CN1133068A

CN1133068A - 枯草杆菌蛋白酶变异体

Info

Publication number: CN1133068A
Application number: CN94193785A
Authority: CN
Inventors: T·P·格雷卡; R·R·博特; L·J·威尔逊
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1996-10-09
Anticipated expiration: 2014-10-13
Also published as: FI961631A0; ZA948086B; CZ289323B6; CN1056649C; JPH09504170A; AU8015794A; EP0723590B1; US20030077807A1; RU2136756C1; PT723590E; FI119697B; EP0723590A1; PL313942A1; NO961468L; US20040023353A1; AU700373B2; ATE284962T1; CZ106596A3; DK0723590T3; KR100344976B1

Abstract

公开了衍生自天然或重组的非人体羰基水解酶的新变异体。一般，这种变异羰基水解酶是通过体外修饰编码天然或重组羰基水解酶的前体DNA序列，使其仅编码前体氨基酸序列中多个取代的氨基酸残基。与前体水解酶相比，变异羰基水解酶具有不同的性质如不同的蛋白水解活性，稳定性等。被取代的氨基酸残基对应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶残基+76位置的残基结合一个或多个选自下组的残基：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274。

Description

枯草杆菌蛋白酶变异体

相关申请

本申请是1993年10月14日申请的美国申请No.08/137,240(未审定)的部分续展申请，原案申请在此全部引用作为参考。

发明领域

本发明涉及新的羰基水解酶变异体，其氨基酸序列中相应于前体羰基水解酶的多个氨基酸残基，尤其是那些对应于或相当于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶+76位置的残基并结合一个或多个选自下组的残基：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，被不同的氨基酸所取代。一般，这种突变/变异羰基水解酶的获得是通过体外修饰编码天然或重组羰基水解酶的前体DNA序列，使其仅编码前体氨基酸序列中取代的多个氨基酸残基，或同时还编码前体氨基酸序列中的其它取代、插入或缺失。

发明背景

丝氨酸蛋白酶是羰基水解酶的一个亚类。它们包括一组不同的、具有广谱特异性和生物学功能的酶。参见Stroud，R.Sci.Amer.，131：74—88。尽管它们功能各异，但是丝氨酸蛋白酶的的催化机制已由对至少两类遗传学上截然不同家族酶的研究所提出：枯草杆菌蛋白酶和相关的哺乳动物胰凝乳蛋白酶以及同源的细菌丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和S.gresius胰蛋白酶)。这两个家族的丝氨酸蛋白酶具有非常类似的催化机制。参见Kraut，J.(1977)，Ann.Rev.Biochem.，46：331—358。此外，尽管这两类酶家族的一级结构不相关，但是它们的三级结构都形成由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的保守性催化三氨基酸结构。

枯草杆菌蛋白酶是一种丝氨酸内切蛋白酶(分子量27,500)，各种不同杆菌属种和其他微生物都大量分泌该酶。已经确定了至少4种不同杆菌属种的枯草杆菌蛋白酶的蛋白质序列。参见Markland，F.S.，et al.(1983)，Honne—Seyler′s Z.Physiol.Chem.，364：1537—1540。已经报道了分辨率为2.5埃的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的三维晶体结构。参见Wright，C.S.，et al.(1969)Na-ture，221：235—242；Drenth，J.，et al.(1972)，Eur.J.Biochem.，26：177—181。这些研究表明，尽管枯草杆菌蛋白酶与哺乳动物丝氨酸蛋白酶在遗传学上是不相关的，但是具有类似的活性部位结构。含有共价相连的肽抑制剂的枯草杆菌蛋白酶(Robertus，J.D.，et al.(1972)，Biochemistry，11：2439—2449)或产物复合物(Robertus，J.D.，et al.(1976)，J.Biol Chem.，251：1097—1103)的X射线晶体结构提供了有关枯草杆菌蛋白酶活性部位和假设的底物结合裂隙的信息。此外，已报道了大量枯草杆菌蛋白酶动力学和化学修饰方面的研究(Philipp，M.，et al.(1983)，Mol.Cell.Biochem..，51：5—32；Svendsen，B.(1976)，Carlsberg Res.Comm.，41：237—291；Markland，F.S.Id.)，而且至少有一则报道说枯草杆菌残基222处的甲硫氨酸侧链被过氧化氢转变成甲硫氨酸亚砜(Stauffer，D.C.，et al.(1965)，J.Biol.Chem.，244：5333—5338)，并且残基221处的丝氨酸侧链用化学修饰法转变成半胱氨酸(Polgar，et al.(1981)，Biochimica et Biophsica Acta，667：351—354.)。

美国专利4,760,025(RE 34,606)公开了对枯草杆菌蛋白酶氨基酸残基的修饰，这些残基对应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶位置中的酪氨酸—1、天冬氨酸+32、天冬酰胺+155、酪氨酸+104、甲硫氨酸+222、甘氨酸+166、组氨酸+64、甘氨酸+169、苯丙氨酸+189、丝氨酸+33、丝氨酸+221、酪氨酸+217、谷氨酸+156和丙氨酸+152。美国专利5,182,204公开了解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中氨基酸残基+224及其他枯草杆菌蛋白酶中相应位置的修饰情况，其中是通过取代、插入或缺失而进行修饰而且可以与美国专利4,760,025(RE 34,606)所述的残基修饰结合以形成有用的枯草杆菌蛋白酶突变体或变异体。美国专利5,155,033公开了类似的突变型枯草杆菌蛋白酶，其中它在相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶+225位有修饰。美国专利5,185,285和5,204,015公开了在+123和/或+274位有修饰的突变型枯草杆菌蛋白酶。这些专利的公开内容在此引用作为参考，同时引用作为参考的还有美国专利申请07/898，382。该申请公开了枯草杆菌蛋白酶中许多氨基酸残基的修饰情况，具体包括+99、+101、+103、+107、+126、+128、+135、+197和+204。所有这些专利/申请都是共同拥有的。美国专利4,914,031公开了某些枯草杆菌蛋白酶类似物，包括在+76位被修饰的枯草杆菌蛋白酶。该专利的公开内容也在此引用作为参考。但是，本文指明的特定残基和/或此处提出权利要求的具体组合并没有在这些文献中提及。

因此，本发明的一个目的是提供一种羰基水解酶(最好是枯草杆菌蛋白酶)变异体，它含有DNA编码的前体羰基水解酶中多个取代的氨基酸残基，这些取代对应于或相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶残基+76位置的残基并结合一个或多个选自下组的残基：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，被不同的氨基酸所取代。与衍生出该变异体氨基酸的羰基水解酶前体比较，这些变异体通常至少有一种不同于前体相应特性的性质。

本发明的另一目的是提供编码该羰基水解酶变异体的DNA序列，以及含有该突变DNA序列的表达载体。

此外，本发明的另一目的是提供用该载体转化的宿主细胞，以及能够表达该DNA从而能在胞内或胞外产生羰基水解酶变异体的宿主细胞。

列出上述文献仅仅是因为它们是在本申请的申请日之前公开的，并不意味着本发明的发明人不能凭借先发明或基于更早申请的优先权而位于这些公开文献之前。发明概述

本发明包括非天然产生的羰基水解酶变异体，与衍生出该变异体氨基酸的前体羰基水解酶比较，它们具有不同的蛋白水解活性、稳定性、底物特异性、pH分布图和/或工作性能。前体羰基水解酶可以是天然产生的羰基水解酶或重组的羰基水解酶。具体地，这种羰基水解酶变异体具有自然界没有发现的氨基酸序列，它是通过用不同的氨基酸置换前体羰基水解酶的多个氨基酸衍生而得。前体酶的这些多个氨基酸残基对应于+76位并结合一个或多个选自下组的残基：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，其中编号位置对应于天然解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶或相应于其他羰基水解酶或枯草杆菌蛋白酶如透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的氨基酸残基。本发明的羰基水解酶变异体含有氨基酸残基+76处的置换并结合一个或多个其他修饰。较佳地，本发明的变异酶含有下列组合氨基酸残基的取代、缺失或插入：76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222。最佳地，本发明的变异酶含有下列残基组合的氨基酸残基取代、缺失或插入：解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。

本发明还包括编码这种羰基水解酶或枯草杆菌蛋白酶变异体的变异DNA序列。这些变异DNA序列衍生自编码天然存在的或重组前体酶的前体DNA序列。变异DNA序列是通过修饰前体DNA序列使其编码一个或多个具体取代的氨基酸残基而得到，其中这些被前体DNA序列编码的氨基酸残基对应于解淀粉芽孢杆菌中76、99、101、103、104、107、123、27、105、109、126、128、135、156、166、195、197、204、206、210、216、217、218、222、260、265和/或274或其任何组合。尽管确定的被修饰氨基酸残基与可应用于解淀粉芽孢杆菌的编号相同(这种编号方法已成为确定所有枯草杆菌蛋白酶中残基位置的常规方法。)，但是用于本发明的优选前体DNA序列是如图6所示的透镜状芽孢杆菌的DNA序列(SEQ ID No.11)。

