書で詳細に記載されている。ズブチリシンを発現
させる上で他の宿主細胞には、Bacillus subtilis 1168
（米国特許第4,760,025号（RE34,606）および米国特許
第5,264,366号明細書でも記載されており、それらの開
示は引用することにより本明細書の開示の一部とされ
る）とB.licheniformis、B.lentusなどのようないずれ
か適切なBacillus株がある。
宿主細胞は組換えDNA技術を用いて作成されたベクタ
ーで形質転換またはトランスフェクトされる。このよう
な形質転換された宿主細胞は、カルボニルヒドロラーゼ
変種をコードするかまたは望ましいカルボニルヒドロラ
ーゼ変種を発現するベクターを複製することができる。
カルボニルヒドロラーゼ変種のプレおよびプレプロ形に
ついてコードするベクターの場合、このような変種は発
現されると、典型的には宿主細胞から宿主細胞媒体中に
分泌される。
“作動的に結合された”とは、２つのDNA領域間の関
係について表すとき、それらが互いに機能的に関連して
いることを単純に意味する。例えば、プレ配列は、それ
がシグナル配列として機能して、タンパク質の成熟形の
分泌に関与し、おそらくシグナル配列を開裂させるなら
ば、ペプチドに作動的に結合されている。プロモーター
はそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動
的に結合されており、リボソーム結合部位はそれが翻訳
を行えるように配置されているならばコード配列に作動
的に結合されている。
天然前駆カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子
は、当業者に知られる一般的方法に従い得られる。その
方法では通常目的のヒドロラーゼの領域をコードする推
定配列を有した標識プローブを合成し、ヒドロラーゼを
発現する生物からゲノムライブラリーを作り、プローブ
とのハイブリッド形成により目的とする遺伝子について
ライブラリーをスクリーニングする。次いで、陽性ハイ
ブリッド形成クローンの酵素地図が作成され、配列決定
される。例で用いられるB.lentus遺伝子は米国特許第5,
185,258号明細書の例１で記載されたようにクローニン
グされ、その開示は引用することにより本明細書の開示
の一部とされる。例で用いられるBPN′遺伝子はRE34,66
明細書の例１で記載されたようにクローニングされ、そ
の開示は引用することにより本明細書の開示の一部とさ
れる。
次いで、クローン化カルボニルヒドロラーゼが宿主細
胞を形質転換してヒドロラーゼを発現させるために用い
られる。次いでヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数プラス
ミドに結合される。このプラスミドは、それがプラスミ
ド複製に必要な周知要素：即ち問題の遺伝子に作動的に
結合されたプロモーター（それが宿主により認識、即ち
転写されるならば、遺伝子自体の相同的プロモーターと
して供給される）、外来性であるかまたはヒドロラーゼ
遺伝子の内在ターミネーター領域により供給される（あ
る真核宿主細胞のヒドロラーゼ遺伝子から宿主で転写さ
れたmRNAの安定性にとり必要な）転写終結およびポリア
デニル化領域と、望ましくは抗生物質含有培地中の増殖
でプラスミド感染宿主細胞の連続培養維持を行える抗生
物質耐性遺伝子のような選択遺伝子を含んでいるという
意味で、宿主で複製される。高コピー数プラスミドは宿
主用の複製起点も含み、それにより染色体制限なしに細
胞質で多数のプラスミドを生成させることができる。し
かしながら、ヒドロラーゼ遺伝子の多数コピーを宿主ゲ
ノム中に組込むこともこの本範囲に含まれる。これは、
特に相同的組換えを受けやすい原核および真核生物で容
易化される。
本例で用いられる遺伝子は天然B.lentus遺伝子および
天然B.amyloliquefaciens遺伝子である。一方、天然ま
たは変異前駆カルボニルヒドロラーゼ（ズブチリシン）
についてコードする合成遺伝子も作成してよい。このよ
うなアプローチで、前駆ヒドロラーゼ（ズブチリシン）
のDNAおよび／またはアミノ酸配列が決定される。その
後多数の重複合成一本鎖DNA断片が合成され、ハイブリ
ッド形成および結合により前駆ヒドロラーゼについてコ
ードする合成DNAを生じる。合成遺伝子作成例は米国特
許第5,204,015号明細書の例３で示され、その開示は引
用することにより本明細書の開示の一部とされる。
天然または合成前駆カルボニルヒドロラーゼ遺伝子が
クローニングされると、いくつかの修飾が天然前駆カル
ボニルヒドロラーゼの合成以外にも遺伝子の使用を高め
るために行われる。このような修飾には、、米国特許第
4,760,025号（RE34,606）およびEPO公開第０ 251 446
号明細書で開示されたような組換えカルボニルヒドロラ
ーゼの生産と、ここで記載されたカルボニルヒドロラー
ゼ変種の生産がある。
下記カセット変異誘発法も本発明で有用なカルボニル
ヒドロラーゼ変種の作成および同定を容易にするために
用いられるが、部位特異的変異誘発を含めた他の方法も
用いてよい。最初に、ヒドロラーゼについてコードする
天然遺伝子が得られ、全部または一部が配列決定され
る。次いで配列がコードされた酵素で１以上のアミノ酸
の変異（欠失、挿入または置換）を行うことが望まれる
箇所について走査される。この箇所に隣接する配列は、
発現されたときに様々な変異体についてコードするオリ
ゴヌクレオチドプールで遺伝子の短いセグメントを置換
するための制限部位の存在について評価される。このよ
うな制限部位は、好ましくは遺伝子セグメントの置換を
容易にするためにヒドロラーゼ遺伝子内で独特な部位で
ある。しかしながら、ヒドロラーゼ遺伝子で過度に重複
していない好都合な制限部位はいずれも用いうるが、但
し制限切断で作られた遺伝子断片は適正な配列で再アセ
ンンブリーできねばならない。制限部位が選択された箇
所から好都合な距離内の位置（10〜15ヌクレオチド）に
存在しないならば、このような部位は読取枠だけでなく
コードされたアミノ酸も最終作成で変わらないように遺
伝子でヌクレオチドを置換させることにより作成され
る。その配列を変えて望ましい配列にするための遺伝子
の変異は、通常知られる方法に従いM13プライマー伸長
により行われる。適切な隣接領域を配置して、２つの好
都合な制限部位配列にするために必要な変化を評価する
作業は、遺伝子コードの重複性、遺伝子の制限酵素地図
および多数の異なる制限酵素によりルーチン化される。
好都合な隣接制限部位が利用しうるならば、上記方法は
部位を含まない隣接領域だけと併用される必要があるこ
とに留意すべきである。
天然DNAまたは合成DNAがクローニングされると、変異
される位置に隣接した制限部位は同族制限酵素で切断さ
れ、複数の末端相補オリゴヌクレオチドカセットがその
遺伝子に結合される。変異誘発は、すべてのオリゴヌク
レオチドが同様の制限部位を有するように合成できて、
合成リンカーが制限部位を作成する上で不要であるた
め、この方法により簡易化される。
ここで用いられるタンパク質分解活性は、活性酵素mg
当たりのペプチド結合の加水分解速度として規定され
る。多くの周知操作がタンパク質分解活性を測定するた
めに存在する（K.M.Kalisz,″Microbial Proteinase
s″,Advances in Biochemical Engineering/Biotechnol
ogy,A.Fiechter ed.,1983）。修正タンパク質分解活性
に加えてまたは代えて、本発明の変種酵素はKm、Kcat、
Kcat/Km比および／または修正基質特異性および／また
は修正pH活性プロフィルのような他の修正された性質を
有していてもよい。これらの酵素は、例えば洗濯用途の
ような加水分解プロセスで存在することが予想される特
定基質用に作ることができる。
１つの目的は前駆カルボニルヒドロラーゼと比較して
変化したタンパク質分解活性を有する変異カルボニルヒ
ドロラーゼを得ることであり、そうすればこのような活
性を（数値的に大きく）増加させて標的基質で更に効率
的に作用するように酵素を使用できるようになるからで
ある。前駆体と比較して変化した熱安定性および／また
は変化した基質特異性を有する変種酵素にも興味ある。
