KR100344976B1 - 서브틸리신변종 - Google Patents
서브틸리신변종 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100344976B1 KR100344976B1 KR1019960701923A KR19960701923A KR100344976B1 KR 100344976 B1 KR100344976 B1 KR 100344976B1 KR 1019960701923 A KR1019960701923 A KR 1019960701923A KR 19960701923 A KR19960701923 A KR 19960701923A KR 100344976 B1 KR100344976 B1 KR 100344976B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- subtilisin
- sequence
- amino acid
- bacillus
- residues
- Prior art date
Links
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 title claims abstract description 152
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 105
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims abstract description 86
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 34
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 67
- 102200025035 rs786203989 Human genes 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 102220528606 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5_S99D_mutation Human genes 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims 2
- 210000005255 gram-positive cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 25
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 abstract 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 42
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 42
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 17
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 17
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 7
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 7
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 5
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 4
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 4
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 3
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000004453 electron probe microanalysis Methods 0.000 description 3
- UFZOPKFMKMAWLU-UHFFFAOYSA-N ethoxy(methyl)phosphinic acid Chemical compound CCOP(C)(O)=O UFZOPKFMKMAWLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical group N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical class O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- RKGFWMYLTBPZGL-YUMQZZPRSA-N (2s)-2-amino-1-[(2s)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]sulfinyl-4-methylsulfanylbutan-1-one Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)S(=O)C(=O)[C@@H](N)CCSC RKGFWMYLTBPZGL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- INMYHLJNCIBJSD-KOKHDOHPSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid;(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 INMYHLJNCIBJSD-KOKHDOHPSA-N 0.000 description 1
- LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 0.000 description 1
- YGUMVDWOQQJBGA-VAWYXSNFSA-N 5-[(4-anilino-6-morpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-2-[(e)-2-[4-[(4-anilino-6-morpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-2-sulfophenyl]ethenyl]benzenesulfonic acid Chemical compound C=1C=C(\C=C\C=2C(=CC(NC=3N=C(N=C(NC=4C=CC=CC=4)N=3)N3CCOCC3)=CC=2)S(O)(=O)=O)C(S(=O)(=O)O)=CC=1NC(N=C(N=1)N2CCOCC2)=NC=1NC1=CC=CC=C1 YGUMVDWOQQJBGA-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- XSVSPKKXQGNHMD-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-3-methyl-1,2-thiazole Chemical compound CC=1C=C(Br)SN=1 XSVSPKKXQGNHMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220570975 60 kDa heat shock protein, mitochondrial_V76D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100008050 Caenorhabditis elegans cut-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000063103 Mangifera odorata Species 0.000 description 1
- 235000001375 Mangifera odorata Nutrition 0.000 description 1
- 108030000089 Metallocarboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006166 Metallocarboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Natural products NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- -1 acrylamino Chemical group 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000006229 carbon black Substances 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000000882 contact lens solution Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940066734 peptide hydrolases Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 108010059841 serine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- FRPJTGXMTIIFIT-UHFFFAOYSA-N tetraacetylethylenediamine Chemical compound CC(=O)C(N)(C(C)=O)C(N)(C(C)=O)C(C)=O FRPJTGXMTIIFIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Abstract
본발명은 천연적으로 얻어지거나 또는 인체의 것이 아닌 재조합형의 카보닐 하이드롤라제의 DNA 서열로부터 유도된 신규의 카보닐 하이드롤라제 변종에 관한다.
카보닐 하이드롤라제 변종은 일반적으로 전구체 카보닐 하이드롤라제의 아미노산 서열내의 복수개의 아미노산 잔기를 치환시켜, 천연적으로 얻어지거나 재조합형의 카보닐 하이드롤라제를 암호화하는 전구체 DNA 서열을 시험관내에서 변경시킴으로써 얻어진다. 이러한 카보닐 하이드롤라제 변종은 변경된 단백질 분해 활성, 변경된 안정성 등과 같은 전구체 하이드롤라제와는 다른 특성을 갖는다.
치환된 아미노산 잔기들은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 (Bacillus amylo - liquefaciens) 서브틸리신내 +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 및/또는 +274 위치의 하나 이상의 잔기들과 조합한 +76 위치에 해당한다.
Description
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 1993년 10 월 14 일 출원된 미국 출원 일련번호 제 08 / 137,240호 (계류중)의 일부 계속 출원이며 상기 출원의 전체내용을 참고로 합체하고 있다.
발명의 분야
본 발명은 전구체 카보닐 하이드롤라제의 복수개의 아미노산 잔기, 구체적으로 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신내 +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 및/또는 +274 로 이루어지는 그룹에서 선택된 하나 이상의 잔기와 조합된 + 76 잔기와 등가이거나 이에 해당되는 위치의 잔기들이 상이한 아미노산 잔기들로 치환된 아미노산 서열을 갖는 신규한 카보닐 하이드롤라제 변종에 관한다. 상기 돌연변이 / 변종 하이드롤라제는 전구체 아미노산 서열내 복수개의 아미노산 잔기의 치환을 단독으로 또는 전구체 아미노산 서열내 다른 치환, 삽입 또는 삭제와 조합하여 암호화하는 일반적으로 자연 발생적인 또는 재조합형 카보닐 하이드롤라제를 암호화하는 전구체 DNA 서열을 시험관에서 개질시켜 얻는다.
발명의 배경
세린 프로테아제는 카보닐 하이드롤라제의 아족이다. 이들은 광범위한 특이성 및 생물학적 관능을 갖는 다양한 종류의 효소로 구성된다. Stroud, R.Sci. Amer., 131 : 74 - 88. 이들의 관능적인 다양성에도 불구하고, 세린 프로테아제의 촉매 기구는 유전학적으로 뚜렷한 두가지 이상의 효소군, 즉 상동성 박테리아 세린 프로테아제 (예를 들어 트립신 및S. gresius트립신) 및 관련된 포유동물의 카이모트립신 및 서브틸리신에 의하여 다루어 왔다. 상기 두 세린 프로테아제 군은 매우 유사한 촉매 메카니즘을 보인다. Kraut, J. (1977),Ann. Rev. Biochem., 46 : 331 - 358. 더욱이, 상기 두 효소군의 1차 구조는 관련이 없을지라도 3 차 구조는 함께 세린, 히스티딘 및 아스파테이트로 이루어지는 촉매 트라이어드 아미노산이 보존된다.
서브틸리신은 다양한 바실러스 (Bacillus) 종 및 기타의 미생물로부터 다량으로 분비된 세린 엔도프로테아제 (분자량 27,500) 이다. 서브틸리신의 단백질 서열은 바실러스의 4개 이상의 상이한 종으로부터 결정하였다. Markland, F.S., 등 (1983),Hoone - Sevlrt's Z. Physiol. Chem., 364 : 1537 - 1540. 또한 바실러스 아밀로리퀘페이션스 (Bacillus amyloliquefaciens) 서브틸리신의 3 차원적인 결정학적 구조가 2.5 Å 해상까지 보고되었다. Wright, C.S.,등. (1969),Nature, 221 : 235 - 242 ; Drenth, J.,등 (1972),Eur. J. Biochem., 26 : 177 - 181.
이들 연구는 서브틸리신이 포유동물의 세린 프로테아제와 유전학적으로 관련이 없을지라도 유사한 활성 부위 구조를 가짐을 암시한다. 공유결합된 펩티드 저해제를 함유하는 서브틸리신 (Robertus, J.D., 등. (1972),Biochemistry, 11 : 2439 - 2449) 또는 생성 착물 (Robertus, J.D., 등 (1976),J. Biol. Chem., 251 : 1097- 1103) 의 X - 선 결정 구조는 또한 서브틸리신의 갈라진 틈을 결합시키는 추정상의 기질 및 활성부위에 관한 정보를 제공하였다. 또, 서브틸리신의 잔기 222에서 메티오닌의 곁사슬을 과산화수소에 의하여 메티오닐 - 설폭사이드로 전환시키고 (Stauffer, D.C., 등. (1965),J. Biol. Chem., 244 : 5333 - 5338) 잔기 221 에서 세린의 곁사슬을 화학적 개질에 의하여 시스테인으로 전환시키는 (Polgar, 등. (1981),Biochimica et Biophysica Acta, 667 : 351 - 354) 하나 이상의 보고서 뿐만 아니라 서브틸리신을 운동학적 및 화학적으로 개질시키는 다수의 연구가(Philipp, M., 등. (1983),Mol. Cell. Biochem, 51 : 5 - 32 ; Svendsen. B. (1976),Carlsberg Res. Comm., 41 : 237 - 29l ; Markland. F.S.Id) 보고되었다.
미합중국 특허 제 4,760,025 호 (RE 34,606) 에서는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신에서 티로신 - 1, 아스파테이트 + 32, 아스파라진 + 155, 티로신 + 104, 메티오닌 + 222, 글리신 + 166, 히스티딘 + 64, 글리신 + 169, 페닐알라닌 + 189, 세린 + 33, 세린 + 221, 티로신 + 217, 글루타메이트 + 156 및 알라닌 + 152 위치에 해당되는 서브틸리신 아미노산 잔기들의 개질방법을 기술하고 있다.
미합중국 특허 제 5,182,204 호에서는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신에서 아미노산 + 224 잔기 및 기타의 서브틸리신에서는 등가의 위치를 개질시키는 방법에 대하여 기술하고 있으며 이것은 치환, 삽입 및 삭제에 의하여 개질시킬 수 있고 미합중국 특허 제 4,760,O25 호 (RE 34,606) 에서 동정된 잔기에 대한 개질방법과 조합하여 유용한 서브틸리신 돌연변이 또는 변종을 제조할 수 있을 것이다. 미합중국 특허 제 5,155,033 호에서는 바실러스 아밀로리궤페이션스 서브틸러신의 + 225 에 상당하는 위치를 개질시킨 유사한 돌연변이 서브틸리신에 대하여 기술하고 있다. 미합중국 특허 제 5,185,258 호에서는 위치 + 123 및 / 또는 + 274 에서 개질시킨 돌연변이 서브틸리신에 대하여 기술하고 있다. 상기 특허의 공개내용은 구체적으로 + 99, + 101, + 103, + 107, + 126, + 128, + 135, + 197 및 + 204 를 포함하여 서브틸리신내 많은 아미노산 잔기의 개질에 대하여 기술한 미합중국 특허 출원 SN 07 / 898,382 호의 공개내용처럼 참고로 본원에 합체되어 있다. 상기 모든 특허 / 출원은 보통 소유되어 있다. 미합중국 특허 제 4,914,031 호는 + 76 위치에서 개질된 서브틸리신을 포함하여 혹종의 서브틸리신 유사체에 대하여 기술하고 있다. 상기 특허의 공개내용 또한 본원에 참고로 합체되어 있다. 그러나, 본 원에서 동정된 특정한 잔기 및 / 또는 본원에서 특허청구된 특정한 조합물은 상기 참고문헌들에서 동정되지 않았다.
따라서, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신에서 그룹 + 99, + 101, + 103, + 104, + 107, + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, + 210, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, + 265 및 /또는 + 274 에서 선택된 하나 이상의 위치와 함께 위치 + 76 에 해당하는 전구체 카보닐 하이드롤라제를 암호화하는 DNA 에서 복수개의 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 카보닐 하이드롤라제 (바람직하게는 서브틸리신) 변종을 제공하는 것이 본 원의 제 1 의 목적이다. 상기 변종은 일반적으로 상기 변종의 아미노산 서열이 유도되는 카보닐 하이드롤라제 전구체의 등가의 특성과 상이한 하나 이상의특성을 가진다.
본 발명의 제 2 의 목적은 상기 카보닐 하이드롤라제 변종을 암호화하는 DHA 서열 및 상기 변종 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 제 3 의 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 DNA 를 발현시켜 세포내적으로 또는 세포외적으로 카보닐 하이드롤라제 변종을 생성시킬 수 있는 숙주세포를 제공하는 것이다.
상기 기술한 참고문헌은 본 건의 출원일 이전의 그 공개내용을 위해서만 제공한 것이며, 선출원에 기초한 선원에 의하여 발명자가 후원임을 인정하는 것은 아니다.