本发明的变异DNA序列编码76位插入或取代的氨基酸残基并结合一个或多个其他修饰。较佳地，变异DNA序列编码下列组合的取代或插入氨基酸残基：76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222。最佳地，变异DNA序列编码下列组合修饰的残基：76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。这些重组DNA序列编码的羰基水解酶变异体具有新的氨基酸序列，而且与前体羰基水解酶DNA序列编码的酶相比，通常至少有一种基本上不同于前体酶相应特性的性质。这些性质包括蛋白水解活性、底物特异性、稳定性、改变的pH分布图和/或增强的工作性能。

本发明包括在指定的氨基酸残基位置处的19种天然L—氨基酸的任何取代。这种取代可以在任何前体枯草杆菌蛋白酶上进行(原核的、真核的、哺乳动物的等)。较佳地，取代是在各确定的氨基酸残基位置进行，包括(但并不限于)这些位置：76位的取代包括D、H、E、G、F、K、P和N；99位的取代包括D、T、N、Q、G和S；101位的取代包括G、D、K、L、A、E、S和R；103位的取代包括Q、T、D、E、Y、K、G、R、S和A；76位的取代包括D、H、E、G、F、K、P和N；104位的取代包括所有19种天然氨基酸；107位的取代包括V、L、M、Y、G、E、F、T、S、A、N和I；123位的取代包括N、T、I、G、A、C和S；27位的取代包括K、N、C、V和T；105位的取代包括A、D、G、R和N；107位的取代包括A、L、V、Y、G、G、T、S和A；109位的取代包括S、K、R、A、N和D；126位的取代包括A、F、I、V和G；128位的取代包括G、L和A；135位的取代包括A、F、I、S和V；156位的取代包括D、E、A、G、Q和K；166位的取代包括所有19种天然氨基酸；195位的取代包括E；197位的取代包括E；204位的取代包括A、G、C、S和D；206位的取代包括L、Y、N、D和E；210位的取代包括L、I、S、C和F；216位的取代包括V、E、T和K；217位的取代包括所有19种天然氨基酸；218位的取代包括S、A、G、T和V；222位的取代包括所有19种天然氨基酸；260位的取代包括P、N、G、A、S、C、K和D；265位的取代包括N、G、A、S、C、K、Y和H；和274位的取代包括A和S。在各位置上特别优选的取代氨基酸列于表I。尽管在表I中列出了具体的氨基酸，但是应理解，所确定的残基可用任何氨基酸进行取代。

表I

氨基酸残基优选的取代/插入氨基酸

+76 D，H

+99 D，T，N，G

+101 R，G，D，K，L，A，E

+103 A，Q，T，D，E，Y，K，G，R

+104 I，Y，S，L，A，T，G，F，M，W，D，V，N

+107 V，L，Y，G，F，T，S，A，N

+123 S，T，I

+27 K

+105 A，D

+109 S，K，R

+126 A，I，V，F

+128 G，L

+135 I，A，S

+156 E，D，Q

+166 D，G，E，K，N，A，F，I，V，L

+195 E

+197 E

+204 A，G，C

+206 L

+210 I，S，C

+216 V

+217 H，I，Y，C，A，G，F，S，N，E，K

+218 S

+222 A，Q，S，C，I，K

+260 P，A，S，N，G

+265 N，A，G，S

+274 A，S

此外，本发明包括含有该变异体羰基水解酶DNA序列的表达载体及用该载体转化的、能够产生该变异体的宿主细胞。本发明还涉及含有本发明羰基水解酶变异体的去垢剂组合物。

附图简述

图1A-C是解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的DNA和氨基酸序列以及该基因(SEQ ID No.6)的部分限制酶图谱。

图2显示了解淀粉芽孢杆菌(BPN′)和透镜状芽孢杆菌(野生型)的枯草杆菌蛋白酶中保守氨基酸残基。

图3A和3B显示了4种枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列。最上面一行是解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(有时也称为枯草杆菌蛋白酶BPN′)的氨基酸序列(SEQ ID No.7)。第二行是枯草杆菌(Bacil-lus subtilis)的枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID No.8)。第三行是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID No.9)。第四行是透镜状芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(在PCT WO89/06276中也称为枯草杆菌蛋白酶309)氨基酸序列(SEQ ID No.10)。符号“*”表示与枯草杆菌BPN′相比，缺失特定的氨基酸残基。

图4是质粒GGA274的构建图。

图5是质粒GGT274的构建图，该质粒是本申请中所用的某些表达质粒的中间质粒。

图6A和6B是透镜状芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的DNA和氨基酸序列(SEQ ID No.11)。成熟的枯草杆菌蛋白酶由从对应于Ala的密码子GCG(334—336)开始的密码子所编码。

图7A和7B是本发明的一个优选例子(N76D/S103A/V104I)的DNA和氨基酸序列(SEQ ID No.12)。该图中的DNA用所述的方法进行修饰，从而编码76位的天冬氨酸、103位的丙氨酸和104位的异亮氨酸。成熟的枯草杆菌蛋白酶变异体由从对应于Ala的密码子GCG(334—336)开始的密码子所编码。

图8是载体pBCDAICAT的构建图。

图9是载体pUCCATFNA的构建图。

图10显示了在液态去垢剂配方中，与野生型相比，优选的突变酶的稳定性。

发明详述

已经发现，对透镜状芽孢杆菌中相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶+76位的氨基酸残基进行体外突变，可以产生稳定性与前体枯草杆菌蛋白酶不同(例如改变的自我蛋白水解稳定性)的枯草杆菌蛋白酶变异体(见表IV和VI)。

还发现，对相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274位的残基进行体外突变，无论单独或互相组合的突变，以及以任何与+76位突变组合一起进行，则产生的枯草杆菌蛋白酶变异体具有不同的蛋白水解活性、不同的热稳定性、不同的pH分布图、不同的底物特异性和/或不同的工作性能。

羰基水解酶是水解含有键的化合物的酶，其中，X为氧或氮。它们包括天然存在的羰基水解酶和重组羰基水解酶。天然存在的羰基水解酶主要包括水解酶，例如肽水解酶如枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶。肽水解酶包括α-氨酰基肽水解酶、肽基(peptidyl)氨基酸水解酶、酰氨基水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、巯基蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶和酸性蛋白酶被包括在内，还包括内切和外切蛋白酶。

“重组羰基水解酶”指这样的羰基水解酶，其中编码天然羰基水解酶的DNA序列被修饰以产生编码羰基水解酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的突变型DNA序列。合适的修饰方法公开于本文、美国专利4,760,025(RE 34,606)、美国专利5,204,015和美国专利5,185,258中，这些文献在此引用作为参考。

枯草杆菌蛋白酶是细菌或真菌的羰基水解酶，它们一般切除蛋白质或肽的肽键。如本文所用，“枯草杆菌蛋白酶”指天然存在的枯草杆菌蛋白酶或重组的枯草杆菌蛋白酶。已知各种微生物会产生和分泌一系列天然存在的枯草杆菌蛋白酶。这一系列中的各成员的氨基酸序列并不完全同源。但是，该系列中的枯草杆菌蛋白酶具有相同或相似类型的蛋白水解活性。这类丝氨酸蛋白酶具有共同的确定催化的三元结构的氨基酸序列，该催化性三元结构使其与胰凝乳蛋白酶相关类的丝氨酸蛋白酶区分开。枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶两者都具有由天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸组成的催化性三元结构。在枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶中，这些氨基酸的相对次序从氨基端到羧基端依次为天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。但是，在胰凝乳蛋白酶相关的蛋白酶中，相对次序为组氨酸—天冬氨酸—丝氨酸。因此，本文中枯草杆菌蛋白酶指具有枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶的催化性三元结构的丝氨酸蛋白酶。具体例子包括(但不限于)图3所示的枯草杆菌蛋白酶。

“重组枯草杆菌蛋白酶”指这样的枯草杆菌蛋白酶，其中编码枯草杆菌蛋白酶的DNA序列被修饰从而产生编码天然存在枯草杆菌蛋白酶氨基酸序列中一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入的变异(或突变)DNA序列。用于产生这种修饰的合适方法，以及可以与此处公开的方法结合使用的方法，包括在下列文献中公开的方法：美国专利4,760,025(RE34,606)、美国专利5,204,015和美国专利5,185,258。

“非人体羰基水解酶”及其编码DNA可以从众多原核和真核有机体中获得。原核有机体的合适例子包括革兰氏阴性有机体如大肠杆菌或假单胞菌(Pseudomonas)，革兰氏阳性细菌如微球菌(Micro-cocuus)或杆菌(Bacillus)。可获得羰基水解酶及其基因的真核有机体的例子包括酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，真菌如曲霉属(Aspergillus sp.)和人以外的哺乳动物如牛，从中可以获得编码羰基水解酶凝乳酶的基因。与枯草杆菌蛋白酶相同，从各种相关物种中可以获得一系列羰基水解酶，它们的氨基酸序列在该系列中的各成员之间并不完全同源，但是却具有相同或相似类型的生物活性。因此，此处所用的非人体羰基水解酶具有一个功能上的定义，即与原核和真核来源直接或间接相关的羰基水解酶。