好ましくは、変異されるカルボニルヒドロラーゼはズブ
チリシンである。Bacillus amyloliquefaciensズブチリ
シンの＋76、＋99、＋101、＋103、＋104、＋107、＋12
3、＋27、＋105、＋109、＋126、＋128、＋135、＋15
6、＋166、＋195、＋197、＋204、＋206、＋210、＋21
6、＋217、＋218、＋222、＋260、＋265および／または
＋274あるいはそれらいずれかの組合せに相当する残基
においてズブチリシンタイプカルボニルヒドロラーゼで
このような結果を得るために有用な特定のアミノ酸が以
下の実施例において示されている。一部の場合には、低
いタンパク質分解活性が望ましい。逆に、一部の場合に
は、前駆体よりも変種酵素のタンパク質分解活性を増加
させることが望まれる。加えて、アルカリまたは熱安定
性であろうと、変種の安定性の増加または減少（変更）
が望まれる。Kcat、KmまたはKcat/Kmの増加または減少
は、これらの動力学的パラメーターを決定するために用
いられる基質に特異的である。
しかも、ズブチリシンでいくつか他の修飾と共に＋76
位に相当する残基は酵素の全体的安定性および／または
タンパク質分解活性を調節する上で重要なことがわかっ
た。このため、例で示されたように、相当する＋76位に
おけるBacillus lentusズブチリシンのアスパラギン
（Ｎ）は、得られる変異酵素で高い安定性および／また
は高い活性を生じるように、下記アミノ酸残基＋99、＋
101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋27、＋105、＋10
9、＋126、＋128、＋135、＋156、＋166、＋195、＋19
7、＋204、＋206、＋210、＋216、＋217、＋218、＋22
2、＋260、＋265および／または＋274のうち１以上の修
飾と共に、好ましいプロテアーゼ酵素でアスパラギン酸
（Ｄ）により置換することができる。
本発明で有用な最も好ましいプロテアーゼ酵素は例で
示されている。これらには置換残基の下記特定組合せ:N
76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76/S103A/V
1041、N76D/V1041/I107V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D
/S101R/S103A/V104Iがある。これらの置換は好ましくは
Bacillus lentus（組換えまたは天然型）ズブチリシン
で行われるが、置換はいかなるBacillusズブチリシンで
行ってもよい。
このおよび他の変種ズブチリシンで得られた結果に基
づくと、Bacillus amyloliquefaciensの＋76、＋99、＋
101、＋103、＋104、＋107、＋123、＋27、＋105、＋10
9、＋126、＋128、＋135、＋156、＋166、＋195、＋19
7、＋204、＋206、＋210、＋216、＋217、＋218、＋22
2、＋260、＋265および／または＋274位に相当するカル
ボニルヒドロラーゼ（好ましくは、ズブチリシン）の残
基が、これら酵素のタンパク質分解活性、性能および／
または安定性と、このような変種酵素のクリーニングま
たは洗浄性能にとり、重要であることは明らかである。
以下は本発明組成物で有用なプロテアーゼ酵素の製造
例により示されている。
プロテアーゼ製造例 B.subtilisでGG36遺伝子発現用の作成 B.lentusからのズブチリシン遺伝子の発現のためのク
ローニングおよび作成は、米国特許第5,185,258号明細
書で記載された場合と本質的に同様に行う。プラスミド
GGA274（図４に記載）が図５で示されたように下記のや
り方で更に修飾される。GGA274プラスミドの作成時に導
入されたPst I部位は、下記配列:5′GAAGCTGCAＡCTCGTT
AAA3′（Seq.ID No.1）を有するオリゴヌクレオチド
で、下記のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発により除
去される。下線“A"残基は制限酵素Pst Iの認識配列を
除いて、274位でアラニンからトレオニンに対応アミノ
酸残基を変える。274位のトレオニンはクローン化B.len
tusズブチリシン遺伝子配列で本来みられる野生型残基
である。ズブチリシンについてコードするDNAセグメン
トは、EcoR IおよびBamH I切断でプラスミドGGA274また
はその誘導体（図５で示されたGGT274）から切り出され
る。DNA断片は、変異誘発のために、MP19のようなバク
テリオファージM13ベースベクター中に逆サブクローニ
ングされる。変異誘発後、EcoR IおよびHind III切断、
その後クローニングが、変異ズブチリシンタンパク質の
発現および回収のために、GGA274のような発現プラスミ
ド中に変異ズブチリシン遺伝子を逆移動させる上で行わ
れる。
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発はZoller,M.et a
l.（1983）,Methods Enzymol.,100:468−500で記載され
たように行われる。例として、配列５′GCTGCTＣTAＧAC
AATTCG3′（Seq.ID No.2）の合成オリゴヌクレオチドが
76位のアミノ酸残基をアスパラギン（Ｎ）からアスパラ
ギン酸（Ｄ）、即ちN76Dに変えるために用いられる。下
線“G"および“C"残基は野生型遺伝子配列からの変化を
表す。CAは＋75位でロイシンを保ち、Xbal制限酵素のXb
al認識部位（TCTAGA）を導入するようにアミノ酸配列を
変化させ、一方ＧACの変化は＋76のアスパラギンをアス
パラギン酸に変化させる。
99、101、103および104位の変異誘発には、異なるオ
リゴヌクレオチドが望ましい変異の組合せに応じて使用
できる。例えば、配列５′GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCG
ＣCATCAGCTCGATT3′（Seq.ID No.3）のオリゴヌクレオ
チドが単一ズブチリシン分子で下記変化:S99D、S101R、
S103AおよびV104Iを同時に行うために用いられる。同様
に、配列５′TCAGGTTCGGTCTCGAGＣＧTTGCCCAAGGATTG3′
（Seq.ID No.4）および５′CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG3′
（Seq.ID No.5）のオリゴヌクレオチドがI107VおよびN1
23Sを各々作るために利用される。同じく、下線残基は
アミノ酸配列または制限酵素認識配列で望ましい変化を
生じさせる野生型配列からの変化を表す。
ズブチリシン変種のタンパク質分解活性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発の方法に従
い、表IIIで掲載された変種が作られる。これらズブチ
リシン変種の各々のタンパク質分解活性は表IIIで示さ
れている。動力学的パラメーターkcat、Kmおよびkcat/K
mは、P.Bonneau et al.（1991）J.Am.Chem.Soc.,Vol.11
3,No.3,p.1030に記載された方法を用いて、合成ペプチ
ド基質サクシニル−Ｌ−Ala−Ｌ−Ala−Ｌ−Pro−Ｌ−P
he−ｐ−ニトロアニリドの加水分解に関して測定され
る。簡単にいえば、少量のズブチリシン変種ストック溶
液がpH8.6の0.1M Tris−HCl緩衝液に溶解された基質を
含む1cmキュベットに加えられ、25℃で恒温される。反
応の進行は410nmで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸
光度をモニターすることにより分光測定で追跡される。
動力学的パラメーターは、非直線回帰アルゴリズムを用
いて各反応毎に反応速度および生成物濃度をMichaelis
−Menten式に当てはめることにより得られる。
表IIIに掲載された結果は、試験されたズブチリシン
変種のすべてがタンパク質分解活性に留めていることを
示している。更に、データの詳しい分析では、タンパク
