FI119697B - Subtilisin variantteja - Google Patents
Subtilisin variantteja Download PDFInfo
- Publication number
- FI119697B FI119697B FI961631A FI961631A FI119697B FI 119697 B FI119697 B FI 119697B FI 961631 A FI961631 A FI 961631A FI 961631 A FI961631 A FI 961631A FI 119697 B FI119697 B FI 119697B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- subtilisin
- ala
- ser
- gly
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 45
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 37
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 102200025035 rs786203989 Human genes 0.000 claims description 267
- 102220528606 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5_S99D_mutation Human genes 0.000 claims description 42
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 25
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 claims 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 87
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 abstract description 80
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 abstract description 66
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 abstract description 29
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 32
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 31
- 102220350531 c.80A>G Human genes 0.000 description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 17
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 17
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 15
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 15
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 15
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 6
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 5
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 4
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MGSVBZIBCCKGCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- ULNXMMYXQKGNPG-LPEHRKFASA-N Met-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N ULNXMMYXQKGNPG-LPEHRKFASA-N 0.000 description 3
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 3
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N Thr-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAJFZCICSVBOJK-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 3
- 108010064997 VPY tripeptide Proteins 0.000 description 3
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPGCVZRRBYOGCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004453 electron probe microanalysis Methods 0.000 description 3
- UFZOPKFMKMAWLU-UHFFFAOYSA-N ethoxy(methyl)phosphinic acid Chemical compound CCOP(C)(O)=O UFZOPKFMKMAWLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-WJNSRDFLSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N Ala-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- AOAKQKVICDWCLB-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N AOAKQKVICDWCLB-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N Asn-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O GNKVBRYFXYWXAB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N Asn-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RAQMSGVCGSJKCL-FOHZUACHSA-N 0.000 description 2
- KEUNWIXNKVWCFL-FXQIFTODSA-N Asn-Met-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KEUNWIXNKVWCFL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical group N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N Gly-Thr-His Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 RHRLHXQWHCNJKR-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 2
- FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N Gly-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)CN)C(=O)O LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 2
- GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N Gly-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)CN)O GBYYQVBXFVDJPJ-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N His-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 2
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- RIHIGSWBLHSGLV-CQDKDKBSSA-N Leu-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RIHIGSWBLHSGLV-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MCIXMYKSPQUMJG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- POQFNPILEQEODH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Ala Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O POQFNPILEQEODH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- UGGWCAFQPKANMW-FXQIFTODSA-N Ser-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UGGWCAFQPKANMW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- ZKBKUWQVDWWSRI-BZSNNMDCSA-N Ser-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKBKUWQVDWWSRI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N Ser-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- BGRWYDHXPHLNKA-UHFFFAOYSA-N Tetraacetylethylenediamine Chemical compound CC(=O)N(C(C)=O)CCN(C(C)=O)C(C)=O BGRWYDHXPHLNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710097834 Thiol protease Proteins 0.000 description 2
- LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N Thr-Asn-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C([O-])=O)=CNC2=C1 OHGNSVACHBZKSS-KWQFWETISA-N 0.000 description 2
- HHPSUFUXXBOFQY-AQZXSJQPSA-N Trp-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O HHPSUFUXXBOFQY-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 2
- JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O JKUZFODWJGEQAP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- PLVVHGFEMSDRET-IHPCNDPISA-N Tyr-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N PLVVHGFEMSDRET-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 108010033719 glycyl-histidyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 description 2
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229940066734 peptide hydrolases Drugs 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- 125000000134 2-(methylsulfanyl)ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])SC([H])([H])C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- PPINMSZPTPRQQB-NHCYSSNCSA-N 2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PPINMSZPTPRQQB-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- YGUMVDWOQQJBGA-VAWYXSNFSA-N 5-[(4-anilino-6-morpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-2-[(e)-2-[4-[(4-anilino-6-morpholin-4-yl-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-2-sulfophenyl]ethenyl]benzenesulfonic acid Chemical compound C=1C=C(\C=C\C=2C(=CC(NC=3N=C(N=C(NC=4C=CC=CC=4)N=3)N3CCOCC3)=CC=2)S(O)(=O)=O)C(S(=O)(=O)O)=CC=1NC(N=C(N=1)N2CCOCC2)=NC=1NC1=CC=CC=C1 YGUMVDWOQQJBGA-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- XSVSPKKXQGNHMD-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-3-methyl-1,2-thiazole Chemical compound CC=1C=C(Br)SN=1 XSVSPKKXQGNHMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- LBJYAILUMSUTAM-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O LBJYAILUMSUTAM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N Ala-Gly-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VGPWRRFOPXVGOH-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N Ala-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N OBVSBEYOMDWLRJ-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 1
- AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N Ala-Tyr-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)CC1=CC=C(O)C=C1 AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N Ala-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XSLGWYYNOSUMRM-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 101710099461 Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- DPXDVGDLWJYZBH-GUBZILKMSA-N Arg-Asn-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O DPXDVGDLWJYZBH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NUBPTCMEOCKWDO-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NUBPTCMEOCKWDO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N Arg-Asp-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XVLLUZMFSAYKJV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VDCIPFYVCICPEC-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VDCIPFYVCICPEC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ACRYGQFHAQHDSF-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ACRYGQFHAQHDSF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N GWNMUVANAWDZTI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OWUCNXMFJRFOFI-BQBZGAKWSA-N Asn-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OWUCNXMFJRFOFI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NTWOPSIUJBMNRI-KKUMJFAQSA-N Asn-Lys-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NTWOPSIUJBMNRI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N Asn-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UXHYOWXTJLBEPG-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O KWBQPGIYEZKDEG-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- UQBGYPFHWFZMCD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UQBGYPFHWFZMCD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JUWZKMBALYLZCK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N Asp-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O YIDFBWRHIYOYAA-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- IOUQWHIEQYQVFD-JYJNAYRXSA-N Glu-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O IOUQWHIEQYQVFD-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LLEUXCDZPQOJMY-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N Gly-Ala-Tyr Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CIMULJZTTOBOPN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XCLCVBYNGXEVDU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BEQGFMIBZFNROK-JGVFFNPUSA-N Gly-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O BEQGFMIBZFNROK-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N Gly-His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 ADZGCWWDPFDHCY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- RVGMVLVBDRQVKB-UWVGGRQHSA-N Gly-Met-His Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN RVGMVLVBDRQVKB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FGPLUIQCSKGLTI-WDSKDSINSA-N Gly-Ser-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FGPLUIQCSKGLTI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN BAYQNCWLXIDLHX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N Gly-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CN KSOBNUBCYHGUKH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- GNBHSMFBUNEWCJ-DCAQKATOSA-N His-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GNBHSMFBUNEWCJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OWYIDJCNRWRSJY-QTKMDUPCSA-N His-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OWYIDJCNRWRSJY-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- UAVQIQOOBXFKRC-BYULHYEWSA-N Ile-Asn-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UAVQIQOOBXFKRC-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- SVBAHOMTJRFSIC-SXTJYALSSA-N Ile-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N SVBAHOMTJRFSIC-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102100026038 Lens fiber membrane intrinsic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710115990 Lens fiber membrane intrinsic protein Proteins 0.000 description 1
- DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N Leu-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N Leu-Asp-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QCSFMCFHVGTLFF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQWSMEOYXJTFRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FMEICTQWUKNAGC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O LAPSXOAUPNOINL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N Leu-Gly-Val Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O POZULHZYLPGXMR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N Leu-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KUIDCYNIEJBZBU-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N Leu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OVZLLFONXILPDZ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MPGHETGWWWUHPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N Lys-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O NCTDKZKNBDZDOL-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IEIHKHYMBIYQTH-YESZJQIVSA-N Lys-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O IEIHKHYMBIYQTH-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N Met-Asp-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 108030000089 Metallocarboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000006166 Metallocarboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220503816 NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 5_S99P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000749985 Nites Species 0.000 description 1
- GCFNFKNPCMBHNT-IRXDYDNUSA-N Phe-Tyr-Gly Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)NCC(=O)O)N GCFNFKNPCMBHNT-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- VIIRRNQMMIHYHQ-XHSDSOJGSA-N Phe-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N VIIRRNQMMIHYHQ-XHSDSOJGSA-N 0.000 description 1
- AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N Pro-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AMBLXEMWFARNNQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DXTOOBDIIAJZBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N Pro-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N Pro-His-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BRJGUPWVFXKBQI-XUXIUFHCSA-N Pro-Leu-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BRJGUPWVFXKBQI-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N Pro-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BGWKULMLUIUPKY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WVXQQUWOKUZIEG-VEVYYDQMSA-N Pro-Thr-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WVXQQUWOKUZIEG-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101710180958 Putative aminoacrylate hydrolase RutD Proteins 0.000 description 1
- 101100373202 Rattus norvegicus Cx3cl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000630486 Robertus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N Ser-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JPIDMRXXNMIVKY-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N Ser-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O HQTKVSCNCDLXSX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OOKCGAYXSNJBGQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SRKMDKACHDVPMD-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N SRKMDKACHDVPMD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ASGYVPAVFNDZMA-GUBZILKMSA-N Ser-Met-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CO)N ASGYVPAVFNDZMA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MQUZANJDFOQOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N Ser-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XJDMUQCLVSCRSJ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- QNBVFKZSSRYNFX-CUJWVEQBSA-N Ser-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O QNBVFKZSSRYNFX-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N Ser-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ZWSZBWAFDZRBNM-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004115 Sodium Silicate Substances 0.000 description 1
- GFDUZZACIWNMPE-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O GFDUZZACIWNMPE-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N Thr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N Thr-Asp-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O JEDIEMIJYSRUBB-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N Thr-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JKGGPMOUIAAJAA-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- YUPVPKZBKCLFLT-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Val Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N)O YUPVPKZBKCLFLT-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N Thr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- JAJOFWABAUKAEJ-QTKMDUPCSA-N Thr-Pro-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N)O JAJOFWABAUKAEJ-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N Thr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N Thr-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LXXCHJKHJYRMIY-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 1
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N Thr-Val-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AKHDFZHUPGVFEJ-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N Thr-Val-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- DXYWRYQRKPIGGU-BPNCWPANSA-N Tyr-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DXYWRYQRKPIGGU-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N Tyr-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N FNWGDMZVYBVAGJ-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N Tyr-Gly-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AZGZDDNKFFUDEH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- SZEIFUXUTBBQFQ-STQMWFEESA-N Tyr-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O SZEIFUXUTBBQFQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- ZPFLBLFITJCBTP-QWRGUYRKSA-N Tyr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O ZPFLBLFITJCBTP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LUMQYLVYUIRHHU-YJRXYDGGSA-N Tyr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LUMQYLVYUIRHHU-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N Val-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N UEOOXDLMQZBPFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- ZLFHAAGHGQBQQN-AEJSXWLSSA-N Val-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZLFHAAGHGQBQQN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N Val-Arg-Gly Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N COYSIHFOCOMGCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMRFIKXKOFNMHW-GUBZILKMSA-N Val-Arg-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N VMRFIKXKOFNMHW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DBOXBUDEAJVKRE-LSJOCFKGSA-N Val-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N DBOXBUDEAJVKRE-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N CGGVNFJRZJUVAE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N Val-Ser-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N Val-Ser-Pro Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000621261 Xanthomonas sp. (strain T-22) Xanthomonalisin Proteins 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000882 contact lens solution Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004851 dishwashing Methods 0.000 description 1
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027668 glycyl-alanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010079413 glycyl-prolyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000011905 homologation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 108010020132 microbial serine proteinases Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 101150003695 proS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150080066 proS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 108010059841 serine carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N sodium silicate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Si]([O-])=O NTHWMYGWWRZVTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052911 sodium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004071 soot Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010072644 valyl-alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Separation Of Suspended Particles By Flocculating Agents (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Subtiilein variantteja
Ristiviittaukset läheisiin patenttihakemuksiin Tämä patenttihakemus on osittain jatkoa US-patent-5 tihakemukselle, jonka sarjanumero on 08/137 240, jätetty 14.10.1993 (vireillä), ja joka sisällytetään tähän kirjal-1isuusvii11eeksi kokonaisuudessaan.
Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee uusia karbonyylihydrolaasiva-10 riantteja, joiden aminohapposekvenssissä on suuri määrä prekursorikarbonyylihydrolaasin aminohappojäännöksiä korvattu eri aminohapolla, erityisesti asemissa, jotka ovat vastaavat tai ekvivalentit jäännöksen +76 kanssa, yhdessä yhden tai usemman jäännöksen kanssa, jotka valitaan joukos-15 ta, johon kuuluvat +99, +101, +103, +104, +107, +123, +27, +105, +109, +126, +128, +135, +156, +166, +195, +197, +204, +206, +210, +216, +217, +218, +222, +260, +265 ja/ tai +274 Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinista. Tällaiset mutant ti /variant ti-karbonyylihydrolaasit saadaan yleisesti, 20 muuntamalla in vitro prekursori-DNA-sekvenssiä, joka koo-dittaa luonnossa esiintyvää tai rekombinanttista karbonyy-·;··· lihydrolaasia, koodittamaan suuren määrän näitä aminohappo- jäännöksiä korvaamista prekursoriaminohapposekvenssissä yk- • · . .·. sin tai yhdessä muun substituution, insertion tai deleetion • · · 25 kanssa prekursoriaminohapposekvenssissä.
• · . Keksinnön tausta • · ·
Seriiniproteaasit ovat karbonyylihydrolaasien ala- • · · *·* * ryhmä. Ne käsittävät monimuotoisen luokan entsyymejä, joil la on laajalti erilaiset spesifisyydet ja biologiset funk- • · 30 tiot. Stroud, R. Sei. Amer. 131: 74 - 88. Huolimatta se- • · · riiniproteaasien funktionaalisesta monimuotoisuudesta, se- .V. riiniproteaasien katalyyttinen koneisto on ominainen vähin- • · · tään kahdelle geneettisesti erilaiselle entsyymiperheelle: • · *!* subtilisiineille ja nisäkkäiden kymotrypsiinille läheisille • · 35 ja homologisille bakteerien seriiniproteaaseille (esim. trypsiini ja S. gresiuksen trypsiini). Näillä kahdella se- 2 riiniproteaasien perheellä on huomattavan samanlaiset kata-lyys mekanismit. Kraut, J. (1977), Ann. Rev. Biochem. 46: 331 - 358. Lisäksi, vaikka primäärinen rakenne ei ole läheinen, näiden kahden entsyymiperheen tertiäärirakenteessa 5 on yhteneväistä konservoitunut katalyyttinen aminohappot-riadi, joka koostuu seriinistä, histidiinistä ja aspara-giinihaposta.
Subtilisiini on seriini-endoproteaasi (MP = 27 500) , jota erittyy suurina määrinä laajasta joukosta Bacillus- 10 lajeja ja muita mikro-organismeja. Subtilisiinin prote- iinisekvenssi on määritetty vähintään neljästä eri Bacil- lus-lajista. Markland, F. S. et ai. (1983), Honne-Seyler's Z. Physiol. Chem. 364: 1537 - 1540. Bacillus amyloliquefa- ciensin subtilisiinin kolmiulotteinen kristallografinen ra- 15 kenne 2,5 Ä:n resoluutiolla on myös esitetty. Wright, C. S.
et ai. (1969), Nature 221: 235 - 242; Drenth, J. et ai.
(1972), Eur. J. Biochem. 26: 177 - 181. Nämä tutkimukset osoittavat, että vaikka subtilisiini ei ole geneettisesti sukua nisäkkäiden seriiniproteaaseille, sen aktiivisen koh- 20 dan rakenne on samanlainen. Subtilisiinia sisältävien kova- lenttisesti sidottujen peptidi-inhibiittoreiden (Robertus, ·;·*: J. D. et ai. (1972) , Biochemistry 11: 2439 - 2449) tai tuo- tekompleksien röntgensäde-kiderakenteet (Robertus, J. D. et . ai. (1976), J. Biol. Chem. 251: 1097 - 1103) ovat myös tar- • · · 25 jonneet tietoa subtilisiinin aktiivisesta kohdasta ja ole- • · . tetusta substraatin sitomisraosta. Lisäksi on raportoitu • · · ”* suuresta joukosta kineettisiä ja kemiallisia muuntelututki- « · · *·* muksia subtilisiinille (Philipp, M. et ai. (1983), Mol.