“羰基水解酶变异体”的氨基酸序列衍生自“前体羰基水解酶”的氨基酸序列。前体羰基水解酶(如枯草杆菌蛋白酶)包括天然存在的羰基水解酶(枯草杆菌蛋白酶)和重组羰基水解酶(枯草杆菌蛋白酶)。羰基水解酶变异体的氨基酸序列是通过前体氨基酸序列中一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而从前体蛋白酶氨基酸序列衍生而得。这种修饰是对编码前体羰基水解酶(枯草杆菌蛋白酶)的“前体DNA序列”进行的，而不是对前体羰基水解酶(枯草杆菌蛋白酶)本身进行修饰。合适的对前体DNA序列进行操作的方法包括此处公开的方法以及本领域技术人员已知的方法(例如参见，EP0328299，WO89/06279和那些在此引用的美国专利和申请。)。

对应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶+76位并结合一个或多个选自下组位置：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274的特定残基被用于突变。较佳地，修饰的残基选自下列组合：76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222；最佳地是：76/99；76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104和76/101/104。这些氨基酸位置的编号对应于图1中给出的成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的编号。但是，本发明并不局限于这个特定枯草杆菌蛋白酶的突变，还延伸包括在“相当于”解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中各确定残基的位置处具有氨基酸残基的前体羰基水解酶的突变形式。在本发明的一个优选例子中，前体枯草杆菌蛋白酶是透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶，而取代、缺失或插入是在透镜状芽孢杆菌中相当于上述位置的氨基酸残基处进行的。

如果前体羰基水解酶的残基(氨基酸)与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基或残基部分是同源的(即在一级或三级结构中位置对应)或类似的(即具有相同或相似的结合、反应或化学作用等功能)，那么它与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的残基是相当的。

为了确立与一级结构的同源性，前体羰基水解酶的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的一级序列直接进行比较，尤其与一系列在已知序列的枯草杆菌蛋白酶中已知的不变残基进行比较。图2显示了解淀粉芽孢杆菌和透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶之间的保守残基。将保守残基排列好之后，其中允许必要的插入和缺失以维持排列(即避免通过任意的缺失和插入而导致消除保守残基)，便可确定与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶一级序列中特定氨基酸相当的残基。保守残基的排列最好100％地保留这种残基。但是，大于75％或少至50％的排列也已足以确定相当的残基。催化性三元结构即Asp32/His64/Ser221的保守性应保留。

例如，在图3中，来自解淀粉芽孢杆菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌(carlsbergensis)和透镜状芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列被排列在一起以提供序列间最大程度的同源性。这些序列间的比较表明，在各序列中都含有一些保守残基。这些保守残基(BPN′和透镜状芽孢杆菌之间)在图2中指明。

因此，这些保守残基可用于确定解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶在其他羰基水解酶如来自透镜状芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(PCT出版物No.WO89/06279，1989年7月13日出版)(此处优选的枯草杆菌蛋白前体酶)或称为PB92的枯草杆菌蛋白酶(EP0328299)(它与优选的透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶高度同源)中对应的相当氨基酸残基。在图3A和3B中排列了某些这种枯草杆菌蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列，以显示保守残基的同源性最大。从中可以看出，与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶相比，透镜状芽孢杆菌的序列中有一些缺失。因此，例如在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中Val165的相当氨基酸在透镜状芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中为异亮氨酸。

因此，例如在解淀粉芽孢杆菌和透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中+76位的氨基酸都是天冬酰胺(N)。但是，在本发明的优选枯草杆菌蛋白酶变异体中，相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中+76的氨基酸可以用天冬氨酸(D)取代。出于阐述目的，在表II中列出了此处指明的被取代的某些氨基酸残基和各位置的最佳取代之间的比较情况。

表II

+76 +99 +101 +103 +104 +107 +123

液化性淀粉杆菌 N D S Q Y I N

(野生型)

透镜状芽孢杆菌 N S S S V I N

(野生型)

最佳取代 D D R A I/Y V S

对于三级结构已经用X射线晶体法确定的前体羰基水解酶，也可以通过比较三级结构的同源性而确定相当的残基。相当的残基的定义是，在排列之后，前体羰基水解酶和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的一个特定氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标(N对N，CA对CA，C对C和O对O)在0.13nm之内，更佳地在0.1nm之内的残基。在最佳模型被取向和定位以给出该羰基水解酶的非氢蛋白质原子与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的原子坐标间最大重迭后，便完成了排列。最佳模型是在最高分辨率下使试验衍射数据的R因子最低的晶体模型。与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基在功能上类似的相当残基被定义为前体羰基水解酶的这种氨基酸，它们采用某种构象使得它们或者改变、修饰或对蛋白质结构、底物结合或催化等起作用，并且按照解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基所限度或归属的方式进行。此外，它们是前体羰基水解酶(已获得X晶体衍射图)中这样的氨基酸，它们占据一个类似位置使得残基的至少两个侧链原子的原子坐标在对应的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的侧链原子的0.13nm之内，尽管给定的残基的主侧链原子没有满足基于占据同源位置的相当残基标准。解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的三维结构的坐标显示在EPO出版物No.0251446(对应于美国专利申请08/212,291，其公开内容在此引用作为参考)中，可如上所述用其确定三级结构水平的相当残基。

指定被取代、插入或缺失的残基中，一些是保守残基，而另一些不是保守残基。当残基不是保守性的时，一个或多个氨基酸的置换被限定于这样的取代，它们导致产生具有不同于自然界中发现的氨基酸序列的变异体。当残基是保守的时，这种置换不应产生天然存在的序列。本发明的羰基水解酶变异体包括羰基水解酶变异体的成熟形式，以及这种水解酶变异体的原(pro-)或前原(prepro-)形式。前原形式是优选的，因为这便于羰基水解酶变异体的表达、分泌和成熟化。

“原序列”指与成熟形式的羰基水解酶的N末端部分相连的氨基酸序列，但它被去除时便出现成熟的羰基水解酶。许多在自然界发现的蛋白水解酶是转译时的原酶产物，并且以这种形式表达而不经过翻译后加工。优选的产生羰基水解酶变异体、尤其是枯草杆菌蛋白酶变异体的原序列是假设的解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的原序列，尽管也可以使用其它枯草杆菌蛋白酶原序列。在实施例1和2中，使用透镜状芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶的原序列。

“信号序列”或“前序列”指与羰基水解酶的N末端部分相连或与原水解酶的N末端部分相连的任何氨基酸序列，它参与成熟或原形式的水解酶的分泌。信号序列的定义是一种功能性的序列，包括由枯草杆菌蛋白酶基因或其他可分泌羰基水解酶的N末端编码的所有氨基酸序列，这些序列参与实现自然条件下枯草杆菌蛋白酶或其他羰基水解酶的分泌。本发明采用这种序列以实现此处定义的羰基水解酶变异体的分泌。优选的用于实施例的信号序列包括解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶信号序列的前7个氨基酸残基，它与透镜状芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶信号序列的其余部分融合在一起。

羰基水解酶变异体的“前原”形式由具有可操作地连于水解酶氨基端原序列的水解酶成熟形式和可操作地连于原序列氨基端的“前”或“信号”序列组成。

“表达载体”指这样的DNA构建物，它含有可操作地连于合适的调控序列的DNA序列，并能够在合适的宿主中实现该DNA的表达。这种调控序列包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或就是潜在的基因组插入子。一旦转入合适宿主，载体会独立于基因组而进行复制并发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时可互换使用，因为质粒是目前最常用的载体形式。但是，本发明包括其他形式的起相当功能的，以及本发明中已知或将要已知的表达载体。

用于本发明的“宿主细胞”一般是原核或真核宿主，最好是用美国专利4,760,025(RE34,606)公开方法进行操作从而使其不能分泌具有酶活性的内切蛋白酶。优选的表达枯草杆菌蛋白酶的宿主细胞是杆菌属菌株BG2036，它缺乏具有酶活性的中性蛋白酶和碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)。菌株BG2036的构建在美国专利5,264,366中有详细描述。其他表达枯草杆菌蛋白酶的宿主细胞包括枯草杆菌I168(在美国专利4,760,025(RE34,606)和美国专利5,264,366中有描述，这些专利的内容在此引用作为参考。)以及任何合适的杆菌属菌株如地前芽孢杆菌、透镜状芽孢杆菌等。

用重组DNA技术构建的载体转化或转染宿主细胞。这种转化的宿主细胞能够复制编码羰基水解酶变异体的载体，或者能够表达所需的羰基水解酶变异体。当载体编码前—或前原—形式的羰基水解酶变异体时，这种变异体(表达时)通常是以宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

用“可操作地相连”描述两个DNA区域的关系时，就表明它们在功能上是相互相关的。例如，原序列与肽可操作地相连，如果它作为信号序列参与成熟形式的蛋白质分泌，其中最可能涉及信号序列的切除。启动子与编码序列是可操作地相连的，如果它控制序列的转录；核糖体结合位点与编码序列是可操作地相连的，如果它被置于允许翻译的位置。