質分解活性がBacillus amyloliquefaciensで76、99、10
1、103、104、107および123位に相当するアミノ酸残基
において置換の様々な組合せによりBacillus lentusズ
ブチリシンで有意に変わっていることを示している。
ズブチリシン変種の熱安定性 前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発のプロセスに
より作られた本発明のBacillus lentusズブチリシンお
よび変種で観察される熱安定性の比較は表IVで示されて
いる。50mM CaCl2含有または非含有0.1Mグリシン、0.01
％Tween−80pH10.0中の精製酵素15μg/mlを小さな管中
に入れ、10℃で５分間、10〜60℃で１分間および60℃で
20分間インキュベートする。次いで管を氷上に10分間お
く。管からの一部は、25℃に恒温された0.1M tris−HCl
緩衝液pH8.6に溶解された1.2mMの合成ペプチド基質サク
シニル−Ｌ−Ala−Ｌ−Ala−Ｌ−Pro−Ｌ−Phe−ｐ−ニ
トロアニリドを含有する1cmキュベットへの添加によ
り、酵素活性について調べる。初期の直線的反応速度
は、時間の関数として410nmで反応生成物ｐ−ニトロア
ニリンの吸光度をモニターすることにより分光測定で追
跡する。データは加熱前に対する活性％として表示され
る。表IVに掲載された結果は、大多数の変種（26例中
２）が50mM CaCl2添加試験条件下でBacillus lentusズ
ブチリシンに匹敵する熱安定性を発揮することを示して
いる。50mM CaCl2非添加試験条件下でも、大多数の変種
（26例中19）がBacillus lentusズブチリシンよりも有
意に安定である。更に、変種N76D/S99D、N76D/V104I、N
76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V1041、N76D/V1041/I107
V、N76D/V104Y/I107VおよびN76D/S101R/S103A/V104Iは5
0mM CaCl2非添加試験条件下で単一置換変種N76Dよりも
有意に安定である。
ファージミドから作られた一本鎖DNA鋳型によるオリゴ
ヌクレオチド特異的変異誘発 A.B.lentus変種の作成 変異誘発プロトコールはオリゴヌクレオチド特異的変
異誘発で前記された場合と本質的に同様である。一本鎖
DNA鋳型はファージミド法で作る。一本鎖DNA鋳型作成用
のファージミドベクターを作成するために、我々はベク
ターpBCDAICATを最初に作成した。ベクター作成のフロ
ーチャートは図８で示されている。初めに、pC194プラ
スミド（Horinouchi,S.and Weisblum,B.,J.Bacteriol.,
150:8−15,1982）のCAT遺伝子についてコードするC1a I
−C1a I切断をpUC19（New England BioLabs,Beverly,M
A）のポリリンカー領域のAcc I部位中にクローニングし
てプラスミドpUCCHLを作り、GG36DAIコードDNAの５′末
端からのEcoR I−Dra I 0.6KB断片をpBSKSプラスミド
（Stratagene,Inc.,San Diego,CA）のEcoR IおよびEcoR
V部位中にクローニングしてpBC2SK5を作る。プラスミ
ドpBC2SK5の単一EcoR I部位をEcoR I切断により除去
し、その後T4DNAポリメラーゼ触媒で補充し、再結合さ
せて、EcoR I部位を有しないプラスミドpBC2SK−5Rを作
る。pBCSK−5R中にクローニングされたEcoR I−Dra I断
片をPst I−Hind III断片として単離し、pUCCHLのPst I
−Hind III部位（pUC19のポリリンカーの一部）中にク
ローニングしてプラスミドpUCCHL5Rを作る。GG36DAI遺
伝子のコード配列をEcoR I−BamH I判断として切出し、
pUCCHL5RのEcoR I−BamH I部位中にクローニングしてpU
CCATを作る。次いでpUCCATの大きなEcoR I−Hind III断
片をBS2KS＋のEcoR IおよびHind III部位中にクローニ
ングしてプラスミドpBCDAICATを作る。
一本鎖DNAを作るために、pBCDAICATを含むE.coliをRe
ssel.M.,Kidd,S.and Kelley,M.R.,GENE,45:333−338,19
86に記載されたプロトコールに従いファージR408（Stra
tagene,Inc.,San Diego,CAから得た）で感染させる。一
本鎖DNA鋳型が入手できたら、オリゴヌクレオチド特異
的変異誘発で前記されたような標準変異誘発方法を実施
する。ある変異体の作成は説明目的で以下に詳述されて
いる。
B.lentus（GG36）N76D/S103A/V104I/L217Hの作成で
は、GG36 N76D/S103A/V104IについてコードするEcoR I
−BamH I DNA断片をpUCCATの作成（図８参照）に用い
て、プラスミドpBCDAICATを作る。一本鎖DNA鋳型を前記
プロトコールに従い作った後、下記配列の変異誘発プラ
イマー を用いて、L217Hを作る。前記のように、下線残基は行
われたヌクレオチド変化を表し、xC1a Iは存在するC1a
I部位が変異誘発後に除去されたことを示す。変異誘発
プロトコールは前記オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
で記載されたとおりである。変異誘発後、プラスミドDN
Aを初めにC1a I部位の除去についてスクリーニングし、
C1a I部位を欠いたクローンをDNA配列分析に付して、21
7位アミノ酸残基でＬからＨに変化したDNA配列について
確認する。
B.BPN′変種の作成およびB.subtilisでのそれらの発現 B.amyloliquefaciens（BPN′）N76D/Q103A/Y104I/Y21
7Lの作成を２つの連続工程のほかは同様の方式で行う。
N76Dを最初にBPN′Y217L中に導入してBPN′N76D/Y217L
を作り、第二の変異誘発を行ってBPN′N76D/Y217LをBP
N′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lに変換する。第一変異誘発
用の一本鎖DNA鋳型を作るために、BPN′Y217Lズブチリ
シンについてコードするEcoR I−BamH I断片（Wells,
J.,et al.,PNAS,84,5167,1087で記載されたY217Lプラス
ミドから誘導される）を用いて、プラスミドpUCCATFNA
を作る（図９参照）。BPN′Y217Lを含むpUCCATFNAプラ
スミドを用いて、pBCFNACATプラスミドを作成する（図
９）。一本鎖DNAを前記のように作る。BPN′N76D/Y217L
を作るために、下記配列のオリゴヌクレオチドプライマ
ー を用いて、変化N76Dを作る。次いで一本鎖DNAをBPN′N7
6D/Y217L保有pBCFNACATプラスミド（N76D変異誘発後のp
BCFNACATプラスミド）から作り、下記配列のもう１つの
オリゴヌクレオチド で変異誘発させて、BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217Lを得
る。クローニング、一本鎖DNA作成、変異誘発および変
異体のスクリーニングに関係するすべての工程は前記の
ように実施する。BPN′遺伝子およびその変種の発現
は、RE34,606に記載されたようなBacillus subtilisの
プロテアーゼ欠失株中に直接プラスミドDNA（異なる変
種のBPN′遺伝子を含むpBCFNACAT）を組込むことにより
行う。
多数の変種をこれらのプロテアーゼ製造例の開示どお
りに作る。動力学的データおよび安定性データはこのよ
うな変種について作る。動力学的データは前記方法を用
いて作り、表Ｖで示されている。安定性データはここで
詳述されたように作成した。結果は表VIで示されてい
る。
熱安定性アッセイ操作 精製酵素は、緩衝液で平衡化されたSephadex G−25か
らなるカラムに酵素を適用し、同緩衝液を用いてカラム
から酵素を溶出させることにより、0.1MグリシンpH10.