Cell Biochem. 51: 5 - 32; Svendsen, B. (1976), Carlsberg • · 30 Res. Comm. 41: 237 - 291; Markland, F. S. Id.) samoin kuin ··· ϊ.,.ί on vähintään yksi raportti, jossa metioniinin sivuketju subtilisiinin jäännöksessä 222 oli muutettu vetyperoksidil- • · · la metioniini-sulfoksidiksi (Stauffer, D. C. et ai. (1965), *** J. Biol. Chem. 244: 5333 - 5338) ja seriinin sivuketju • · ·.·.♦ 35 jäännöksessä 221 muunnettu kysteiiniksi muuntamalla kemial- • · • · · • · · • · 3 lisesti (Polgar et ai. (1981), Biochimica et Biophysica Acta 667: 351 - 354.) US-patentissa 4 760 025 (RE 34 606) kuvataan subti-lisiinin aminohappojäännösten muuntelu, joka vastaa Bacil-5 lus amyloliquefaciensin subtilisiinissa asemia tyrosiini -1, asparagiinihappo +32, asparagiini +155, tyrosiini +104, metioniini +222, glysiini +166, histidiini +64, glysiini +169, fenyylialaniini +189, seriini +33, seriini +221, tyrosiini +217, glutamiinihappo +156 ja alaniini +152. US-10 patentissa 5 182 204 kuvataan aminohappojäännöksen +224 muunnos Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa ja vastaavissa asemissa muissa subtilisiineissa, joita voidaan muuttaa substituutiolla, insertiolla ja deleetiolla, ja jotka muunnelmat voidaan yhdistää jäännösten muunnelmiin, 15 joita on kuvattu US-patentissa 4 760 025 (RE 34 606), jotta muodostettaisiin hyödyllisiä subtilisiinimutantteja tai variantteja. US-patentissa 5 155 033 kuvataan samanlaisia subtilisiinimutantteja, joissa on muutos ekvivalentissa asemassa kuin B. amyloliquefaciensin subtilisiinin asema 20 +225. US-patenteissa 5 185 258 ja 5 204 015 kuvataan subti lisiinimutantteja, joissa on modifikaatiot asemissa +123 ·;··· ja/tai +274. Nämä patenttijulkaisut sisällytetään tähän kirjallisuusviitteiksi, samoin kuin US-patenttihakemus sar- • · . .·. janumerolla 07/898 382, jossa kuvataan monien aminohappo- « · · 25 jäännösten muunnokset subtilisiinissa, mukaan luettuna spe- . sifisesti +99, +101, +103, +107, +126, +128, +135, +197 ja • · · ’•j·* +204. Kaikki nämä patentit/patenttihakemukset ovat yhteis- ♦ · · *·* ' omistuksessa. US-patentti 4 914 031 kuvaa tiettyjä subtili- siinianalogeja, joihin kuuluu subtilisiini, jota on muutet- • · ·,·,· 30 tu asemasta +76. Myös tämän patentin julkaisu sisällytetään : tähän kirjallisuusviitteeksi. Tässä osoitettuja erityisiä .·]·. jäännöksiä ja/tai erityisiä yhdistelmiä, jotka kuuluvat tä- • · · I.I män hakemuksen vaatimuksiin, ei kuitenkaan ole osoitettu • · *;* näissä viite julkaisuissa.
• · ϊ.ϊ.ί 35 Näin ollen tämä keksintö tarjoaa käyttöön subtili- siinivariantin, jonka, jonka aminohapposekvenssiä ei esiinny 4 luonnossa ja joka on johdettu prekursorisubtilisiinista, jolle on tunnusomaista, että se käsittää substituutioita, jotka vastaavat: N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V tai N76D/S99D/S101R B. amyloliquefaciensin subtilisiinissa, jol-5 loin subtilisiinivariantilla on parantunut pesuainesuori-tus verrattuna prekursorisubtilisiiniin. Edullisille sub-tilisiinivarianteille on tunnusomaista, että subtilisiini-variantit käsittävät substituutioita, jotka vastaavat: N76D/S99D/S103A; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; 10 N76D/S103A/V104I; N76D/S103G/V104I; N76D/S103A/V104F; N76D/S103A/V104N; N76D/S103A/V104T; N76D/V104I/I107V; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S101G/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V109I; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104T/I107A; 15 N76D/S103A/V104T/I107L; N76D/S103A/V104I/L126F;
N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L135V; N76D/S103A/V104I/D197E; N76D/S103A/V104I/N204A; N76D/S103A/V104I/N204G; N76D/S103A/V104I/P210I; N76D/S103A/V104I/T260P tai 20 N76D/S103A/V104I/S265N
B. amyloliquefaciensin subtilisiinissa.
*:··· Keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön DNA-sekvenssit, jotka koodittavat tällaisia variantteja, samoin kuin eks- • · ..·. pressiovektorit, jotka sisältävät tällaisia variantti-DNA- • · · 25 sekvenssejä.
• ·
Vielä lisäksi tämä keksinnön tarjoaa käyttöön isän- • · · ”* täsolut, jotka on transformoitu tällaisilla vektoreilla, • i · *·* ’ samoin kuin isäntäsolut, jotka kykenevät ekspressoimaan täl laista DNA:ta, tuottaakseen variantteja joko intrasellulaa- • · 30 risesti tai ekstrasellulaarisesti.
• M
Edellä esitetyt viitteet esitetään ainoastaan sik-si, että ne on julkaistu ennen tämän hakemuksen hakemispäi- • · · .···. vää, eikä mitään tässä tule pitää tunnustuksena siitä, ett- • · *** eivät keksijät olisi oikeutettuja päiväämään aikaisemmaksi • · 35 tällaista julkaisua aikaisemman keksinnön vuoksi tai etuoi- • · • · · • · · • · 5 keuden vuoksi, joka perustuu aikaisemmin jätettyihin patenttihakemuksiin .
Keksinnön yhteenveto
Keksintö koskee luonnossa esiintymättömiä subtili-5 siinivariantteja, joilla on parantuneet pesusuoritusominai-suudet verrattuna prekursorisubtilisiiniin, josta variantin aminohapposekvenssi on johdettu. Prekursorisubtilisiini voi olla luonnossa esiintyvä tai rekombinanttisubtilisiini. Sellaisilla varianteilla on erityisesti aminohapposekvenssi, 10 jota ei esiinny luonnossa, ja joka johdetaan korvaamalla suuri määrä aminohappojäännöksiä prekursorisubtilisiinissa eri aminohapoilla.
Keksintö sisältää myös variantti-DNA-sekvenssit, jotka koodittavat tällaisia subtilisiinivariantteja. Nämä 15 variantti-DNA-sekvenssit johdetaan prekursori-DNA-sekvens- sistä, joka koodittaa luonnossa esiintyvää tai rekombinant-tista prekursorientsyymiä. Vaikka aminohappojäännökset, jotka on todettu oikeiksi muuntamista varten on merkitty B. amyloliquefaciensissa käytettävän numeroinnin mukaisesti 20 (mikä on tullut tavanomaiseksi menetelmäksi tunnistaa jäännösten asemia kaikissa subtilisiineissa), edullinen prekur-·;··· sori-DNA-sekvenssi, joka on hyödyllinen tässä keksinnössä on Bacillus lentuksen DNA-sekvenssi, joka on esitetty kuvi- ] .·. ossa 6 (SEQ ID NO. 11) .
• · · '**. 25 Piirustusten kuvaus • · . Kuvioissa 1 A - C esitetään DNA- ja aminohapposek- • · · *;|·* venssi Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinille ja tä- • · · *·* ’ män geenin osittainen restriktiokartta (SEQ ID NO. 6) .
Kuviossa 2 esitetään konservoidut aminohappojään- • · :.V 30 nökset subtilisiineissä Bacillus amyloliquefaciensista (BPN') ja Bacillus lentuksesta (villityyppi) .
.V. Kuvioissa 3A ja 3B esitetään neljän subtilisiinin • · · aminohapposekvenssi. Ylinnä on Bacillus amyl oi iquefaci ensin • · subtilisiinin aminohapposekvenssi (joskus kutsuttu nimellä • · ·.·.· 35 subtilisiini BPN') (SEQ ID NO. 7). Toisena ylhäältä on Ba- • «
ί/.j ci Uus subti Uksen subtilisiinin aminohapposekvenssi (SEQ
6 ID NO. 8) . Kolmantena on B. licheniformiksen subtilisiinin aminohapposekvenssi (SEQ ID NO. 9) . Neljäntenä on Bacillus lentuksen subtilisiinin aminohapposekvenssi (jota kutsutaan myös subtilisiini 309:ksi PCT-patenttihakemuksessa WO89/06 5 276) (SEQ ID NO. 10). Symboli * merkitsee spesifisen amino happo jäännöksen puuttumista verrattuna subtilisiiniin BPN'. Kuviossa 4 esitetään plasmidin GGA274 rakenne. Kuviossa 5 esitetään rakenne GGT274:lle, joka on välituote tietyille tässä hakemuksessa käytetyille ekspres-10 sioplasmideille.
Kuvioissa 6A ja 6B esitetään Bacillus lentuksen sub tilisiinin DNA- ja aminohapposekvenssi (SEQ ID NO. 11) . Kypsää subtilisiiniproteiinia koodittavat kodonit, jotka alkavat kodonilla GCG (334 - 336), joka vastaa aminohappoa 15 Ala.
Kuvioissa 7A ja 7B esitetään keksinnön edullisen suoritusmuodon DNA- ja aminohapposekvenssi (N76D/S103A/ V104I) (SEQ ID NO. 12). DNA:ta tässä kuviossa on muunnettu kuvatuilla menetelmillä koodittamaan asparagiinihappoa ase-20 massa 76, alaniinia asemassa 103 ja isoleusiinia asemassa 104. Kypsää subtilisiinivarianttiproteiinia koodittavat ko-·;··· donit, jotka alkavat kodonista GCG (334 - 336) , joka vastaa aminohappoa Ala.
• · • · . .·. Kuviossa 8 esitetään vektorin pBCDAICAT rakenne.
• · · 25 Kuviossa 9 esitetään vektorin pUCCATFNA rakenne.
• · . Kuviossa 10 esitetään edullisen mutanttientsyymin • · ♦ *·|** stabiliteetti verrattuna villityyppiseen, nestemäisessä de- • · · *·* * tergenttikoostumuksessa.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus • · 30 Karbonyylihydrolaasit ovat entsyymejä, jotka hydro- ··· • · • · ···
O
· · H
:.V lysoivat yhdisteitä, jotka sisältävät C-x-sidoksia, ··· joissa X on happi tai typpi. Niihin kuuluvat luonnossa esiintyvät karbonyylihydrolaasit ja rekombinantti-karbo- • · · 35 nyylihydrolaasit. Luonnossa esiintyviin karbonyylihydro- laaseihin kuuluvat pääasiassa hydrolaasit, esim. peptidi- • ·· 7 hydrolaasit, kuten subtilisiinit tai metalloproteaasit. Peptidihydrolaaseihin kuuluvat α-aminoasyylipeptidihydro-laasi, peptidyyliaminohappohydrolaasi, asyyliaminohydrolaa-si, seriinikarboksipeptidaasi, metallokarboksipeptidaasi, 5 tioliproteinaasi, karboksyyliproteinaasi ja metalloprotei-naasi. Seriini-, metallo-, tioli- ja hapanproteaasit kuluvat mukaan, samoin kuin endo- ja eksoproteaasit.
"Rekombinan11i-karbonyy1ihydro1aas i" tarkoi 11aa karbonyylihydrolaasia, jossa luonnossa esiintyvää karbonyy-10 lihydrolaasia koodittavaa DNA-sekvenssiä on muunnettu tuottamaan mutantti-DNA-sekvenssi, joka koodittaa yhden tai useamman aminohapon substituutiota, insertiota tai delee-tiota karbonyylihydrolaasin aminohapposekvenssissä. Sopivia muuntelumenetelmiä on kuvattu tässä ja US-patenteissa 15 4 760 025 (RE 34 606), 5 204 015 ja 5 185 258.
Subtilisiinit ovat bakteerien ja sienten karbonyy-lihydrolaaseja, jotka toimivat yleensä pilkkoen proteiinien tai peptidien peptidisidoksia. Tässä käytettynä "subtili-siini" tarkoittaa luonnossa esiintyvää subtilisiinia tai 20 rekombinantti-subtilisiinia. Useiden mikrobilajien tiedetään tuottavan ja usein erittävän sarjaa luonnossa esiinty-·;··; viä subtilisiineja. Tämän sarjan jäsenten aminohappose- kvenssit eivät ole täysin homologisia. Kuitenkin subtili- • · , .·. siinit tässä sarjassa osoittavat samaa tai samanlaista pro- • · · ***. 25 teolyyttisen aktiivisuuden tyyppiä. Tällä seriiniproteaasi- • · . en luokalla on yhteinen aminohapposekvenssi, joka määritte- • · · ’···* lee katalyyttisen triadin, joka erottaa ne seriini-prote- • · · '·' * aasien kymotrypsiinille läheisestä luokasta. Subtilisii- neilla ja kymotrypsiinille läheisillä seriiniproteaaseilla • · :.ϊ.· 30 on kummallakin katalyyttinen triadi, joka käsittää aspara- giinihapon, histidiinin ja seriinin. Subtilisiinille lähei- .·]·. sissä proteaaseissa näiden aminohappojen ksekinäinen jär- • · · jestys, lukien aminopäästä karboksipäähän, on asparagiini- • · *;* happo-histidiini-seriini. Kymotrypsiinille läheisissä pro- • · ϊ.ϊ,ϊ 35 teaaseissa suhteellinen järjestys on kuitenkin histidiini-asparagiinihappo-s eriini. Näin ollen subtilisiini viittaa • · 8 tässä seriiniproteaasiin, jolla on subtilisiinilie läheisten proteaasien katalyyttinen triadi. Esimerkkeihin kuuluvat, mutta eivät rajoitu näihin, kuviossa 3 esitetyt subti-lisiinit.
5 "Rekombinantti-subtilisiini" tarkoittaa subtilisii- nia, jossa subtilisiinia koodittavaa DNA-sekvenssiä on muunnettu tuottamaan variantti (tai mutantti) -DNA-sek-venssi, joka koodittaa yhden tai useamman aminohapon substituutiota, deleetiota tai insertiota luonnossa esiintyvän 10 subtilisiinin aminohapposekvenssissä. Sopivia menetelmiä tällaisen muunnelman valmistamiseksi, ja jotka voidaan yhdistää tässä kuvattuihin, kuuluvat ne, jotka on kuvattu US-patenteissa 4 760 025 (RE 34 606), 5 204 015 ja 5 185 258.
"Ei-ihmis-karbonyylihydrolaasit" ja niitä kooditta-15 va DNA voidaan saada monista prokaryoottisista ja euka- ryoottisista organismeista. Sopiviin esimerkkeihin prokaryoottisista organismeista kuuluvat gram-negatiiviset organismit, kuten E. coli tai Pseudomonas ja gram-positiiviset bakteerit, kuten Micrococcus tai Bacillus. Esimerkkeihin 20 eukaryoottisista organismeista, joista karbonyylihydrolaasi ja niiden geenit voidaan saada, kuuluvat hiivat, kuten Sac-....j charomyces cerevisiae, sienet, kuten Asper gi Uus sp. ja muut nisäkäs lähteet kuin ihminen, kuten esimerkiksi Bovine • · ^ . sp., josta voidaan saada karbonyylihydrolaasia kymosiini « · · ’**. 25 koodittava geeni. Mitä tulee subtilisiineihin, sarja karbo- . nyylihydrolaaseja voidaan saada erilaisista läheisistä la- • « · *··** jeista, joiden aminohapposekvenssit eivät ole täysin homo- • · · *·* * logisia sen sarjan välillä, mutta jotka kuitenkin ilmentä vät samaa tai samantyyppistä biologista aktiivisuutta. Näin • · V.: 30 ollen ei-ihmis-karbonyylihydrolaasilla on tässä käytettynä :***: funktionaalinen merkitys, jolla viitataan karbonyylihydro- laaseihin, jotka liittyvät suoraan tai epäsuorasti proka- • · · l.l ryoottisiin ja eukaryoottisiin lähteisiin.
• · "Karbonyylihydrolaasivariantin" aminohapposekvenssi • · 35 on johdettu "prekursorikarbonyylihydrolaasin" aminohappose- :*·.· kvenssistä. Prekursorikarbonyylihydrolaaseihin (kuten sub- • · 9 tilisiini) kuuluvat luonnossa esiintyvät karbonyylihydro-laasit (subtilisiini) ja rekombinantti-karbonyylihydrolaa-sit (subtilisiini). Karbonyylihydrolaasivariantin aminohapposekvenssi on "johdettu" prekursorihydrolaasin aminohap-5 posekvenssistä yhden tai useamman prekursorin aminohapposekvenssin aminohapon substituutiolla, deleetiolla tai inser-tiolla. Tällainen muutos tehdään "prekursorikarbonyylihyd-rolaasiin", joka koodittaa prekursorikarbonyylihydrolaasin (subtilisiini) aminohapposekvenssiä, ennemmin kuin manipu-10 loimalla prekursorikarbonyylihydrolaasi (subtilisiini) -entsyymiä per se. Sopiviin menetelmiin prekursori-DNA-sek-venssin tällaista manipulaatiota varten kuuluvat tässä kuvatut menetelmät, samoin kuin alan ammattilaisten tuntemat menetelmät (katso esimerkiksi EP-0 328 299, WO 89/06 279 ja 15 US-patentit ja patenttihakemukset, joihin on jo tässä viitattu) .
Subtilisiinivariantit on kuvattu vaatimuksissa 1 ja 2. Aminohappoasemanumerot viittaavat niihin, jotka on ilmoitettu Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinisekvens-20 sille, joka on esitetty kuviossa 1. Keksintö ei kuitenkaan rajoitu tämän erityisen subtilisiinin mutaatioon, vaan ·...; ulottuu prekursorikarbonyylihydrolaaseihin, jotka sisältä- vät aminohappo jäännöksiä asemissa, jotka ovat "ekvivalent- • · 1 teja" erityisille identifioiduille asemille Bacillus amylo- • · · 25 liquefaciensin subtilisiinissa, Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa prekursorisubtilisiini on Bacillus lentuk- • · · *···* sen subtilisiini ja substituutiot, deleetiot tai insertiot • ·· - • · · V * tehdään ekvivalenttiin aminohappojäännökseen B-lentuksessa.