编码天然存在前体羰基水解酶的基因可用本领域技术人员已知的通用方法获得。这些方法通常包括合成具有假定的编码感兴趣的水解酶区域的标记探针，从表达水解酶的有机体制备基因组文库，以及通过与探针的杂交在文库中筛选感兴趣的基因。对阳性杂交克隆作图谱分析和测序。用于实施例的透镜状芽孢杆菌基因是按美国专利5,185,258中实施例1所述的方法进行克隆的，该专利的公开内容在此引用作为参考。用于实施例5的BPN′基因是按RE34,606中实施例1所述的方法进行克隆的，该专利的公开内容在此引用作为参考。

克隆的羰基水解酶接着被用于转化宿主细胞以表达水解酶。然后水解酶基因被连入高拷贝数的质粒。该质粒在宿主中复制，只要它含有质粒复制所需的、众所周知的元件：可操作地连于感兴趣基因的启动子(如果能被宿主识别(即转录)，那么也可以使用基因本身的同源启动子。)、转录终止和聚腺苷酸化区域(在某些真核宿主细胞中，对于宿主中从水解酶基因转录下来的mRNA稳定性是必须的。)，该区域可以是外源的，或由水解酶基因的内源终止区域提供，同时更佳地有选择基因如抗生素抗性基因(它能够通过在含抗生素的培养基中生长而连续培养维持被质粒感染的宿主细胞)。高拷贝数质粒还可含有在宿主中复制的起始点，从而能够不受染色体的限制而在细胞质中产生大量的质粒。但是，将多拷贝的水解酶基因整合入宿主基因组中也在本发明范围之内。这对于特别适合同源重组的原核或真核有机体而言很方便。

用于实施例的基因是天然透镜状芽孢杆菌基因和天然解淀粉芽孢杆菌基因。或者，可产生编码天然存在或突变前体羰基水解酶(枯草杆菌蛋白酶)的合成基因。在这种方法中，应确定前体羰基水解酶(枯草杆菌蛋白酶)的DNA和/或氨基酸序列。随后合成多个重迭的合成单链DNA片段，然后通过杂交和连接而形成编码前体水解酶的合成DNA。合成基因构建物的一个例子是美国专利5,204,015实施例3中所述的构建物，该专利的公开内容在此引用作为参考。

一旦天然存在或合成的前体羰基水解酶基因被克隆，便可以进行一系列的修饰，从而在合成天然存在前体羰基水解酶之外，更广泛地使用基因。这种修饰包括如美国专利4,760,025(RE 34,606)和EPO出版物No.0251446中所述的那样产生重组羰基水解酶，以及如此处所述的那样产生羰基水解酶变异体。

下列盒式诱变方法可用于协助构建和鉴别本发明的羰基水解酶变异体，尽管也可使用其他方法如定点诱变。首先，获得天然存在的编码水解酶的基因，进行全长或部分测序。然后，扫描序列，在编码的酶中找出需要产生一个或多个氨基酸突变(缺失、插入或取代)的位置。评估该位置两侧的序列是否存在限制性位点，以便用寡核苷酸混合物(oligonucleotide pool)置换某个基因短片段，这些寡核苷酸混合物被表达时会编码不同的突变型。这种限制性位点较佳地是水解酶基因中的唯一位点，以便置换基因片段。然而，在水解酶基因中并不过多的任何方便的限制性位点都可使用，只要限制性消化产生的基因片段能够按适当的次序重新装配在一起。如果从选定的位置起在方便的距离(10—15个核苷酸)内没有限制性位点，那么限制性位点可通过取代基因中一些核苷酸而产生，其中取代时不会在最终的构建中改变阅读框或编码的氨基酸。可按常规方法，通过M13引物延伸而使基因发生突变从而改变其序列成为所需序列。确定合适的两侧区域以及衡量为了具有两个方便的限制性位点序列而所需改变等工作是常规性的，因为有遗传密码子的兼并性，基因限制性内切酶图谱和大量不同的限制性内切酶。应注意，如果存在一个方便的侧向限制性位点，那么仅需对不含有限制性位点的侧向区域使用上述方法。

一旦天然存在DNA或合成DNA被克隆，那么在待突变位置两侧的限制性位点可用同族限制性酶进行消化，然后将多种末端互补寡核苷酸盒连入基因。该方法简化了诱变过程，因为可合成所有的寡核苷酸使其具有相同的限制性位点，从而不需要合成接头来产生限制性位点。

如此处所用，蛋白水解活性被定义为每毫克活性酶水解肽键的速率。有许多熟知的程序可测量蛋白水解活性(K.M.Kalisz，“Mi-crobial Proteinases，”Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，A.Fiechter ed.，1988)。除了具有改变的蛋白水解活性之外，本发明的变异酶还可有其他改变性能如Km、Kcat、Kcat/Km比率和/或改变的底物特异性和/或改变的pH活性分布图。可以对酶进行改造使其适应预计会存在的特定底物，例如在制备肽中存在的底物，或者适应水解过程例如冲洗使用。

本发明的一方面目的是为了获得与前体羰基水解酶相比，蛋白水解活性有所改变的变异羰基水解酶，因为增加这种活性(数值上更大)可以使酶更有效地作用于靶底物。此外，与前体相比，热稳定性和/或底物特异性改变的变异酶也是感兴趣的。较佳地，被突变的羰基水解酶是枯草杆菌蛋白酶。在实施例中给出了用于从枯草杆菌蛋白酶型羰基水解酶获得这种效果的具体氨基酸，它们相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶残基+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，或其组合。在某些情况下，更低的蛋白水解活性是有利的，例如蛋白水解活性的下降在需要羰基水解酶合成活性的场合(如用于合成肽)是有用的。人们可能希望降低会破坏合成产物的蛋白水解活性。相反，在某些情况下，与前体相比增加变异酶的蛋白水解活性是有利的。此外，增加或减少(改变)变异体的稳定性，无论是碱性稳定性或热稳定性，都可能是有利的。Km，Kcat或Kcat/Km的增加或降低对用来确定这些动力学参数的底物是特异的。

在本发明的另一方面，已确定枯草杆菌蛋白酶中相当于+76的残基与大量其他修饰的组合对于调节酶的整体稳定性和/或蛋白水解活性是至关重要的。因此，如实施例中所述，在优选例子中，在透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中相当于+76位上的天冬酰胺(N)可以用天冬氨酸(D)取代并结合一个或多个下列氨基酸残基的修饰：+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，从而产生稳定性更好和/或活性更好的突变酶。

本发明的最佳例子在实施例中给出。这些例子包括下列取代残基的特定组合：N76D/S99；N76D/V104I；N76D/S99D/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I。所有在本发明中提出权利要求的突变组合都在实施例中有描述。这些取代最好是在透镜状芽孢杆菌(重组的或天然的)枯草杆菌蛋白酶上进行，尽管也可在任何杆菌属枯草杆菌蛋白酶上进行取代。

根据这种以及其他变异枯草杆菌蛋白酶的结果，似乎羰基水解酶(较佳地是枯草杆菌蛋白酶)中相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶残基+76、+99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274的残基，对于酶的蛋白水解活性、工作性能和/或稳定性以及变异酶的清洗或冲洗性能是至关重要的。

本发明的许多羰基水解酶变异体，尤其是枯草杆菌蛋白酶，可用于配制各种去垢剂组合物。有大量已知化合物是能用于含有本发明的羰基水解酶突变型的组合物的合适表面活性剂。其中包括非离子型、阴离子型、阳离子型或两性离子型洗涤剂，比如参见Barry J.Anderson的US4,404,128及Jiri Flora等人的US4,261,868。一种合适的去垢剂配方是在美国专利5,204,015(前面引用作为参考)实施例7中描述的配方。对于可用作清洗组合物的各种不同配方，本领域是很熟悉的。除了典型的清洗组合物，很清楚本发明的枯草杆菌变异体也可用于任何使用天然或野生型枯草杆菌蛋白酶的场合。因此，这些变异体可以用于例如条状或液体肥皂、洗碗剂、隐形眼镜清洗液或产品、肽水解、废物处理、织物应用以及蛋白质生产中用作切割融合的酶。在去垢剂组合物中，本发明的变异体可有增强的性能(与前体相比)。如本文所用，在去垢剂中的增强性能的定义是，在标准洗涤过程后，用通常的评估方法所确定的某些酶敏感污迹如草或血的清洗效果提高。

本发明的枯草杆菌蛋白酶可配制成熟知的粉末状或液体去垢剂，其浓度为约0.01—5重量％(较佳地为0.1—0.5％)时pH为6.5—12.0。这些去垢清洗组合物还可含有其他酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂酶或内糖苷酶以及助洗剂和稳定剂。