발명의 요약
본 발명은 변종의 아미노산 서열이 유도되는 전구체 카보닐 하이드롤라제와 비교할때 상이한 단백질 가수분해 활성, 안정성, 기질 특이성, pH 프로파일 및 / 또는 성능 특성을 갖는 자연 발생적이 아닌 카보닐 하이드롤라제 변종을 포함한다. 전구체 카보닐 하이드롤라제는 자연 발생적인 카보닐 하이드롤라제 또는 재조합형 하이드롤라제일 수 있을 것이다. 특히, 상기 카보닐 하이드롤라제 변종은 자연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열을 가지며, 이것은 전구체 카보닐 하이드롤라제의 복수개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산으로 치환시킴으로써 유도된 것이다. 전구체 효소의 복수개의 아미노산 잔기는 하나 이상의 다음 잔기 + 99, + 101, + 103, + 104, + 107, + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, + 210, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, +265 및 / 또는 + 274 와 함께 위치 + 76 (상기 번호를 매긴 위치는 바실러스 아밀로리퀘페이션스로부터 얻은 자연 발생적인 서브틸리신에 해당하거나 또는 바실러스 렌터스 서브틸리신과 같은 기타의 카보닐 하이드롤라제 또는 서브틸리신에서 상당 아미노산 잔기에 해당함) 해당된다. 본 발명의 카보닐 하이드롤라제 변종은 하나 이상의 추가적인 변이와 조합된 아미노산 잔기 + 76 의 치환을 포함한다. 본 발명의 변종 효소는 바람직하게는 76/99 ;
및 /또는 76/103/104/222 으로 조합된 아미노산 잔기의 치환, 삭제 및 삽입으로 구성된다. 본 발명의 변종 효소는 가장 바람직하게는 바실러스 아밀로리퀘페이션스의 76/99 ; 76/104 ; 76/99/104 ; 76/103/104 ; 76/104/107 ; 76/101/103/104 ; 76/99/101/103/104 및 76/101/104 잔기로 조합된 아미노산 잔기의 치환, 삭제 또는 삽입으로 구성된다.
본 발명은 또한 상기 카보닐 하이드롤라제 또는 서브틸리신 변종을 암호화하는 변종 DNA 서열을 포함한다. 상기 변종 DNA 서열은 자연 발생적인 또는 재조합형 전구체 효소를 암호화하는 전구체 DNA 서열로부터 유도된다.
상기 변종 DNA서열은 바실러스 아밀로리퀘페이션스에서 위치 76, 99, 101, 103, 104, 107, l23, 27, 105, 109, 126, 128, 135, 156, 166, 195, 197, 204, 206, 210, 216, 217, 218, 222, 260, 265 및 / 또는 274 또는 이의 혹종의 조합에 해당하는 전구체 DNA 서열에 의하여 암호화된 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 치환을 암호화하는 전구체 DNA 서열을 개질시켜 유도한다. 본 원에서 개질을 위하여 동정되는 아미노산 잔기는 비. 아밀로리퀘페이션스에 적용가능한 넘버링 (모든 서브틸리신내 잔기 위치를 동정하기 위한 종래의 방법이 되었음) 에 따라 동정될지라도 본 발명에 유용한 바람직한 전구체 DNA 서열은 제 6 도에 도시된 바와 같은 바실러스 렌터스의 DNA 서열 (제 11 번 서열) 이다.
본 발명의 DNA 서열은 하나 이상의 치환과의 조합으로 아미노산 잔기 76 의 치환 또는 삽입을 암호화한다. 본 변종 DNA 서열은 바람직하게는 76/99 ;
및 / 또는 76/103/104/222 으로 조합된 아미노산 잔기의 치환 또는 삽입을 암호화한다. 본 변종 DNA 서열은 가장 바람직하게는 76/99 ; 76/104 ; 76/99/104 ; 76/103/104 ; 76/104/107 ; 76/101/103/104 ; 76/99/101/103/104 및 76/101/104 잔기들의 조합들의 개질을 암호화한다. 상기 재조합형 DNA 서열은 신규한 아미노산 서열 및 일반적으로 전구체 카보닐 하이드롤라제 DNA 서열에 의하여 암호화된 효소의 전술한 특성과 실질적으로 상이한 하나 이상의 특성을 갖는 카보닐 하이드롤라제 변종을 암호화한다. 상기 특성에는 단백질 가수분해 활성, 기질 특이성, 안정성, 변화 pH 프로파일 및 / 또는 증대된 성능 특성이 포함된다.
본 발명은 지시된 아미노산 위치에서 19 개의 자연 발생적인 혹종의 L - 아미노산의 치환을 포함한다. 상기 치환은 전구체 서브틸리신 (원핵생물, 진핵생물, 포유동물등) 에서 행할 수 있다. 각각의 동정된 아미노산 잔기 위치에서 이루어지는 치환은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다. D, H, E, G, F, K, P 및 N 을 포함하는 위치 76 에서의 치환 ; D, T, N, Q, G 및 S 를 포함하는 위치 99 에서의 치환 ; G, D, K, L, A, E, S 및 R 을 포함하는 위치 101 에서의 치환 ; Q, T, D, E, Y, K, G, R, S 및 A 를 포함하는 위치 103 에서의 치환 ; 19 개의 자연 발생적인 아미노산을 전부 포함하는 위치 104 에서의 치환 ; V, L, M, Y, G, E, F, T, S, A, N 및 I 를 포함하는 위치 107 에서의 치환 ; N, T, I, G, A, C 및 S 를 포함하는 위치 123 에서의 치환 ; K, N, C, V 및 T 를 포함하는 위치 27 에서의 치환 ; A, D, G, R 및 N 을 포함하는 위치 105 에서의 치환 ; A, L, V, Y, G, F, T, S 및 A 를 포함하는 위치 107 에서의 치환 ; S, K, R, A, N 및 D 를 포함하는 위치 109에서의 치환 ; A, F, I, V 및 G 를 포함하는 위치 126 에서의 치환 ; G, L 및 A 를 포함하는 위치 128 에서의 치환 ; A, F, I, S 및 V 를 포함하는 위치 135 에서의 치환 ; D, E, A, G, Q 및 K를 포함하는 위치 156 에서의 치환 ; 19 개의 자연 발생적인 아미노산을 전부 포함하는 위치 166 에서의 치환 ; E 를 포함하는 위치 195 에서의 치환 ; E 를 포함하는 위치 197 에서의 치환 ; A, G, C, S 및 D 를 포함하는 위치 204 에서의 치환 ; L, Y, N, D 및 E 를 포함하는 취치 206 에서의 치환 ; L, I, S, C 및 F 를 포함하는 위치 210 에서의 치환 ; V, E, T 및 K 를 포함하는 위치 216 에서의 치환 ; 19 개의 자연 발생적인 아미노산을 전부 포함하는 위치 217 에서의 치환 ; A, S, G, T 및 V 를 포함하는 위치 218 에서의 치환 ; 19 개의 자연 발생적인 아미노산을 전부 포함하는 위치 222 에서의 치환 ; P, N, G, A, S, C, K 및 D 를 포함하는 위치 260 에서 치환 ; N, G, A, S, C, K, Y 및 H 를 포함하는 위치 265 에서의 치환 ; A 및 S 을 포함하는 위치 274 에서의 치환. 상기 각각의 위치에서 치환되는 특히 바람직한 아미노산은 다음의 표 I 에 기술하였다. 표 I에 구체적인 아미노산을 나타내었으나 동정된 위치에서 혹종의 아미노산이 치환될수 있음을 이해하여야 한다.
또, 본 발명은 상기 변종 카보닐 하이드롤라제 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터 및 상기 변종을 생성시킬 수 있는 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 카보닐 하이드롤라제 변종으로 구성되는 청정 조성물에 관한다.
제 1A 도 - 제 1C 도는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 DNA 및 아미노산 서열 및 상기 유전자 (서열 제 6 번) 의 제한효소 지도를 묘사한 것이다.
제 2 도는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 (BPN') 및 바실러스 렌터스 (Bacillus lentus) (야생형) 로부터 얻은 서브틸리신 중에서 보존되는 아미노산 잔기를 기술한 것이다.
제 3A 도 및 치 3B 도는 4 개의 서브틸리신의 아미노산 서열을 기술한 것이다. 첫번째 라인은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신 (또한 때때로 서브틸리신 BPN' 으로 일컬음) 으로부터 얻은 서브틸리신의 아미노산 서열 (서열 번호 제 7 번) 을 나타낸다. 두번째 라인은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 로부터 얻은 서브틸리신의 아미노산 서열 (서열 제 8 번) 을 기술한 것이다. 세번째 라인은 비. 리퀘니포르미스 (B. licheniformis) 로부터 얻은 서브틸리신의 아미노산 서열 (서열 제 9 번) 을 기술한 것이다. 네번째 라인은 바실러스 렌터스 (또한 제 PCT WO89 / 06276 호에서는 서브틸리신 309 로 일컬음) 로부터 얻은 서브틸리신의 아미노산 서열 (서열 제 10 번) 을 기술한 것이다. * 표는 서브틸리신 BPN ' 과 비교할때 특정한 아미노산 잔기가 없음을 나타낸다.
제 4 도는 플라스미드 GGA274의 구조를 나타낸 것이다.
제 5 도는 본 출원에 사용되는 혹종의 발현 플라스미드에 대한 중간물인 GGT274 의 구조를 나타낸 것이다.
제 6A 도 및 제 6B 도는 바실러스 렌터스로부터 얻은 서브틸리신의 DNA 및 아미노산 서열 (서열 제 11 번) 을 기술한 것이다. 성숙 서브틸리신 단백질은 Ala에 대응되는 코돈 GCG (334 - 336) 로 출발되는 코돈으로 암호화된다.
제 7A 도 및 제 7B 도는 본 발명(N76D / S103A / V104I)의 바람직한 구체예의 DNA 및 아미노산 서열 (서열 제 12 번) 을 기술한 것이다. 상기 도면에서 DNA 는 위치 76 에서 아스파테이트, 위치 103 에서 알라닌 및 위치 104 에서 이소류신을 암호화할 수 있도록 기술하는 방법으로 개질시킨 것이다.
성숙 서브틸리신 변종 단백질은 Ala 에 대응되는 코돈 GCG (334 - 336) 로출발되는 코돈에 의하여 암호화된다.
제 8 도는 벡터 pBCDAICAT 의 구성을 기술한 것이다.
제 9 도는 벡터 pUCCATFNA 의 구성을 기술한 것이다.
제 10 도는 액체 세정 조제물내에서 야생형과 비교할때 바람직한 돌연변이 효소의 안정성을 보여준다.
바실러스 아밀로리퀘페이션스의 + 76 과 등가의 아미노산 잔기에서 비. 렌터스의 시험관 돌연변이는 전구체 서브틸리신에 대하여 변화된 안정성 (예를 들어 개질된 자동 단백질 가수분해 안정성) 을 보이는 서브틸리신 변종을 생성시킨다 (표 IV 및 표 VI 를 참조하시오).
또한 바실러스 아밀로리퀘페이션스의 + 99, + 101, + 103, + 104, + 107, + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, +210, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, + 265 및 /또는 + 274 에 상당하는 잔기 (단독으로 또는 서로 조합하고 및 + 76 돌연변이와의 혹종의 조합으로)에서의 시험관 돌연변이는 변화된 단백질 가수분해 활성, 변화된 열안정성, 변화된 pH 프로파일, 변화된 기질 특이성 및 / 또는 변화된 성능 특성을 보이는 서브틸리신 변종을 생성시킴을 발견하였다.
카보닐 하이드롤라제는 다음의 결합을 갖는 화합물을 가수분해시키는효소이다.
[ 식중, X 는 산소 또는 질소임.
이들은 자연 발생적인 카보닐 하이드롤라제 및 재조합형 카보닐 하이드롤라제를 포함한다. 자연 발생적인 카보닐 하이드롤라제는 주로 하이드롤라제 ( 예를 들어, 서브틸리신 또는 메탈로프로테아제라 같은 펩티드 하이드롤라제 ) 를 포함한다. 펩티드 하이드롤라제는- 아미노아크릴펩티드 하이드롤라제, 펩티딜아미노산 하이드롤라제, 아크릴아미노 하이드롤라제, 세린 카복시펩티다제, 메탈로카복시펩티다제, 티올 프로테이나제, 카복시프로테이나제 및 메탈로프로테이나제를 포함한다.
세린, 메탈로, 티올 및 산 프로테아제 및 엔도 및 엑소 - 프로테아제가 포함된다.
" 재조합형 카보닐 하이드롤라제 " 는 자연 발생적인 카보닐 하이드롤라제를 암호화하는 DNA 서열이 개질되어 카보닐 하이드롤라제 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 삭제를 암호화하는 들연변이 DNA 서열을 만들어내는 카보닐 하이드롤라제를 말한다. 적당한 개질 방법은 본 원 및 참고로 그 공개내용이 본 원에 합체된 미합중국 특허 제 4,760,025 호 ( RE 34,606 ), 미합중국 특허 제 5,2O4,015 호 및 미합중국 특허 제 5,185,258 호에 기술되어 있다.