0、0.01％Tween−80中に緩衝液交換する。
60℃に恒温された0.1Mグリシン、0.01％Tween−80pH1
0.0を含有する管に緩衝液交換された酵素を加えて、15
μg/mlの最終酵素濃度にする。
一部を様々な時間に60℃インキュベートから取出し、
25℃に恒温された0.1M tris−HCl緩衝液pH8.6に溶解さ
れた1.2mMの合成ペプチド基質サクシニル−Ｌ−Ala−Ｌ
−Ala−Ｌ−Pro−Ｌ−Phe−Ｐ−ニトロアニリドを含有
する1cmキュベットへの添加により、酵素活性について
直ちに調べる。初期の直線的反応速度は、時間の関数と
して410nmで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの吸光度を
モニターすることにより分光測定で追跡する。
50％酵素不活化に要する時間の長さである半減期は、
60℃でインキュベート時間の関数として反応速度の一次
プロットから決める。
データは同一条件下でBacillus lentusズブチリシン
（GG36）について決められた半減期の％として表VIに掲
載されている。
2.クリーニング組成物物質 本発明のクリーニング組成物は、前記プロテアーゼ酵
素に加えて、プロテアーゼ酵素と適合する１種以上のク
リーニング組成物物質も含んでいる。ここで用いられる
“クリーニング組成物物質”という用語は、望まれるク
リーニング組成物の具体的タイプおよび製品の形（例え
ば、液体、顆粒、スプレー組成物）について選択される
あらゆる液体、固体または気体物質を意味し、しかもそ
の物質は組成物で用いられるプロテアーゼ酵素と適合し
ている。クリーニング組成物物質の具体的選択は、クリ
ーニングされる表面、物品または布帛と使用中（例え
ば、洗浄洗剤使用中）のクリーニング条件にとり組成物
の望ましい形について考慮することにより容易に行われ
る。ここで用いられる“適合する”という用語は、プロ
テアーゼが通常の使用状況中に望んでいるほど有効でな
くなる程度までにはクリーニング組成物物質がプロテア
ーゼ酵素のタンパク質分解活性を減少させないことを意
味する。具体的なクリーニング組成物物質は以下で詳細
に例示されている。
１種以上の前記プロテアーゼ酵素の有効量がタンパク
質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で
有用な組成物中に含有される。このようなクリーニング
組成物には、形態上制限されない（例えば、液体及び顆
粒）、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物；
形態上制限されない（例えば、顆粒、液体及び固形処
方）、布帛クリーニングするための洗剤組成物；皿洗い
組成物（形態上制限されない）；形態上制限されない
（例えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方）オーラル
クリーニング組成物；形態上制限されない（例えば、液
体、錠剤）義歯クリーニング組成物がある。ここで記載
される“プロテアーゼ酵素の有効量”とは、特定のクリ
ーニング組成物で必要な酵素活性を出すために必要な前
記プロテアーゼ酵素の量に関する。このような有効量は
当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変
種、クリーニング適用例、クリーニング組成物の具体的
組成と、液体または乾燥（例えば、顆粒、固形）組成物
が必要かどうかなどのような多くのファクターに基づい
ている。
好ましくは、本発明のクリーニング組成物は約0.0001
〜約10％、更に好ましくは0.001〜約１％、更に一層好
ましくは約0.001〜約0.1％の１種以上のプロテアーゼ酵
素を含んでいる。プロテアーゼ酵素が用いられた様々な
クリーニング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳細
に記載されている。ここで用いられるすべての部、パー
センテージ及び比率は、他で指摘されないかぎり重量に
よる。
ここで用いられる“非布帛クリーニング組成物”に
は、硬質表面クリーニング組成物、皿洗い組成物、口内
洗浄組成物、義歯クリーニング組成物及び身体洗浄組成
物がある。
A.硬質表面、皿及び布帛用のクリーニング組成物 プロテアーゼ酵素は、高い起泡性および／または良好
な不溶性基質除去性が望まれるあらゆる洗剤組成物で用
いることができる。このため、プロテアーゼ酵素は、完
全に処方された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布
帛洗濯組成物などを提供するために、様々な慣用成分と
共に用いることができる。このような組成物は液体、顆
粒、固形物などの形をとることができる。このような組
成物は30〜60重量％もの界面活性剤を含有した最新の
“濃縮”洗剤として処方してもよい。
本クリーニング組成物は、場合により、好ましくは、
様々なアニオン系、ノニオン系、双極性などの界面活性
剤を含有することができる。このような界面活性剤は、
典型的には組成物の約0.1〜約60％、好ましくは約１〜
約35％のレベルで存在する。
ここで有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なC
11−C18アルキルベンゼンスルホネートと一級およびラ
ンダムアルキルサルフェート、 式CH3（CH2）ｘ（CHOSO3 -M+）CH3およびCH3（CH2）
ｙ（CHOSO3 -M+）CH2CH3のC10−C18二級（2,3）アルキル
サルフェート（式中ｘおよび（ｙ＋１）は少くとも約
７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍは水溶性
カチオン、特にナトリウムである）、C10−C18アルキル
アルコキシサルフェート（特に、EO1〜７エトキシサル
フェート）、C10−C18アルキルアルコキシカルボキシレ
ート（特に、EO1〜７エトキシカルボキシレート）、C10
−C18アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サル
フェート化ポリグリコシド、C12−C18α−スルホネート
化脂肪酸エステル、C12−C18アルキルおよびアルキルフ
ェノールアルコキシレート（特に、エトキシレートおよ
び混合エトキシ／プロポキシ）、C12−C18ベタインおよ
びスルホベタイン（“スルタイン”）、C10−C18アミン
オキシド、C8−C24サルコシネート（特にオレオイルサ
ルコシネート）などがある。アルキルアルコキシサルフ
ェート（AES）およびアルキルアルコキシカルボキシレ
ート（AEC）がここでは好ましい（このような界面活性
剤と前記アミンオキシドおよび／またはベタインまたは
スルタイン界面活性剤との併用も、処方者の希望に応じ
て好ましい）。他の慣用的で有用な界面活性剤は標準テ
キストに掲載されている。特に有用な界面活性剤には、
引用することにより本明細書の開示の一部とされる1993
年３月16日付で発行されたConnorらの米国特許第5,194,
639号明細書で開示されたC10−C18N−メチルグルカミド
がある。
５〜17、好ましくは６〜14、更に好ましくは７〜12範
囲内の平均親水性−親油性バランス（HLB）を有する界
面活性剤を与えるエチレンオキシドと疎水性部分との縮
合物であるノニオン系界面活性剤のクラスが特に有用で
ある。疎水性（親油性）部分は性質上脂肪族でもまたは
芳香族でもよく、いずれか特定の疎水基と縮合されたポ
リエチレン基の長さは親水性および疎水性要素間で望ま
しいバランス度を有する水溶性化合物を生じるように容
易に調整できる。アルコール１モル当たりエチレンオキ
シド３〜８モルを含むC9−C15一級アルコールエトキシ
レート（または混合エトキシ／プロポキシ）、特にアル
コール１モル当たりエチレンオキシド６〜８モルを含む
C14−C15一級アルコール、アルコール１モル当たりエチ
レンオキシド３〜５モルを含むC12−C15一級アルコール
およびそれらの混合物が特に好ましい。
他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロピー剤、加工助
剤、色素または顔料、液体処方用溶媒などを含めて、洗
剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分を本組成
物に含有させることができる。起泡性の一層の増加が望
まれるならば、C10−C16アルコールアミドのような起泡
増進剤が典型的には約１〜約10％レベルで組成物中に配
合できる。C10−C14モノエタノールおよびジエタノール
アミドがこのような起泡増進剤の典型的クラスである。
このような起泡増進剤と前記のアミンオキシド、ベタイ
ンおよびスルタインのような高起泡性補助界面活性剤と
の併用も有利である。所望であれば、MgCl2、MgSO4など
のような可溶性マグネシウム塩が、更に起泡性を出すた
めに、典型的には約0.1〜約２％のレベルで添加でき
る。
本液体洗剤組成物は、キャリヤとして水および他の溶
媒を含有することができる。メタノール、エタノール、
プロパノールおよびイソプロパノールで例示される低分
子量一級または二級アルコールが適切である。一価アル
コールが界面活性剤を溶解させる上で好ましいが、約２
〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキシ基を含んだ