在常规清洗组合物中加入本发明的枯草杆菌蛋白酶并不会形成任何特殊的使用限制。换言之，对去垢剂合适的任何温度和pH也适用于本发明的组合物，只要pH在上述范围内而温度低于所述的枯草杆菌蛋白酶变性温度。此外，本发明的枯草杆菌蛋白酶可用于不含去垢剂的清洗组合物，同样可仅含有该酶或者同时含有助洗剂和稳定剂。

下面通过实施例描述本发明，这些实施例不用于限制本发明范围。实施例1构建在枯草杆菌中表达GG36基因

为了表达透镜状芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶基因而进行的克隆和构建，基本上是按照美国专利5,185,258所述的方法进行。质粒GGA274(见图4)进一步按图5所示的方式进行修饰。在构建GGA274中引入的PstI位点通过下述的寡核苷酸定点诱变而切除，其中寡核苷酸序列如下：

5′-GAAGCTGCAA CTCGTTAAA-3′(SEQ ID NO：1)带下划线的“A”残基消除了限制性酶PstI的识别序列，并将274位的相应氨基酸残基从Ala变为Thr。274位的苏氨酸是最初在克隆的透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因序列中发现的野生型残基。从质粒GGA274或其衍生物(图5中的GGT274)中通过EcoRI和BamHI消化而切下编码枯草杆菌蛋白酶的DNA片段。将DNA片段亚克隆至细菌噬菌体M13类型载体如MP19以便诱变。诱变后，进行EcoRI和HindIII消化，随后克隆，从而将突变的枯草杆菌蛋白酶基因重新连入诸如GGA274之类的表达载体以便表达和回收突变枯草杆菌蛋白酶蛋白质。实施例2寡核苷酸定点诱变

寡核苷酸定点诱变按照Zoller，M.et al.(1983)，MethodsEnzymol.，100：486—500所述的方法进行。一个例子是，用人工合成的序列

5′-GCTGCTCTAG ACAATTCG-3′(SEQ ID NO：2)寡核苷酸将76位的氨基酸残基从天冬酰胺(N)变为天冬氨酸(D)，即N76D。带下划线的“G”和“C”残基表示从野生型基因序列改变而来。CA保留了+75位的亮氨酸，同时改变了氨基酸序列从而引入XbaI限制性酶的识别位点(TCTAGA)，而GAC的改变使+76天冬酰胺变为天冬氨酸。

对于99、101、103和104位的诱变，可使用不同的寡核苷酸，这取决于所需的突变组合情况。例如，序列

5′GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT-3′(SEQ ID NO：3)寡核苷酸可用于在单个枯草杆菌蛋白酶分子中同时产生下列改变：S99D；S101R；S103A和V104I。类似地，序列

5′-TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG-3′(SEQ ID NO：4)和5′-CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG-3′(SEQ ID NO：5)可分别用于产生I107V和N123S。同样，带下划线的残基表示从野生型序列改变而来，以用于产生所需的氨基酸序列或限制性酶识别序列的改变。实施例3枯草杆菌蛋白酶变异体的蛋白水解活性

按照实施例2的方法，制得表III中列出的变异体。每种枯草杆菌蛋白酶变异体的蛋白水解活性都列在表III中。用P.Bonneau，etal.(1991)J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，No.3，p.1030中所述的方法，通过水解合成肽底物琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基酰苯胺而测量动力学参数K_cat，K_M和K_cat/K_M。简言之，将一少量枯草杆菌蛋白酶变异体原液加入1厘米的小试管中，试管中含有溶解于0.1M Tris-HClpH 8.6缓冲液中的底物并保温于25℃。反应后，用光谱分光光度法测量在410nm处反应产物对硝基酰苯胺的吸收值。用非线性回归算法获得动力学参数，使各反应的反应速度和产物浓度与Michaelis-Menten方程式相符。

表III

对透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和突变蛋白测得的

动力学参数K_cat，K_M和K_cat/K_M酶 K_cat(s_-1) K_M(M) K_cat/K_M(s_-1M^-1)透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 170 0.00078 2.18×10⁵N76D 219 0.0008 2.74×10⁵M76D/S99D 88 0.00061 1.44×10⁵N76D/S103A 400 0.0014 2.86×10⁵N76D/V104I 459 0.0011 4.17×10⁵N76D/I107V 219 0.0011 1.99×10⁵N76D/N123S 115 0.0018 6.40×10⁴N76D/S99D/S101R 146 0.00038 3.84×10⁵N76D/S99D/S103A 157 0.0012 1.31×10⁵N76D/S99D/V104I 247 0.00097 2.55×10⁵N76D/S101R.S103A 405 0.00069 5.90×10⁵N76D/S101R/V104I 540 0.00049 1.10×10⁶N76D/S102A/V104I 832 0.0016 5.20×10⁵N76D/V104I/I107V 497 0.00045 1.10×10⁶N76D/V104Y/I107V 330 0.00017 1.90×10⁶N76D/V104I/N123S 251 0.0026 9.65×10⁴N76D/I107V/N123S 147 0.0035 4.20×10⁴N76D/S99D/S101R/S103A 242 0.00074 3.27×10⁵N76D/S99D/S101R/V104I 403 0.00072 5.60×10⁵N76D/SS99D/S103A/V104I 420 0.0016 2.62×10⁵N76D/S101R/S103A/V104I 731 0.00065 1.12×10⁶N76D/S103A/V104I/N123S 321 0.0026 1.23×10⁵N76D/V104I/I107V/N123S 231 0.003 7.70×10⁴N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 624 0.00098 6.37×10⁵N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 194 0.0043 4.51×10⁴N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 311 0.0023 1.35×10⁵

表III中列出的数据表明，所有测试的枯草杆菌蛋白酶变异体都保留了蛋白水解活性。此外，仔细分析数据揭示，相当于解淀粉芽孢杆菌中76、99、101、103、104、107和123位的氨基酸残基的各种取代组合，会明显改变透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的蛋白水解活性。实施例4枯草杆菌蛋白酶变异体的热稳定性

对于透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶及用实施例2方法制得的变异体，观察比较其热稳定性，结果列于表IV。将纯化的酶(15μg/ml于0.1M甘氨酸，0.01吐温(％Tween—80)pH10.0中，含有或不含50mM CaCl₂)一份份地装入各小试管中，在10℃保温5分钟，10—60℃1分钟，60℃20分钟。然后将试管置于冰上10分钟。分析各试管中样品的酶活性，即将其加入1厘米的小试管中，试管中含有溶解于0.1M Tris-HClpH 8.6缓冲液中的底物琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基酰苯胺并保温于25℃。在最初线性反应速度之后，用光谱分光光度法测量在410nm处反应产物对硝基酰苯胺的吸收值，以时间作为函数。数据为加热前活性的百分比。列于表IV中的数据表明，在加入50mM CaCl₂的测试条件下，绝大多数变异体(26个中的24个)的热稳定性与透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的热稳定性相近。在不加入50mM CaCl₂的测试条件下，绝大多数变异体(26个中的19个)比透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶明显地更具热稳定性。此外，在不加入50mM CaCl₂的测试条件下，变异体N76D/S99D、N76D/V104I、N76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/I107V、N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I比单个取代的N76D变异体明显地更稳定。

表IV

对透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和突变蛋白测得的

热稳定性(pH 10，60℃，+/-50mM CaCl₂)

酶最初活性的残留百分比

-CaCl₂ +CaCl₂

透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 2 96

N76D 34 97

N76D/S99D 49 98

N76D/S103A 26 92

N76D/V104I 58 98

N76D/I107V 32 96

N76D/N123S 0 97

N76D/S99D/S101R 30 100

N76D/S99D/S103A 36 100

N76D/S99D/V104I 48 97

N76D/S101R/S103A 26 100

N76D/S101R/V104I 38 100

N76D/S103A/V104I 58 100

N76D/V104I/I107V 60 97

N76D/V104Y/I107V 48 74

N76D/V104I/N123S 0 98

N76D/I107V/N123S 16 100

N76D/S99D/S101R /S103A 38 100

N76D/S99D/S101R/V104I 33 100

N76D/S99D/S103A/V104I 38 98

N76D/S101R/S103A/V104I 40 99

N76D/S103A/V104I/N123S 1 98

N76D/V104I/I107V/N123S 3 99

N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 36 99

N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 2 95

N76D/S99D/S10IR/S103A/V104I/N123S 0 100实施例5用噬菌粒(phagemid)产生的单链DNA模板进行寡核苷酸定点诱变A.构建透镜状芽孢杆菌变异体