서브틸리신은 일반적으로 단백질 또는 펩티드의 펩티드 결합을 절단하는 작용을 하는 박테리아 또는 균류 카보닐 하이드롤라제이다. 본 원에서 사용될때 " 서브틸리신 " 은 자연 발생적인 서브틸리신 또는 재조합형 서브틸리신을 의미한다. 일련의 자연 발생적인 서브틸리신의 제조방법은 공지되어 있으며 이것은 다양한 미생물 종에 의하여 분비된다. 상기 일련의 자연 발생적인 서브틸리신들의 아미노산 서열은 완전히 상동성이지는 않다. 그러나, 상기 일련의 서브틸리신은 등가이거나 유사한 형태의 단백질 가수분해 활성을 보인다. 상기 그룹의 세린 프로테아제는 이들과 카이모트립신 관련 그룹의 세린 프로테아제를 구별해주는 촉매 트라이어드를 정하는 통상적인 아미노산 서열을 공유한다. 서브틸리신 및 카이모트립신 관련 세린 프로테아제는 모두 아스파테이트, 히스티딘 및 세린으로 구성되는 촉매 트라이어드를 가진다. 서브틸리신 관련 프로테아제에서 이들 아미노산의 상대적인 순서는 아미노산 말단으로부터, 카르복시 말단으로부터 읽으면, 아스파테이트 - 히스티딘 - 세린이다. 그러나, 카이모트립신 관련 프로테아제에서는 상대적인 순서가 히스티딘 - 아스파테이트 - 세린이다. 따라서, 본 원에서 서브틸리신은 서브틸리신 관련 프로테아제의 촉매 트라이어드를 갖는 세린 프로테아제를 말한다. 예로는 본 원 제 3 도에 동정된 서브틸리신을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
" 재조합형 서브틸리신 " 이란 서브틸리신을 암호화하는 DNA 서열이 개질되어 자연 발생적인 서브틸리신 아미노산 서열내에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입을 암호화하는 변종 ( 또는 돌연변이 ) DNA 서열을 만들어내는 서브틸리신을 말한다. 본 원에 기술된 방법과 조합시킬 수 있는 적당한 개질 방법은 미합중국 특허 제 4,760,025 호 ( RE 34,606 ), 미합중국 특허 제 5,204,015 호 및미합중국 특허 제 5,185,258 호에 기술된 방법을 포함한다.
" 인간이 아닌 카보닐 하이드롤라제 " 및 이를 암호화하는 DNA 는 많은 원핵생물 및 진핵생물 유기체로부터 얻을 수 있을 것이다. 원핵생물 유기체의 적당한 예에는 이. 콜리 (E. coli) 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 와 같은 그람 음성 유기체 및 마이크로코커스 (Micrococcus) 또는 바실러스와 같은 그람 양성 박테리아가 포함된다. 카보닐 하이드롤라제 및 이의 유전자를 얻을 수 있는 진핵생물 유기체의 예에는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccaromyces cerevisiae) 와 같은 이스트, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종과 같은 균류 및 예를 들어 카보닐 하이드롤라제 카이모신을 암호화하는 유전자를 얻을 수 있는 소 종과 같은 인간이 아닌 포유동물의 공급원이 포함된다. 서브틸리신에 있어서, 일련의 하이드롤라제는 이들 사이의 상동성이 완전하지 않음에도 불구하고 등가이거나 유사한 형태의 생물학적 활성을 보이는 아미노산을 여러 관련 종으로부터 얻을 수 있다. 따라서, 본 원에서 사용될때 인간이 아닌 카보닐 하이드롤라제는 원핵생물 또는 진핵생물 공급원과 직접 또는 간접적으로 관련된 카보닐 하이드롤라제를 가리키는 관능적인 명확성을 가진다.
" 카보닐 하이드롤라제 변종 " 은 " 전구체 카보닐 하이드롤라제 " 의 아미노산 서열로부터 유도되는 아미노산 서열을 가진다. 전구체 카보닐 하이드롤라제 ( 이를테면 서브틸리신 ) 에는 자연 발생적인 카보닐 하이드롤라제 ( 서브틸리신 ) 및 재조합형 단백질 하이드롤라제 ( 서브틸리신 )가 포함된다. 카보닐하이드롤라제 변종의 아미노산 서열은 전구체 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산의 치환, 삭제 또는 삽입에 의하여 전구체 하이드롤라제 아미노산 서열로부터 " 유도 " 된다. 상기 개질은 전구체 카보닐 하이드롤라제 ( 서브틸리신 ) 효소 그 자체의 조작보다는 전구체 카보닐 하이드롤라제 ( 서브틸리신 ) 의 아미노산 서열을 암호화하는 " 전구체 DNA 서열 " 에 대한 것이다. 전구체 DNA 서열의 적당한 조작 방법에는 본 원에 기술된 방법 및 당업자에 공지된 방법 ( 예를 들어, 본 원에서 이미 참고문헌으로 인용한 유럽 제 0 328299호, 제 WO89 / O6279 호, 미합중국 특허 및 출원을 참조하시오 ) 이 포함된다.
본 원에서는 돌연변이를 위하여 바실러스 아밀로리퀘페이선스 서브틸리신의 위치 + 99, + 101, + 103, + 104, + 107, + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, + 210, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, + 265 및 /또는 + 274 중 하나 이상과 조합된 위치 + 76 에 해당하는 구체적인 잔기를 동정한다. 개질되는 잔기는 바람직하게는 76/99 ;
및 / 또는 76/103/104/222 ; 및 가장 바람직하게는 76/99 ; 76/104 ; 76/99/104 ; 76/103/104 ; 76/104/107 ; 76/101/103/104 ; 76/99/101/103/104 및 76/101/104 의조합에서 선택된다. 상기 아미노산 위치 번호는 제 1 도에 나타낸 성숙 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신 서열에 부여된 번호를 말한다. 그러나, 본 발명은 상기 특정한 서브틸리신의 돌연변이에 한정되지 않고 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신에서 특별히 동정된 잔기에 " 상당하는 " 위치의 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 카보닐 하이드롤라제까지 미친다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 전구체 서브틸리신은 바실러스 렌터스 서브틸리신이고 상기 나열한 것에 해당하는 비. 렌터스내 상당 아미노산 잔기에서 치환, 삭제 또는 삽입이 일어난다.
전구체 카보닐 하이드롤라제의 잔기 ( 아미노산 ) 는 이것이 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신내 특정한 잔기 또는 이 잔기 부분과 유사하거나 ( 즉, 화학적으로 결합, 반응 또는 상호작용할 수 있는 등가이거나 유사한 관능적인 능력을 가짐 ) 또는 상동관계 ( 즉, 1 차 또는 3 차 구조내 위치에 해당 ) 에 있을 경우 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 잔기에 상당한다.
1 차 구조와의 상동성을 확립하기 위하여 전구체 카보닐 하이드롤라제의 아미노산 서열을 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신 1 차 구조 및 특히 서열이 공지된 서브틸리신내에서 불변형으로 공지된 일련의 잔기와 직접 비교한다.
본 원에서 제 2 도는 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신 및 바실러스 렌터스 서브틸리신 사이에 보존되는 잔기들을 도시한다. 배열상태를 유지시키기 위하여 (즉, 임의의 삭제 및 삽입을 통한 보존 잔기의 제거를 피함 ) 필요한 삽입 및 삭제를 참작하여 상기 보존 잔기를 배열시킨후, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 1 차 서열내 특정한 아미노산에 상당하는 잔기를 정한다. 바람직하게는보존 잔기의 배열은 상기 잔기를 100 % 보존하여야 한다. 그러나, 75 % 이상 또는 50 % 정도의 보존 잔기의 배열 또한 상당하는 잔기를 정하는데 적당하다. 촉매 트라이어드 ( Asp32 / His64 / Ser221 ) 의 보존은 유지되어야 한다.
예를 들어, 제 3 도에서 바실러스 아밀로리퀘페이션스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리퀘니포르미스 ( 칼스버젠시스 ;carlsbergensis) 및 바실러스 렌터스로부터 얻은 서브틸리신의 아미노산 서열을 아미노산 사이에 최대의 상동성을 제공할 수 있도록 배열한다. 상기 서열들의 비교는 다수의 보존 잔기가 각 서열에 함유되어 있음을 보여준다. 상기 보존 잔기 ( BPN ' 및 비. 렌터스 사이의 경우 )는 제 2 도에 나타내었다.
따라서, 바실러스 렌터스 ( 1989 년 7 월 13 일 공개된 PCT 공개공보 제 WO89 / O6279호), 본 원의 바람직한 서브틸리신 전구체 효소, 또는 바람직한 바실러스 렌터스 서브틸리신과 밀접한 상동관계를 갖는 PB92 라 일컬어지는 서브틸리신 ( 유럽 제 0 328 299호 ) 과 같은 다른 카보닐 하이드롤라제에서 바실러스 아밀로리퀘페이션스의 대응되는 상당 아미노산 잔기를 정하는데 상기 보존 잔기를 사용할 수 있을 것이다. 제 3A 도 및 제 3B 도에서 혹종의 상기 서브틸리신의 아미노산 서열을 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 서열을 기준으로 배열되어 보존 잔기의 최대 상동성을 가지도록 배열하였다. 볼 수 있는 바와 같이 바실리스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신과 비교할때 바실러스 렌터스의 서열에서 다수의 삭제가 일어난다. 따라서, 예를 들어, 다른 서브틸리신내 바실러스 아밀로리퀘페이션스의 Val165에 대한 상응 아미노산은 바실러스 렌터스 및 바실러스 리퀘니포르미스에 대하여 이소류신이다.
따라서 예를 들어, 위치 + 76 에서의 아미노산은 비. 아밀로리퀘페이션스 및 비. 렌터스 서브틸리신에서 아스파라긴 (N ) 이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 서브틸리신 변종에서, 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 + 76 에 상당하는 아미노산은 아스파테이트 ( D ) 로 치환된다. 본 원에서 상기 각 위치에 대한 치환 대 가장 바람직한 치환을 위하여 동정된 혹종의 아미노산 잔기들의 비교를 예시의 목적으로 표 II 에 나타내었다.
표 II
등가의 잔기들은 또한 그 3 차 구조가 X - 선 결정학에 의하여 결정된 전구체 카보닐 하이드롤라제에 대한 3 차 구조의 수준에서 상동관계를 측정하여 결정할 수 있을 것이다. 등가의 잔기들은 전구체 카보닐 하이드롤라제 및 바실러스 아밀로리퀘페이션스의 아미노산 잔기의 둘 이상의 주 사슬 원자들의 원자 좌표 ( N 에 대하여 N, CA 에 대하여 CA, C 에 대하여 C 및 O 에 대하여 O ) 가 배열후 0.13, 바람직하게는 0.1 nm 이내일 경우이다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스에서 카보닐 하이드롤라제의 수소가 아닌 단백질 원자의 원자 좌표의 최대 오버랩을 얻기 위하여최상의 모델을 배향 및 위치시킨후 배열한다.
최상의 모델은 이용가능한 최고의 해상도에서 실험적인 회절 데이터에 대하여 최저의 R 인자를 나타내는 결정학적인 모델이다.
바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 특정한 잔기와 관능적으로 유사 한 등가의 잔기들은 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 특정 잔기에 대하여 정의되고 작용하는 방식으로 단백질 구조, 기질 결합 또는 촉매화의 변경, 수정 또는 이에 기여할 수 있도록 적합한 전구체 카보닐 하이드롤라제의 아미노산으로 정의된다. 이들은 상동 위치를 점하는 것을 기초로 할때 주어진 잔기들의 주사슬 원자들이 동일성 기준을 만족시키지 못할 수 있으나 상기 잔기의 둘 이상의 곁사슬 원자들의 원자 좌표가 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 대응 곁사슬 원자들의 0.13 nm 와 일치하는 범위까지 유사한 위치를 점하는 전구체 카보닐 하이드롤라제의 잔기 ( 이것의 3 차 구조는 X - 선 결정학으로 얻었음 ) 이다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 3 차원적 구조의 좌표는 유럽 공개공보 제 0 251 446 호 ( 미합중국 특허 출원 제 SN 08 / 212,291 호와 동일 , 본 원에 참고로 그 공개내용이 합체됨 ) 에 기술되어 있고 3 차 구조의 수준에서 등가의 잔기를 결정하기 위하여 상기 개설한 바와 같이 사용할 수 있다.
치환, 삽입 또는 삭제를 위하여 동정한 몇몇의 잔기는 보존 잔기인 반면 다른것들은 아니다. 보존되지 않는 잔기들의 경우, 하나 이상의 아미노산의 치환은 자연적으로 발견되는 것에 대응되지 않는 아미노산 서열을 갖는 변종을 생성시키는 치환에 한정된다. 보존되는 잔기들의 경우, 상기 치환으로 자연 발생적인 서열이 되어서는 안된다. 본 발명의 카보닐 하이드롤라제 변종은 카보닐 하이드롤라제 변종의 프리프로 (prepro) -, 프로 (pro) - 및 성숙 형태를 포함한다. 프리프로 형태가 카보닐 하이드롤라제 변종의 발현, 분비 및 성숙을 용이하게하므로 바람직한 구성이다.