ようなポリオール（例えば、1,3−プロパンジオール、
エチレングリコール、グリセリンおよび1,2−プロパン
ジオール）も使用できる。組成物は約５〜約90％、典型
的には約10〜約50％のこのようなキャリヤを含有する。
本洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、
洗浄水が約6.8〜約11.0のpHを有するように処方される
ことが好ましい。このため、最終製品は典型的にはこの
範囲で処方される。推奨される使用量レベルでpHをコン
トロールするための技術は緩衝剤、アルカリ、酸などの
使用があり、これは当業者に周知である。
本発明の硬質表面クリーニング組成物および布帛クリ
ーニング組成物を処方する場合、処方者は約５〜約50重
量％のレベルで様々なビルダーを用いようとするであろ
う。典型的ビルダーには１〜10ミクロンゼオライト、ポ
リカルボキシレート、例えばシトレートおよびオキシジ
サクシネート、積層シリケート、ホスフェートなどがあ
る。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されてい
る。
同様に、処方者はこのような組成物中にセルラーゼ、
リパーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼおよびプロテ
アーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約0.001
〜約１重量％のレベルで用いようとするであろう。様々
な洗浄および布帛ケア酵素が洗濯洗剤業界で周知であ
る。
ペルカーボネート、ペルボレートなどのような様々な
漂白化合物が、典型的には約１〜約15重量％のレベルで
このような組成物中で使用できる。所望であれば、この
ような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナ
ノイルオキシベンゼンスルホネートなどのようなブリー
チ活性剤も含有することができ、これらも当業界で知ら
れている。使用量レベルは、典型的には約１〜約10重量
％の範囲である。
様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタ
イプ、様々なキレート化剤、特にアミノホスホネートお
よびエチレンジアミンジサクシネート、様々な土汚れ除
去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様
々な分散剤、特にポリアクリレートおよびポリアルパラ
テート、様々な増白剤、特にアニオン系増白剤、様々な
色素移動阻止剤、例えばポリビニルピロリドン、様々な
起泡抑制剤、特にシリコーンおよび二級アルコール、様
々な布帛柔軟剤、特にスメクタイト土および土凝集ポリ
マー（例えば、ポリ（オキシエチレン））などはすべて
約１〜約35重量％範囲のレベルでこのような組成物に使
用できる。標準処方集と公開特許では、このような慣用
物質の多数の詳細な記載を含んでいる。
酵素安定剤も本発明のクリーニング組成物で用いてよ
い。このような酵素安定剤にはプロピレングリコール
（好ましくは、約１〜約10％）、ギ酸ナトリウム（好ま
しくは、約0.1〜約１％）およびギ酸カルシウム（好ま
しくは、約0.1〜約１％）がある。
1.硬質表面クリーニング組成物 ここで用いられる“硬質表面クリーニング組成物”と
は、床、壁、浴室タイルなどのような硬質表面をクリー
ニングするための液体および顆粒洗剤組成物に関する。
本発明の硬質表面クリーニング組成物は、有効量の１種
以上のプロテアーゼ酵素、好ましくは組成物の約0.0001
〜約10重量％、更に好ましくは約0.001〜約５％、更に
一層好ましくは約0.001〜約１％の活性プロテアーゼ酵
素を含有する。１種以上のプロテアーゼ酵素を含有する
ことに加えて、このような硬質表面クリーニング組成物
は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダ
ーを含有する。しかしながら、スプレーウィンドークリ
ーナーのようなある特殊製品では界面活性剤が時々用い
られないが、その理由はそれらがガラス表面で薄膜状／
すじ状残留物を形成するかもしれないからである。
界面活性剤成分は存在するとき本組成物の0.1％と少
ないが、典型的には組成物は約0.25〜約10％、更に好ま
しくは約１〜約５％の界面活性剤を含有する。
典型的には、組成物は約0.5〜約50％、好ましくは約
１〜約10％の洗浄ビルダーを含有する。好ましくは、pH
は約８〜12の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウ
ム、炭酸ナトリウムまたは塩酸のような慣用的pH調整剤
が、調整が必要ならば使用できる。
溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはグリ
コールエーテル、例えばジエチレングリコールモノヘキ
シルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテ
ル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレン
グリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコー
ルモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブ
チルエーテルと、ジオール、例えば2,2,4−トリメチル
−1,3−ペンタンジオールおよび２−エチル−1,3−ヘキ
サンジオールがあるが、それらに限定されない。用いら
れる場合、このような溶媒は典型的には約0.5〜約15
％、好ましくは約３〜約11％のレベルで存在する。
加えて、イソプロパノールまたはエタノールのような
高揮発性溶媒は、表面への組成物の“フルストレンク
ス”適用後に表面が洗い落とされないとき、表面から組
成物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いるこ
とができる。用いられる場合、揮発性溶媒は典型的には
組成物中に約２〜約12％のレベルで存在する。
本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記非
制限例で説明される（下記例において、例中の“プロテ
アーゼ＃”は前記表IIIで該当番号を有する本発明組成
物で有用な変種に関するものである）。
例１〜４において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果てプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例５および６において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
例７〜10において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例11および12において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
2.皿洗い組成物 本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は１
種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。ここで用いら
れる“皿洗い組成物”とは、限定されないが顆粒および
液体形を含めて、皿をクリーニングするためのすべての
形態の組成物に関する。本発明の皿洗い組成物態様は下
記例で説明される。
例13〜16において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例17および18において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
例19A〜Ｃにおいて、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも例19
A〜Ｃにおいて、特に表III、ＶおよびVIで列挙された本
発明で有用なプロテアーゼのいずれの組合せも、実質上
同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
3.布帛クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング
組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含んでいる。こ
こで用いられる“布帛クリーニング組成物”とは、限定
されないが顆粒、液体および固形を含めて、布帛をクリ
ーニングするためのすべての形態の洗剤組成物に関す
る。
a.顆粒布帛クリーニング組成物 本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、有効量の１
種以上のプロテアーゼ酵素、好ましくは組成物の約0.00
1〜約10重量％、更に好ましくは約0.005〜約５％、更に
好ましくは約0.01〜約１％の活性プロテアーゼ酵素を含
有する。１種以上のプロテアーゼ酵素に加えて、顆粒布
帛クリーニング組成物は典型的には少くとも１種の界面