诱变方案与上面实施例2所述的方法基本相同。用噬菌粒方法产生单链DNA模板。为了构建用于产生单链DNA模板的噬菌粒，我们首先构建载体pBCDAICAT。载体构建流程图示于图8。首先，来自pC194质粒(Horinouchi，S.and Weisblum，B.，J.Bacteriol.，150：8—15，1982)的编码CAT基因的ClaI—ClaI片段被克隆入pUC19(New England BioLabs，Beverly，MA)多接头区域的AccI位点中，形成质粒pUCCHL。来自GG36DAI编码DNA5′端的0.6KB EcoRI—DraI片段被克隆入pBSKS质粒(Stratagene，Inc.，San Diego，CA)的EcoRI和EcoRV位点，形成质粒pBC2SK5。质粒pBC2SK5的单个EcoRI位点的去除是通过EcoRI消化、随后用T4 DNA聚合酶催化填平再重新连入形成不含EcoRI位点质粒pBC2SK—5R。被克隆入pBC2SK—5R的EcoRI—DraI片段以PstI—HindIII片段形式分离出，然后克隆入pUCCHL的PstI—HindIII位点(pUC19的多接头部分)形成质粒pUCCHL5R。GG36DAI基因的编码序列以EcoRI—BamHI片段形式切下，克隆入pUCCHL5R的EcoRI—BamHI位点，形成pUCCAT。pUCCAT的大EcoRI—HindIII片段接着被克隆入BS2KS+的EcoRI和HindIII位点，形成质粒pBCDAICAT。

为了产生单链DNA，按照Russel，M.，Kidd，S.and Kelley，M.R.，GENE45：333—338，1986的方法，用噬菌体R408(得自Stratagene，Inc.，San Diego，CA)感染含有pBCDAICAT的大肠杆菌。一旦形成单链DNA模板，就进行实施例2所述的标准诱变方法。某些突变型的构建在下面详细给出以便阐述。

为了构建透镜状芽孢杆菌(GG36)N76D/S103A/V104I/L217H，用编码GG36 N76D/S103A/V104I的EcoRI—BamHI片段构建pUCCAT(见图8)，形成质粒pBCDAICAT。一旦形成单链DNA模板，就按照上述方案，用如下序列的诱变引物形成L217H

* *** **x ClaI5′TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT-3′(SEQ ID NO：13)与前面相同，带下划线的残基表示被改变的核苷酸，而xClaI表示原存在的ClaI位点在诱变后被消除。诱变方案描述于实施例2。在诱变后，首先筛选质粒DNA是否消除了ClaI位点，那些缺少ClaI位点的克隆通过DNA序列分析以确定217位氨基酸残基从L变为H的DNA序列。B.BPN′变异体的构建及其在枯草杆菌中的表达

解淀粉芽孢杆菌(BPN′)N76D/Q103A/Y104I/Y217L构建按类似的方式进行，除了两个连续步骤。首先将N76D引入BPN′Y217L中形成BPN′N76D/Y217L，然后进行第二次诱变将BPN′N76D/Y217L变为BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L。为了产生用于第一次诱变的单链DNA模板，用编码BPN′Y217L枯草杆菌蛋白酶的EcoRI—BamHI片段(衍生自Wells，J.，et al.，PNAS，84，5167，1087中所述的Y217L质粒)构建质粒pUCCATFNA(见图9)。用含有BPN′Y217L的pUCCATFNA质粒构建质粒pBCF-NACAT(图9)。如上产生单链DNA。为了产生BPN′N76D/Y217L，用如下序列的寡核苷酸引物形成N76D变化

* *** **x XbaI5′-C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G-3′(SEQ ID NO：14)然后用含有BPN′N76D/Y217L的质粒pBCFNACAT(N76D诱变后的质粒pBCFNACAT)制备单链DNA，并用另一如下序列的寡核苷酸引物形成BPN′N76D/Q103A/Y104I/Y217L

* *** **x PvuII5′GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT-3′(SEQ ID NO：15)所有克隆、制备单链DNA、诱变和筛选突变型的步骤都按上述方法进行。

BPN′基因及其变异体的表达是通过将质粒DNA(含有不同变异BPN′基因的pBCFNACAT)直接整合入RE34,606中所述的缺少蛋白酶的枯草杆菌菌株。

按实施例2和5所述的方法制备各种变异体。对这些变异都测其动力学数据和稳定性数据。动力学数据是用实施例3的方法获得的，列于表V。稳定性数据的获得如下所述。结果列于表VI。热稳定性测试程序

纯化的酶是在0.1M甘氮酸pH10.0，0.01％Tween—80中进行缓冲液交换(buffer—exchanged)，即将酶上柱于Sephadex G—25柱，该柱已用缓冲液平衡过，然后用相同缓冲液将酶从柱中洗脱出来。

向含有0.1M甘氮酸，0.01％Tween—80 pH10.0并保温于60℃的试管中，加入缓冲液交换过的酶，使最终酶浓度为15μg/ml。

按不同时间从60℃保温中取出一份样品，立刻测试其酶活性，即将其加入1厘米的小试管中，试管中含有溶解于0.1M Tris—HCl pH8.6缓冲液中的1.2mM人工合成肽底物琥珀酰—L—Ala—L—Ala—L—Pro—L—Phe—对硝基酰苯胺并保温于25℃。在最初线性反应速度之后，用光谱分光光度法测量在410nm处反应产物对硝基酰苯胺的吸收值，以时间作为函数。

以60℃保温时间作为函数，根据反应速度的一级坐标图确定半衰期(即50％酶失去活性所需的时间)。

表VI中的数据是在相同条件下测得的透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(GG36)半衰期的百分比。

表V酶 K_cat K_M K_cat/K_M

(s^-1)(mM) (s^-1M^-1)透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 170 0.78 2.20E＋05N76D/S103G/V104I^* 380 1.4 2.70E＋05N76D/S103A/V104F 730 0.33 2.20E＋06N76D/S103A/V104N 790 2.8 2.80E＋05N76D/S103A/V104S 170 0.83 2.00E＋05N76D/S103A/V104T 370 1.9 2.00E＋05N76D/S103A/V104W 880 0.31 2.80E＋06N76D/S103A/V104Y 690 0.5 1.40E＋06K27R/N76D/V104Y/N123S 500 1.2 4.20E＋05N76D/S101G/S103A/V104I^* 620 1.3 4.80E＋05N76D/S103A/V104I/S105A^* 550 1.3 4.20E＋05N76D/S103A/V104I/S105G^* 440 1.7 2.60E＋05N76D/S103A/V104T/I107A^* 120 5.7 2.10E＋04N76D/S103A/V104T/I107L^* 310 3.2 9.70E＋04N76D/S103A/V104I/L126A 90 2.2 4.10E＋04N76D/S103A/V104I/L126F 180 1.9 9.50E＋04N76D/S103A/V104I/126I 100 2.4 4.20E＋04N76D/S103A/V104I/L126V 64 3.2 2.00E＋04N76D/S103A/V104I/S128G^* 560 1.7 3.30E＋05N76D/S103A/V104I/S128L^* 430 3.8 1.10E＋05N76D/S103A/V104I/L135A 140 0.76 1.80E＋05N76D/S103A/V104I/L135F 390 0.69 5.70E＋05N76D/S103A/V104I/L135I 110 0.73 1.50E＋05N76D/S103A/V104I/L135V 140 0.86 1.60E＋05N76D/S103A/V104I/S156E^* 170 2.6 6.50E＋04N76D/S103A/V104I/S166D^* 160 3.5 4.60E＋04N76D/S103A/V104I/D197E 510 1.4 3.60E＋05N76D/S103A/V104I/N204A^* 530 1.1 4.80E＋05N76D/S103A/V104I/N204G^* 580 1.4 4.10E＋05N76D/S103A/V104I/N204C^* 370 1.3 2.90E＋05N76/S103A/V104I/P201I^* 500 1.2 4.20E＋05N76D/S103A/V104I/L217H^* 80 0.63 1.30E＋05N76D/S103A/V104I/M222A 70 3.1 2.30E＋04N76D/S103A/V104I/M222S 80 3.1 2.60E＋04N76D/S103A/V104I/T260P 660 1.5 4.40E＋05N76D/S103A/V104I/S265N 590 1.3 4.50E＋05K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 220 1.4 1.60E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 430 1.1 3.90E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 400 1.1 3.60E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 440 1.2 3.70E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 440 1.2 3.70E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 760 0.98 7.80E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 410 1.2 3.40E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 390 1 3.90E＋05N76D/S103A/V104I/1126F/S265N 170 2.1 8.10E＋04N76D/S103A/V104I/S156E/S166D^* 40 6.3 6.40E＋03K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 410 0.98 4.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 540 0.66 8.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 770 0.79 9.80E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S 610 0.99 6.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 580 0.78 7.40E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 660 1 6.60E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 590 0.89 6.60E＋05K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A 520 1 5.20E＋05K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 460 0.65 7.10E＋05液化性淀粉杆菌枯草杆菌蛋白酶(BPN′) 50 0.14 3.60E＋05BPN′-N76D/Y217L^* 380 0.46 8.30E＋05*这些突变型是按实施例5方法制备，其他所有的是按实施例2方法制备。