" 프로서열 " 란 제거될 경우 " 성숙한 " 형태의 카보닐 하이드롤라제의 모양이 되게하는, 성숙한 형태의 카보닐 하이드롤라제의 N - 말단 부분에 결합된 아미노산의 서열을 말한다. 다수의 단백질분해 효소는 자연에서 번역 전구효소 생성물로 발견되고 후번역 과정없이 상기 방식으로 발현된다. 카보닐 하이드롤라제 변종, 구체적으로 서브틸리신 변종을 생성시키는 바람직한 프로서열은 기타의 서브틸리신 프로서열을 사용할 수 있을지라도 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 추정상의 프로서열이다. 실시예 1 및 2 에서는 바실러스 렌터스 서브틸리신으로부터 얻은 추정 프로서열 (ATCC 21536)을 사용하였다.
" 시그널 서열 " 또는 "프리(pre)서열" 란 하이드롤라제의 성숙 또는 프로 형태의 분비에 참여할 수 있는 카보닐 하이드롤라제의 N - 말단 부분 또는 프로하이드롤라제의 N - 말단 부분에 결합된 아미노산의 혹종의 서열을 말한다. 상기의 시그널 서열의 정의는 관능적인 것이며 자연 조건에서 서브틸리신 또는 기타의 카보닐 하이드롤라제의 분비에 참여하는 서브틸리신 유전자 또는 분비가능한 기타의카보닐 하이드롤라제의 N - 말단 부분에 의하여 암호화된 모든 아미노산 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명은 본 원에서 정의한 바와 같은 카보닐 하이드롤라제 변종을 분비시키는 서열을 사용한다. 본 실시예에서 사용하는 바람직한 시그널 서열은 바실러스 렌터스 서브틸리신 (ATCC 21536) 의 시그널 서열의 나머지에 합체된 바실러스 서브틸리트 서브틸리신으로부터 얻은 시그널 서열의 첫 7개의 아미노산 잔기로 구성된다.
카보닐 하이드롤라제 변종의 " 프리프로(prepro)" 형태는 하이드롤라제의 아미노 말단과 작동가능하게 결합한 프로서열 및 상기 프로서열의 아미노 말단과 작동가능하게 결합한 프로서열 및 상기 프로서열의 아미노 말단과 작동가능하게 결합한 " 프리 " 또는 " 시그널 " 서열을 갖는 성숙한 형태의 하이드롤라이제 성숙 형태로 이루어진다.
" 발현 벡터 " 란 적당한 숙주에서 DNA 를 발현시킬 수 있는 적당한 컨트롤 서열과 결합한 DNA 서열을 함유하는 DNA 구성체을 말한다. 상기 컨트롤 서열은 전사시키는 촉진 유전자, 상기 전사를 컨트롤하는 임의의 작동 서열, 적당한 mRNA 리보솜 결합 위치를 암호화하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 컨트롤하는 서열을 포함한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 미립물질, 또는 단순히 포텐셜 게놈 삽입물일 수 있을 것이다. 일단 적당한 숙주로 형질전환되면 숙주 게놈과 독립하게 상기 벡터는 복제되어 작용을 하거나 몇몇의 경우 게놈 자체에 삽입될 수 있을 것이다. 본 명세서에서 " 플라스미드 " 또는 " 벡터 " 는 때때로 플라스미드가 현재 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터인 것으로 바꿔 사용할 수 있다. 그러나, 본발명은 당업계에 공지되고 있거나 공지된 등가의 역할을 하는 기타 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도되었다.
본 발명에 사용되는 " 숙주 세포 " 는 일반적으로 바람직하게는 효소적으로 활성인 엔도프로테아제를 분비할 수 없도록 미합중국 특허 제 4,760,025 호 (RE 34,606) 에 기술된 방법으로 조작된 원핵생물 또는 진핵생물 숙주이다. 발현 서브틸리신에 바람직한 숙주 세포는 효소적으로 활성인 중성 프로테아제 및 알카리성 프로테아제 (서브틸리신) 가 결여된 바실러스 균주 BG2036 이다. 균주 BG2036 의 구성에 대하여는 미합중국 특허 제 5,264,366 호에 상세히 기술되어 있다. 발현 서브틸리신에 대한 기타의 적당한 숙주 세포는 바실린스 서브틸리스 I168 (또한 참고로 본 원에 그 공개내용이 합체되어 있는 미합중국 특허 제 4,760,O25 호 (RE 34,606) 및 미합중국 특허 제 5,264,366 호에 기술된) 및 비. 리퀘니포르미스, 비. 렌터스등과 같은 혹종의 적당한 바실러스 균주를 포함한다.
숙주 세포는 재조합형 DNA 기술을 사용하여 구성된 벡터로 형질전환된다. 상기 형질전환된 숙주 세포는 카보닐 하이드롤라제 변종을 암호화하거나 원하는 카보닐 하이드롤라제 변종을 발현시킬 수 있다. 프리 - 또는 프리프로 - 형태의 카보닐 하이드롤라제 변종을 암호화하는 벡터의 경우 상기 변종은 발현될때 일반적으로 숙주 세포에서 숙주 세포 배지로 분비된다.
두 DNA 영역 사이의 관계를 기술할때 " 작동가능하게 결합된 " 이란 말은 단순히 이들이 관능적으로 서로 연관이 있음을 의미한다. 예를 들어 프리서열은 시그널 서열로 작용할 경우 펩티드와 작동가능하게 결합되어 아마도 상기 시그널 서열의 절단을 포함하는 성숙한 형태의 단백질 분비에 참여한다.
프로모터는 이것이 서열의 전사를 컨트롤할 경우 전사 부분과 작동가능하게 결합하고 리보솜 결합 부위는 번역이 이루어질 수 있도록 위치될 경우 전사 부분과 작동가능하게 결합한다.
자연 발생적인 전구체 카보닐 하이드롤라제를 암호화하는 유전자는 당업자에 공지된 일반적인 방법으로 얻을 수 있을 것이다. 일반적으로 상기 방법은 대상 하이드롤라제 영역을 암호화하는 추정 서열을 갖는 표지된 프로브를 합성하는 단계, 상기 하이드롤라제를 발현시키는 유기체로부터 게놈 라이브러리를 얻는 단계 및 프로브에 잡종형성시켜 대상 유전자의 라이브러리를 스크리닝시키는 단계로 구성된다. 포지티브하게 잡종형성시킨 클론을 이 후 매핑 및 시퀀싱한다.
본 실시예에 사용한 비. 렌터스 유전자는 본 원에 그 공개내용이 합체된 미합중국 특허 제 5,185,258 호의 실시예 1 에 기술된 바와 같이 클로닝시켰다.
본 실시예 5 에 사용한 BPN' 유전자는 본 원에 그 공개내용이 합체된 제 RE 34,606호의 실시예 1 에 기술된 바와 같이 클로닝시켰다.
이 후 상기 클로닝된 하이드롤라제를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 하이드롤라제를 발현시킨다. 상기 하이드롤라제 유전자는 고 카피 넘버 플라스미드내에 리게이팅시킨다. 상기 플라스미드는 이것이 플라스미드 복제에 필요한 널리 공지된 요소들 즉, 문제의 유전자와 조작 용이하게 결합한 프로모터 (숙주 세포에 의하여 인식 즉, 전사될 경우 상기 유전자 자체의 프로모터로 공급될 수 있음), 외인성이거나 상기 하이드롤라제 유전자의 내인성 종결 유전자 영역에 의하여 공급된전사 종결 및 폴리아데닐화 영역 (혹종의 진핵생물 숙주 세포에서 하이드롤라제 유전자로부터 숙주에 의하여 전사된 mRNA 의 안정성을 위하여 필요함) 및 바람직하게는 항균 매질내에서 생장시켜 플라스미드 - 감염 숙주 세포를 계속 배양 유지시킬 수 있게 하는 항균 유전자와 같은 선택 유전자를 함유하는 개체만이 복제된다. 고 카피 넘버 플라스미드는 또한 숙주 복제의 기원을 함유하여 염색체의 한계 없이 세포질내에 다수의 플라스미드가 생성되게 한다. 그러나, 숙주 게놈에 하이드롤라제 유전자의 다중 카피를 삽입시키는 것도 본 발명의 영역내이다. 이것은 특히 상동성 재조합에 민감한 원핵생물 및 진핵생물 유기체에 의하여 용이하게 된다.
본 실시예에 사용하는 유전자는 중성 비. 렌터스 유전자 및 중성 비. 아밀로리퀘페이션스 유전자이다. 이와는 다르게 자연 발생적인 전구체 카보닐 하이드롤라제 및 돌연변이 전구체 카보닐 하이드롤라제 (서브틸리신) 을 암호화하는 합성 유전자를 제조할 수 있을 것이다. 상기와 같은 접근방법으로 전구체 하이드롤라제 (서브틸리신) 의 DNA 및 / 또는 아미노산 서열을 결정한다.
잡종성형 및 리게이팅시킬 때 전구체 하이드롤라제를 암호화하는 합성 DNA 를 제조하는 다중, 오버랩핑 합성 일본쇄 DNA 조각들을 합성한다. 합성 유전자 구성체의 실시에 대하여는 본 원에 참고로 그 공개내용이 합체된 미합중국 특허 제 5,204,015 호의 실시예 3 에 기술되어 있다.
일단 자연 발생적인 또는 합성의 전구체 카보닐 하이드롤라제 유전자가 클로닝된 다음에는 자연 발생적인 전구체 카보닐 하이드롤라제의 합성 이상으로 상기 유전자를 사용할 수 있도록 여러가지 개질을 행한다. 상기 개질에는 미합중국 특허제 4,760,015 호 (RE 34,606) 및 유럽 공개공보 제 0 251 446 호에 기술된 바와 같은 재조합형 카보닐 하이드롤라제의 제조 및 본 원에 기술된 카보닐 하이드롤라제 변종의 제조가 포함된다.
부위 - 지정 돌연변이 유발을 포함하는 다른 방법을 사용할 수 있을지라도 본 발명의 카보닐 하이드롤라제 변종의 동정 및 구성을 용이하게 하기 위하여 다음의 카세트 돌연변이 유발 방법을 사용할 수 있을 것이다. 먼저, 상기 하이드롤라제를 암호화하는 자연 발생적인 유전자를 얻어 전체적 또는 부분적으로 시퀀싱한다. 이 후 돌연변이를 원하는 서열에서 스캐닝시켜 상기 암호화된 효소에 하나 이상의 아미노산을 돌연변이 (삭제, 삽입 또는 치환) 시킨다. 상기 위치에 접한 서열은 발현시 여러가지 변종을 암호화하는 올리고 누클레오티드 풀로 유전자의 짧은 단편을 치환시키는 제한효소부위가 존재한다.
상기 제한효소부위는 바람직하게는 하이드롤라제 유전자내에 있는 독특한 부위로서 유전자 단편의 치환을 용이하게 한다. 그러나, 제한효소 절단에 의하여 생성되는 유전자 단편들을 알맞은 서열로 재조합할 수 있는 경우에는, 하이드롤라제 유전자내에 지나치게 중복되지 않는 혹종의 편리한 제한효소부위를 사용할 수 있을 것이다. 선택한 위치에서 편리한 거리내에 제한효소부위가 존재하지 않을 경우, 최종 구성체에서 리딩 프레임 및 암호화되는 아미노산이 변화되지 않도록 하는 방식으로 유전자내 누클레오티드를 치환시켜 제한효소 부위를 만들 수 있다. 원하는 서열이 될 수 있도록 상기 서열을 변화시키기 위하여 일반적으로 공지된 방법에 따라 M13 프라이머 연장에 의하여 상기 유전자를 돌연변이시킨다. 두가지 편리한 제한부위 서열을 얻기 위하여 필요한 변화를 평가하고 적당한 인접영역을 로케이팅시키는 일은 상이한 중복되는 유전 암호, 유전자의 제한효소 지도 및 다수의 제한효소에 의하여 일상적으로 수행된다. 편리한 인접 제한효소 부위를 이용할 수 있을 경우 상기 방법은 부위를 갖지 않는 인접영역과 연결하여 사용할 필요가 있다.
일단 자연 발생적인 DNA 또는 합성 DNA 를 클로닝시킨다음 돌연변이될 위치에 접한 제한부위는 인식 제한효소로 절단되고 다수의 말단 - 상보적인 올리고누클레오티드 카세트는 유전자내에 리게이팅된다. 올리고누클레오티드는 모두 등가의 제한부위를 가질 수 있도록 합성될 수 있으므로 상기 방법에 의한 돌연변이 유발을 단순화시킬 수 있으며, 제한부위를 만들기 위한 합성 연쇄 유전자 (linker) 는 불필요하다.