活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤
を含む。
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で
説明される。
例20〜21において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例22および23において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
例24および25において、表IIIで列挙されたプロテア
ーゼ＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載
された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質
上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例26および27において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
例28〜34の各々において、表IIIで列挙されたプロテ
アーゼ＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記
載された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実
質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しか
も、例28〜34において、特に表III、ＶおよびVIで列挙
された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合
せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わ
る。
b.液体布帛クリーニング組成物 本発明の液体布帛クリーニング組成物は、有効量の１
種以上のプロテアーゼ酵素、好ましくは組成物の約0.00
01〜約10重量％、更に好ましくは約0.001〜約１％、最
も好ましくは約0.001〜約0.1％の活性プロテアーゼ酵素
を含有する。このような液体布帛クリーニング組成物
は、典型的にはアニオン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性
洗浄ビルダーと水を更に含んでいる。
本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で
説明される。
例35〜37において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例38および39において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
c.固形布帛クリーニング組成物 手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニ
ング組成物は、有効量の１種以上のプロテアーゼ酵素
を、好ましくは組成物の約0.001〜約10重量％、更に好
ましくは約0.01〜約１％で含有する。
本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で
説明される。
例42および43において、表IIIで列挙されたプロテア
ーゼ＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載
された本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質
上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例44および45において、特に表III、ＶおよびVIで列
挙された本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組
合せも、実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12およびプ
ロテアーゼ＃４に置き代わる。
B.追加クリーニング組成物 前記の硬質表面クリーニング、皿洗いおよび布帛クリ
ーニング組成物に加えて、１種以上のプロテアーゼ酵素
も不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のクリーニ
ング組成物中に配合してもよい。このような追加クリー
ニング組成物にはオーラルクリーニング組成物、義歯ク
リーニング組成物およびコンタクトレンズクリーニング
組成物があるが、それらに限定されない。
1.口内洗浄組成物 本発明のもう１つの態様において、薬学上許容される
量の１種以上のプロテアーゼ酵素が菌または義歯からタ
ンパク質汚れを除去する上で有用な組成物中に含有され
る。ここで用いられる“口内洗浄組成物”とは、歯磨
剤、練歯磨剤、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプ
レー、マウスゲル、チューインガム、ロゼンジ、小袋、
錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液などに関
する。好ましくは、本発明の口内洗浄組成物は組成物の
約0.0001〜約20重量％、更に好ましくは約0.001〜約10
％、更に一層好ましくは約0.01〜約５％の１種以上のプ
ロテアーゼ酵素と、薬学上許容されるキャリヤを含む。
ここで用いられる“薬学上許容される”とは、その用語
が表す薬物、薬剤または不活性成分が妥当な利益／危険
比で釣り合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺
激、アレルギー反応などなくヒトおよびそれより下等の
動物の組織と接触する使用に適していることを意味す
る。
典型的には、口内洗浄組成物の口内洗浄成分の薬学上
許容される口内洗浄キャリヤ成分は、通常組成物の約50
〜約99.99重量％、好ましくは約65〜約99.99％、更に好
ましくは約65〜約99％である。
本発明の口内洗浄組成物に含有させてもよい薬学上許
容されるキャリヤ成分と任意成分は当業者に周知であ
る。口内洗浄組成物で有用な様々な組成タイプ、キャリ
ヤ成分と任意成分は、1992年３月17日付で発行されたSe
ibelの米国特許第5,096,700号;1991年７月２日付で発行
されたSampathkumarの米国特許第5,028,414号;1991年７
月２日付で発行されたBenedict,BushおよびSunbergの米
国特許第5,028,415号明細書に開示されており、それら
すべてが引用することにより本明細書の開示の一部とさ
れる。
本発明の口内洗浄組成物態様は下記例で説明される。
例46〜49において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、例
46〜49において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された
本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、
実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例50〜53において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、例
50〜53において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された
本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、
実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例54〜57において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、例
54〜57において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された
本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、
実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例58〜61において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、例
58〜61において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された
本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、
実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
2.義歯クリーニング組成物 本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をク
リーニングするための義歯クリーニング組成物は１種以
上のプロテアーゼ酵素を含有する。このような義歯クリ
ーニング組成物は、有効量の、好ましくは組成物の約0.