Prekursorikarbonyylihydrolaasin jäännös (aminohap- • · V,! 30 po) on ekvivalentti Bacillus amyloliquefaciensin subtili- • · · J ! sunin jäännökselle, jos se on joko homologinen (ts. vastaa asemaltaan joko primäärisessä tai tertiäärisessä rakentees- • · · sa) tai analoginen spesifiselle jäännökselle tai osalle tä- • · • · *;* tä jäännöstä Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa • · 35 (ts. sillä on sama tai samanlainen toiminnallinen kapasi- • · • · φ • ·· • · 10 teetti yhdistämään, reagoimaan tai vuorovaikuttamaan kemiallisesti) .
Jotta selvitettäisiin homologia primäärirakenteen kanssa, prekursorikarbonyylihydrolaasin aminohapposekvens-5 siä verrataan suoraan Bacillus amyloliquefaciensin subtili-siinin primäärisekvenssiin ja erityisesti sarjaan jäännöksiä, joiden tiedetään olevan muuntelemattomia subtilisii-neissa, joiden sekvenssi on tunnettu. Kuviossa 2 esitetään konservoituneet jäännökset B. amyloliquefaciensin subtili-10 siinin ja B. lentuksen subtilisiinin välillä. Kun konservoidut sekvenssit on kohdistettu rivissä, ottaen huomioon välttämättömät insertiot ja deleetiot kohdistuksen säilymiseksi (ts. välttäen konservoitujen jäännösten eliminaatiota sattumanvaraisen deleetion ja insertion kautta), tietyille 15 aminohapoille Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinin primaarisessa sekvenssissä ekvivalentit jäännökset määritetään. Konservoitujen jäännösten kohdistamisen tulisi edullisesti konservoida 100 % tällaisista jäännöksistä. Enemmän kuin 75 prosentin tai niin vähän kuin 50 prosentin konser-20 voiduista jäännöksistä kohdistaminen on kuitenkin riittävä määrittelemään ekvivalentit jäännökset. Katalyyttinen tria-di, Asp32/His64/Ser221, tulisi säilyttää.
··.·. Esimerkiksi kuviossa 3 Bacillus amyloliquefacien- • · _ ] ^ sin, Bacillus subtiliksen, Bacillus licheniformiksen (carls- • · · ***. 25 bergensis) ja Bacillus lentuksen subtilisiinien aminohap posekvenssit on kohdistettu saamaan aikaan suurin mahdolli- ♦ · · *···' nen määrä homologiaa aminohapposekvenssien välille. Näiden ··· • · · V * sekvenssien vertailu osoittaa, että kussakin sekvenssissä on joukko konservoituneita jäännöksiä. Nämä konservoidut • · 30 jäännökset (kuten BPN':n ja B. lentuksen välillä) on esi- :***: tetty kuviossa 2 .
»·· .*. Näitä konservoituja jäännöksiä voidaan näin ollen • · · M käyttää määrittämään Bacillus amyloliquefaciensin subtili- • · *·”* siinia vastaavat ekvivalentit aminohappojäännökset muissa i/./. 35 karbonyylihydrolaaseissa, kuten subtilisiinissa Bacillus :*·.· lentuksesta (PCT-julkaisu WO 89/06 279, tullut julkiseksi • · ' 11 13.7.1989), edullisessa subtilisiiniprekursorientsyymissä tässä tai subtilisiinissa, jota kutsutaan PB92:ksi (EP 0 328 299), joka on erittäin homologinen edullisen Bacillus lentuksen subtilisiinin kanssa. Tiettyjen subtili-5 siinien aminohapposekvenssit näistä on kohdennettu kuvioissa 3A ja 3B Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinin sekvenssin kanssa, jotta saadaan konservoitujen jäännösten suurin mahdollinen homologia. Kuten voidaan nähdä, Bacillus lentuksen sekvenssissä on joukko deleetioita verrattuna Ba-10 cillus amylolliquefaciensin subtilisiiniin. Näin ollen esimerkiksi ekvivalentti aminohappo Vall65:lle Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa on isoleusiini B. lentuksen ja B. licheniformiksen subtilisiineissa.
Näin ollen esimerkiksi asemassa +76 oleva aminohap-15 po on asparagiini (N) sekä B. amyloliquefaciensin että B. lentuksen subtilisiineissa. Keksinnön mukaisessa subtili-siinivariantissa on +76:lie B. amyloliquefaciensin subtilisiinissa ekvivalentti aminohappo korvattu asparagiinihapol-la (D). Tiettyjen tässä identifioiduista aminohappojäännök-20 sistä substituution vertailu tai edullisin substituution kussakin tällaisessa asemassa on esitetty taulukossa I esi-merkkeinä.
• # ·· ·
: Taulukko I
·*· 25 ·;··:__+76 +99 +101 +103 +104 +107 +123
• ·1: B. amyloliquefaciens N D S Q Y I N
··· :*·1· (villityyppi)
B. lentus N S S S V I N
(villityyppi) • · · 1 — 1 “ 1 1 " 1 — — " ' — — • ·
,···_ Edullisin substituutio DDR A I/Y V S
• · ·
Ekvivalentit jäännökset voidaan määrittää myös mää- :***: rittämällä homologia tertiäärirakennetasolla prekursorikar- ··· bonyylihydrolaasille, jonka tertiäärirakenne on määritetty • · · **. 30 röntgensädekristallografiällä. Ekvivalentit jäännökset mää- • · · ritetään niiksi, joissa prekursorikarbonyylihydrolaasin ja 12
Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinin tietyn aminohappo jäännöksen kahden tai useamman pääketjun atomien atomi-koordinaatit (N N:llä, CA CArlla, C C:llä ja 0 0:11a) ovat 0,13 nm:n ja edullisesti 0,1 nm:n sisällä kohdennuksen jäl-5 keen. Kohdennus saavutetaan, kun paras malli on orientoitu ja asemoitu antamaan kyseessä olevan karbonyylihydrolaasin muiden proteiiniatomien kuin vety suurin mahdollinen atomi-koordinaattien limittäisyys Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinin kanssa. Paras malli on kristallografinen mal-10 li, joka antaa alhaisimman R-tekijän kokeellisille diffrak-tiotuloksille suurimmalla saatavilla olevalla resoluutiolla .
1-1^)1
Σ* I·*7,0 I
15 Ekvivalentit jäännökset, jotka ovat funktionaali- sesti analogisia spesifiselle jäännökselle Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa, on määritetty niinä prekur-sorikarbonyylihydrolaasien aminohappoina, jotka voivat omaksua konformaation niin, että ne joko muuttavat, muokkaavat 20 tai myötävaikuttavat proteiinin rakenteeseen, substraatin sitomiseen tai katalyysiin tavalla, joka on määritelty ja • · ] luettu kuuluvaksi spesifiselle jäännökselle Bacillus amylo- • · · '**. liquefaciensin subtilisiinissa. Lisäksi ne ovat niitä pre- kursorikarbonyylihydrolaasin jäännöksiä (joiden tertiääri- • · · *·ϊ·* 25 rakenne on saatu röntgenkristallografiällä), joilla on ana- • · · *.* * loginen asema siinä määrin, että vaikka annetun jäännöksen pääketjun atomit eivät ehkä tyydytä ekvivalenssin kriteere- • · jä sillä perusteella, että niillä olisi homologinen asema, jäännöksen vähintään kahden sivuketjua tornin atomikoordinaa- • · · 30 tit ovat 0,13 nm:n sisällä vastaavista sivuketjuatomeista • · · *.* Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinissa. Bacillus amy- ♦ · ^““ *···* loliquefaciensin subtilisiinin kolmiulotteisen rakenteen : koordinaatit on esitetty julkaisussa EP 0 251 446 (vastaa • · :*·.· US-patenttihakemusta sarjanumerolla 08/212 291) , joka jul- • · 13 kaisu sisällytetään tähän kirjallisuusviitteeksi) ja niitä voidaan käyttää edellä esitetyllä tavalla määritettäessä ekvivalentteja jäännöksiä tertiäärirakennetasolla.
Jotkin jäännöksistä, jotka on identifioitu substi-5 tuutioon, ovat konservoituja jäännöksiä, kun taas toiset eivät ole. Niiden jäännösten tapauksessa, jotka eivät ole konservoituja, yhden tai useamman aminohapon korvaaminen on rajoitettu substituutioihin, jotka tuottavat variantin, jonka aminohapposekvenssi ei vastaa luonnossa esiintyvää. Kon-10 servoitujen jäännösten ollessa kyseessä tällaisten korvaamisten ei tulisi johtaa luonnossa esiintyvään sekvenssiin. Tämän keksinnön mukaisiin karbonyylihydrolaasivariantteihin kuuluvat karbonylihydrolaasivarianttien kypsät muodot, samoin kuin tällaisten hydrolaasivarianttien pro- ja prepro-15 muodot. Prepro-muodot ovat edullinen rakenne, koska tämä edistää karbonyylihydrolaasivarianttien ekspressiota, eritystä ja kypsymistä.
"Prosekvenssi" tarkoittaa aminohapposekvenssiä, joka on sidottu karbonyylihydrolaasin kypsän muodon N-termi-20 naaliseen osaan, joka poistettuna johtaa karbonyylihydrolaasin "kypsän" muodon ilmenemiseen. Monet proteolyyttiset entsyymit ovat luonnossa translaation proentsyymituotteina ja translaation jälkeisen prosessoinnin puuttuessa ekspres- • · \ ! soidaan tällä tavalla. Edullinen prosekvenssi karbonyyli- • · · ***. 25 hydrolaasivarianttien, erityisesti subtilisiinivarianttien, • · · · · tuottamiseksi on Bacillus amyloliquefaciensin subtilisiinin • · · '···' oletettu pro-sekvenssi, vaikka muita subtilisiinin pro- ··· *.* * sekvenssejä voidaan käyttää. Esimerkeissä 1 ja 2 käytettiin oletettua pro-sekvenssiä Bacillus lentuksen subtilisiinista :Y: 30 (ATCC 21536) .
"Signaalisekvenssi" tai "presekvenssi" tarkoittaa • · · mitä tahansa aminohapposekvenssiä, joka on sitoutunut kar- • · · bonyylihydrolaasin N-terminaaliseen osaan tai pro-hydrolaa- • · *·;·* sin N-terminaaliseen osaan, joka voi osallistua hydrolaasin 35 kypsän tai pro-muotojen eritykseen. Tämä signaalisekvenssin :*·.· määritelmä on funktionaalinen, tarkoittaen sisältää kaikki • · 14 ne aminohapposekvenssit, joita subtilisiinigeenin tai muun eritettävän karbonyylihydrolaasin, N-terminaalinen osa koodi ttaa, ja jotka osallistuvat subtilisiinin tai muiden kar-bonyylihydrolaasien erityksen toteutukseen natiiveissa olo-5 suhteissa. Tässä keksinnössä käytetään sellaisia sekvenssejä toteuttamaan tässä määriteltyjen karbonyylihydroiaasivarianttien eritys. Esimerkeissä käytetty edullinen signaa-lisekvenssi käsittää ensimmäiset seitsemän aminohappojäännöstä Bacillus subtiliksen subtilisiinin signaalisekvens-10 sistä fuusioituna Bacillus lentuksen (ATCC 21536) subtilisiinin signaalisekvenssin loppuosaan.
Karbonyylihydrolaasivariantin "prepro"-muoto käsittää hydrolaasin kypsän muodon, jossa on pro-sekvenssi liitettynä toimivasti hydrolaasin aminopäähän ja "pre"- tai 15 "signaali"-sekvenssi liitettynä toimivasti pro-sekvenssin aminopäähän.
"Ekspressiovektori" tarkoittaa DNA-rakennetta, joka sisältää DNA-sekvenssin, joka on liitetty toimivasti sopivaan kontrollisekvenssiin, joka kykenee toteuttamaan maini-20 tun DNA:n ekspression sopivassa isännässä. Tällaisiin kont-rollisekvenssehin kuuluvat promoottori transkription to-teuttamiseksi, haluttaessa operaattorisekvenssi kontrolloi-maan tällaista transkriptiota, sekvenssi, joka koodittaa • · | sopivia mRNA:n ribosomin sitomiskohtia ja sekvenssit, jotka • · · ***. 25 kontrolloivat transkription terminaatiota ja translaatiota.
• · · · ·
Vektori voi olla plasmidi, faagipartikkeli, tai yksinker- • · · *···* taisesti potentiaalinen genominen insertti. Kun vektori on • · · *.* * kerran transformoitu sopivaan isäntään, se voi replikoida ja toimia riippumatta isännän genomista, tai se voi joissa- • · 30 kin tapauksissa intergroitua itse genomiin. Tässä selityk-sessä määritelmiä "plasmidi" ja "vektori" käytetään joskus • · · erotuksetta, koska plasmidi on yleisimmin käytetty vektorin • · · muoto tätänykyä. Keksinnön on kuitenkin tarkoitus sisältää • · *··** sellaiset muut ekspressiovektorimuodot, jotka palvelevat : :: 35 vastaavia funktioita ja jotka ovat alalla tunnettuja tai :*·.· tulevat sellaisiksi.
• · 15 "Isäntäsolut", joita käytetään tässä keksinnössä, ovat yleensä prokaryoottisia tai eukaryoottisia isäntiä, joita on edullisesti mainipuloitu menetelmillä, joita on kuvattu US-patentissa 4 760 025 (RE 34 606), ja jotka teke-5 vät ne kyvyttömiksi erittämään entsymaattisesti aktiivista endoproteaasia. Edullinen isäntäsolu subtilisiinin ekspres-soimiseksi on Bacillus-kanta BG2036, josta puuttuu entsymaattisesti aktiivinen neutraali proteaasi ja alkalinen proteaasi (subtilisiini). Kannan BG2036 rakenne on kuvattu 10 yksityiskohtaisesti US-patentissa 5 264 366. Muihin isän-täsoluihin subtilisiinin ekspressoimiseksi kuuluvat Bacillus subtilis 1168 (joka on myöskin kuvattu US-patenteissa 4 760 025 (RE 34 606) ja 5 264 366, nämä julkaisut sisällytetään tähän kirjallisuusviitteiksi) , samoin kuin mikä ta-15 hansa sopiva Bacillus-kanta, kuten B. licheniformis, B. len-tus, jne.
Isäntäsolut transformoidaan tai transfektoidaan vektoreilla, jotka on rakennettu käyttämällä rekombinantti-DNA-tekniikoita. Tällaiset transformoidut isäntäsolut kyke-20 nevät joko replikoimaan vektoreita, jotka koodittavat kar-bonyylihydrolaasivariantteja, tai ekspressoimaan haluttua karbonyylihydrolaasivarianttia. Vektorien tapauksessa, jot- • · ;·#·# ka koodittavat karbonyylihydrolaasivariantin pre- tai prep- • · I ro-muotoa, tällaiset variantit ekspressoituna eritetään • · · ·*·. 25 tyypillisesti isäntäsolusta isäntäsolun ravintoalustaan.
• · · · · "Toimivasti liitetty", kuvatessaan suhdetta kahden • · · \ί.* DNA-alueen välillä, tarkoittaa yksinkertaisesti, että ne • · · ·.· · ovat toiminnallisesti yhteen kuuluvat toistensa kanssa.
Esimerkiksi pre-sekvenssi on liitetty toimivasti peptidiin, :V: 30 jos se toimii signaalisekvenssinä, osallistuen proteiinin :*'*· kypsän muodon eritykseen, johon todennäköisimmin liittyy sig- • · · .*. naalisekvenssin pilkkominen. Promoottori on liitetty toimi- • · · *·[** vasti koodattavaan sekvenssiin, jos sen kontrolloi sekvens- • · ’···’ sin transkriptiota; ribosomin sitova kohta on liitetty toi- :V: 35 mivasti koodittavaan sekvenssiin, jos se on asemoitu niin, että se sallii translaation.
• · 16
Luonnossa esiintyvää prekursori-karbonyylihydrolaa-sia koodattavat geenit voidaan saada alan ammattilaisten tuntemien yleisten menetelmien mukaisesti. Menetelmissä yleisesti syntetoidaan leimatut koettimet, joissa on olete-5 tut sekvenssit, jotka koodittavat kiinnostuksen kohteena olevan hydrolaasin alueita, valmistetaan genomiset kirjastot organismeista, jotka ekspressoivat hydrolaasia ja seulotaan kirjastoista kiinnostuksen kohteena oleva geeni hyb-ridisoimalla koettimiin. Positiivisesti hybridisoituvat kloo-10 nit kartoitetaan ja sekvensoidaan. Esimerkeissä käytetty B. lentuksen geeni kloonattiin, kuten US-patentin 5 185 258 esimerkissä 1 on kuvattu, tämä julkaisu sisällytetään tähän kirjallisuusviitteeksi. BPN'-geeni, jota käytettiin esimerkissä 5, kloonattiin, kuten esimerkissä 1 RE 34 606:ssa on 15 kuvattu, tämä julkaisu sisällytetään tähän kirjallisuusviitteeksi .