본 원에서 사용될때 원핵생물 활성은 활성 효소 1 mg 당 펩티드 결합의 가수분해율로 정의된다. 원핵생물 활성을 측정하기 위한 다수의 널리 공지된 절차 (K. Hf. Kalisz, " Microbial Proteinases, "Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988) 가 존재한다. 개질된 원핵생물 활성에 더하여 또는 이것과는 다르게 본 발명의 변종 효소는 Km, kcat, kcat/ Km비와 같은 다른 개질된 특성 및 / 또는 개질된 기질 특이성 및 / 또는 개질된 pH 활성 프로파일을 가질 수 있을 것이다. 상기 효소들은 예를 들어 세탁 용도와 같은 가수분해 방법 또는 펩티드 제조에서 존재할 것으로 기대되는 특정한 기질에 대하여 알맞을 수 있다.
본 발명의 한 양상의 목적은 (수적으로 더 큰) 활성의 증가가 표적 기질에 대하여 더 효과적으로 효소를 사용할 수 있게하는, 전구체 카보닐 하이드롤라제와 비교할때 변화된 원핵생물 활성을 갖는 변종 카보닐 하이드롤라제를 얻는 것이다. 또한 전구체와 비교할 때 변화된 열안정성 및 / 또는 변화된 기질 특이성을 갖는 변종 효소도 관심의 대상이다. 바람직하게는 돌연변이되는 카보닐 하이드롤라제는 서브틸리신이다. 바실러스 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신의 +76, + 99, + 101, + 103, + 104, + 107, + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, + 210, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, + 265 및 / 또는 + 274 또는 이들의 혹종의 조합과 등가의 잔기에서 서브틸리신형 카보닐 하이드롤라제에서 상기 결과를 얻기에 유용한 특정한 아미노산은 실시예에 나타내었다. 몇몇의 경우 더 낮은 단백질 분해 활성을 바랄 수 있을 것이다 (예를 들어 (펩티드 합성에 대하여와 같이) 카보닐 하이드롤라제의 합성 활성을 의도할 경우 단백질 분해 활성 감소가 유용할 것이다). 편리하게는 몇몇의 경우 변종 효소. 대 전구체의 단백질 분해 활성을 증가시키는 것이 바람직하다. 역으로 어떤 경우에는 전구체에 대하여 다양한 효소의 단백질 분해활성을 증가시키는 것이 바람직 할 수 있다. 또 알카리성 안정성이든 열안정성이든 변종의 안정성을 증가 또는 감소시키는 것 (변화)이 바람직할 수 있을 것이다. Km, Kcat, Kcat/ Km의 증가 또는 감소는 운동학적인 변수를 측정하기 위하여 사용되는 기질에 특정한 것이다.
본 발명의 또다른 양상에서는 다수의 다른 서브틸리신 개질위치와 조합된 +76 과 등가의 잔기가 전체적인 안정성 및 / 또는 효소의 단백질 가수분해 안정성 조절에 중요하다. 따라서, 실시예에 기술한 바와 같이 바실러스 렌터스 서브틸리신 위치 + 76 의 아스파라진 (N) 은 + 99, + 101, + 103, + 104, + 107, + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, + 210, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, + 265 및 / 또는 + 274 의 하나 이상의 아미노산 잔기를 개질시키는 바람직한 구체예에서 아스파테이트 (D) 로 치환되어 돌연변이 효소의 안정성 및 / 또는 활성을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예를 실시예에 기술하였다. 이들은 N76D / S99D ; N76D/V104I ; N76D/S99D/V104I ; V76D/S103A/V104I ; N76D/V104/I107Y ; N76D/V104Y/I107V 및 N76D/S101R/S103A/V104I 와 같은 치환 잔기의 특정 조합을 포함한다. 또한 본 발명에 특허청구된 모든 돌연변이 조합을 실시예에 기술한다. 혹종의 바실러스 서브틸리신에서 치환시킬 수 있을지라도 상기 치환은 바람직하게는 바실러스 렌터스 (재조합형 또는 자연형) 에서 이루어진다.
이것과 다른 변종 서브틸리신에서 얻은 결과를 기초로 하여 바실러스 아밀로리퀘페이션스의 위치 +76, + 99, + 101, + 103, + 104, + 107. + 123, + 27, + 105, + 109, + 126, + 128, + 135, + 156, + 166, + 195, + 197, + 204, + 206, + 21O, + 216, + 217, + 218, + 222, + 260, + 265 및 / 또는 + 274 과 등가의 카보닐 하이드롤라제 (바람직하게는 서브틸리신) 잔기는 상기 효소들의 단백질 가수분해 활성, 성능 및 / 또는 안정성 및 상기 변종 효소의 세척력에 중요하다.
다수의 본 발명 카보닐 하이드롤라제 변종, 특히 서브틸리신은 여러가지 세정 조성물의 제조에 유용하다. 본 발명의 카보닐 하이드롤라제 변종으로 구성된 유용한 적당한 계면활성제는 다수의 공지된 화합물이다. 이들은 Barry J. Anderson 의 미합중국 특허 제 4,404,128 호 및 Jiri Flora 등의 미합중국 특허 제 4,261,868 호에 기술된 바와 같은 비이온성, 양이온성, 음이온성 또는 양쪽 이온성 세정제를 포함한다. 적당한 세정 조제물은 미합중국 특허 제 5,204,015 호 (앞서 참고로 합체됨)의 실시예 7 에 기술된 것이다. 기술상 세정 조제물로 사용할 수 있는 상이한 조제물이 공지되어 있다. 전형적 세제에 대하여 당업계는 일반적인 세척 조성물외에 자연 또는 야생형 서브틸리신을 사용하는 혹종의 용도에 본 발명 서브틸리신 변종을 사용할 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 상기 변종을 예를 들어 고형 비누 또는 액체 비누 용도, 식기 세척용 조제물, 콘택트 렌즈 세척용액 또는 생성물, 펩티드 가수분해, 쓰레기 처리, 섬유 용도, 단백질 제조에서 융합 - 절단 효소등으로 사용할 수 있다. 본 발명의 변종은 (전구체와 비교할때) 세정 조성물에서 증대된 성능을 가질 수 있을 것이다. 본 원에서 사용될때 세정제내에서 증대된 성능이란 표준 세척 싸이클후 통상적인 평가방법으로 측정하였을때 풀 또는 피와 같은 혹종의 효소 민감성 오염에 대한 세척력이 증대된 것으로 정의된다.
본 발명의 서브틸리신은 약 0.01 - 약 5 중량 % (바람직하게는 0.1 - 0.5 중량 %)로 pH 6.5 - 12.0 을 갖는 분말형 및 액체세정제내에 조제할 수 있다. 상기 세정 세척 조성물에는 또한 빌더, 안정제 및 공지된 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제 또는 엔도글리코시다아제와 같은 기타의 효소가 포함될 수 있을 것이다.
종래의 세척 조성물에 본 발명의 서브틸리신을 가하는 것이 혹종의 특정한 용도제한을 야기하지는 않는다. 즉, 세정제에 적당한 혹종의 온도 및 pH 는 pH 가 상기 범위내이고 온도가 기술된 서브틸리신의 변성 온도이하인 이상 본 조성물에 또한 적당하다. 또, 본 발명의 서브틸리신은 빌더 및 안정제와 조합하여 또는 단독으로 세정제 없이 세척 조성물에 사용할 수 있다.
다음은 실시예이며 본 특허청구의 범위에 제한을 두려는 의도는 아니다.
실시예 1
발현시키기 위한 비. 서브틸리스내 GG36 유전자를 구성체
비. 렌터스로부터 얻어진 서브틸리신을 발현시키기 위한 클로닝 및 구성은 미합중국 특허 제 5,185,258 호에 기술한 바와 실질적으로 동일하게 수행하였다.
플라스미드 GGA274 (제 4 도에서 기술한) 를 제 5 도에 나타낸 바와 같이 다음과 같은 방식으로 추가적으로 개변시켰다. GGA274 플라스미드를 구성시키는 중에 도입된PstI부위를 후술할 올리고누클레오티드 - 조작된 돌연변이로써 제거하는데, 이때 올리고누클레오티드는 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3'(1 번 서열) 의 서열을 갖는다. 밑줄을 그은 "A" 잔기는 제한 효소.PstI의 인지 서열이 제거되었고 274위치의 아닐린으로부터 얻어진 당해 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환하였다. 274 위치의 트레오닌은 클로닝시킨 비. 렌터스 서브틸리신 유전자 서열에서 원래 발견되는 야생형 잔기이다.EcoRI및BamHI절단시켜 플라스미드 GGA274 또는 이의 유도체들 (제 5 도에 나타낸 GGA274) 로부터 서브틸리신을 암호화하는 DNA 단편을 절단시켰다. 이 DNA 단편을 MP 19 와 같은 돌연변이시키기 위하여 박테리오파지 M 13 -기초한 벡터로 다시 서브클로닝하였다. 돌연변이시킨 후, 클로닝시킨 다음EcoRI및BamHI절단시켜 돌연변이된 서브틸리신 단백질을 발현 및 회수를 위하여 GGA274 와 같은 발현 플라스미드로 다시 옮겼다.
실시예 2
올리고누클레오티드 - 디렉티드 돌연변이
Zeller, M. 등이 Method Enzymol., 100 : 468 - 500 (1983) 에서 기술한 바와 같이 올리고누클레오티드 - 디렉티드 돌연변이를 수행하였다. 예로써, 서열 5' GCTGCTCTAGACAATTCG 3' 의 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 아스파라긴 (N) 을 아스파트산 (D) 로, 또는 N76D 로 아미노산 잔기를 치환하였다. 밑줄그은 "G" 및 "C" 잔기는 야생형 유전자 서열에서의 변화를 의미한다.CA는 위치 + 75 에 류신을 계속 유지시키고XbaI제한 효소의XbaI인지 부위 (TCTAGA) 를 도입시키기 위하여 아미노산 서열을 변화시키는 반면,GAC 에서 + 76 아스파라긴이 아스파테이트로 치환되게 한다.
99, 101, 103 및 104 위치에서 돌연변이시키기 위하여, 목적하는 돌연변이의 조합에 따라 이종의 올리고누클레오티드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 5' GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (3 번 서열) 의 올리고누클레오티드를 동시에 사용하여 다음과 같이 변화시킬 수 있었다 ; 단일 서브틸리신 분자내의 S99D ; S101R ; S103A ; 및 V104I. 유사하게는, 서열 5' TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG 3'(4 번 서열) 및 서열 5' CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG 3'(5 번 서열) 을 사용하여 각각 I107V 및 N123S 를 만들었다. 다시, 밑줄그은 잔기는 아미노산 서열 또는 제한 효소 인지 서열이 목적하는 바와 같이 변화되는 야생형 서열의 변화를 의미한다.
실시예 3
서브틸리신 변종의 단백질 분해 활성
실시예 2 의 방법을 수행한 후, 하기 표 III 에 나열한 변종들을 만들었다.
이러한 서브틸리신 변종들의 각각의 단백질 분해 활성은 표 III 에 나타나 있다. P. Bonneau 등이J. Am. Chem. Soc., vol. 113, No. 3, p. 1030 (1991) 에서 기술한 방법을 이용하여 합성 펩티드 기질 숙시닐 - L - Ala - L - Ala - L - Pro - L - Phe - p - 니트로아닐리드를 가수분해시킬 때의 반응속도 변수 kcat, kM및 kcat/kM를 측정하였다. 요약하자면, 소량의 서브틸리신 변종 원액의 분취량을 pH 8.6, 25 ℃ 로 온도조절된 0.1 M 의 트리스 - HCI 완충액내에 용해된 기질을 함유한 1 cm 큐벳에 가하였다. 반응은 410 nm 에서 반응생성물 p - 니트로아닐린이 흡수됨을 모니터링함으로써 분광광도 측정법식으로 진행하였다. 반응속도 변수는 각각의 반응에 대한 반응 속도 및 생성물 농도가 Michaelis - Menten 식에 들어맞도록 비선형 회귀연산법을 이용하여 얻었다.
상기 표 III 에 나타난 결과는 테스트한 서브틸리신 변종들 전부가 단백질 분해 활성을 보유하고 있음을 나타낸다. 더욱이, 데이터를 상세하게 분석하면 단백질 분해 활성은 바실러스 아밀로리퀘페이션스내의 위치 76, 99, 101, 103, 104,107 및 123 과 등가의 아미노산 잔기들의 치환을 다양하게 조합시킴으로써 바실러스 렌터스 서브틸리신에 대하여 상당히 변화되었다.