0001〜約50重量％、更に好ましくは約0.001〜約35％、
更に一層好ましくは約0.01〜約20％の１種以上のプロテ
アーゼ酵素と、義歯クリーニングキャリアを含んでい
る。発泡錠などのような様々な義歯クリーニング組成物
フォーマットが当業界で周知であり（例えば、引用する
ことにより本明細書の開示の一部とされるYoungの米国
特許第5,055,305号明細書参照）、義歯からタンパク質
汚れを除去する上で１種以上のプロテアーゼ酵素の配合
用に通常適している。
本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明
される。
例62〜66において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、例
62〜65において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された
本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、
実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
3.身体洗浄組成物 本発明のもう１つの態様において、（液体および固形
で）皮膚をクリーニングするためのパーソナルクレンジ
ング組成物は１種以上のプロテアーゼ酵素を含有してい
る。このような組成物は、典型的には組成物の約0.001
〜約５重量％、好ましくは約0.005〜約２％、最も好ま
しくは約0.01〜約0.8％のプロテアーゼ酵素を含有す
る。ここで記載されたようなプロテアーゼ酵素を含有で
きる好ましいパーソナルクレンジング組成物は、1993年
９月14日付で出願された双方ともVisscherらによる米国
特許出願第08/121,623号および第08/121,624号明細書で
示され、それらの開示は引用することにより本明細書の
開示の一部とされる。このような組成物は下記例で説明
される。 例66 液体身体洗浄組成物含有石鹸 成分 重量％ 石鹸（ＫまたはNa） 15.00 30％ラウレート 30％ミリステート 25％パルミテート 15％ステアレート 脂肪酸（上記比率） 4.50 Naラウリルサルコシネート 6.00 ナトリウムラウレス−３サルフェート 0.66 ココアミドプロピルベタイン 1.33 グリセリン 15.00 プロピレングリコール 9.00 ポリクォータニウム10 0.80 エチレングリコールジステアレート（EDTA） 1.50 プロピルパラベン 0.10 メチルパラベン 0.20 プロテアーゼ＃12 0.10 KOHまたはNaOH pH調整上必要量 硫酸カルシウム 3 酢酸 3 水 残部100％まで 例67 固形身体洗浄組成物 成分 重量％ ナトリウムココイルイセチオネート 47.20 ナトリウムセテアリルサルフェート 9.14 パラフィン 9.05 ナトリウム石鹸（その場） 3.67 ナトリウムイセチオネート 5.51 塩化ナトリウム 0.45 二酸化チタン 0.4 EDTA三ナトリウム 0.1 エチドロン酸三ナトリウム 0.1 香料 1.20 Na2SO4 0.87 プロテアーゼ＃12 0.10 水／その他 残部100％まで 例66〜67において、表IIIで列挙されたプロテアーゼ
＃１〜11および13〜25は、特に表ＶおよびVIで記載され
た本発明で有用な追加プロテアーゼを含めて、実質上同
様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。しかも、例
66〜67において、特に表III、ＶおよびVIで列挙された
本発明で有用なプロテアーゼ酵素のいずれの組合せも、
実質上同様の結果でプロテアーゼ＃12に置き代わる。
例68 洗浄性能試験 本発明組成物で有用な変種の洗浄性能は、EMPA116
（コットン上に血液／ミルク／カーボンブラック）衣切
れ（Testfabrics,Inc.,Middlesex,NJ 07030）から汚れ
の除去を調べることにより評価する。
ギザギザ端のある３×４−1/2インチに切断された６
回のEMPA116布切れを、水1000ml、硬度15gpg（Ca++:Mg
++3:1w:w）、洗剤7gおよび適宜に酵素を含有したモデル
7243S Terg−Ｏ−Tometer（United States Testing C
o.,Inc.,Hoboken,NJ）の各ポットに入れる。洗剤ベース
はwfk−Testgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13
07 62,D−47759 Krefeld,GermanyのWFK1洗剤である： 成分 最終処方の％ ゼオライトＡ 25％ 硫酸ナトリウム 25％ ソーダ灰 10％ 直鎖アルキルベンゼンスルホネート 8.8％ アルコールエトキシレート（７−8EO） 4.5％ ナトリウム石鹸 ３％ ケイ酸ナトリウム（SiO2:Na2O 3:3:1） ３％ このベース洗剤に下記添加を行う： 成分 最終処方の％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物 13％ コポリマー（Sokalan CP5） ４％ TAED（Mykon ATC Green） ３％ 酵素 0.5％ 増白剤（Tinopal AMS−GX） 0.2％ 過ホウ酸ナトリウム一水和物はDegussa Corporation,
Ridgefield−Park,NJ 07660から得る。Sokalan CP5はBA
SF Corporation,Parsippany,NJ 07054から得る。Mykon
ATC Green（TAED,テトラアセチルエチレンジアミン）は
Warwick International,Limited,Mostyn,Holywell,Clwy
d CH8 9HE,Englandから得る。Tinopal AMS GXはCiba−G
eigy Corporation,Greensboro,NC 27419から得る。
６枚のEMPA116布切れを60℃で30分間酵素入り洗剤で
洗浄し、その後各回毎に水1000mlで５分間にわたり２回
すすぎ洗いする。酵素を標準曲線では0.05〜1ppm、ルー
チン分析では0.25ppmの最終濃度で加える。布切れを乾
燥し、プレスし、布切れの反射率をMinolta Chroma Met
er,Model CR−200（Minolta Corporation,Ramsey,NJ 07
446）のＬ＊ａ＊ｂ＊スケールでＬ値を用いて測定す
る。性能はB.Lentus（GG36）プロテアーゼの性能の％と
して報告し、同様の汚れ除去性能を示すために必要な変
種プロテアーゼの量でB.Lentus（GG36）プロテアーゼの
量を割り100を掛けることにより計算する。データは表V
IIで示される。 表VII 酵素 洗浄性能 B.Lentusズブチリシン 100 N76D 310 N76D/S103A 230 N76D/V104I 130 N76D/I107V 160 N76D/S99D/S101R 370 N76D/S99D/S103A 290 N76D/S101R/S103A 130 N76D/S101R/V104I 300 N76D/S103A/V104I 320 N76D/S103G/V104I 160 N76D/S103A/V104F 210 N76D/S103A/V104N 110 N76D/S103A/V104T 170 N76D/V104I/I107V 210 N76D/S99D/S101R/S103A 220 N76D/S99D/S101R/V104I 140 N76D/S101G/S103A/V104I 170 N76D/S101R/S103A/V104I 150 N76D/S103A/V104I/S105A 170 N76D/S103A/V104T/I107A 120 N76D/S103A/V104T/I107L 110 N76D/S103A/V104I/L126F 110 N76D/S103A/V104I/L128G 280 N76D/S103A/V104I/L135V 160 N76D/S103A/V104I/D197E 160 N76D/S103A/V104I/N204A 170 N76D/S103A/V104I/N204G 160 N76D/S103A/V104I/N204C 150 N76D/S103A/V104I/P210I 470 N76D/S103A/V104I/M222A 100 N76D/S103A/V104I/T260P 280 N76D/S103A/V104I/S265N 190 例69 液体洗剤処方のプロテアーゼ安定性 液体洗剤処方で不活化に関するプロテアーゼ安定性の
比較を、ここで記載された操作に従いBacillus Lentus
ズブチリシンおよびその変種酵素N76D/S103A/V104Iにつ
いて行う。研究用の洗剤処方はThe Procter ＆ Gamble
CompanyによりUSAで作られたTide Ultra液体洗濯洗剤の
市販ボトルである。洗剤処方の熱処理はその場のプロテ
アーゼを不活化する上で必要である。これは4.5時間に
わたり96℃で洗剤をインキュベートすることにより行
う。次いで酵素20g/範囲内のB.Lentusズブチリシンお
よびN76D/S103A/V104I変種の濃縮製品を洗剤処方中酵素
0.3g/の最終濃度まで室温で熱処理Tide Ultraに加え
る。プロテアーゼ添加熱処理洗剤を50℃に恒温された水
浴中でインキュベートする。一部を０、24、46、76およ
び112時間間隔でインキュベート管から取出し、25℃に
恒温した0.1M Tris−HCl緩衝液、pH8.6に溶解された1.2
mMの合成ペプチド基質suc−Ala−Ala−Pro−Phe−ｐ−
ニトロアニリドを含有した1cmキュベットへの添加で酵
素活性について調べる。初期の直線的反応速度は、時間
の関数として410nmで反応生成物ｐ−ニトロアニリンの
吸光度をモニターすることにより分光測定で追跡する。
図10で示されるように、N76D/S103A/V104I変種は天然B.