表VI酶热稳定性

(天然酶半衰期的百分比)透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 100N76D 590N76D/S99D 840N76D/S103A 390N76D/V104I 660N76D/I107V 710N76D/N123S 70N76D/S99D/S101R 610N76D/S99D/S103A 590N76D/S99D/V104I 910N76D/S101R/S103A 930N76D/S101R/V104I 500N76D/S103A/V104I 460N76D/S103G/V104I^* 370N76D/S103A/V104F 480N76D/S103A/V104N 230N76D/S103A/V104S 230N76D/S103A/V104T 370N76D/S103A/V104W 280N76D/S103A/V104Y 400N76D/V104I/I107V 940N76D/V104Y/I107V 820N76D/V104I/N123S 80N76D/I107V/N123S 150K27R/N76D/V104Y/N123S 100N76D/S99D/S101R/S103A 570N76D/S99D/S101R/V104I 1000N76D/S99D/S103A/V104I 680N76D/S101G/S103A/V104I^* 390N76D/S101R/S103A/V104I 470N76D/S103A/V104I/S105A^* 360N76D/S103A/V104I/S105D^* 370N76D/S103A/V104T/1107A^* 270N76D/S103A/V104T/I107L^* 230N76D/S103A/V104I/N123S 110N76D/V104I/I107V/N123S 220N76D/S103A/V104I/L126A 270N76D/S103A/V104I/L126F 950N76D/S103A/V104I/L126I 410N76D/S103A/V104I/L126V 320N76D/S103A/V104I/S128G^* 640N76D/S103A/V104I/S128L^* 760N76D/S103A/V104I/L135A 230N76D/S103A/V104I/L135F 200N76D/S103A/V104I/L135I 510N76D/S103A/V104I/L135V 500N76D/S103A/V104I/S156E^* 120N76D/S103A/V104I/S166D^* 590N76D/S103A/V104I/D197E 460N76D/S103A/V104I/N204A^* 230N76D/S103A/V104I/N204G^* 240N76D/S103A/V104I/N204c^* 500N76D/S103A/V104I/P2101^* 1370N76D/S103A/V104I/L217H^* 60N76D/S103A/V104I/M222A 520N76D/S103A/V104I/M222S 490N76D/S103A/V104I/T260P 490N76D/S103A/V104I/S265N 360K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S 210K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E 120K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C 110K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L 380K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V 140K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P 40K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A 60N76D/S99D/S101R/S103A/V104I 590N76D/S99D/S103A/V104I/N123S 110N76D/S103A/V104I/L126F/S265N 810N76D/S103A/V104I/S156E/S166D^* 220K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E 90K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S 250K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S 270K27R/N76D/V104Y/N123S/C204C/N218S 460K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S 1400K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P 310K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A 180N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S 90K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274A 230K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N218S 240液化性淀粉杆菌枯草杆菌蛋白酶(BPN′) 100BPN′-N76D/Y217L* 420*这些突变型是按实施例5方法制备，其他所有的是按实施例2方法制备。实施例6洗涤性能测试

在前面实施例中描述过的变异体洗涤性能的评估是通过从EMPA116布块(Testfabrics，Inc.，Middlesex，NJ 07030)上去除污迹(布上的血/牛奶/碳黑)情况进行的。

6块被切成3×4.5英寸、边缘为锯齿状的EMPA116布块，被置于7243S型Terg—O—Tometer(United States Testing Co.，Inc.，Hoboken，NJ)的各个盆中，其中含有1000毫升水、硬度为159pg(Ca⁺⁺∶Mg⁺⁺∷3∶1∷w∶w)，7克去垢剂和适当的酶。去垢剂基料是wfk-Testgewebe GmbH(Adlerstrasse 42，Postfach 130762，D—47759 Krefeld，Germany)的WFK1去垢剂。

组份终配方百分比

沸石A 25％

硫酸钠 25％

苏打粉 10％

线性烷基苯磺酸盐 8.8％

醇乙氧化物(7—8EO) 4.5％

钠皂 3％

硅酸钠(SiO₂∶Na₂O∷3.3∶1) 3％

向该基本去垢剂中，加入下列组份：

组份终配方百分比

过硼酸钠一水合物 13％

共聚物(Sokalan CP5) 4％

TAED(Mykon ATC Green) 3％

酶 0.5％

增白剂(Tinopal AMS—GX) 0.2％

过硼酸钠一水合物是从Degussa Corporation，Ridgefield—Park，NJ07660获得的。Sokalan CP5是从BASF Corporation，Par-sippany，NJ07054获得的。Mykon ATC Green(TAED，四乙酰基乙二胺)是从Warwick International，Limited，Mostyn，Holywell，Clwyd CH8 9HE，England获得。Tinopal AMSGX是从Ciba—Geigy Corporation，Greensboro，NC27419获得的。

6块EMPA116布块在去垢剂中用酶在60℃洗30分钟，然后在1000毫升水中漂洗5分钟二次。加入的酶终浓度对标准曲线为0.05—1ppm，常规分析为0.25ppm。干燥并压平布块，用Minolta ChromaMeter，Model CR—200(Minolta Corporation，Ramsey，NJ07446)L*a*b刻度上的L值测量布块的反射系数。性能以透镜状芽孢杆菌(GG36)蛋白酶性能的百分比表示，用透镜状芽孢杆菌(GG36)蛋白酶的数量除以得到同样污迹去除效果所需的变异体蛋白酶的数量，然后乘以100。数据列于表VII。

表VII

酶清洗性能

透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶 100

N76D 310

N76D/S103A 230

N76D/V104I 130

N76D/I107V 160

N76D/S99D/S101R 370

N76D/S99D/S103A 290

N76D/S101R/S103A 130

N76D/S101R/V104I 300

N76D/S103A/V104I 320

N76D/S103G/V104I 160

N76D/S103A/V104F 210

N76D/S103A/V104N 110

N76D/S103A/V104T 170

N76D/V104I/I107V 210

N76D/S99D/S101R/S103A 220

N76D/S99D/S101R/V104I 140

N76D/S101G/S103A/V104I 170

N76D/S101R/S103A/V104I 150

N76D/S103A/V104I/S105A 170

N76D/S103A/V104T/I107A 120

N76D/S103A/V104T/I107L 110

N76D/S103A/V104I/L126F 110

N76D/S103A/V104I/S128G 280

N76D/S103A/V104I/L135I 160

N76D/S103A/V104I/L135V 160

N76D/S103A/V104I/D197E 170

N76D/S103A/V104I/N204A 160

N76D/S103A/V104I/N204G 150

N76D/S103A/V104I/P210I 470

N76D/S103A/V104I/M222A 100

N76D/S103A/V104I/T260P 280

N76D/S103A/V104I/S265N 190实施例7在液体去垢剂配方中蛋白酶的稳定性

对透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶及其变异酶N76D/S103A/V104I，根据此处所述的程序比较它们在液体去垢剂配方中的蛋白酶稳定性(导致失活)。用于研究的去垢剂配方是市场上出售的瓶装Tide Ultra液体洗衣去垢剂(美国的Procter& Gamble Company制造)。为了使原来的酶失活，必须对去垢剂制剂进行热处理。这通过将去垢剂在96℃保温4.5小时而实现。然后在室温下，将透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和N76D/S103A/V104I变异体的浓制剂(20克酶/升)加入热处理过的Tide Ultra中，使去垢剂制剂中的终浓度为0.3克酶/升。将带有加入酶的、热处理去垢剂在50℃水浴中保温。在0，24，46，76和112小时时从保温试管中取出各份样品，测试其酶活性，即将其加入1厘米的小试管中，试管中含有溶解于0.1M Tris—HClpH 8.6缓冲液中的底物琥珀酰—L—Ala—L—Ala—L—Pro—L—Phe—对硝基酰苯胺并保温于25℃。在最初线性反应速度之后，用光谱分光光度法测量在410nm处反应产物对硝基酰苯胺的吸收值，以时间作为函数。如图10所示，观察到N76D/S103A/V104I变异体的抗失活稳定性远大于天然透镜状芽孢杆菌酶。在特定的测试条件下，估计在Tide Ultra去垢剂制剂中两种酶的失活半衰期是，透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶为45小时，而N76D/S103A/V104I变异体是125小时。

在整个申请中，通用的单字符和三字符表示各种氨基酸。这些字符可参见Dale，J.W.(1989)，Molecular Genetics of Bacteria，John Wiley & Sons，Ltd.，Appendix B.

尽管上面描述了本发明的优选实施例，很明显本发明相关领域的熟练技术人员在完整地领会本发明之后，可对本发明进行各种改变或各种相应改动，这些都在所附权利要求书所限定的范围之内。

序列表(1)一般信息

(i)申请人：Genencor International，Inc.

(ii)发明名称：枯草杆菌蛋白酶变异体

(iii)序列数目：15

(iv)通信地址：

(A)地址：Genencor International，Inc

(B)街道：180 Kimball Way

(C)城市：So.San Francisco

(D)州：CA

(E)国家：USA

(F)邮编：94080

(v)计算机可读形式：

(A)记录介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容型

(C)操作系统：PC—DOS/MS—DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25

(vi)本申请资料：

(A)申请号：PCT/US94/11562

(B)申请日：13—OCT—1994

(C)分类：

(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：Horn，Margaret A.