실시예 4
서브틸리신 변종들의 열안정성
바실러스 렌터스 서브틸리신에 대하여 관찰한 열안정성과 실시예 2 의 방법에 의해 제조한 본 발명의 변종들의 열안정성을 비교하여 하기 표 IV 에 나타내었다. 50 mM의 CaCl₂를 함유하거나 함유하지 않는, 0.1 M 글리신 0.01 % 트윈 - 80 (Tween - 80) pH 10.0내의 15 ug/ml 의 정제 효소를 작은 시험관에 분취시켜 5 분동안은 10 ℃ 에서, 1 분동안 10 ℃ 에서 60 ℃ 까지, 20 분동안은 60 ℃ 로 인큐베이팅시켰다. 그다음 시험관들을 얼음위에 10 분동안 올려놓아 두었다. 시험관의 분취량을 pH 8.6, 25℃ 로 온도조절된 0.1 M 의 트리스 - HCl 완충액내에 용해된 1.2 mM의 합성 펩티드 기질 숙시닐 - L - Ala - L - Ala - L - Pro - L - Phe - p - 니트로아닐리드를 함유한 1 cm 큐벳에 가하여 효소 활성에 대하여 분석하였다. 초기 선형의 반응속도는 시간의 함수로서 410 nm 에서 반응생성물 p - 니트로아닐린이 흡수됨을 모니터링함으로써 분광광도 측정법식으로 진행하였다. 데이터는 가열전 활성 % 로 나타내었다. 표 IV 에 나타낸 결과는 거의 대부분 (26 개중 24 개) 의 변종들이, 50 mM 의 CaCl₂를 가한 테스트 조건에서 바실러스 렌터스 서브틸리신에 필적할만한 열안정성을 나타냄을 보여주고 있다. 50 mM 의 CaCl₂를 가하지 않은 테스트 조건에서는 거의 대부분 (26 개중 19 개) 의 변종들이 바실러스 렌터스 서브틸리신보다 횔씬 더 안정하였다.
더욱이, N76D/S99D, N76D/V104I, N76D/S99D/V104I, N76D/S103A/V104I,N76D/V104/I107V, N76D/V104Y/I107V 및 N76D/S101R/S103A/V104I 변종들은 50 mM 의 CaCl₂를 가하지 않은 테스트 조건에서 단일 치환 변종 N76D 보다 훨씬 더 안정하였다.
실시예 5
파지미드 (phagemide) 로부터 얻어진 일본쇄 DNA 주형을 사용한 올리고누클레오티드 - 디렉티드 돌연변이
A.비. 렌터스 변종들의 구성
돌연변이 제조방법은 상기 실시예 2와 실질적으로 동일하였다. 일본쇄 DNA 주형은 파지미드 방법으로 만들었다. 일본쇄 DNA 주형 생성용 파지미드 벡터를 구성시키기 위하여 우리는 먼저 pBCDAICAT 벡터를 구성하였다.
벡터 구성의 플로우 차트를 제 8 도에 개략적으로 도시하였다. 먼저 pC194 플라스미드 (Horinouchi, S. 및 Weisblum, b.,J. Bacteriol., 150 : 8 - 15, 1982) 에서 얻은 CAT 유전자를 암호화하는ClaI내지ClaI단편을 pUC19 (매사추세추, 버벌리 소재, NEW ENGLAND Biolabs.)의 다중연쇄 유전자 (polylinker) 영역의 AccI 부위로 클로닝시켜 플라스미드 pUCCHL 을 만들고 GC36DAI를 인코딩하는 DNA의 5' 말단으로부터의EcoRI - DraI0.6 Kb 단편을 pBSKS 플라스미드 (캐나다, 샌디에고 소재, Stratagene, INC.) 의EcoRI및EcoRV부위로 를로닝시켜 pBC2SK5 를 만들었다. 플라스미드 pBC2SK5 의 단일EcoRI부위를EcoRI절단시킨 다음, T4 DNA 로 촉진된 중합효소에 의해 채우고, 다시 리게이팅시켜EcoRI부위를 갖지않는 플라스미드 pBC2SK - 5R 을 만들었다. pBC2SK - 5R 로 클로닝시킨EcoRI-DraI단편을PstI - HindIII단편으로 분리시킨 다음 pUCCHL (pUC19 의 다중연쇄 유전자 부분) 의PstI - HindIII부위로 클로닝시켜 플라스미드 pUCCHL5R 을 얻었다. GG36DAI 유전자의 암호화 서열을EcoRI - BamHI단편으로 절단시키고 pUCCHL5R 의EcoRI - BamHI로 클로닝시켜 pUCCAT 를 얻었다. 거대한 pUCCAT 의EcoRI -HindIII단편을 BS2KS+ 의EcoRI및HindIII부위로 클로닝시켜 플라스미드 pBCDICAT 를 얻었다.
일본쇄 DNA 를 얻기 위하여, Russel, M., Kidd, S. 및 Kelley, M.R., GENE 45 : 333 - 338 (1986) 에서 기술한 바와 같은 실험계획서에 따라 pBCDICAT 를 파지를 함유한 이. 콜리 R4O8 (캐나다, 샌디에고 소재, Stratagene 에서 구입) 로 감염시켰다. 일본쇄 DNA 주형을 사용할 수 있게 되자, 상기 실시예 2 에서 기술한 바와 같은 표준 돌연변이 방법을 수행하였다. 혹종의 돌연변이체의 구성을 예증할 목적으로 하기에서 상세히 기술하였다.
비. 렌터스 (GG36) N76D/S103A/V104I/L217H 를 구성시키기 위하여, N76D/S103A/V104I를 암호화하는EcoRI - BamHIDNA 단편을 pUCCAT 의 구성 (제 8 도 참조) 안으로 클로닝하여 플라스미드 pBCDAICAT 를 얻었다. 상기 실험 방법에 따라 일본쇄 DNA 주형을 만든 후 하기 서열을 갖는 돌연변이 프라이머를 사용하여 L217H 를 만들었다.
상기한 바와 같이, 밑줄그은 잔기는 누클레오티드를 치환한 것을 의미하며 xClaI는 돌연변이 후 존재하던ClaI부위가 제거되었음을 의미한다. 돌연변이 방법은 실시예 2 에서 기술한 바와 같다. 돌연변이시킨 후 먼저ClaI부위에 대하여 플라스미드 DNA 를 스크리닝시켰는데 이러한ClaI부위를 결실한 클론들을 DNA 서열 분석하여 217번째 아미노산 잔기에서 L 이 H 로 치환하였음을 확증하였다.
B.BPN' 변종의 구성 빛 이들의 비. 서브틸리스내에서의 발현
비. 아밀로리퀘페이션스 (BPN' ) N76D/Q103A/Y1O4I/Y217L 의 구성체는 2 개의 연속 단계만 제외하고 유사한 방식으로 진행되었다. N76D 은 먼저 BPN' Y217L 에 도입시켜 BPN' N76D/Y217L 을 만들고 두번째 돌연변이시켜 BPN' N76D/Y217L 을 BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L 로 전환시켰다. 첫번째 돌연변이에 사용할 일본쇄 DNA 주형을 만들기 위하여, BPN' Y217L 서브틸리신 (Wells, J., 등이 PNAS, 84, 5167, 1087 에서 기술한 Y217L 플라스미드에서 유도한) 을 암호화하는EcoRI - BamHI단편을 사용하여 플라스미드 pUCCATFNA 를 구성시켰다. (제 9 도 참조). BPN' Y217L 을 함유하는 pUCCATFNA 플라스미드를 사용하여 pBCFNACAT 플라스미드를 구성하였다 (제 9 도). 상기한 바와 같이 일본쇄 DNA 주형을 만들었다. BPN' N76D/Y217L 을 만들기 위하여 하기 서열을 갖는 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 N76D를 변화시켰다.
서열)BPN' N76D/Y217L 을 함유하는 pBCFNACAT 플라스미드 (N76D 돌연변이후의 pUCCATFNA 플라스미드) 로부터 일본쇄 DNA 주형을 만들어 하기 서열을 갖는 다른 올리고누클레오티드로 돌연변이시켜 BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L을 얻었다.
열) 클로닝, 일본쇄 DNA 주형 제조, 돌연변이, 및 돌연변이체 스크리닝에 포함된 모든 단계는 상기에서 기술한 바와 같다.
BPN' 유전자 및 이의 변종은 플라스미드 DNA 를 RE 34,606 에서 기술한 바와 같은 바실러스 서브틸리스의 프로테아제 결핍된 균주에 직접적으로 합체시킴으로써 발현시켰다.
실시예 2 및 실시예 5 의 기술에 의하여 수많은 변종들을 만들었다. 반응속도 데이터 및 안정성 데이터는 이러한 변종들로 얻어졌다. 반응속도 데이터는 실시예 3 에서 기술한 방법으로 얻어졌고 하기 표 V 에 나타내었다. 안정성 데이터는 본원에서 상세히 기술한 바와 같이 얻었다. 그 결과들을 표 VI 에 나타내었다.
열안정성 분석 절차
정제 효소를 0.1 M 의 글리신 pH 10.0, 0.01 % 의 트윈 - 80 으로 평형을 칼럼으로부터 효소를 용리시킴으로써 상기 정제 효소를 상기 완충액으로 완충액 교환시켰다.
pH 10.0, 60 ℃ 로 온도조절된 0.1 M 의 글리신, 0.01 % 의 트윈 - 80 을 함유하는 시험관에 상기 완충액이 교환된 효소를 가하여 최종 효소 농도가 15 ug/ml가 되게 하였다.
시간을 달리하면서 분취량을 60 ℃ 인큐베이션에서 꺼내어 바로 pH 8.6, 25 ℃ 로 온도조절된 0.1 M 의 트리스 - HCl 완충액내에 용해된 1.2 mM 의 합성 펩티드 기질 숙시닐 - L - Ala - L - Ala - L - Pro - L - Phe - p - 니트로아닐리드를 함유한 1 cm 큐벳에 가하여 효소 활성에 대하여 분석하였다. 초기 선형의 반응 속도는 시간의 함수로서 410 nm 에서 반응생성물 p - 니트로아닐린이 흡수됨을 모니터링함으로써 분광광도 측정법식으로 진행하였다.
반감기, 즉 50 % 의 효소 불활성에 소요되는 시간을 60 ℃ 에서 인큐베이션시킨 시간의 함수로서 반응속도의 일차 플롯으로부터 측정하였다.
데이터는 하기 표 VI 에 동일 조건하에서의 바실러스 렌터스 서브틸리신 (GG36) 에 대하여 측정한 반감기 % 로서 나타내었다.
*표시된 돌연변이체들은 실시예 5 의 방법으로 만들고, 다른 모든 돌연변이체들은 실시예 2 의 방법으로 제조하였음.
비. 아밀로리퀘페이션스 서브틸리신(BPN' ) 100
BPN' - N76D/Y217L*420˚
*표시된 돌연변이체들은 실시예 5 의 방법으로 만들고, 다른 모든 돌연변이체들은 실시예 2 의 방법으로 제조하였음.
실시예 6
세정 성능 테스트
직물 조각 (뉴저지 07030, 미들섹스 소재, Testfabrics, INC.) EMPA 116 (면 위에 혈액/우유/카본블랙) 에서 오염이 제거됨을 측정함으로써 전 실시예들에서 기술한 변종들의 세정 성능을 평가하였다.
6 개의 EMPA 116 을 3 ×4-l/2 인치 크기로 잘라서 모서리에 분홍색을 들여 1000 ml 의 물, 15 gpg 의 경도 (Ca++:Mg++::3:1::w:w), 7 g의 세제, 및 적당량의 효소를 함유하는 모델 7243S Terg - O - Tometer (뉴저지, 호보컨소재, United States Testing Co., INC.) 의 각각의 포트에 놓았다. 세제 베이스는 독일 연방공화국, 크레펠트, 데 - 47759, 포스트파흐 13 07 62, 아들러스트라쎄 42 소재,wfk -Testgewebe GmbH 사 제품이다 ;
이러한 베이스 세제에 다음을 가하였다 ;
소듐 퍼보레이트 모노하이드레이트는 뉴저지 07660, 리지필드 - 파크 소재의 Degussa Corporation 제품이고, Sokalan CP5 는 뉴저지 07054, 파지퍼니 소재의 BASF Corporation 제품이다. Mykon ATC Green (TEAD, 테트라아세틸에틸 렌디아민)은 영국, 클라이드 씨에치 8 9 에치이, 홀리웰, 모스틴 소재의 Warwick International, Limited 제품이다. Tinopal AMX GX 는 노스캐놀라이나 27419, 그린스보로 소재의 Ciba - Ceigy 사 제품이다.