Lentus酵素よりも不活化に関して有意に大きな安定性を
有することが観察される。特定の試験条件下で２酵素に
ついてTide Ultra洗剤処方中の不活化に関して評価され
た半減期は、B.Lentusズブチリシンで45時間およびN76D
/S103A/V104I変種で125時間である。
本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様
々な変更及び修正が本発明の精神及び範囲から逸脱せず
に行えることは当業者にとり明らかであろう。本発明の
範囲内に属するすべてのこのような修正を添付された請
求の範囲ではカバーしていると考えられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 グレイカー，トーマス ポール アメリカ合衆国カリフォルニア州、パシ フィコ、マンザニータ、1166 (72)発明者 ボット，リチャード レイ アメリカ合衆国カリフォルニア州、バー リンゲーム、ヒルサイド、ドライブ、 3032 (72)発明者 ウイルソン，ロリー ジーン アメリカ合衆国カリフォルニア州、ミル ブレー、エル、ボニート、ウェイ、33 (72)発明者 ブロード，フィリップ フレデリック ザ、サード アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、スクイレルスネスト、レイン、5780 (72)発明者 バーネット，ボビー リー アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、エルクウッド、ドライブ、12175 (72)発明者 ラビン，ドン ネルトン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナ チ、シード、ロード、8224 (56)参考文献 特表 平４−500385（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−505976（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500384（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502457（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C11D 3/386

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然でみられないアミノ酸配列を有するカ
    ルボニルヒドロラーゼ変種であって、ズブチリシン前駆
    カルボニルヒドロラーゼから誘導された、有効量のプロ
    テアーゼ酵素（ここで、このプロテアーゼ酵素はN76D/S
    103A/V104Iズブチリシン変種である）と、 （ｂ）１種以上のクリーニング組成物物質を含んでなる
    ことを特徴とする、クリーニング組成物。
  2. 【請求項２】クリーニング組成物物質が、界面活性剤、
    溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、土汚れ除去剤、分散
    剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟剤、起泡増強剤、酵
    素安定剤、ビルダー、漂白剤、色素、香料およびそれら
    の混合物からなる群より選択されるものである、請求項
    １に記載のクリーニング組成物。
  3. 【請求項３】（ａ）Bacillus lentusズブチリシンから
    誘導されるN76D/S103A/V104Iズブチリシン変種であるプ
    ロテアーゼ酵素約0.0001〜約10％、 （ｂ）少くとも約５％の界面活性剤、 （ｃ）少くとも約５％のビルダー、および （ｄ）場合により、溶媒、緩衝剤、酵素、汚れ放出剤、
    土汚れ除去剤、分散剤、増白剤、起泡抑制剤、布帛柔軟
    剤、起泡増強剤、酵素安定剤、漂白剤、色素、香料およ
    びそれらの混合物からなる群より選択される１種以上の
    クリーニング組成物物質を含んでなることを特徴とす
    る、布帛クリーニング組成物。
  4. 【請求項４】クリーニング組成物物質が、組成物の少く
    とも約１重量％の界面活性剤を含み、上記界面活性剤が
    アルキルベンゼンスルホネート、一級アルキルサルフェ
    ート、二級アルキルサルフェート、アルキルアルコキシ
    サルフェート、アルキルアルコキシカルボキシレート、
    アルキルポリグリコシドおよびそれらの対応サルフェー
    ト化ポリグリコシド、α−スルホネート化脂肪酸エステ
    ル、アルキルおよびアルキルフェノールアルコキシレー
    ト、ベタインおよびスルホベタイン、アミンオキシド、
    Ｎ−メチルグルカミド、ノニオン系一級アルコールエト
    キシレート、ノニオン系一級アルコール混合エトキシ／
    プロポキシとそれらの混合物からなる群より選択される
    物質を含んでなる、請求項３に記載のクリーニング組成
    物。
  5. 【請求項５】少くとも約30％の界面活性剤を含んだ濃縮
    顆粒布帛クリーニング組成物の形をとる、請求項３に記
    載の布帛クリーニング組成物。
  6. 【請求項６】漂白剤、布帛柔軟剤および酵素からなる群
    より選択される１種以上のクリーニング組成物物質を更
    に含んでなる、請求項４に記載の布帛クリーニング組成
    物。
  7. 【請求項７】セルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、プロ
    テアーゼ、ペルオキシダーゼおよびそれらの混合物から
    なる群より選択される少くとも１種の酵素を更に含んで
    なる、請求項４に記載の布帛クリーニング組成物。
  8. 【請求項８】（ａ）天然でみられないアミノ酸配列を有
    するカルボニルヒドロラーゼ変種であって、ズブチリシ
    ン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、約0.00
    01〜約10％のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテア
    ーゼ酵素は、N76D/S103A/V104Iズブチリシン変種であ
    る）、 （ｂ）約0.1〜約10％の界面活性剤、および （ｃ）場合により、溶媒、緩衝剤、酵素、分散剤、起泡
    抑制剤、酵素安定剤、漂白剤、色素、香料およびそれら
    の混合物からなる群より選択される１種以上のクリーニ
    ング組成物物質を含んでなることを特徴とする、皿洗い
    組成物。
  9. 【請求項９】（ａ）天然でみられないアミノ酸配列を有
    するカルボニルヒドロラーゼ変種であって、ズブチリシ
    ン前駆カルボニルヒドロラーゼから誘導された、約0.00
    1〜約５％のプロテアーゼ酵素（ここで、このプロテア
    ーゼ酵素は、N76D/S103A/V104Iズブチリシン変種であ
    る）、 （ｂ）約0.01〜約95％の界面活性剤、および （ｃ）場合により、約0.05％〜約50％の酵素安定剤、 を含んでなることを特徴とする、身体洗浄組成物。
  10. 【請求項１０】布帛および皿をクリーニングする方法で
    あって、クリーニングに必要な布帛または皿をBacillus
    lentusズブチリシンから誘導されるN76D/S103A/V104I
    ズブチリシン変種であるプロテアーゼ酵素と接触させる
    ことからなることを特徴とする、クリーニング方法。
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