Kloonattua karbonyylihydrolaasia käytetään sitten isäntäsolujen transformoimiseen hydrolaasin ekspressoimi-seksi. Hydrolaasigeeni ligatoidaan sitten suuren kopiomää-20 rän omaavaan plasmidiin. Tämä plasmidi replikoituu isännässä siinä mielessä, että se sisältää hyvin tunnetut elemen-tit, jotka ovat välttämättömiä plasmidin replikaatiolle: • · .. . promoottorin liitettynä toimivasti kysymyksessä olevaan • · * * geeniin (joksi voidaan tarjota geenin oma homologinen pro- • · · *···] 25 moottori, jos isäntä tunnistaa, ts. transkriptoi sen), • · · · · * * transkription terminaatio- ja polyadenylaatioalueen (vält- tämätön isännän hydrolaasigeenistä transkriptoiman mENA:n ··· : stabiilisuudelle tietyissä eukaryoottisissa isäntäsoluis- sa), joka on eksogeeninen, tai jonka tarjoaa hydrolaasigee-30 nin endogeeninen terminaattorialue ja, suotavasti selek- • · .***. tiogeenin, kuten antibioottiresistenssigeenin, joka tekee • · · .·. mahdolliseksi plasmidin infektoimien isäntäsolujen jatkuvan « · · ’·[·' ylläpidon viljelmässä kasvattamalla antibioottia sisältä- • · *···* vässä ravintoalustassa. Suuren kopiomäärän plasmidit sisäl- 35 tävät myös replikaation aloituskohdan isännälle, mahdollis- • · taen siten suurten määrien plasmidia luomisen sytoplasmaan • · 17 ilman kromosomin luomia rajoituksia. Tämän keksinnön piiriin kuuluu kuitenkin hydrolaasigeenin monien kopioiden integroiminen isännän genomiin. Tätä edistävät prokaryootti-set ja eukaryoottiset organismit, jotka ovat erityisen alt-5 tiita homologiselle rekombinaatiolle. Näissä esimerkeissä käytetyt geenit ovat luonnollinen B. lentus -geeni ja luonnollinen B. amyloliquefaciens -geeni. Vaihtoehtoisesti voidaan tuottaa synteettinen geeni, joka koodittaa luonnossa esiintyvää tai mutantti-prekursori-karbonyylihydrolaasia 10 (subtilisiinia). Tällaisessa sovellutuksessa prekursorihyd- rolaasin (subtilisiinin) DNA ja/tai aminohapposekvenssi määritetään. Sen jälkeen syntetoidaan monia limittäisiä synteettisiä yksijuosteisia DNA-fragmentteja, jotka hybridi-saatiossa ja ligaatiossa tuottavat synteettisen DNA:n, joka 15 koodittaa prekursorihydrolaasia. Esimerkki synteettisestä geenirakenteesta on esitetty esimerkissä 3 US-patentissa 5 204 015, joka julkaisu sisällytetään tähän kirjallisuusviitteeksi .
Kun luonnossa esiintyvä tai synteettinen prekurso-20 ri-karbonyylihydrolaasigeeni on kloonattu, tehdään joukko muunnoksia laajentamaan geenin käyttöä yli luonnossa esiin-tyvän prekursorikarbonyylihydrolaasin synteesin. Tällaisiin • · j·... muunnoksiin kuuluu US-patentissa 4 760 025 (RE 34 606) ja • · I julkaisussa EP 0 251 446 kuvattujen rekombinantti-karbonyy- • · · **·. 25 lihydrolaasien valmistus ja tässä kuvattujen karbonyylihyd- ····· rolaasivarianttien valmistus.
• · ·
Seuraavaa kasettimutageneesimenetelmää voidaan käyt- ··· ·.·* tää edistämään tämän keksinnön mukaisten karbonyylihydro- laasivarianttien rakentamista ja tunnistusta, vaikka muita 30 menetelmiä, joihin kuuluvat palkkasummat tu mutageneesi, • · :***; voidaan käyttää. Ensiksi saadaan hydrolaasia koodittava ··· luonnossa esiintyvä geeni ja sekvensoidaan se kokonaan tai • · · **]·* osaksi. Sitten sekvenssi kartoitetaan kohdan suhteen, johon • · *·♦♦' on toivottavaa tehdä yhden tai useamman aminohapon mutaatio 35 (deleetio, insertio tai substituutio) kooditetussa entsyy- • ♦ ;**J missä. Tätä kohtaa reunustavista sekvensseistä arvioidaan • · 18 restriktiokohtien läsnäolo korvaamalla lyhyt geenisegmentti oligonukleotidipoolilla, joka ekspressoituna koodittaa eri mutantteja. Tällaiset restriktiokohdat ovat edullisesti ainoita kohtia hydrolaasigeenissä niin, että geenisegmentin 5 korvaaminen helpottuu. Mitä tahansa sopivaa restriktiokoh-taa, joka ei ole ylen runsaasti esiintyvä hydrolaasigeenissä voidaan käyttää edellyttäen, että restriktiopilkkomisel-la luodut geenifragmentit voidaan asentaa oikeaan sekvenssiin. Jos restriktiokohtia ei ole kohdissa, jotka ovat so-10 pivalla etäisyydellä valitusta pisteestä (10 - 15 nukleotidia) , tällaisia kohtia luodaan korvaamalla nukleotideja geenissä sellaisella tavalla, etteivät lukukehys tai koodi-tettavat aminohapot muutu lopullisessa rakenteessa. Geenin mutaatio tarkoituksena muuttaa sen sekvenssiä varmistamaan 15 haluttu sekvenssi, tehdään M13-alukepidennyksellä yleisesti tunnettujen menetelmien mukaisesti. Sopivien reunustavien alueiden sijoittaminen ja tarvittavien muutosten arviointi, jotta päädytään kahteen sopivaan restriktiokohtasekvens-siin, tehdään rutiininomaisesti geneettisen koodin ylimää-20 rällä, geenin restriktioentsyymikartalla ja suurella määrällä eri restriktioentsyymejä. On huomattava, että jos so-piva reunustava restriktiokohta on saatavilla, edellä esi- • · tettyä menetelmää tarvitsee käyttää vain yhdessä reunusta- • · I van alueen kanssa, joka ei sisällä kohtaa.
« · · • · · ***. 25 Kun luonnossa esiintyvä tai synteettinen DNA on ····· kloonattu, mutatoitavia asemia reunustavat restriktiokohdat • · · *·!·* pilkotaan samoilla restriktioentsyymeillä ja joukko pää- • · · *.* : dyille komplementaarisia oligonukleotidikasetteja ligatoi- daan geeniin. Mutageneesiä yksinkertaistetaan tällä mene- : 30 telmällä, koska kaikki oligonukleotidit voidaan syntetoida :***: niin, että niissä on samat restriktiokohdat, eivätkä syn- • · · teettiset linkkerit ole välttämättömiä luomaan restrik- • · · tiokohtia.
• · Tässä käytettynä proteolyyttinen aktiivisuus määri- :V: 35 tellään peptidisidosten hydrolyysin tasona mg aktiivista :*·.· entsyymiä kohti. On olemassa monia hyvin tunnettuja menet- • · 19 telytapoja proteolyyttisen aktiivisuuden mittaamiseksi (K.
M. Kalisz, "Microbial Proteinases,", Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, A. Fiechter toim. 1988) . Parantuneen pesusuorituskyvyn lisäksi tämän keksinnön mukai-5 silla varianttientsyymeillä voi olla muita muunnettuja ominaisuuksia, kuten Km, kcat, kcat/Km -suhde ja/tai muunnettu substraattispesifisyys, muunnettu proteolyyttinen aktiivisuus ja/tai muunnettu pH-aktiivisuusprofiili. Nämä entsyymit voidaan suunnitella sopimaan tietylle substraatille, 10 jonka odotetaan olevan läsnä.
Varianttikarbonyylihydrolaasi, jolla saattaa olla muuntunut proteolyyttinen aktiivisuus verrattuna prekurso-rikarbonyylihydrolaasiin, koska lisäämällä tällaista aktiivisuutta (numeerisesti suuremmaksi) mahdollistetaan entsyy-15 min käyttö tehokkaammassa toiminnassa kohdesubstraatille. Kiinnnostavia ovat myös varianttientsyymit, joilla on muuntunut lämpöstabiliteetti ja/tai muuntunut substraattis-pesifisyys verrattuna prekursoriin. Mutatoitava karbonyyli-hydrolaasi on edullisesti subtilisiini. Näitä kahta termiä 20 on käytetty vaihtoehtoisesti tässä selitysosassa.
Keksinnön suoritusmuodot on esitetty esimerkeissä. Näihin kuuluvat seuraavat erityiset korvattujen jäännösten .. . yhdistelmät: N76D/V104I, N76D/ S99D/V104I, • · ♦ : f N76D/S103A/V104I, N76D/V104I/I107V, N76D/ V104Y/I107V ja • · « *···] 25 N76D/S101R/S103A/V104I. Esimerkeissä on kuvattu myös kaikki «···· * * mutanttiyhdistelmät, jotka kuuluvat erityisesti tämän kek- sinnön suojapiiriin. Nämä substituutiot tehdään edullisesti ··· · Bacillus lentuksen (rekombinantti tai natiivi-tyypin) sub- tilisiiniin, vaikka substituutiot voidaan tehdä mihin ta-30 hansa Bacillus-subtilisiiniin.
• · .**·. Keksinnön mukaiset karbonyylihydrolaasivariantit, ··♦ /. ovat hyödyllisiä erilaisten detergenttikoostumusten formu- ♦ ♦ · *·[·* loimisessa. Suuri määrä tunnettuja yhdisteitä on sopivia pinta-aktiivisia aineita, jotka ovat hyödyllisiä koostumuk- »V: 35 sissa, jotka käsittävät keksinnön mukaisia karbonyylihydro- * ♦ laasimutantteja. Näihin kuuluvat ei-ioniset, anioniset, ka- ♦ « 20 tioniset, anioniset tai kahtaisioniset detergentit, kuten Barry J. Andersonin US-patentissa 4 404 128 ja Jiri Floran et ai. US-patentissa 4 261 868 esitetään. Sopiva detergent-tikoostumus on esimerkissä 7 US-patentissa 5 204 015 kuvat-5 tu (sisällytetty aikaisemmin kirjallisuusviitteeksi). Alalla ovat tunnettuja erilaiset koostumukset, joita voidaan käyttää puhdistuskoostumuksina. On helposti ymmärrettävää, että tyypillisten puhdistuskoostumusten lisäksi tämän keksinnön mukaisia subtilisiinivariantteja voidaan käyttää mi-10 hin tahansa tarkoitukseen, joissa käytetään natiiveja tai villityyppisiä subtilisiineja. Näin ollen näitä variantteja voidaan käyttää esimerkiksi tanko- tai nestesaippuasovellu-tuksissa, astianpesuainekoostumuksissa, piilolasien puhdis-tusliuoksissa tai tuotteissa, peptidihydrolyysissä, jäteve-15 den käsittelyssä, tekstiilisovellutuksissa, fuusion pilkko-misentsyymeinä proteiinien tuotannossa, jne. Tämän keksinnön mukaiset variantit osoittavat tehostunutta suoritusomi-naisuutta detergenttikoostumuksessa (verrattuna prekurso- riin). Tässä käytettynä tehostunut suoritusominaisuus de-20 tergentissä määritellään tiettyjen entsyymille herkkien tahrojen, kuten ruoho- tai veritahrojen parantuneena puh-distumisena, määritettynä tavallisella arviointitavalla ta- • · ...# vanomaisen pesuohjelman jälkeen.
• φ • I Keksinnön mukaisia subtilisiineja voidaan formuloi- • · · *···[ 25 da tunnettuihin jauhemaisiin ja nestemäisiin detergenttei- • · · · · hin, joiden pH on välillä 6,5 - 12,0 tasoilla noin 0,01 - 5 % ·.!.* (edullisesti 0,1 - 0,5 %) painosta. Nämä detergentti-puh- ««· \* * distuskoostumukset voivat sisältää myös muita entsyymejä, kuten tunnettuja proteaaseja, amylaaseja, sellulaaseja, li-30 pääse ja tai endoglykosidaaseja, samoin kuin saippuan ainek- • · .***. siä ja stabilointiaineita.
···
Keksinnön mukaisten subtilisiinien lisääminen ta- • · · *·[·* vanomaisiin puhdistuskoostumuksiin ei luo mitään erityisiä • · *···* rajoituksia käytölle. Toisin sanoen mikä tahansa lämpötila :V: 35 ja pH, joka on sopiva detergentille, on sopiva myös näille • · koostumuksille, kunhan pH on edellä esitetyllä alueella ja • · 21 lämpötila on subtilisiinin kuvattujen denaturoitumislämpötilojen alle. Lisäksi keksinnön mukaisia subtilisiineja voidaan käyttää puhdistuskoostumuksissa ilman detergentte-jä, jälleen joko yksin tai yhdessä saippuan ainesten ja 5 stabilointiaineiden kanssa.
Seuraava esitetään esimerkinomaisena, eikä sen pidä tulkita rajoittavan patenttivaatimusten piiriä.
Esimerkki 1
Rakenne GG3 6-geenin ekspressoimiseksi B. subtilik- 10 sessa B. lentuksesta olevan subtilisiinigeenin kloonaus ja rakentaminen ekspressiota varten tehtiin olennaisesti samoin kuin US-patentissa 5 185 258 on kuvattu. Plasmidia GGA274 (joka on kuvattu tämän hakemuksen kuviossa 4) muo-15 kattiin vielä seuraavalla tavalla, kuten kuviossa 5 on esitetty. Pstl-kohta, joka liitettiin GGA274-plasmidin rakentamisen aikana poistettiin oligonukleotidisuunnatulla muta-geneesillä, joka on kuvattu jäljempänä, jolloin oligonukle-otidilla oli seuraava sekvenssi 5' GAAGCTGCAACTCGTTAAA 3' 20 (SEQ ID NO. 1). Alleviivattu "A"-jäännös eliminoi restrik- tioentsyymin PstI tunnistussekvenssin ja muutti vastaavan aminohappo jäännöksen alaniinista treoniiniksi asemassa 274.
• ·
Treoniini asemassa 274 on villi tyyppinen jäännös, joka • · * 1 esiintyy alunperin kloonatuissa B. lentuksen subtilisiini- • · · —' *·2·[ 2 5 geenisekvensseissä. Subtilisiinia koodittava DNA-segmentti ···· · irrotettiin plasmidista GGA274 tai sen johdannaisista (GGT274 on esitetty kuviossa 5) pilkkomalla EcoRIrllä ja ··· * BamHI:llä. DNA-fragmentti alakloonattiin mutageneesiä var ten takaisin bakteriofagi M13-pohjaisiin vektoreihin, kuten 30 MP19. Mutageneesin jälkeen tehtiin pilkkominen EcoRI:llä ja • · j3; HindIII:lla, mitä seurasi kloonaus, jotta siirrettiin muta- ··· toitu subtilisiinigeeni takaisin ekspressioplasmidiin, ku- • · · *·[·1 ten GGA274 mutatoitujen subtilisiiniproteiinien ekspressio- • · *···1 ta ja talteenottoa varten.
• · • · · • · · • · · • · · 2 • · · 3 • ·
Esimerkki 2 22
Oligonukleotidiohj attu mutageneesi
Oligonukleotidiohjattu mutageneesi tehtiin, kuten julkaisussa Zoller, M. et ai. (1983), Methods Enzymol. 100: 5 468 - 500 on kuvattu. Esimerkkinä käytettiin synteettistä oligonukleotidia, jonka sekvenssi on 5' GCTGCTCTAGACAATTCG 3' (SEQ ID NO. 2) muuttamaan aminohappo jäännös asemassa 76 asparagiinista (N) asparagiinihapoksi (D) tai N76D. Alleviivatut jäännökset "G" ja "C" osoittavat muutoksia villi-10 tyyppisessä geenisekvenssissä. CA pitää leusiinin asemassa +75 ja muuttaa aminohapposekvenssiä liittämällä Xbal-res-triktioentsyymin Xbal-tunnistuskohdan (TCTAGA), samalla kun muutos GAC muuttaa asparagiinin asemassa +76 aspartaatiksi.
Mutageneesiä varten asemissa 99, 101, 103 ja 104 15 voidaan käyttää eri oligonukleotideja riippuen halutun mutaation yhdistelmästä. Esimerkiksi sekvenssin 5' GTAT-TAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT 3' (SEQ ID NO 3) omaavaa oligonukleotidia käytettiin tekemään samanaikaisesti seuraavat muutokset: S99D, S101R, S103A ja V104I yksittäi-20 sessä subtilisiinimolekyylissä. Samoin käytettiin oligonukleotideja, joiden sekvenssit olivat 5'TCAGGTTCGGTCTCGAGCGT-*:*·: TGCCCAAGGATTG 3' (SEQ ID NO. 4) ja 5' CACGTTGCTAGCTTGAGTT- ·’·*: TAG 3' (SEQ ID NO. 5) luomaan I107V ja vastaavasti N123S.