6개의 EMPA 116 조각을 세제내에서 효소로 60 ℃ 에서 30 분동안 세척하고 연속하여 각각 1000 ml 의 물에서 5 분동안 2 회 헹구었다. 효소를 표준 곡선을 그릴 수 있도록 최종농도가 0.05 - 1 ppm 되게 가하고 일상적인 분석을 위하여는 0.25 ppm 이 되게 가하였다. 상기 조각들을 건조시킨 다음 압축시키고 미놀타 코로마 미터, 모델 CR - 2OO (뉴저지 07446, 램지 소재의 Minolta Corporation)의 L*a*b*스케일상의 L 값을 이용하여 조각들로부터의 반사율을 측정하였다. 성능은 비. 렌터스 (GG36) 프로테아제의 성능 % 로 기록하고 비. 렌터스 (GG36) 프로테아제의 양을, 이와 동일한 오염 제거 성능의 100 배를 제공하는데 필요한 변종 프로테아제로 나누어 계산한다. 그 데이터를 하기 표 VII 에 나타내었다.
실시예 7
액체 세제 조제물내에서의 프로테아제 안정성
바실러스 렌터스 서브틸리신 및 본 원에서 개략적으로 나타낸 절차에 따른 이들의 변종 효소 N76D/S103A/V104I 에 대하여 액체 세제 조제물내에서의 불활성화에 대한 프로테아제 활성을 비교하였다. 연구를 위하여 사용한 세제 조제물은 미합중국 Procter & Gamble Company 사 제품인 Tide Ultra 액체 세탁 기용의 병에 넣어 시판되는 세제이다. 세제 조제물의 열처리는 이미 존재하는 프로테아제를 불활성시키는데 필수적이다. 열처리는 세제를 96 ℃ 에서 4 시간 30 분동안 인큐베이팅시켜 수행하였다. 비. 렌터스 서브틸리신 및 N76D/S103A/V104I 변종의 농축 제조물을 상기 열처리시킨 Tide Ultra 에 실온에서 효소 리터당 20 그램 범위로 가하여 최종농도가 세제 조제물내 효소 리터당 0.3 그램이 되도록 하였다. 프로테아제를 가한 열처리된 세제를 50 ℃ 로 온도 조절시킨 수조에서 인큐베이팅시켰다. 인큐베이션 시험관에서 분취량을 0, 24, 46, 76, 및 112 시간의 간격을 두고 빼내어 pH 8.6, 25 ℃ 로 온도조절된 0.1410 nm 에서 반응생성물 p - 니트로아닐린이 흡수됨을 모니터링함으로써 분광광도 측정법식으로 진행하였다. 제 10 도에 나타낸 바와 같이, N76D/S103A/V104I 변종들은 불활성면에서 원래의 비. 렌터스 효소보다 훨씬 더 안정함을 나타내는 것으로 관찰되었다. 구체화된 테스트 조건하에서 두개의 효소에 대한 Tide Ultra 세제 조제물내에서 불활성에 대하여 추산된 반감기는 비. 렌터스 서브틸리신에 대해서는 45 시간이고 N76D/S103A/V104I 변종에 대하여 125 시간이었다.
본원을 통틀어 참고번호는 통상적인 1 문자 및 3 문자 코드 방식으로 다양한 아미노산을 나타내었다. 이러한 코드는 Dale, J. W. (1989), Molecular Genetic of Bacteria, John Wiley & Sons, Ltd., Appendix B 에 나타낸 것과 동일하다.
본발명의 바람직한 구체예들이 상기에서 상세하게 기술되었지만, 본원 발명과 관련된 업계의 전문가들이 본원 발명을 전체적으로 이해한 후, 동봉한 청구 범위에 의해 한정되는 본발명의 영역에서 출발하지 않고도 다양한 변경 및 등가의 수정예들을 만들 수 있을 것임은 명백하다 할 것이다.
서열 목록
(1) 일반적인 정보
(i) 출원인 ; 그레이카, 토마스 피
보트, 리차드 알
윌슨, 로리 제이
(ii) 발명의 명칭 ; 서브틸리신 변종
(iii) 서열 개수 ; 15
(iv) 연락할 주소 ;
(A) 수신인 ; 제넨코 인터내셔널, 아이엔씨
(B) 가 (街) ; 180 킴볼 웨이
(C) 시 (市) ; 에스오. 샌프란시스코
(D) 주 (州) ; 캘리포니아
(E) 국가 ; 미합중국
(F) 우편번호 ; 94080
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 형태 ; 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 ; IBM PC 호환기종
(C) 작동 시스템 ; PC - DOS/MS - DOS
(D) 소프트웨어 ; Patentln Release #1.0, 버젼 #1.25
(vi) 현재 출원 데이터
(A) 출원 번호 ;
(B) 출원일 ;
(C) 분류 ;
(Viii) 대리인/대행인 정보
(A) 성명 ; 호온, 마가렛 에이.
(B) 등록 번호 ; 33,401
(C) 참조/등록 번호 ; GC235 - 2
(ix) 통신 정보
(A) 전화 ; (415) 742 - 7536
(B) 팩스 ; (415) 742 - 7217
(2) 1 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 19개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 1 번 서열 ;
(2) 2번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 18 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 포톨로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 2 번 서열 ;
(2) 3 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 39 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 3 번 서열 ;
(2) 4 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 33 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 4 번 서열 ;
(2) 5 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 22 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 5 번 서열 ;
(2) 6 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 1497 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 6 번 서열 ;
(2) 7 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 275 개의 아미노산
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; 단백질
(xi) 서열 기술 ; 7 번 서열 ;
(2) 8 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 275 개의 아미노산
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; 단백질
(xi) 서열 기술 ; 8 번 서열 ;
(2) 9 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 275 개의 아미노산
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; 단백질
(xi) 서열 기술 ; 9 번 서열 ;
(2) 10 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 269 개의 아미노산
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; 단백질
(xi) 서열 기술 ; 10 번 서열 ;
(2) 11 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 1140 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 11 번 서열 ;
(2) 12 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 1140 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 12 번 서열 ;
(2) 13 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 30 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 13 번 서열 ;
(2) 14 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 31 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 14 번 서열 ;
(2) 15 번 서열에 대한 정보
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 ; 33 개의 염기쌍
(B) 형태 ; 핵산
(C) 사슬성 ; 일본쇄
(D) 토폴로지 ; 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA (게놈)
(xi) 서열 기술 ; 15 번 서열 ;
Claims (10)
- 76/103/104/204, 76/217 및 76/103/104/156/166 위치와 등가의 위치에서 복수개의 아미노산 잔기들이 다른 아미노산으로 치환된 치환물로 구성되는 전구체 카보닐 하 이드롤라제로부터 유도된, 천연에서는 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는 서브틸리신 변종.
- 제 1 항 에 있어서, 치환물의 조합이 76/99, 76/101, 76/103, 76/104,76/103/104/126/265 및 76/103/104/222 와 등가의 위치에서 만들어지는 서브틸리신 변종.
- 제 2 항에 있어서, 76/99, 76/104, 76/99/104, 76/104/107, 76/101/103/104,76/99/101/103/104 및 76/101/104 로 이루어지는 그룹에서 선택되는 서브틸리신 변종.
- 제 2 항에 있어서, 서브틸리신 변종들이 N76D/S99D ; N76D/S101R ;N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 및 N76D/S103A/V104I/M222A 로 구성되는 서브틸리신 변종.
- 제 4 항에 있어서, 서브틸리신 변종들이 N76D/S99D, N76D/V104I,구성되는 서브틸리신 변종.
- 제 2 항에 있어서, 바실러스 서브틸리신으로부터 유도된 서브틸리신 변종.
- 제 6 항에 있어서, 바실러스 렌터스(Bacillus lentus)으로부터 유도된 서브틸리신 변종.
- 제 1 항의 서브틸리신 변종을 암호화하는 DNA.
- 제 8 항의 DNA 를 함유하는 발현 벡터.
- 제 9 항의 발현 벡터로 형질전환된 그람 양성 세포.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13724093A | 1993-10-14 | 1993-10-14 | |
| US08/137240 | 1993-10-14 | ||
| PCT/US1994/011562 WO1995010615A1 (en) | 1993-10-14 | 1994-10-13 | Subtilisin variants |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100344976B1 true KR100344976B1 (ko) | 2002-11-23 |
Family
ID=22476438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019960701923A KR100344976B1 (ko) | 1993-10-14 | 1994-10-13 | 서브틸리신변종 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6586221B2 (ko) |
| EP (2) | EP0723590B1 (ko) |
| JP (1) | JP4086207B2 (ko) |
| KR (1) | KR100344976B1 (ko) |
| CN (1) | CN1056649C (ko) |
| AT (1) | ATE284962T1 (ko) |
| AU (1) | AU700373B2 (ko) |
| BR (1) | BR9407825A (ko) |
| CA (1) | CA2173973C (ko) |
| CZ (1) | CZ289323B6 (ko) |
| DE (1) | DE69434187T2 (ko) |
| DK (1) | DK0723590T3 (ko) |
| ES (1) | ES2235164T3 (ko) |
| FI (1) | FI119697B (ko) |
| HK (1) | HK1000649A1 (ko) |
| MA (1) | MA23346A1 (ko) |
| NO (1) | NO325568B1 (ko) |
| NZ (1) | NZ274998A (ko) |
| PL (1) | PL178478B1 (ko) |
| PT (1) | PT723590E (ko) |
| RU (1) | RU2136756C1 (ko) |
| TW (1) | TW448230B (ko) |
| WO (1) | WO1995010615A1 (ko) |
| ZA (1) | ZA948086B (ko) |
Families Citing this family (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1253695A (en) * | 1993-10-14 | 1995-05-04 | Procter & Gamble Company, The | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| MA23346A1 (fr) * | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| BR9407834A (pt) * | 1993-10-14 | 1997-05-13 | Procter & Gamble | Composições de limpeza contendo protease |
| US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| BR9608126A (pt) * | 1995-05-05 | 1999-02-09 | Unilever Nv | Composição detergente |
| DE19530816A1 (de) * | 1995-08-23 | 1997-02-27 | Cognis Bio Umwelt | Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten |
| DE19535082A1 (de) | 1995-09-21 | 1997-03-27 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| US5858948A (en) * | 1996-05-03 | 1999-01-12 | Procter & Gamble Company | Liquid laundry detergent compositions comprising cotton soil release polymers and protease enzymes |
| DE19636035A1 (de) | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| US6300116B1 (en) * | 1996-11-04 | 2001-10-09 | Novozymes A/S | Modified protease having improved autoproteolytic stability |
| DE19703364A1 (de) | 1997-01-30 | 1998-08-06 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| JP4031055B2 (ja) * | 1997-06-04 | 2008-01-09 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 強力な洗浄および／またはスポットおよびフィルム低減のためのプロテアーゼ酵素およびそれを混合した組成物 |
| BR9810083A (pt) * | 1997-06-04 | 2000-08-08 | Procter & Gamble | Partìculas de enzimas detergentes tendo uma camada de barreira de carboxilato solúvel em àgua e composições incluindo as mesmas |
| EP0988367A1 (en) * | 1997-06-04 | 2000-03-29 | The Procter & Gamble Company | Mixed protease enzyme systems for cleaning protein based soils and compositions incorporating same |
| US6284246B1 (en) | 1997-07-30 | 2001-09-04 | The Procter & Gamble Co. | Modified polypeptides with high activity and reduced allergenicity |
| ES2367505T3 (es) * | 1997-10-23 | 2011-11-04 | Danisco Us Inc. | Variantes de proteasa con sustituciones múltiples con carga neta alterada para usar en detergentes. |
| AU2002325461B2 (en) * | 1997-10-23 | 2006-05-11 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants with altered net charge for use in detergents |
| AR015977A1 (es) | 1997-10-23 | 2001-05-30 | Genencor Int | Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes |
| AU2207099A (en) * | 1997-12-24 | 1999-07-19 | Genencor International, Inc. | An improved method of assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergentcomposition |
| US6528255B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-03-04 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6465186B1 (en) | 1997-12-30 | 2002-10-15 | Genecor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| GB9727470D0 (en) | 1997-12-30 | 1998-02-25 | Genencor Int Bv | Proteases from gram positive organisms |
| US6599731B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-07-29 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6495136B1 (en) | 1998-03-26 | 2002-12-17 | The Procter & Gamble Company | Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties |
| US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
| JP2002507426A (ja) | 1998-03-26 | 2002-03-12 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | アミノ酸置換を有するセリンプロテアーゼ変異体 |
| DE19857687A1 (de) | 1998-12-15 | 2000-06-21 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Waschmittel |
| KR100660818B1 (ko) * | 1998-12-18 | 2006-12-26 | 노보자임스 에이/에스 | 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소 |
| DK1141335T3 (da) | 1998-12-21 | 2009-11-09 | Genencor Int | Kemisk modificerede enzymer med multipelt ladede varianter |
| CZ2002171A3 (cs) | 1999-07-22 | 2002-06-12 | The Procter & Gamble Company | Proteinázový konjugát, čistící prostředek a prostředek osobní péče |
| US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
| AU5928100A (en) | 1999-07-22 | 2001-02-13 | Procter & Gamble Company, The | Subtilisin protease variants having amino acid deletions and substitutions in defined epitope regions |
| MXPA02000840A (es) | 1999-07-22 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Variantes de proteasa de subtilisina que tienen substituciones de aminoacidos en regiones de epitopes definidas. |
| MXPA02002682A (es) * | 1999-09-09 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Una composicion de detergente que contiene una proteasa. |
| JP2003516751A (ja) * | 1999-12-15 | 2003-05-20 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示すズブチラーゼ変異体 |
| WO2001044452A1 (en) * | 1999-12-15 | 2001-06-21 | Novozymes A/S | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
| CN100489094C (zh) * | 2001-03-23 | 2009-05-20 | 金克克国际有限公司 | 具有改变的免疫原性反应的蛋白质及制备和使用该蛋白质的方法 |
| DK200101090A (da) | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
| US7153820B2 (en) | 2001-08-13 | 2006-12-26 | Ecolab Inc. | Solid detergent composition and method for solidifying a detergent composition |
| US20030157645A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-08-21 | Direvo Bio Tech Ag. | Subtilisin variants with improved characteristics |