(B)登记号：33，401

(C)参考/案卷号：GC235—2PCT

(ix)通讯信息：

(A)电话：(415)742—7536

(B)传真：(415)742—7217(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GAAGCTGCAA CTCGTTAAA 19(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GCTGCTCTAG ACAATTCG 18(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：39碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT 39(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG 33(2)SEQID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG 22(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1497碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：GGTCTACTAA AATATTATTC CATACTATAC AATTAATACA CAGAATAATC TGTCTATTGG 60TTATTCTGCA AATGAAAAAA AGGAGAGGAT AAAGAGTGAG AGGCAAAAAA GTATGGATCA 120GTTTGCTGTT TGCTTTAGCG TTAATCTTTA CGATGGCGTT CGGCAGCACA TCCTCTGCCC 180AGGCGGCAGG GAAATCAAAC GGGGAAAAGA AATATATTGT CGGGTTTAAA CAGACAATGA 240GCACGATGAG CGCCGCTAAG AAGAAAGATG TCATTTCTGA AAAAGGCGGG AAAGTGCAAA 300AGCAATTCAA ATATGTAGAC GCAGCTTCAG TCACATTAAA CGAAAAAGCT GTAAAAGAAT 360TGAAAAAAGA CCCGAGCGTC GCTTACGTTG AAGAAGATCA CGTAGCACAT GCGTACGCGC 420AGTCCGTGCC TTACGGCGTA TCACAAATTA AAGCCCCTGC TCTGCACTCT CAAGGCTACA 480CTGGATCAAA TGTTAAAGTA GCGGTTATCG ACAGCGGTAT CGATTCTTCT CATCCTGATT 540TAAAGGTAGC AAGCGGAGCC AGCATGGTTC CTTCTGAAAC AAATCCTTTC CAAGACAACA 600ACTCTCACGG AACTCACGTT GCCGGCACAG TTGCGGCTCT TAATAACTCA ATCGGTGTAT 660TAGGCGTTGC GCCAAGCGCA TCACTTTACG CTGTAAAAGT TCTCGGTGCT GACGGTTCCG 720GCCAATACAG CTGGATCATT AACGGAATCG AGTGGCGGAT CGCAAACAAT ATGGACGTTA 780TTAACATGAG CCTCGGCGGA CCTTCTGGTT CTGCTGCTTT AAAAGCGGCA GTTGATAAAG 840CCGTTGCATC CGGCGTCGTA GTCGTTGCGG CAGCCGGTAA CGAAGGCACT TCCGGCAGCT 900CAAGCACAGT GGGCTACCCT GGTAAATACC CTTCTGTCAT TGCAGTAGGC GCTGTTGACA 960GCAGCAACCA AAGAGCATCT TTCTCAAGCG TAGGACCTGA GCTTGATGTC ATGGCACCTG 1020GCGTATCTAT CCAAAGCACG CTTCCTGGAA ACAAATACGG GGCGTACAAC GGTACGTCAA 1080TGGCATCTCC GCACGTTGCC GGAGCGCCTG CTTTGATTCT TTCTAAGCAC CCGAACTGGA 1140CAAACACTCA AGTCCGCAGC AGTTTAGAAA ACACCACTAC AAAACTTGGT GATTCTTTGT 1200ACTATGGAAA AGGGCTGATC AACGTACAAG CGGCAGCTCA GTAAAACATA AAAAACCGGC 1260CTTGGCCCCG CCGGTTTTTT ATTATTTTTC TTCCTCCGCA TGTTCAATCC GCTCCATAAT 1320CGACGGATGG CTCCCTCTGA AAATTTTAAC GAGAAACGGC GGGTTGACCC GGCTCAGTCC 1380CGTAACGGCC AACTCCTGAA ACGTCTCAAT CGCCGCTTCC CGGTTTCCGG TCAGCTCAAT 1440GCCATAACGG TCGGCGGCGT TTTCCTGATA CCGGGAGACG GCATTCGTAA TCGGATC 1497(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：275氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala

35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His

50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala

130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala

165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val

180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser

210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys

245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270Ala Ala Gln

275(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：275氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp

20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala

35 40 45Ser Phe Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His

50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ser Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu

85 90 95Asp Ser Thr Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu

100 105 110Trp Ala Ile Ser Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly

115 120 125Pro Thr Gly Ser Thr Ala Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser

130 135 140Ser Gly Ile Val Val Ala Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly145 150 155 160Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala

165 170 175Val Gly Ala Val Asn Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Ala

180 185 190Gly Ser Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr

195 200 205Leu Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr

210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr225 230 235 240Trp Thr Asn Ala Gln Val Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr

245 250 255Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala

260 265 270Ala Ala Gln

275(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：274氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala

35 40 45Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly

50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn

85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp

100 105 110Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala

115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg

130 135 140Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Asn Ser Gly Ser145 150 155 160Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val

165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly

180 185 190Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr

195 200 205Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro

210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu

245 250 255Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala

260 265 270Ala Gln(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：269氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1140碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540ATTGCTGCTT TAAACAATTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGTTCGGTCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1140碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATCCC 960AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT 30(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T 31(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33碱基对

(B)类型：核酸

(C)股性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT 33

Claims

1.一种羰基水解酶变异体，其特征在于，它具有衍生自前体羰基水解酶的、在自然界没有发现的氨基酸序列，它在该前体羰基水解酶中相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中+76位上的多种氨基酸残基被不同氨基酸所取代，并结合一个或多个相当下列位置的氨基酸残基的取代：解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的+99，+101，+103，+104，+107，+123，+27，+105，+109，+126，+128，+135，+156，+166，+195，+197，+204，+206，+210，+216，+217，+218，+222，+260，+265和/或+274。

2.如权利要求1所述的变异体，其特征在于，该前体羰基水解酶是枯草杆菌蛋白酶。

3.如权利要求2所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，取代组合是在相当于下列的位置上进行：76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/101/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123，76/99/101/103/104/123，76/103/104/126，76/103/104/135，76/103/104/197，76/103/104/222，76/103/104/260，76/103/104/265，76/103/104/126/265，27/76/104/123/274，27/76/104/109/123/274，27/76/104/123/218/274，27/76/104/123，27/76/104/107/123，27/76/104/109/123，27/76/104/109/123/218/274，27/76/104/123/197，27/76/104/123/204，27/76/104/123/206，27/76/104/123/216，27/76/104/123/218，27/76/104/123/260，27/76/104/123/195/197，27/76/104/123/195/218，27/76/104/123/197/218，27/76/104/123/204/218，27/76/104/123/206/218，27/76/104/123/218/260，27/76/104/123/195/197/218，76/103/104/217，76/103/104/156，76/103/104/166，76/103/104/105，76/101/103/104，76/103/104/128，76/103/104/210，76/103/104/107，76/103/104/204，76/217，76/103/104/156/166和76/103/104/128.

4.如权利要求3所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，取代组合是在相当于下列的位置上进行：76/99，76/101，76/103，76/104，76/107，76/123，76/99/101，76/99/103，76/99/104，76/101/103，76/101/104，76/103/104，76/104/107，76/104/123，76/107/123，76/99/101/103，76/99/101/104，76/99/103/104，76/101/103/104，76/103/104/123，76/104/107/123，76/99/101/103/104，76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265和/或76/103/104/222。

5.如权利要求4所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，取代组合是在相当于下列的位置上进行：76/99，76/104，76/99/104，76/103/104，76/104/107，76/101/103/104，76/99/103/104和76/101/104。

6.如权利要求4所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，枯草杆菌蛋白酶变异体含有：N76D/S99D；N76D/S101R；N76D/S103A；N76D/V104I；N76D/I107V；N76D/N123S；N76D/S99D/S101R；N76D/S99D/S103A；N76D/S99D/V104I；N76D/S101R/S103A；N76D/S101R/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V；N76D/V104Y/I107V；N76D/V104I/N123S；N76D/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A；N76D/S99D/S101R/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I；N76D/S101R/S103A/V104I；N76D/S103A/V104I/N123S；N76D/V104I/I107V/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I；N76D/S99D/S103A/V104I/N123S；N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S；N76D/S103A/V104I/S128G；N76D/S103A/V104I/T260P；N76D/S103A/V104I/S265N；N76D/S103A/V104I/D197E；N76D/S103A/V104I/S105A；N76D/S103A/V104I/L135I；N76D/S103A/V104I/L126F；N76D/S103A/V104T/L107T；N76D/S103A/V104I/P210I；N76D/S103A/V104I/L126F/S265N和N76D/S103A/V104I/M222A。

7.如权利要求5所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，枯草杆菌蛋白酶变异体含有：N76D/S99，N76D/V104I，N76D/S99D/V104I，N76D/S103A/V104I，N76D/V104I/107V，N76D/V104Y/I107V，N76D/S101R/S103A/V104I，N76D/S99D/S101R/S103A/V104I和N76D/S101R/V104I。

8.如权利要求2所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，它衍生自杆菌属枯草杆菌蛋白酶。

9.如权利要求8所述的枯草杆菌蛋白酶变异体，其特征在于，它衍生自透镜状芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶。

10.编码权利要求1所述的羰基水解酶的DNA。

11.编码权利要求10所述的DNA的表达载体。

12.用权利要求11的表达载体转化的宿主细胞。