• · . Alleviivatut jäännökset osoittavat taas muutosta villityyp- • · t 25 pisestä sekvenssistä, mikä sai aikaan halutut muutokset jo- • · ko aminohapposekvenssiin tai restriktioentsyymin tunnistus- • · · sekvensseihin.
• · · *·* * Esimerkki 3
Subtilisiinivarianttien proteolyyttinen aktiivisuus • · *.*.* 30 Esimerkin 2 menetelmien mukaisesti tehtiin taulu- ··· ·...· kossa III luetellut variantit. Kunkin näistä subtilisiini- varianteista proteolyyttinen aktiivisuus on esitetty taulu- • · · .···. kossa II. Kineettiset parametrit kcat» KM ja kcat/KM määri- • 9 *!* tettiin seuraavan synteettisen peptidisubstraatin hydrolyy- • · ·.·.· 35 sillä: sukkinyyli-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilidi • · ·.’·· käyttämällä menetelmää, jonka ovat kuvanneet P. Bonneau, et 23 ai. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113 (3) s. 1030. Lyhyesti sanottuna pieni määrä subtilisiinivariantin kantaliuosta lisättiin 1 cm kyvettiin, joka sisälsi substraattia liuotettuna 0,1 M Tris-HCl-puskuriin, pH 8,6 ja säädettiin lämpö 5 25 °C:seen. Reaktioprosessia seurattiin spektrofotometri- sesti mittaamalla reaktiotuotteen p-nitroaniliini reaktiota 410 nm:ssa. Kineettiset parametrit saatiin käyttämällä ei-lineaarista regressioalgoritmia soveltamaan reaktionopeus ja tuotteen konsentraatio kustakin reaktiosta Michaelis-10 Menten-yhtälöön.
• · ·· · • · · • · • · • · · • · · • · · • · • · « • · · • · · • · · • · · • · · • · • 1 · • · · • · • · · • · • · • · · • · # · · • · · • · ·«· • · • · ··· • 1 • · · « · · • · · • · · • ·· • ·
Taulukko II
24
Kineettiset parametrit kcat/ 1¾ ja kcatKM määritettynä Bacillus lentuksen subtilisiinille ja varianteille
Entsyymi k,.,,; (s11) K« (M) kc.t/K„ S. Ientus Subtiilein 170 0,00078 2,18x1ο1 N76D 219 0,0008 2,74x10s N7ED/S99D 88 0,00061 1,44x10s N76D/S103A 400 0,0014 2,86x10s N76D/V104I 459 0,0011 4,17x10s N76D/I107V 219 0,0011 1,99x10s N76D/N123S 115 0,0018 6,40x101 N76D/S99D/S101R 146 0,00038 3,84x10s N76D/S99D/S103A 157 0,0012 1,31x10s N76D/S99D/V104I 247 0,00097 2,55x10s N76D/S101R/S103A 405 0,00069 5,90x10s N76D/S101R/V104I 540 0,00049 1,10x101 N76D/S103A/V104I 832 0,0016 5,20x10s N76D/V104I/I107V 497 0,00045 1,10x101 N76D/V104Y/I107V 330 0,00017 1,90x101 N76D/V104I/N123S 251 0,0026 9,65x101 N76D/X107V/K123S 147 0,0035 4,20x101 N76D/S99D/S101R/S103A 242 0,00074 3,27x10s N76D/S99D/S101R/V104I 403 0,00072 5,60x10s . N76D/S99D/S103A/V104I 420 0,0016 2,62x10s N76D/S101R/S103A/V1041 731 0,00065 1,12x101 .**.·. N76D/S103A/V104I/H123S 321 0,0026 1,23x10s * N76D/V104I/I107V/N123S 231 0,003 7,70x101 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0,00098 ' 6,37x10s ....: N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0,0043 4,51x101 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 311 0,0023 1,35x10s • · · • · · 5 • · · • · ·
Taulukossa II luetellut tulokset osoittavat, että • · *.1.· kaikki testatut subtilisiinivariantit säilyttävät proteo- • · · :...: lyyttisen aktiivisuutensa. Lisäksi tulosten yksityiskohta!- .·.·. 10 nen analyysi tuo ilmi, että Bacillus lentuksen subtilisii- • · · — • · .···. nin proteolyyttinen aktiivisuus oli merkitsevästi muuttunut • · eri substituutiokombinaatioilla aminohappojäännöksiin, jot-ka vastaavat asemia 76, 99, 101, 103, 104, 107 ja 123 Ba- • · •.‘•j cillus amyloliquefaciensissa.
Esimerkki 4 25
Subtilisiinivarianttien lämpöstabiliteetti
Bacillus lentuksen subtilisiinille ja tämän keksinnön mukaisille varianteille, jotka on tehty esimerkin 2 me-5 netelmien mukaisesti, havaittu lämpöstabiliteetti on esitetty taulukossa III. Puhdistettu entsyymi, 15 pg/ml 0,1 M glysiinissä 0,01 % Tween-80:ssä, pH 10,0 50 mM CaCl2:n kanssa tai ilman sitä, mitattiin pieniin koeputkiin ja in-kuboitiin 10 °C:ssa 5 minuuttia, 10 °C - 60 °C minuutin ai-10 kana ja 60 °C:ssa 20 minuuttia. Koeputket laitettiin sitten jäihin 10 minuutiksi. Putkista otetuista samansuuruisista näytteistä analysoitiin entsyymiaktiivisuus lisäämällä 1 cm kyvetteihin, jotka sisälsivät 1,2 mM synteettistä pepti-disubstraattia sukkinyyli-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitro-15 anilidia liuotettuna 0,1 M Tris-HCl-puskuriin, pH 8,6, lämpötila säädetty 25 °C:seen. Alun lineaarista reaktionopeutta seurattiin spektrofotometrillä mittaamalla reaktiotuotteen p-nitroaniliini absorbanssia 410 nrrussa ajan funktiona. Tulokset on esitetty prosentteina aktiivisuudesta ennen 20 kuumennusta. Taulukossa III luetellut tulokset osoittavat, että suurin osa varianteista osoittaa lämpöstabiliteettia ·;··; verrattuna Bacillus lentuksen subtil isiini in (24 26:sta) testiolosuhteissa, kun oli lisätty 50 mM CaCl2. Testiolo- • · . .·. suhteissa ilman 50 mM CaCl2-lisäystä suuri joukko variant- • · · 25 teja (19 26:sta) on merkitsevästi stabiilimpia kuin Bacil-lus lentuksen subtilisiini. Lisäksi variantit N76D/S99D, • · · N76D/V104I, N76D/S99D/ V104I, N76D/S103A/V104I, • · ·
: N76D/V104I/I107V, N76D/V104Y/ I107V ja N76D/S101R/S103A/V104I
ovat merkitsevästi stabiilimpia kuin ainoa substituutiova- • · ϊ.ϊ.ϊ 30 riantti N76D testiolosuhteissa ilman lisättyä 50 mM CaCl2:ia.
·»· • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · 1 · • · · • · · • ·
Taulukko III
26
Bacillus lentuksen subtilisiinille ja varianteille määritetty lämpöstabiliteetti pH:ssa 10, 60 °C:ssa ± 50 mM CaCl2-lisäys 5 % jäljellä alkuperäisestä aktiivisuudesta
Entsyymi - caCl2 + CaCla B. lentue Subtilisin 2 96 N76D 34 97 N76D/S99D 49 98 N76D/S103A 26 92 N76D/V104I 58 98 N76D/I107V 32 96 N76P/N1235 0 97 N76P/S99D/S101R 30 100 N76P/S99D/5103A 36 100 N76P/S99P/V104I 48 97 N76D/S1D1R/S103A 26 100 N76P/S101R/V104I 3B 100 N7 6D/S103A/V3041 58 100 N76D/V104I/X107V 60 97 N76D/V104Y/1107V 48 74 H76D/V104I/N123S 0 98 N76D/I107V/N123S 16 100 . N76D/S99D/S101R/S103A 38 100 *·**· N76D/S99D/S101R/V1041 33 100 W6U/S99D/S103Am04I 38 98 • ·’ N76D/S101R/S103A/V104I 40 99 : N76D/S103A/V104I/N123S 1 98 N76D/V104I/I107V/N1235 3 99 ’*’*· N76D/S99D/S101R/S103A/V1042 36 99 . N76D/S99D/S103A/V104I/M123S 2 95 *·:·* N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/M123S 0 100 • · · • · ♦ • · ·
Esimerkki 5 • *
Oligonukleotidiohjattu mutageneesi yksijuosteisella • · · ·...· 10 BNA-templaatilla, joka luotiin B. lentuksen varianttien
Phagemid-rakenteella • · · ··! A. B. lentus -varianttien rakentaminen • · *!* Mutageneesiprotokolla oli olennaisesti sama kuin • · V.· edellä esimerkissä 2 on kuvattu. Yksijuosteinen DNA-tem- • · !/.: 15 plaatti luotiin phagemid-menetelmällä. Phagemid-vektorin ra- 27 kentamiseksi yksijuosteisen DNA-templaatin luomista varten me rakensimme ensin vektorin pBCDAICAT. Vektorirakenteen kartta on esitetty kuviossa 8. Ensin Clal - Clal -fragmentti, joka kooditti CAT-geeniä pCl94-plasmidista (Ho-5 rinouchi, S. ja Weisblum, B., J. Bacteriol. 150: 8 - 15, 1982) kloonattiin pUC19:n polylinkkerialueen Accl-kohtaan (New England Bio-Labs, Beverly, MA), jotta tehtiin plasmidi pUCCHL ja 0,6 ke:n EcoRI-Dral-fragmentti GG36DAI:ta koodit-tavan DNA:n 5'-päästä kloonattiin pBSKS-plasmidin EcoRI- ja 10 EcoRV-kohtiin (Stratagene, Inc., San Diego, CA), jotta saatiin pBC2SK5. Plasmidin pBC2SK5 ainoa EcoRI-kohta poistettiin pilkkomalla EcoRI:llä, mitä seurasi täyttö, jota katalysoi T4-DNA-polymeraasi, ja uudelleen ligaatio luomaan plasmidi pBC2SK-5R, jossa ei ole EcoRI-kohtaa. EcoRl-Dral-15 fragmentti, joka kloonattiin pBCSK-5R:ään, eristettiin Pstl-Hindlll-fragmenttina ja kloonattiin Patl-Hindlll-kohtaan pUCCHL:ssä (osa pUC19:n polylinkkeriä), jotta luotiin plasmidi pUCCHL5R. GG36DAI-geeniä koodittava sekvenssi irrotettiin EcoRl-BamHl-fragmenttina ja kloonattiin EcoRI-20 BAmHI-kohtiin pUCCHL5R:ssä, jotta saatiin pUCCAT. Suuri EcoRl-Hindlll-fragmentti pUCCHL5R:stä kloonattiin sitten *:··· EcoRI- ja Hindlll-kohtiin BS2KS+:aan, jotta luotiin plasmi- di pBCDAICAT.
• · . .·. Yksijuosteisen DNA:n luomiseksi pBCDAICAT:n sisäl- • · ♦ 25 tävä E. coli infektoitiin faagilla R408 (saatu Stratagenes- • · . tä, San Diego, CA) seuraten protokollaa, jonka ovat kuvan- • · ·
Hl neet Russel, M., Kidd, S ja Kelley, M. R., Gene 45: 333 - • · · ’·’* 338, 1986. Heti kun yksijuosteinen DNA-templaatti oli saa tavilla, toteutettiin tavanomaiset mutageneesimenetelmät, • · V.· 30 kuten edellä on kuvattu esimerkissä 2. Tiettyjen mutanttien ··· rakentaminen on esitetty yksityiskohtaisesti jäljempänä selventämistarkoituksessa.
• · · _··'·_ B. lent uksen (GG36) N76D/S103A/Vl04l/L217H:n raken- • * *Γ tamiseksi käytettiin EcoRI-BamHI-DNA-fragmenttia, joka koo- • · 35 ditti GG36 N76D/S103A/V104I:tä pUCCAT:n rakenteessa (katso • · ·.*·{ kuvio 8) , luomaan plasmidi pBCDAICAT. Kun yksi juosteinen 28 DNA oli tehty edellä kuvatun protokollan mukaisesti, käytettiin mutageneesialuketta, jolla oli seuraava sekvenssi: * *** ** x ciai 5
5' TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT 3 ' (SEQ
ID NO. 13) L217H:n valmistamiseen. Samoin kuin aikaisemmin, alleviivatut jäännökset osoittavat nukleotidimuutoksia, jotka tehtiin, ja x Clal osoittaa, että olemassa oleva Clal-10 kohta eliminoitiin mutageneesin jälkeen. Mutageneesiprotokolla oli esimerkissä 2 kuvatun lainen. Mutageneesin jälkeen plasmidi-DNA seulottiin ensin Clal-kohdan poistumisen suhteen ja ne kloonit, joista puuttui Clal-kohta, saatettiin DNA-sekvenssianalyysiin, jotta todennettiin DNA-sek-15 venssi, joka teki muutoksen L:stä H:ksi 217. aminohappo-jäännöksessä.
B. BPN'-varianttien rakentaminen ja niiden ekspres-sio B. subtiliksessa B. amyloliquefaciensin (BPN') N76D/Q103A/Y104I/Y217L 20 rakentaminen tehtiin samalla tavalla, paitsi kahden peräkkäisen vaiheen suhteen. N76D saatettiin ensin BPN' • j··· Y217L:ään, jotta tehtiin BPN1 N76D/Y217L ja tehtiin toinen mutageneesi, jotta muutettiin BPN' N76D/Y217L BPN' N76D/ • · Q103A/Yl04l/Y217L:ksi. Yksijuosteisen DNA-templaatin luomi- • · · ***. 25 seksi ensimmäistä mutageneesiä varten, EcoRI-BamHI-frag- • · . mentti, joka kooditti BPN' Y217L -subtilisiinia (joka on • · · *·|·* johdettu Y217-plasmidista, jonka ovat kuvanneet Wells, J.
*·* * et ai., PNAS 84, 5167, 1087) käytettiin rakentamaan plasmi- di pUCCATFNA (katso kuvio 9). pUCCATFNA-plasmidia, joka si- 30 sälsi BPN' Y217L:n, käytettiin rakennettaessa pBCFNACAT- plasmidi (kuvio 9) . Yksijuosteinen DNA luotiin, kuten edel- .·[·. lä on kuvattu. BPN' N76D/Y217L:n luomiseksi käytettiin muu- • · · toksen N76D luomiseen oligonukleotidialuketta, jonka sek- • · *:* venssi oli VV 35 * *** ** x Xbal • · 5' C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G 3 ' (SEQ ID NO. 14) . Yksi juos teinen DNA valmistettiin sitten pBCFNACAT-plasmidista, joka sisälsi BPN' N76D/Y217L:n 29 (pBCFNACAT-plasmidi N76D-mutageneesin jälkeen) ja mutageni-5 soitiin toisella oligonukleotidilla, jonka sekvenssi oli * *** ** x pvuii 5' GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT 3' 10 (SEQ ID NO. 15), jotta saatiin BPN' N76D/Q103A/Y104I/Y217L. Kaikki kloonaukseen sisällytetyt vaiheet, yksijuosteisen DNA:n valmistus, mutageneesi ja mutanttien seulonta tehtiin, kuten edellä on esitetty.
BPN1-geenin ja sen varianttien ekspressio saavutet-15 tiin integroimalla plasmidi-DNA (pBCFNACAT, joka sisälsi eri varianttien BPN'-geenin) suoraan proteaasipuutteiseen Bacillus subtilis -kantaan, kuten RE 34,606:ssa on esitetty.
Useita variantteja tehtiin esimerkkien 2 ja 5 mu-20 kaisesti. Tällaisille varianteille luotiin kinetiikkatiedot ja stabiliteettitiedot. Kinetiikkatiedot luotiin käyttäen ·;··· esimerkissä 3 kuvattuja menetelmiä, ja ne on esitetty tau- lukossa IV. Stabiliteettitulokset saatiin, kuten tässä on • · • · . .·. kuvattu. Tulokset on esitetty taulukossa V.
• · · 25 Lämpöstabiliteettianalyysimenettely • ·
. Puhdistettu entsyymi vaihdettiin puskuriin 0,1 M
• · · glysiini pH 10,0, 0,01 % Tween-80 lisäämällä entsyymi pyi- • · · *·1 vääseen, joka käsitti Sephadex G-25:tä tasapainotettuna tällä puskurilla ja eluoimalla entsyymi pylväästä käyttäen • · :.V 30 samaa puskuria.
• · ·
Koeputkeen, joka sisälsi 0,1 M glysiiniä, 0,01 % .·)·. Tween-80:tä pH 10,0, lämpötila säädetty 60 °C:seen, lisät- • · · I.I tiin puskuriin vaihdettu entsyymi lopulliseen entsyymikon- • · *!1 sentraatioon 15 μg/ml.
• · V.: 35 60 °C:n inkubaatiosta otettiin samankokoisia näyt- teitä eri aikoina ja analysoitiin niistä välittömästi ent- 30 syymiaktiivisuus lisäämällä 1 cm kyvettiin, joka sisälsi 1,2 mM synteettistä peptidisubstraattia sukkinyyli-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilidia liuotettuna 0,1 M Tris-HCl-puskuriin pH 8,6, lämpötila säädetty 25 °C:seen. Alun line-5 aarista reaktionopeutta seurattiin spektrofotometrillä mittaamalla reaktiotuotteen p-nitroaniliinin absorbanssia 410 nm:ssa ajan funktiona.