| BR0215383A (pt) * | 2001-12-31 | 2006-11-28 | Genencor Int | proteases que produzem resposta imunogênica alterada e métodos de fabricação e uso das mesmas |
| WO2003062380A2 (en) * | 2002-01-16 | 2003-07-31 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| ES2336092T3 (es) * | 2002-01-16 | 2010-04-08 | Genencor International, Inc. | Variantes de proteasas con multiples sustituciones. |
| CN1784490A (zh) * | 2003-05-07 | 2006-06-07 | 诺和酶股份有限公司 | 变体枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌酶) |
| US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| EP1814573B1 (en) | 2004-10-29 | 2016-03-09 | ratiopharm GmbH | Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf) |
| EP2059591B1 (en) * | 2006-07-18 | 2012-09-05 | Danisco US Inc. | Dishwashing composition that contains a protease variant |
| MX2009003637A (es) * | 2006-10-16 | 2009-04-22 | Danisco Us Inc Genencor Div | Detergentes sin fosfato para lavar platos. |
| US8093200B2 (en) | 2007-02-15 | 2012-01-10 | Ecolab Usa Inc. | Fast dissolving solid detergent |
| US8894898B2 (en) | 2007-10-18 | 2014-11-25 | Ecolab Usa Inc. | Pressed, waxy, solid cleaning compositions and methods of making them |
| JP2011524166A (ja) * | 2008-06-06 | 2011-09-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 変異体微生物プロテアーゼを含む組成物及び方法 |
| CN106399280B (zh) * | 2008-11-11 | 2020-12-22 | 丹尼斯科美国公司 | 包含一种或多种可组合的突变的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶 |
| RU2011123745A (ru) * | 2008-11-11 | 2012-12-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Композиции и способы, включающие вариант субтилизина |
| WO2010126156A2 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Kao Corporation | Alkaline protease variants |
| DE102009029513A1 (de) * | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Proteasen |
| PL2566960T3 (pl) * | 2010-05-06 | 2017-08-31 | The Procter And Gamble Company | Produkty konsumenckie z odmianami proteaz |
| DE102010028951A1 (de) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Lipase |
| DE102010063458A1 (de) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Amylase |
| DE102010063457A1 (de) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase |
| TR201901382T4 (tr) * | 2011-05-05 | 2019-02-21 | Danisco Inc | Serin proteaz varyantlarını içeren bileşimler ve yöntemler. |
| CA2831536A1 (en) | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Ecolab Usa Inc. | Non-phosphate detergents and non-phosphoric acids in an alternating alkali/acid system for warewashing |
| EP2766462B1 (en) | 2011-05-20 | 2019-08-28 | Ecolab USA Inc. | Acid formulations for use in a system for warewashing |
| CN103998590B (zh) | 2011-12-13 | 2019-02-01 | 艺康美国股份有限公司 | 浓的器皿洗涤组合物和方法 |
| DE102012201522A1 (de) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Basf Se | Lagerstabiles flüssiges Geschirrspülmittel enthaltend Protease und Amylase |
| EP2628785B1 (en) * | 2012-02-17 | 2016-05-18 | Henkel AG & Co. KGaA | Detergent compositions comprising subtilase variants |
| DE102012215107A1 (de) | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Basf Se | Festes Geschirrspülmittel mit verbesserter Proteaseleistung |
| US9745543B2 (en) | 2012-09-10 | 2017-08-29 | Ecolab Usa Inc. | Stable liquid manual dishwashing compositions containing enzymes |
| CN103013960A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-03 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌 |
| JP6317449B2 (ja) | 2013-09-09 | 2018-04-25 | エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド | 新規なキレート化剤の組合せによる相乗的汚れ除去 |
| WO2015032447A1 (en) | 2013-09-09 | 2015-03-12 | Ecolab Usa Inc. | Synergistic stain removal through novel chelator combination |
| JP6254693B2 (ja) | 2013-10-24 | 2017-12-27 | エコラボ ユーエスエー インコーポレイティド | 表面から汚れを除去する組成物及び方法 |
| WO2016001450A2 (en) | 2014-07-04 | 2016-01-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| CN107075493B (zh) * | 2014-12-04 | 2020-09-01 | 诺维信公司 | 枯草杆菌酶变体以及编码它们的多核苷酸 |
| EP3872174B1 (en) * | 2015-05-13 | 2023-03-01 | Danisco US Inc. | Aprl-clade protease variants and uses thereof |
| US10731111B2 (en) | 2015-11-25 | 2020-08-04 | Conopco, Inc. | Liquid laundry detergent composition |
| JP2019523645A (ja) * | 2016-05-31 | 2019-08-29 | ダニスコ・ユーエス・インク | プロテアーゼ変異体およびその使用 |
| WO2018045200A2 (en) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | The Regent Of The University Ofcalifornia | Engineered subtiligase variants for versatile, site-specific labeling of proteins |
| CN111373039A (zh) * | 2017-11-29 | 2020-07-03 | 丹尼斯科美国公司 | 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体 |
| US11891588B2 (en) | 2019-07-31 | 2024-02-06 | Ecolab Usa Inc. | Personal protective equipment free delimer compositions o |
| US11492571B2 (en) * | 2019-10-24 | 2022-11-08 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition comprising a protease |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
| CN114836408B (zh) * | 2022-05-28 | 2023-09-19 | 湖北大学 | 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0251446A2 (en) * | 1986-04-30 | 1988-01-07 | Genencor International, Inc. | Non-human Carbonyl hydrolase mutants, DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| EP0398539A1 (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-22 | Amgen Inc. | Multiply mutated subtilisins |
| EP0405901A1 (en) * | 1989-06-26 | 1991-01-02 | Unilever Plc | Enzymatic detergent compositions |
Family Cites Families (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| US5801038A (en) * | 1984-05-29 | 1998-09-01 | Genencor International Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
| US5155033A (en) | 1989-01-06 | 1992-10-13 | Genencor, Inc. | Subtilisins modified at position 225 resulting in a shift in catalytic activity |
| US5204015A (en) | 1984-05-29 | 1993-04-20 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
| US5182204A (en) | 1984-05-29 | 1993-01-26 | Genencor International, Inc. | Non-human carbonyl hydrolase mutants, vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| US5185258A (en) | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| US5013657A (en) | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
| US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
| EP0916732B1 (en) * | 1987-04-06 | 2007-08-22 | Novozymes A/S | The engineering of electronic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins |
| US4914031A (en) | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
| DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| AU3063389A (en) | 1988-01-08 | 1989-08-01 | Dpz Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft M.B.H. | Hiv-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions |
| CN1056187C (zh) | 1988-02-11 | 2000-09-06 | 金克克国际有限公司 | 新的蛋白水解酶及其在洗涤剂中的应用 |
| US5324653A (en) | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
| DK316989D0 (da) | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| EP0405902A1 (en) * | 1989-06-26 | 1991-01-02 | Unilever Plc | Enymatic detergent compositions |
| JP2567282B2 (ja) * | 1989-10-02 | 1996-12-25 | 日本ゼオン株式会社 | ポジ型レジスト組成物 |
| DK271490D0 (da) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
| EP0563169B2 (en) | 1990-12-21 | 2006-04-12 | Novozymes A/S | ENZYME MUTANTS HAVING A LOW DEGREE OF VARIATION OF THE MOLECULAR CHARGE OVER A pH RANGE |
| US5340735A (en) | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| US5316935A (en) * | 1992-04-06 | 1994-05-31 | California Institute Of Technology | Subtilisin variants suitable for hydrolysis and synthesis in organic media |
| AU682314B2 (en) | 1992-07-17 | 1997-10-02 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine proteases |
| DK39093D0 (da) | 1993-04-01 | 1993-04-01 | Novo Nordisk As | Enzym |
| BR9407834A (pt) * | 1993-10-14 | 1997-05-13 | Procter & Gamble | Composições de limpeza contendo protease |
| MA23346A1 (fr) * | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| AU1253695A (en) * | 1993-10-14 | 1995-05-04 | Procter & Gamble Company, The | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| AR015977A1 (es) * | 1997-10-23 | 2001-05-30 | Genencor Int | Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes |
| US6835550B1 (en) * | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
| DK1141335T3 (da) * | 1998-12-21 | 2009-11-09 | Genencor Int | Kemisk modificerede enzymer med multipelt ladede varianter |
| CN100489094C (zh) * | 2001-03-23 | 2009-05-20 | 金克克国际有限公司 | 具有改变的免疫原性反应的蛋白质及制备和使用该蛋白质的方法 |
-
1994
- 1994-10-11 MA MA23668A patent/MA23346A1/fr unknown
- 1994-10-13 RU RU96109372A patent/RU2136756C1/ru active
- 1994-10-13 PL PL94313942A patent/PL178478B1/pl unknown
- 1994-10-13 JP JP51201395A patent/JP4086207B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 DK DK94931345T patent/DK0723590T3/da active
- 1994-10-13 EP EP94931345A patent/EP0723590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 EP EP04024046A patent/EP1526182A3/en not_active Withdrawn
- 1994-10-13 KR KR1019960701923A patent/KR100344976B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 AU AU80157/94A patent/AU700373B2/en not_active Expired
- 1994-10-13 ES ES94931345T patent/ES2235164T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 CZ CZ19961065A patent/CZ289323B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 CN CN94193785A patent/CN1056649C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 US US08/322,678 patent/US6586221B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 NZ NZ274998A patent/NZ274998A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 CA CA002173973A patent/CA2173973C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 AT AT94931345T patent/ATE284962T1/de active
- 1994-10-13 WO PCT/US1994/011562 patent/WO1995010615A1/en active IP Right Grant
- 1994-10-13 DE DE69434187T patent/DE69434187T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 PT PT94931345T patent/PT723590E/pt unknown
- 1994-10-13 BR BR9407825A patent/BR9407825A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-10-14 ZA ZA948086A patent/ZA948086B/xx unknown
-
1995
- 1995-01-18 TW TW084100420A patent/TW448230B/zh not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-12 FI FI961631A patent/FI119697B/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-04-12 NO NO19961468A patent/NO325568B1/no not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-11-11 HK HK97102150A patent/HK1000649A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-18 US US10/323,324 patent/US7250281B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0251446A2 (en) * | 1986-04-30 | 1988-01-07 | Genencor International, Inc. | Non-human Carbonyl hydrolase mutants, DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| EP0398539A1 (en) * | 1989-05-17 | 1990-11-22 | Amgen Inc. | Multiply mutated subtilisins |
| EP0405901A1 (en) * | 1989-06-26 | 1991-01-02 | Unilever Plc | Enzymatic detergent compositions |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100344976B1 (ko) | 서브틸리신변종 | |
| JP3776244B2 (ja) | プロテアーゼ含有クリーニング組成物 | |
| JP5612026B2 (ja) | 洗剤で使用される改変された正味の特性を有する複数置換プロテアーゼ変異体 | |
| CN101899428B (zh) | 枯草杆菌酶变体 | |
| EP0775749B2 (en) | Subtilisin mutants | |
| US20150232829A1 (en) | Multiply-Substituted Protease Variants | |
| MXPA00003801A (en) | Multiply-substituted protease variants | |
| MXPA00003807A (en) | Multiply-substituted protease variants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130624 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140630 Year of fee payment: 13 |
|
| EXPY | Expiration of term |