Puoliintumisaika, joka on sen ajan pituus, joka vaaditaan 50-%:iseen entsyymi-inaktivaatioon, määritettiin 10 reaktionopeuden ensimmäisen asteen käyrältä 60 °C:ssa tehdyn inkubaatioajan funktiona.
Tulokset on esitetty taulukossa V prosentteina puoliintumisajasta, joka määritettiin Bacillus lentuksen sub-tilisiinille (GG36) samanlaisissa olosuhteissa.
····· • · t· · • · · • · • · m • · · • · · ··· ····· • · • · · • · · ··· ··· • · · « · · • ♦ • · « • · · • · ··· • · • ♦ ··♦ • · • · · • t · • ♦ ··· • · • · ··· • · • · · • · · • · 1 · • · · • ·· • ·
Taulukko IV
31
Entsyymi xe*t m (6") (MM) (β·»Μ·Μ B. lentus subtilisin 170 0,78 2,20E+05 N76D/S103G/V104I* 3B0 1,4 2,70E+05 N76D/S103A/V104F 730 0,33 2,20E+06 N76D/S103A/V104N 790 2,8 2,80E+05 N76D/S103A/V104B 170 0,83 2,0OE+O5 N76D/S103A/V104T 370 1,9 2,00E+05 N76D/S103A/V104W 880 0,31 2,B0E+06 N76D/S103A/V104Y 690 0,5 l,40E+06 K27R/N7 6D/V10 4Y/N12 3 S 500 1,2 4,20E+05 N76D/S101G/S103A/V104I* 620 1,3 4,80E+05 J476D/S103A/V1D4I/S105A* 550 1,3 4,20E+05 N76D/S103A/V104I/S105D* 440 1,7 2,60E+05 N76D/S103A/V104T/I107A* 120 5,7 2,10E+04 N76D/S103A/V104T/I107L* 310 3,2 9,70E+04 N76D/S103A/V104I/L126A 90 2,2 4,10E+04 N76D/S103A/V104I/L126F 1B0 1,9 9,50E+04 N76D/S103A/V104I/L126I 100 2,4 4,20E+04 N76D/S103A/V104I/L126V 64 3,2 2,OOE+04 N76D/S103A/V104I/S128G* 560 1,7 3,30E+05 N76D/S103A/V104I/S128L* 430 3,8 l,10E+05 N76D/S103A/V104I/L135A 140 0,76 1,B0E405 N76D/S103A/V104I/L135F 390 0,69 5,70E+05 N76D/S103A/V104I/L135I 110 0,73 l,50E+05 N76D/S103A/V104I/L135V 140 0,B6 l,60E+05 N76P/S103A/V104I/S156E* 170 2,6 6,50E+04 N76D/S103A/V104I/S166D» 160 3,5 4,60E+04 K76D/E103A/V104I/D197E 510 1,4 3,60E+05 N76D/S103A/V104I/N204A* 530 1,1 4,80E+05 N76D/S103A/V104I/J4204G* 580 1,4 4,10E+05 N76D/S103A/V104I/N204C* 370 1,3 2,90E+05 N76/S103A/V104I/P210I* 500 1,2 4.20E+05 N76D/S103A/V104I/L217H* 80 0,63 1,30E+05 N76D/S103A/V104I/M222A 70 3,1 2,30E404 N76D/S103A/V1041/M222S 80 3,1 2,60E+04 H76D/S103A/V104I/T260P 660 1,5 4,40E+05 ·;··· N76D/S103A/V1041/S265N 590 1,3 4,50E+05 K27R/H76D/V104Y/1107V/N123S 220 1,4 l,60E+05 ·*·*: K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 430 1,1 3,90E+05 * * K27R/N76D/V104Y/H123S/N204C 400 1,1 3,60E+05 : K27R/N76D/V104y/14123 S/0206L 440 1,2 3,70E+05 **· K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 440 1,2 3,70E+05 •I··· K27R/N76D/V104Y/14123S/N218S 760 0,98 7,80E+05 K27R/K76D/V104Y/N123S/T260P 410 1,2 3,40E+05 ; K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 390 1 3,90E+05 ···’ N76D/S103A/V1041/L126F/S265N 170 2,1 8,10E+04 ;*·*; N76D/S103A/V104I/S156E/S166D* 40 6,3 6,40E+03 ·* ’ K27R/N76D/V104Y/14123S/G195E/G197E 410 0,98 4,20E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 540 0,66 8,20E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N21BS 770 0,79 9,80E+05 K27R/N76D/V104Y/14123S/N204C/N218S 610 0.99 6,20E+05 *.*.* K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206WN21BS 580 0,78 7,40E+05 .·*·. K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 660 1 6,60E+05 ·...· K27R/N76D/V104Y/N123S/N21BS/T274A 590 0,89 6,60E+05 K27R/N76D/V104Y/Q109S/14123S/N21BS/T274A 520 1 5,20E+O5 • · · **[|* K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N21BS 460 0,65 7,10E+05 • · • · *** B. aitiyloliguefaciens subtilisin (BPN1) 50 0,14 3,60E+05 <·].< BPN'-N7 6D/Y217L* 360 0,46 8f30E+05 • · · • · ;*·,· 5 * Nämä mutantit on tehty kuten esimerkissä 5 on kuvattu, kaikki muut on * * tehty, kuten esimerkissä 2 on kuvattu.
Taulukko V
32
Entsyymi Lämpöstabiliteetti (% natiivin entsyymin puoliintumisajasta) B. lentus subtilisin 100 N76D 590 N76D/S99D 840 N76D/S103A 390 N76D/V104I 650 N76D/I107V 710 N76D/N123S 70 N7 6D/S99D/S101R 610 N76D/S99D/S103A 590 N76D/S99D/V104I 910 N76D/S101R/S103A 930 N76D/S101R/V104I 500 N76D/S103A/V104I 460 N76D/S103G/V104I1 370 N76D/S103A/V104F 480 N76D/S103A/V104N 230 N76D/S103A/V104S 230 N76D/S103A/V104T 370 N76D/S103A/V104W 280 N76D/S103A/V104Y 400 N76D/V104I/I107V 940 N76D/V104Y/I107V 820 N76D/V104I/N123S 80 N76D/I107V/N123S 150 K2 7R/N7 6D/V104 Y /N12 3 S 100 N76D/S99D/S101R/S103A 570 N76D/S99D/S101R/V104I 1000 N76D/S99D/S103A/V104I 680 N76D/S101G/S103A/V104I1 390 : ;1 N76D/S101R/S103A/V104I 470 N76D/S103A/V104I/S105A1 360 N76D/S103A/V104I/S105D1 370 N76D/S103A/V104T/I107A1 270 : N76D/S103A/V104T/I107L1 230 .’I: N76D/S103A/V104I/N123S 110 : N76D/V104I/I107V/N123S 220 N76D/S103A/V1041/L126A 270 . . N76D/S103A/V104I/L126F 950 N76D/S103A/V104I/L126I 410 • · · • · • · • · · • · • « · • · · • · • · · • · • · ··· • · • · · • · · • · · • · · • · · • · 33 N76D/S103A/V104I/L126V 320 N76D/S103A/V104X/S128G* 640 N76D/S103A/V104I/S128L* 760 N76D/S103A/V104I/L135A 230 N76D/S103A/V104I/L135F 200 N76D/S103A/V104I/L135I 510 N76D/S103A/V104I/L135V 500 N76D/S103A/V104I/S156E* 120 N76D/S103A/V104I/S166D* 590 N76D/S103A/V104I/D197E 460 N76D/S103A/V104I/N204A* 230 N76D/S103A/V104I/N204G* 240 N76D/S103A/V104I/N204C* 500 N76D/S103A/V104I/P210I* 1370 N76D/S103A/V104I/L217H* 60 N76D/S103A/V104I/M222A 520 N76D/S103A/V104I/M222S 490 N76D/S103A/V104I/T260P 490 N76D/S103A/V104I/S265N 360 K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 210 K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 120 K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 110 K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 380 K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 140 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 270 K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 40 K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 60 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 590 N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 110 ”**i N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 810 N76D/S103A/V104I/S156E/S166D* 220 : K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 90 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S .250 ....: K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N21BS 270 K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 460 :.:.: K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 1400 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 310 K2 7R /N7 6D/V104Y/N123S/N218S/T274A 180 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 90 :Y: K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A 230 I.! K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 240 • · • · • · · .*. Β. amyloliguefaciens subtilisin (ΒΡΝ1} 100 ΒΡΝ’ -N76D/Y217L* 420 ··· » · *:* * Nämä mutantit on tehty kuten esimerkissä 5 on kuvattu, • · kaikki muut on tehty, kuten esimerkissä 2 on kuvattu.
• · • · · • ·« • · 34
Esimerkki 6 Pesusuoritustesti
Aikaisemmissa esimerkeissä kuvattujen varianttien pesusuoritusta arvioitiin määrittämällä EMPA 116 -tahran 5 poistumista (veri/maito/noki puuvillalla) kangastilkuista (Testfabrics, Inc., Middlesex, NJ 07030).
Kuusi EMPA 116 tilkkua, jotka oli leikattu 7,62 -11,43 cm kokoisiksi, ja joissa oli rei'itetyt reunat, asetettiin kuhunkin Model 7243S Terg-O-Tometer astiaan (United 10 States Testing Co., Inc., Hoboken, NJ) , joka sisälsi 1 000 ml vettä, 15 gpg:n kovuudella (Ca++:Mg++: : 3 :1: :w: w) , 7 g de-tergenttiä ja entsyymiä sopivasti. Detergenttipohja oli WFKl-detergentti wfk - Testgewebe GmbH, Adlerstrasse 42,
Postfach 13 07 62, D-47759 Krefeld, Saksa: 15
Komponentti % lopullises ta koostumuk- _ sesta
Zeoliitti A__25_
Natriumsulfaatti__25_
Kalsinoitu sooda__10_
Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti__8,8_
Alkoholietoksylaatti (7-8 EO) 4,5 • · . .·. Natriumsaippua 3 • · · '» ....... — I I , — -
Natriumsilikaatti (Si02 :Na20: : 3,3 :1) 3
• · iBsss^BsaesssssaasssaaBasssBsss^BSS^sssaBSSBsaBB
35
Natriumperboraattimonohydraatti saatiin Degussa Corporationista, Ridgefield-Park, NJ 07660. Sokalan CP5 saatiin BASF Corporationista, Parsippany, NJ 07054. Mykon ATC Green (TAED, tetra-asetyylietyleenidiamiini) saatiin War-5 wick International Limitedistä, Mostyn, Holywell, Clwyd CH8, 9HE, Englanti. Tinopal AMS GX saatiin Ciba-Geigy Corporationista, Greensboro, NC 274129.
Kuutta EMPA-tilkkua pestiin detergentissä, joka oli varustettu entsyymillä 30 minuuttia 60 °C:ssa ja huuhdel-10 tiin sen jälkeen kahdesti 5 minuuttia 1 000 ml:11a vettä. Entsyymit lisättiin lopullisina konsentraatioina 0,05 - 1 ppm standardikäyriä varten ja 0,25 ppm rutiinianalyysejä varten. Tilkut kuivattiin ja silitettiin ja tilkkujen reflek-tanssi mitattiin käyttäen L-arvoa L*a*b*-asteikolla Minolta 15 Chroma Meterissä, malli CR-200 (Minolta Corporation, Ramsey, NJ 07446) . Suorituskyky on esitetty prosentteina B. lentuksen (GG36) proteaasin suorituskyvystä ja laskettiin jakamalla B, lentuksen (GG36) proteaasin määrä sillä variant tiproteaas in määrällä, joka tarvittiin saamaan aikaan 20 sama tahranpoistosuoritus x 100. Tulokset on esitetty taulukossa VI.
• « ·· · • · · • · • · ♦ · · • · · ·♦· • · • · · • · « ··· ··· ♦ · · • · · • · • · · « · · • « • · • · ··♦ • · ♦ « ♦ • · · • · ··· • · • · ··♦ • · t « · • · « ♦ · ♦ « • · ♦ • ♦♦ • ·
Taulukko VI
36
Entsyymi Pesusuoritus B. lentus subtilisin 100 N76D 310 N76D/S103A 230 N76D/V104I 130 N76D/I107V 160 N76D/S99D/S101R 370 N76D/S99D/S103A 290 N76D/S101R/S103A 130 N76D/S101R/V104I 300 N76D/S103A/V104I 320 N76D/S103G/V104I 160 N76D/S103A/V104F 210 N76D/S103A/V104N 110 N76D/S103A/V104T 170 N76D/V104I/I107V 210 N76D/S99D/S101R/S103A 220 N76D/S99D/S101R/V104I 140 N76D/S101G/S103A/V104I 170 N76D/S101R/S103A/V104I 150 N76D/S103A/V1D4I/S105A 170 N76D/S103A/V104T/I107A 120 N76D/S103A/V104T/I107L 110 N76D/S103A/V104I/L126F 110 N76D/S103A/V104I/S128G 280 N76D/S103A/V104I/L135I 160 N76D/S103A/V104I/L135V 160 . N76D/S103A/V104I/D197E 170 N76D/S103A/V104I/N204A 160 N76D/S103A/V104I/N204G 150 : i N76D/S103A/V104I/P210I 470 : N76D/S103A/V104I/M222A 100 N76D/S103A/V104I/T260P 280 N76D/S103A/V104I/S265N 190 • · · • · · • · · V · 5 Esimerkki 7
Proteaasin stabiliteetti nestemäisessä detergentti-koostumuksessa • · .***. Proteaasin stabiliteetin inaktivoi tumista vastaan * · • · · .·, vertailu nestemäisessä detergenttikoostumuksessa tehtiin • · · ’·[·* 10 Bacillus lent uksen subtilisiinille ja sen varianttientsyy- *··.* mille N76D/S103A/V104I tässä esitetyn menetelmän mukaises- * ti. Tutkimuksessa käytetty detergenttikoostumus oli kaupas- • · ta ostettu pullollinen Tide Ultra nestemäistä pyykinpesude-tergenttiä, jonka Procter & Gamble Company on valmistanut 37 USA:ssa. Detergenttikoos tunnuksen lämpökäsittely oli välttämätön inaktivoimaan in situ -proteaasin. Tämä tehtiin inku-boimalla detergenttiä 96 °C:ssa 4,5 tunnin ajan. B. lentuk-sen subtilisiinin ja N76D/Sl03A/V104l-variantin konsent-5 roidut valmisteet, alueella 20 grammaa/litra entsyymiä, lisättiin sitten lämpökäsiteltyyn Tide Ultraan huoneenlämmössä lopulliseen konsentraatioon 0,3 grammaa/ litra entsyymiä detergenttikoostumuksessa. Lämpökäsiteltyä detergenttiä pro-teaasilisäyksellä inkuboitiin sitten vesihauteessa, jonka 10 lämpötila oli säädetty 50 °C:seen. Inkubointiputkista otettiin samansuuruiset näytteet 0, 24, 46, 76 ja 112 tunnin välein ja analysoitiin entsyymiaktiivisuus lisäämällä 1 cm kyvettiin, joka sisälsi 1,2 mM synteettistä peptidisubst-raattia suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilidi liuotettuna 0,1 15 M Tris-HCl-puskuriin, pH 8,6 ja lämpötila säädettynä 25 °C:seen. Alun lineaarista reaktionopeutta seurattiin spektrofotometrisesti mittaamalla reaktiotuotteen p-nitro-aniliini absorbanssia 410 nm:ssa ajan funktiona. Kuten kuviossa 10 on esitetty, N76D/S103A/ V104l-variantilla on ha-20 vaittu olevan olennaisesti suurempi stabiliteetti inakti- vaatiota vastaan kuin natiivilla B. lentuksen entsyymillä. ·;··· Arvioitu puoliintumisaika inaktivaatiolle Tide Ultra deter- ·*.*. genttikoostunnuksessa näille kahdelle entsyymille erityisis- • · . sä testiolosuhteissa on 45 tuntia B. lentuksen subtilisii- • · · — ....· 25 nille ja 125 tuntia N76D/S103A/ Vl04l-variantille.
• · . Kautta koko tämän patenttihakemuksen on tehty viit- • · · • · · *** tauksia eri aminohappoihin tavanomaisilla yksi- ja kolmi- • · · *·* * kirjainkoodeilla. Tällaiset koodit on identifioitu julkai sussa Dale, J. W. (1989), Molecular Genetics of Bacteria, • 0 30 John Wiley & Sons, Ltd., Liite B.
···
Vaikka edellä on kuvattu keksinnön edullisia suori-tusmuotoja, on sen alan, johon keksintö kuuluu, ammattilai- • · ·
• * · I I
.···. sille ilmeistä, että kun keksintö on ymmärretty kokonaisuu- • · dessaan, useita muutoksia ja samanarvoisia muunnoksia voi- • · ·.·.· 35 daan tehdä eroamatta keksinnön piiristä, joka määritellään • · mukaan liitetyissä patenttivaatimuksissa.
38
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT: Graycar, Thomas P Bott, Richard R Wilson, Lori J
(ii) TITLE OF INVENTION: Subtilisin Variants (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 15 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Genencor International, Inc (B) STREET: 180 Kimball Way (C) CITY: So. San Francisco
(D) STATE: CA
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 94080 (V) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk IB) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: 13-OCT-1994 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Horn, Margaret A.
(B) REGISTRATION NUMBER: 33,401 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: GC235-2 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: {415) 742-7536 (B) TELEFAX: (415) 742-7217 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 19 base pairs : .· (B) TYPE: nucleic acid . (C) STRANDEDNESS: single ::: ID) TOPOLOGY: linear • · · ·:··: (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · · • · · • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: • · · GAAGCTGCAA CTCGTTAAA 19 . . (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: • · · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ; *; (A) LENGTH: 18 base pairs ··· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ::: (D) TOPOLOGY: linear • · .**·. (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · · • · • · · ’;*·) (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: • e e
*· ” GCTGCTCTAG ACAATTCG IB
39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: ·· · '· * : CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG 22 • e : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: • e · ....: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: • * (A) LENGTH: 1497 base pairs • (B) TYPE: nucleic acid • : : (C) STRANDEDNESS: single ::: (D> TOPOLOGY: linear • · · ’·’ (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: • · · :ΐ(ιί GGTCTACTAA AATATTATTC CATACTATAC AATTAATACA CAGAATAATC TGTCTATTGG 60 .v. TTATTCTGCA AATGAAAAAA AGGAGAGGAT AAASAGTGA5 AGGCAAAAAA GTATGGATCA 120 • · · :.: GTTTGCTGTT TGCTTTAGCG TTAATCTTTA CGATGGCGTT CGGCAGCACA TCCTCTGCCC 180 e e • · ^ *:* AGGCGGCAGG GAAATCAAAC GGGGAAAAGA AATATATTGT CGGGTTTAAA CAGACAATGA 240 : : : gcacgatgag cgccgctaag aagaaagatg tcatttctga aaaagocggg aaagtgcaaa 300 • 9 :*·.· AGCAATTCAA ATATGTAGAC GCAGCTTCAG TCACATTAAA CGAAAAAGCT GTAAAAGAAT 360 • · 40 tgaaaaaaga cccgagcgtc gcttacgttg AAGAAGATCA CGTAGCACAT GCGTACGCGC 420 AGTCCGTGCC TTACGGCGTA TCACAAATTA AAGCCCCTGC TCTGCACTCT CAAGGCTACA 480 CTGGATCAAA TGTTAAAGTA GCGGTTATCG ACAGCGGTAT CGATTCTTCT CATCCTGATT 540 TAAAGGTAGC AAGCGGAGCC AGCATGGTTC CTTCTGAAAC AAATCCTTTC CAAGACAACA 600 ACTCTCACGG AACTCACGTT GCCGGCACAG TTGCGGCTCT TAATAACTCA ATCGGTGTAT 660 TAGGCGTTGC GCCAAGCGCA TCACTTTACG CTGTAAAAGT TCTCGGTGCT GACGGTTCCG 720 GCCAATACAG CTGGATCATT AACGGAATCG AGTGGGCGAT CGCAAACAAT ATGGACGTTA 780 TTAACATGAG CCTCGGCGGA CCTTCTGGTT CTGCTGCTTT AAAAGCGGCA GTTGATAAAG B40 CCGTTGCATC CGGCGTCGTA GTCGTTGCGG CAGCCGGTAA CGAAGGCACT TCCGGCAGCT 900 CAAGCACAGT GGGCTACCCT GGTAAATACC CTTCTGTCAT TGCAGTAGGC GCTGTTGACA 960 GCAGCAACCA AAGAGCATCT TTCTCAAGCG TAGGACCTGA GCTTGATGTC ATGGCACCTG 1020 GCGTATCTAT CCAAAGCACG CTTCCTGGAA ACAAATACGG GGCGTACAAC GGTACGTCAA 1080 TGGCATCTCC GCACGTTGCC GGAGCGGCTG CTTTGATTCT TTCTAAGCAC CCGAACTGGA 1140 CAAACACTCA AGTCCGCAGC AGTTTAGAAA ACACCACTAC AAAACTTGGT GATTCTTTGT 1200 ACTATGGAAA AGGGCTGATC AACGTACAAG CGGCAGCTCA GTAAAACATA AAAAACCGGC 1260 CTTGGCCCCG CCGGTTTTTT ATTATTTTTC TTCCTCCGCA TGTTCAATCC GCTCCATAAT 1320
CGACGGATGG CTCCCTCTGA AAATTTTAAC GAGAAACGGC GGGTTGACCC GGCTCAGTCC 13BO
CGTAACGGCC AACTCCTGAA ACGTCTCAAT CGCCGCTTCC CGGTTTCCGG TCAGCTCAAT 1440 GCCATAACGG TCGGCGGCGT TTTCCTGATA CCGGGAGACG GCATTCGTAA TCGGATC 1497 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: . (A) LENGTH: 275 amino acids *J**i (B) TYPE: amino acid .. . (Cl STRANOEDNESS: single : · : (D) TOPOLOGY: linear • ♦ . (ii) MOLECULE TYPE: protein • · · ··♦ • · . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: • · · *** Ala Gin Ser Val Pro Tyr Gly Vai Ser Gin He Lys Ala Pro Ala Leu ::: 1 5 10 is
His Ser Gin Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val lie Asp 20 25 30 • · ·.·.· Ser Gly He Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala ... 35 40 45 • · • · *** Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gin Asp Asn Asn Ser His . . 50 55 60 • · · • · · *.* Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser He Gly ;: 65 70 75 80 • · · .’. Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu ::: 85 90 95 • · :'·.· Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gin Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly He Glu * * 100 105 110 41
Trp Ala lie Ala Asn Asn Het Asp Vai Ile Asn Het Ser Leu Gly Gly 115 120 125
Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Vai Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140
Ser-Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160
Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val lie Ala 165 170 175
Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190
Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser lie Gin Ser Thr 195 200 205
Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220
Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu lie Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gin Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255
Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu He Asn Val Gin Ala 260 265 270
Ala Ala Gin 275 {2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 275 amino acids (B) TYPE: amino acid <C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein • · ·*·*: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:B: • · . Ala Gin Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gin He Lys Ala Pro Ala Leu 15 10 15 • ***** His Ser Gin Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Vai Ala Val He Asp . 20 25 30 • · · • · e 1“ Ser Gly He Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala ::: 35 40 45
Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gin Asp Gly Ser Ser His 50 55 60 • · *.*.* Gly Thr His Val Ala Gly Thr He Ala Ala Leu Asn Asn Ser He Gly .···, 65 70 75 80 • · *1* Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 • · · • · ··· Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gin Tyr Ser Trp He Ile Asn Gly He Glu ϊ.,.ί 100 105 110 .· · Trp Ala He Ser Asn Asn Met Asp Val He Asn Met Ser Leu Gly Gly ·.·.· 115 120 125 : Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser * * 130 135 140 42
Ser Gly Ile Vai Vai Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly 14S 150 155 160
Ser Thr Ser Thr Vai Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Tbr Ile Ala 165 170 175
Vai Gly Ala Vai Asn Ser Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala ISO 185 190
Gly Ser Glu Leu Asp Vai Met Ala Pro Gly Vai Ser Ile Gin Ser Thr 195 200 205
Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr 210 215 220
Pro His Vai Ala Gly Ala Ala Ala Leu lie Leu Ser Lys His Pro Thr 225 230 235 240
Trp Thr Asn Ala Gin Vai Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr 245 250 255
Leu Gly Asn ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Vai Gin Ala 260 265 270
Ala Ala Gin 275 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 274 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
Ala Gin Thr Val Pro Tyr Gly lie Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val 15 10 15 •
Gin Ala Gin Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp .. . 20 25 30 • · · * 1 Thr Gly lie Gin Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala . 35 40 45 • · · ···
Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly • · 50 55 60 ϊ ϊ ϊ Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val 65 70 75 80 • · · *·1 Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn 85 90 95 • · Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Vai Ser Gly He Glu Trp 100 105 110 ; : Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val lie Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala *;1 115 120 125 · · Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gin Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg :.: 130 135 140 • · *:1 Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser . . 145 150 155 160 • · · : 1. Thr Asn Thr lie Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val He Ala Val : 165 170 175 • · 43
Gly Ala Vai Αερ Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Vai Gly 180 185 190
Ala Glu Leu Glu Vai Met Ala Pro Gly Ala Gly Vai Tyr Ser Thr Tyr 195 200 205
Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro 210 215 220
His Vai Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu 225 230 235 240
Ser Ala Ser Gin Vai Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu 245 250 255
Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Vai Glu Ala Ala 260 265 270
Ala Gin (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 269 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
Ala Gin Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gin Ala Pro Ala Ala 15 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30
Thr Gly He Ser Thr His Pro Asp Leu Asn He Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 ""I Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gin Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 #· · • · · • ·* His Val Ala Gly Thr He Ala Ala Leu Asn Asn Ser lie Gly Val Leu . .·. 65 70 75 80 • f « ***, Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala *:·*: 85 90 95 • · · *·!·* Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser He Ala Gin Gly Leu Glu Trp Ala loo 105 no • · ·
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 ;*·*; Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gin Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly • · 130 135 140 ··· *...* Vai Leu Vai Vai Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser He Ser • 145 150 155 160 • · *.*.* Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gin .···. 165 170 175 • · *1* Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gin Tyr Gly Ala Gly Leu Asp He .V. 180 185 190 • ♦ · I . Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gin Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr : 195 200 205 • · 44
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Vai Ala Gly Ala 210 215 220
Ala Ala Leu Vai Lys Gin Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Vai Gin Ile 225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Vai Asn Ala Gin Ala Ala Thr Arg 260 265 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1140 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ID) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60 AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120 GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180 CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240 TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300 TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360 CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420 GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480 GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540
ATTGCTGCTT TAAACAATTC GATTGGCGTT CTTOGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 6DO
·*·1: GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGTTCGGTCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660 • · . GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720 • · · ··· ....: AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780 • · . GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840 • · · ;;·/ GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900 • · · *·* CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960 AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020 • · V.J CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080 AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140 • · · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: :***: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:.
*** (A) LENGTH: 1140 base pairs .*. (B) TYPE: nucleic acid ::: (Cl STRANDEDNESS: single * * (D) TOPOLOGY: linear • · • · · *: (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 45 <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60 AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120 GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180 CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240 TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300 TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360 CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420 GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480 GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540 ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600 GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660 GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720 AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780 GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840 GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900 CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960 AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020 CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080 AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: *:··: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: .. . (A) LENGTH: 30 base pairs : · : (B) TYPE: nucleic acid • · (C) STRANDEDNESS: single . (D) TOPOLOGY: linear • · · • · · {ii> MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: • · · *·* TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: • · ! i ·' (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ... (A) LENGTH: 31 base pairs : : (B) TYPE: nucleic acid *·· (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • · · *·)·* (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · • · • · · :Y: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14: • · CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T 31 • · 46 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15! (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) <xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:15: GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT 33 0 • · ·· · • · · • · • · 9 • · · • · · ··· • · • · · • · · • · · • · · • · · • I · 9 • · • · · • · · • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · 999 • · • 0 ··· • · • · · # · · • · 9 9 9 9 0 • 9 9 9 9
Claims (7)
1. Subtilisiinivariantti, jonka aminohapposekvenssiä ei esiinny luonnossa ja joka on johdettu prekursori-5 subtilisiinista, tunnettu siitä, että se käsittää substituutioita, jotka vastaavat: N76D/S103A; N76D/V104I; N76D/I107V tai N76D/S99D/S101R B. amyloliquefaciensin sub-tilisiinissa, jolloin subtilisiinivariantilla on parantunut pesuainesuoritus verrattuna prekursorisubtilisiiniin. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen subtilisiiniva riantti, tunnettu siitä, että subtilisiinivariantit käsittävät substituutioita, jotka vastaavat: N76D/S99D/S103A; N76D/S101R/S103A; N76D/S101R/V104I; N76D/S103A/V104I; N76D/S103G/V104I; N76D/S103A/V104F;
15 N76D/S103A/V104N; N76D/S103A/V104T; N76D/V104I/I107V; N76D/S99D/S101R/S103A; N76D/S99D/S101R/V104I; N76D/S101G/S103A/V104I; N76D/S101R/S103A/V109I; N76D/S103A/V104I/S105A; N76D/S103A/V104T/I107A; N76D/S103A/V104T/I107L; N76D/S103A/V104I/L126F;
20 N76D/S103A/V104I/S128G; N76D/S103A/V104I/L135I; N76D/S103A/V104I/L135V; N76D/S103A/V104I/D197E; ·:··· N76D/S103A/V104I/N204A; N7 6D/SI 0
3 A/Vl 0 41/N2 04G; N76D/S103A/V104I/P210I; N76D/S103A/V104I/T260P tai • · i ,·. N76D/S103A/V104I/S265N • · ·
25 B. amyloliquefaciensin subtilisiinissa. • · . 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen subtilisii- t · · Hl nivariantti, tunnettu siitä, että prekursorisubtilisii- • · · ’·’ * ni on Bacilluksen subtilisiini.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen subtilisiiniva- • · ·.·.· 30 riantti, tunnettu siitä, että prekursorisubtilisiini on • · · ϊ ! Bacillus lentuksen subtilisiini. • ·· - - - ,V.
5. DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa pa- • · · I.I tenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista subtilisiinivarianttia. • · • · ‘1*
6. Ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se • · 35 sisältää patenttivaatimuksen 5 mukaista DNA:ta. • · ί/·ί
7. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on trans formoitu patenttivaatimuksen 6 mukaisella ekspressiovekto-rilla. 48
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13724093A | 1993-10-14 | 1993-10-14 | |
| US13724093 | 1993-10-14 | ||
| PCT/US1994/011562 WO1995010615A1 (en) | 1993-10-14 | 1994-10-13 | Subtilisin variants |
| US9411562 | 1994-10-13 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI961631A0 FI961631A0 (fi) | 1996-04-12 |
| FI961631A FI961631A (fi) | 1996-04-15 |
| FI119697B true FI119697B (fi) | 2009-02-13 |
Family
ID=22476438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI961631A FI119697B (fi) | 1993-10-14 | 1996-04-12 | Subtilisin variantteja |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6586221B2 (fi) |
| EP (2) | EP0723590B1 (fi) |
| JP (1) | JP4086207B2 (fi) |
| KR (1) | KR100344976B1 (fi) |
| CN (1) | CN1056649C (fi) |
| AT (1) | ATE284962T1 (fi) |
| AU (1) | AU700373B2 (fi) |
| BR (1) | BR9407825A (fi) |
| CA (1) | CA2173973C (fi) |
| CZ (1) | CZ289323B6 (fi) |
| DE (1) | DE69434187T2 (fi) |
| DK (1) | DK0723590T3 (fi) |
| ES (1) | ES2235164T3 (fi) |
| FI (1) | FI119697B (fi) |
| HK (1) | HK1000649A1 (fi) |
| MA (1) | MA23346A1 (fi) |
| NO (1) | NO325568B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ274998A (fi) |
| PL (1) | PL178478B1 (fi) |
| PT (1) | PT723590E (fi) |
| RU (1) | RU2136756C1 (fi) |
| TW (1) | TW448230B (fi) |
| WO (1) | WO1995010615A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA948086B (fi) |
Families Citing this family (85)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ105296A3 (en) * | 1993-10-14 | 1996-09-11 | Procter & Gamble | Bleaching agent containing protease enzymes, cleansing agents, agent for cleaning fabrics and fabric cleaning method |
| DE69434962T2 (de) * | 1993-10-14 | 2008-01-17 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Proteasehaltige reinigungsmittel |
| MA23346A1 (fr) * | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| US6066611A (en) * | 1994-10-13 | 2000-05-23 | The Procter & Gamble Company | Bleaching compositions comprising protease enzymes |
| US5837517A (en) * | 1995-05-05 | 1998-11-17 | Novo Nordisk A/S | Protease variants and compositions |
| HUP9901725A3 (en) * | 1995-05-05 | 2001-09-28 | Unilever Nv | Subtilisin variants |
| DE19530816A1 (de) * | 1995-08-23 | 1997-02-27 | Cognis Bio Umwelt | Verwendung von mutierter Subtilisin-Protease in kosmetischen Produkten |
| DE19535082A1 (de) | 1995-09-21 | 1997-03-27 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| US5858948A (en) * | 1996-05-03 | 1999-01-12 | Procter & Gamble Company | Liquid laundry detergent compositions comprising cotton soil release polymers and protease enzymes |
| DE19636035A1 (de) | 1996-09-05 | 1998-03-12 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| DE69739020D1 (de) * | 1996-11-04 | 2008-11-13 | Novozymes As | Subtilase varianten und verbindungen |
| DE19703364A1 (de) | 1997-01-30 | 1998-08-06 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Wasch- und Reinigungsmittel |
| WO1998055577A1 (en) * | 1997-06-04 | 1998-12-10 | The Procter & Gamble Company | Detersive enzyme particles having water-soluble carboxylate barrier layer and compositions including same |
| JP4031055B2 (ja) * | 1997-06-04 | 2008-01-09 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 強力な洗浄および／またはスポットおよびフィルム低減のためのプロテアーゼ酵素およびそれを混合した組成物 |
| BR9810081A (pt) * | 1997-06-04 | 2000-08-08 | Procter & Gamble | Sistemas de enzima protease mista para limpeza de sujeiras à base de proteìna e composições incorporando os mesmos |
| US6284246B1 (en) | 1997-07-30 | 2001-09-04 | The Procter & Gamble Co. | Modified polypeptides with high activity and reduced allergenicity |
| ES2368718T3 (es) * | 1997-10-23 | 2011-11-21 | Danisco Us Inc. | Variantes de subtilisina con múltiples sustituciones. |
| AR015977A1 (es) * | 1997-10-23 | 2001-05-30 | Genencor Int | Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes |
| AU2002325461B2 (en) * | 1997-10-23 | 2006-05-11 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants with altered net charge for use in detergents |
| EP1042501B2 (en) | 1997-12-24 | 2011-03-30 | Genencor International, Inc. | Method for assaying the wash performance of an enzyme. |
| US6599731B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-07-29 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6465186B1 (en) | 1997-12-30 | 2002-10-15 | Genecor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6528255B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-03-04 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| GB9727470D0 (en) | 1997-12-30 | 1998-02-25 | Genencor Int Bv | Proteases from gram positive organisms |
| US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
| WO1999049056A1 (en) | 1998-03-26 | 1999-09-30 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid substitutions |
| US6495136B1 (en) | 1998-03-26 | 2002-12-17 | The Procter & Gamble Company | Proteases having modified amino acid sequences conjugated to addition moieties |
| DE19857687A1 (de) | 1998-12-15 | 2000-06-21 | Henkel Ecolab Gmbh & Co Ohg | Pastenförmiges Waschmittel |
| KR100660818B1 (ko) * | 1998-12-18 | 2006-12-26 | 노보자임스 에이/에스 | 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소 |
| JP2002533087A (ja) | 1998-12-21 | 2002-10-08 | ジェネンカー インターナショナル，インコーポレイティド | 複数荷電変種を有する化学修飾酵素 |
| CZ2002212A3 (cs) | 1999-07-22 | 2002-07-17 | The Procter & Gamble Company | Varianty subtilisinové proteasy mající aminokyselinové substituce v definovaných epitopových oblastech |
| MXPA02000842A (es) | 1999-07-22 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Conjugados de proteasa que tienen sitios de corte protegidos estericamente. |
| US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
| CN1373802A (zh) | 1999-07-22 | 2002-10-09 | 宝洁公司 | 在特定表位区域具有氨基酸缺失和取代的枯草杆菌蛋白酶变体 |
| WO2001018165A1 (en) * | 1999-09-09 | 2001-03-15 | The Procter & Gamble Company | A detergent composition containing a protease |
| EP1244779B1 (en) * | 1999-12-15 | 2014-05-07 | Novozymes A/S | Subtilase variants having an improved wash performance on egg stains |
| JP2003516751A (ja) * | 1999-12-15 | 2003-05-20 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 卵の染みに及ぼす洗浄性能改良を示すズブチラーゼ変異体 |
| US6777218B1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-08-17 | Novozymes A/S | Subtilase enzymes having an improved wash performance on egg stains |
| US7303907B2 (en) | 2001-01-08 | 2007-12-04 | Health Protection Agency | Degradation and detection of TSE infectivity |
| CA2441595C (en) * | 2001-03-23 | 2012-07-03 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| DK200101090A (da) | 2001-07-12 | 2001-08-16 | Novozymes As | Subtilase variants |
| US7153820B2 (en) | 2001-08-13 | 2006-12-26 | Ecolab Inc. | Solid detergent composition and method for solidifying a detergent composition |
| US20030157645A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-08-21 | Direvo Bio Tech Ag. | Subtilisin variants with improved characteristics |
| WO2003057713A2 (en) * | 2001-12-31 | 2003-07-17 | Genencor International, Inc. | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| JP5328002B2 (ja) * | 2002-01-16 | 2013-10-30 | ジェネンコー・インターナショナル・インク | 複数置換プロテアーゼ変異体 |
| CA2472725C (en) * | 2002-01-16 | 2015-08-11 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| BRPI0409992A (pt) * | 2003-05-07 | 2006-05-09 | Novozymes As | enzima subtilase, polinucleotìdeo isolado, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para produzir a subtilase, composição limpadora ou detergente, usos de uma subtilase e de uma composição limpadora ou detergente, e, métodos para limpar ou lavar louças, lavar uma superfìcie dura ou lavar roupas e para remover manchas de ovo de uma superfìcie dura ou de roupas para lavar |
| US20090060933A1 (en) * | 2004-06-14 | 2009-03-05 | Estell David A | Proteases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
| PL2586456T3 (pl) | 2004-10-29 | 2016-07-29 | Ratiopharm Gmbh | Remodeling i glikopegilacja czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) |
| KR20090031906A (ko) * | 2006-07-18 | 2009-03-30 | 다니스코 유에스 인크. | 광범위한 온도에 걸쳐 활성인 프로테아제 변이형 |
| RU2009118412A (ru) * | 2006-10-16 | 2011-04-27 | ДАНИСКО ЮЭс, ИНК. ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН (US) | Нефосфатные детергенты для посуды |
| US8093200B2 (en) | 2007-02-15 | 2012-01-10 | Ecolab Usa Inc. | Fast dissolving solid detergent |
| ES2704400T3 (es) | 2007-10-18 | 2019-03-18 | Ecolab Usa Inc | Composiciones de limpieza prensadas, cerosas, sólidas y métodos para prepararlas |
| CA2726450A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising variant microbial proteases |
| EP2650354A3 (en) * | 2008-11-11 | 2014-02-12 | The Procter and Gamble Company | Bacillus subtilisin comprising one or more combinable mutations |
| MX2011004801A (es) * | 2008-11-11 | 2011-06-16 | Danisco Inc | Composiciones y metodos que comprenden una variante de subtilisina. |
| EP3061817B1 (en) * | 2009-04-30 | 2018-12-12 | Kao Corporation | Alkaline protease variants |
| DE102009029513A1 (de) * | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Proteasen |
| BR112012028466B1 (pt) * | 2010-05-06 | 2020-03-17 | The Procter & Gamble Company | Composição de produtos com variantes de protease e método para tratar e/ou limpar uma superfície |
| DE102010028951A1 (de) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Lipase |
| DE102010063457A1 (de) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase |
| DE102010063458A1 (de) * | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Amylase |
| ES2707869T3 (es) * | 2011-05-05 | 2019-04-05 | Danisco Us Inc | Composiciones y métodos comprendiendo variantes de serina proteasa |
| US8758520B2 (en) | 2011-05-20 | 2014-06-24 | Ecolab Usa Inc. | Acid formulations for use in a system for warewashing |
| AU2012260575B2 (en) | 2011-05-20 | 2015-09-03 | Ecolab Usa Inc. | Non-phosphate detergents and non-phosphoric acids in an alternating alkali/acid system for warewashing |
| US9139800B2 (en) | 2011-12-13 | 2015-09-22 | Ecolab Usa Inc. | Concentrated warewashing compositions and methods |
| DE102012201522A1 (de) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | Basf Se | Lagerstabiles flüssiges Geschirrspülmittel enthaltend Protease und Amylase |
| ES2582608T3 (es) * | 2012-02-17 | 2016-09-14 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Composiciones detergentes que comprenden variantes de subtilasa |
| DE102012215107A1 (de) * | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Basf Se | Festes Geschirrspülmittel mit verbesserter Proteaseleistung |
| US9745543B2 (en) | 2012-09-10 | 2017-08-29 | Ecolab Usa Inc. | Stable liquid manual dishwashing compositions containing enzymes |
| CN103013960A (zh) * | 2012-12-21 | 2013-04-03 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌 |
| MX2016002935A (es) | 2013-09-09 | 2016-06-06 | Ecolab Usa Inc | Eliminacion sinergica de manchas a traves de una combinacion de quelacion novedosa. |
| BR112016005255B1 (pt) | 2013-09-09 | 2021-06-29 | Ecolab Usa Inc. | Composição detergente concentrada, solução aquosa compreendendo dita composição e uso da mesma para remoção de manchas |
| WO2015058803A1 (en) | 2013-10-24 | 2015-04-30 | Ecolab Inc. | Compositions and methods for removing soils from surfaces |
| US10626388B2 (en) | 2014-07-04 | 2020-04-21 | Novozymes A/S | Subtilase variants and polynucleotides encoding same |
| RU2710720C2 (ru) * | 2014-12-04 | 2020-01-10 | Новозимс А/С | Варианты субтилазы и кодирующие их полинуклеотиды |
| EP3294884B1 (en) * | 2015-05-13 | 2021-01-27 | Danisco US Inc. | Aprl-clade protease variants and uses thereof |
| BR112018010475B1 (pt) | 2015-11-25 | 2023-02-14 | Unilever Ip Holdings B.V. | Composição de detergente líquido e método de lavagem de roupas utilizando uma composição de detergente líquido para lavar roupas |
| JP2019523645A (ja) * | 2016-05-31 | 2019-08-29 | ダニスコ・ユーエス・インク | プロテアーゼ変異体およびその使用 |
| US20190185836A1 (en) * | 2016-09-02 | 2019-06-20 | The Regents Of The University Of California | Engineered subtiligase variants for versatile, site-specific labeling of proteins |
| EP3717643A1 (en) * | 2017-11-29 | 2020-10-07 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants having improved stability |
| US11891588B2 (en) | 2019-07-31 | 2024-02-06 | Ecolab Usa Inc. | Personal protective equipment free delimer compositions o |
| US11492571B2 (en) * | 2019-10-24 | 2022-11-08 | The Procter & Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition comprising a protease |
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
| CN114836408B (zh) * | 2022-05-28 | 2023-09-19 | 湖北大学 | 含有前肽突变体的碱性蛋白酶及应用 |
Family Cites Families (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| US5182204A (en) | 1984-05-29 | 1993-01-26 | Genencor International, Inc. | Non-human carbonyl hydrolase mutants, vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
| US5204015A (en) | 1984-05-29 | 1993-04-20 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| US5763257A (en) * | 1984-05-29 | 1998-06-09 | Genencor International, Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
| US5185258A (en) | 1984-05-29 | 1993-02-09 | Genencor International, Inc. | Subtilisin mutants |
| US5155033A (en) | 1989-01-06 | 1992-10-13 | Genencor, Inc. | Subtilisins modified at position 225 resulting in a shift in catalytic activity |
| US5013657A (en) | 1988-04-12 | 1991-05-07 | Bryan Philip N | Subtilisin mutations |
| US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
| SG30639G (en) * | 1986-04-30 | 1995-09-01 | Genencor Int | Non-human carbonyl hydrolase mutants DNA sequences and vectors encoding same and hosts transformed with said vectors |
| DE3856362T2 (de) * | 1987-04-06 | 2000-05-18 | Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd | Regelung von elektrostatischen interaktionen an metallionen-bindungsstellen zur stabilisierung von proteinen |
| US4914031A (en) | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
| DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
| WO1989006276A2 (en) | 1988-01-08 | 1989-07-13 | Dpz Deutsches Primatenzentrum Gesellschaft Mbh | Hiv-2-type retroviruses of primates, vaccines, diagnostic and pharmaceutical compositions |
| PT89702B (pt) | 1988-02-11 | 1994-04-29 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem |
| US5324653A (en) | 1988-02-11 | 1994-06-28 | Gist-Brocades N.V. | Recombinant genetic means for the production of serine protease muteins |
| US5116741A (en) * | 1988-04-12 | 1992-05-26 | Genex Corporation | Biosynthetic uses of thermostable proteases |
| JPH03505976A (ja) * | 1989-05-17 | 1991-12-26 | アムジエン・インコーポレーテツド | 多重突然変異スブチリシン |
| BR9006827A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicoes detergentes enzimaticas |
| DK316989D0 (da) | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Novo Nordisk As | Enzymer |
| WO1991000335A1 (en) | 1989-06-26 | 1991-01-10 | Unilever Plc | Enzymatic detergent compositions |
| US5665587A (en) * | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
| JP2567282B2 (ja) * | 1989-10-02 | 1996-12-25 | 日本ゼオン株式会社 | ポジ型レジスト組成物 |
| DK271490D0 (da) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Novo Nordisk As | Detergentkomposition |
| WO1992011357A1 (en) | 1990-12-21 | 1992-07-09 | Novo Nordisk A/S | ENZYME MUTANTS HAVING A LOW DEGREE OF VARIATION OF THE MOLECULAR CHARGE OVER A pH RANGE |
| US5340735A (en) * | 1991-05-29 | 1994-08-23 | Cognis, Inc. | Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability |
| US5316935A (en) * | 1992-04-06 | 1994-05-31 | California Institute Of Technology | Subtilisin variants suitable for hydrolysis and synthesis in organic media |
| ES2296285T3 (es) | 1992-07-17 | 2008-04-16 | Genencor International, Inc. | Serin proteasas altamente alcalinas. |
| DK39093D0 (da) | 1993-04-01 | 1993-04-01 | Novo Nordisk As | Enzym |
| MA23346A1 (fr) * | 1993-10-14 | 1995-04-01 | Genencor Int | Variantes de la subtilisine |
| DE69434962T2 (de) * | 1993-10-14 | 2008-01-17 | The Procter & Gamble Company, Cincinnati | Proteasehaltige reinigungsmittel |
| CZ105296A3 (en) * | 1993-10-14 | 1996-09-11 | Procter & Gamble | Bleaching agent containing protease enzymes, cleansing agents, agent for cleaning fabrics and fabric cleaning method |
| AR015977A1 (es) * | 1997-10-23 | 2001-05-30 | Genencor Int | Variantes de proteasa multiplemente substituida con carga neta alterada para su empleo en detergentes |
| US6835550B1 (en) * | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
| JP2002533087A (ja) * | 1998-12-21 | 2002-10-08 | ジェネンカー インターナショナル，インコーポレイティド | 複数荷電変種を有する化学修飾酵素 |
| CA2441595C (en) * | 2001-03-23 | 2012-07-03 | Genencor International, Inc. | Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
-
1994
- 1994-10-11 MA MA23668A patent/MA23346A1/fr unknown
- 1994-10-13 PT PT94931345T patent/PT723590E/pt unknown
- 1994-10-13 KR KR1019960701923A patent/KR100344976B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 US US08/322,678 patent/US6586221B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 JP JP51201395A patent/JP4086207B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 DK DK94931345T patent/DK0723590T3/da active
- 1994-10-13 DE DE69434187T patent/DE69434187T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 BR BR9407825A patent/BR9407825A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 NZ NZ274998A patent/NZ274998A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 PL PL94313942A patent/PL178478B1/pl unknown
- 1994-10-13 CN CN94193785A patent/CN1056649C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 AT AT94931345T patent/ATE284962T1/de active
- 1994-10-13 CZ CZ19961065A patent/CZ289323B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-10-13 AU AU80157/94A patent/AU700373B2/en not_active Expired
- 1994-10-13 WO PCT/US1994/011562 patent/WO1995010615A1/en active IP Right Grant
- 1994-10-13 RU RU96109372A patent/RU2136756C1/ru active
- 1994-10-13 EP EP94931345A patent/EP0723590B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 EP EP04024046A patent/EP1526182A3/en not_active Withdrawn
- 1994-10-13 ES ES94931345T patent/ES2235164T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-13 CA CA002173973A patent/CA2173973C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-14 ZA ZA948086A patent/ZA948086B/xx unknown
-
1995
- 1995-01-18 TW TW084100420A patent/TW448230B/zh not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-12 NO NO19961468A patent/NO325568B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-04-12 FI FI961631A patent/FI119697B/fi not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-11-11 HK HK97102150A patent/HK1000649A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-18 US US10/323,324 patent/US7250281B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI119697B (fi) | Subtilisin variantteja | |
| EP1141262B2 (en) | Subtilase enzymes of the i-s2 sub-group having an additional amino acid residue in an active site loop region | |
| CA2472725C (en) | Multiply-substituted protease variants | |
| EP0723579A1 (en) | Protease-containing cleaning compositions | |
| CZ301469B6 (cs) | Subtilizín a prostredek s jeho obsahem | |
| KR20010093169A (ko) | 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소 | |
| EP2287321B1 (en) | Multiply-substituted protease variants | |
| CN101538563A (zh) | 枯草杆菌酶变体 | |
| EP1183338B1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 97 and 98 | |
| EP1141258B1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region | |
| EP1141260B1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region | |
| EP1183342B1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 128 and 129 | |
| EP1183341B1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 127 and 128 | |
| EP1141259B1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region | |
| EP1803817B1 (en) | Subtilase enzymes of the I-S1 and I-S2 sub-groups having an additional amino acid residue in an active site loop region | |
| KR20010093167A (ko) | 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소 | |
| KR20010093172A (ko) | 활성부위 루프 영역에 추가적 아미노산 잔기를 가지는서브그룹 ｉ-ｓ１과 ｉ-ｓ２의 서브틸라제 효소 | |
| EP1183339A1 (en) | Subtilase enzymes of the i-s1 and i-s2 sub-groups having at least one additional amino acid residue between positions 129 and 130 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 119697 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |