CN1530443A - 枯草杆菌酶变异体和组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了通过诱变一系列枯草杆菌酶(subtilase)的基因并在合适的宿主中表达经诱变的基因而产生的酶。与其野生型母体酶相比，这些酶表现出增强的蛋白自身酶解(autoproteolytic)稳定性。

Description

枯草杆菌酶变异体和组合物
技术领域
本发明涉及新的突变体蛋白酶或酶变异体，它们可用于：配制去污剂组合物和表现增强的蛋白自身酶解稳定性；涉及含该酶的清洁用组合物和去污剂组合物；涉及当插入到合适的宿主细胞或生物体中时编码该酶表达的突变的基因；以及涉及这些经转化并能够表达该酶变异体的宿主细胞。
发明背景
在去污剂工业中，酶在洗涤制剂中已应用了30多年。在这些制剂中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶以及其它的酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。
尽管蛋白酶已在去污剂工业中应用了30多年，但是有关这些酶如何与底物和/或与存在于如去污剂组合物中的其它底物相作用的细节还有许多未知的东西。一些涉及蛋白酶特殊残基的因素和影响蛋白酶的特定性质如通常的氧化和热稳定性的因素已被阐明，但仍有许多有待发现。而且，还不能确切知道在一种特定去污剂组合物中究竟是何种物理或化学特性与好的洗涤效果或蛋白酶的稳定性有关。
目前使用的蛋白酶大部分是从自然界中分离蛋白酶并在去污剂制剂中进行试验发现的。
目前至少下列蛋白酶是已知可商业化得到的，其中许多是在世界上许多国家大量销售的。
枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)BPN′或NOVO(可购自如SIGMA公司，美国圣.路易斯)，以及枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，ALCALASE_(NOVO NORDISK A/S)和MAXATASE_(Genencor)。
一种迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶309，由NOVO NORDISK A/S作为SAVINASE_销售。该酶的一种蛋白质工程变异体作为DURAZYM_销售。
与SAVINASE_极为相似的酶，如枯草杆菌蛋白酶PB92，由Genencor公司销售的MAXACAL_(这种酶的一种蛋白质工程变异体作为MAXAPEM_销售)，由SOLVAY et Cie公司销售的OPTICLEAN_，和GENENCOR国际公司销售的PURAFECT_。
一种迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶147，由NOVO NORDISK A/S作为ESPERASE_销售。
越来越多的商业化应用的蛋白酶是天然产生的野生型蛋白酶的蛋白质工程变异体，如DURAZYM_(NOVO NORDISK A/S)，RELASE_(NOVO NORDISK A/S)，MAXAPEM_(Gist-Brocades N.V.公司)，PURAFECT_(GENENCOR国际公司)。
所以，本发明的一个目的是提供改良的蛋白质工程蛋白酶变异体，特别是适用在去污剂工业中。
蛋白酶
断裂蛋白质底物中的酰胺键的酶被归类为蛋白酶，或(可互换地)肽酶(参考Walsh，1979，酶反应机制(Enzymatic Reaction Mechanisms)，W.H.Freeman和Company，San Francisco，第三章)。芽孢杆菌种的细菌分泌两种胞外型蛋白酶，即中性蛋白酶(或金属蛋白酶)和碱性蛋白酶，其中功能上最重要的是丝氨酸内肽酶并通常称为枯草杆菌蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是一种催化肽键水解的酶，并且其中在活性位置中有一个必需丝氨酸残基(White，Handler和Smith，1973生物化学原理(Principles of Biochemistry)第五版，McGraw-Hill出版公司，纽约，第271-272页)。
细菌的丝氨酸蛋白酶具有20000到45000道尔顿范围的分子量。它们被二异丙基氟磷酸抑制。它们水解简单的末端酯类，在活力上与真核胰凝乳蛋白酶类似(它也是一种丝氨酸蛋白酶)。一个较窄的术语，碱性蛋白酶，包括一个亚组，反应这些丝氨酸蛋白酶的最适pH较高，从pH9.0到11.0(参考Priest(1977)，细菌学综述(Bacteriological Rev.)41.711-753)。
枯草杆菌酶
被尝试地定名为枯草杆菌酶的丝氨酸蛋白酶的一个亚组已由Siezen等在“蛋白质工程”(Protein Engng.)4(1991)719-737)中提出。它们是根据以前称为类枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的40多个氨基酸序列同源性分析而定义的。由革兰氏阳性细菌或真菌产生的枯草杆菌蛋白酶以前被定义为丝氨酸蛋白酶，如今根据Siezen等的定义为枯草杆菌酶的一个亚组。大量的枯草杆菌蛋白酶已被鉴定，而且许多枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列已被测定。它们包括由芽孢杆菌菌种产生的多于六种的枯草杆菌蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶168，枯草杆菌蛋白酶BPN′，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶Y，枯草杆菌蛋白酶Amylosaccharitiaus，以及mesentericopeptidase(Kurihara等(1972)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，247 5629-5631；Wells等，(1983)核酸研究(Nacleic Acids Res.11 7911-7925)；Stahl和Ferrari(1984)细菌学杂志(J.Bacteriol.)159 811-819；Jacobs等(1985)核酸研究，13 8913-8926；Nedkov等(1985)生物化学(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 366 421-430；Svendsen等(1986)FEBS Lett.196，228-232)，一种来自放线菌目的枯草杆菌蛋白酶，来自普通高温放线菌(Thermoactinomyces vuigaris)的thermitase(Meloun等(1985)FEBS Lett.198 195-200)，和一种真菌枯草杆菌蛋白酶，来自Tritirachium album的蛋白酶K(Jany和Mayer(1985)生物化学，366 584-492)。为作进一步参考，下面复制了Siezen等中的表I。
已经从物理上和化学上详细表征了枯草杆菌蛋白酶的特征。除了这些酶的一级结构(氨基酸序列)的知识以外，还测定了枯草杆菌蛋白酶的50多种高分辩率X-射线结构，其描述了底物的结合、过渡状态、产物，至少三种这些不同的蛋白酶抑制剂，以及说明了对天然变异体的结构推断(Kraut(1977)生物化学年度综述(Ann.Rev.Biochem.)46 331-358)。
枯草杆菌酶(subtilase)的一个亚组，I-S1，包括“经典的”枯草杆菌蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶168，枯草杆菌蛋白酶BPN’，枯草杆菌蛋白酶Carisberg(ALCALASE_，NOVO NORDISK A/S)以及枯草杆菌蛋白酶DY。
另一个枯草杆菌酶的亚组，I-S2，是由Siezen等(出处同前)发现的。亚组I-S2蛋白酶被描述为高度碱性的枯草杆菌蛋白酶，包括如枯草杆菌蛋白酶PB92(MAXACAL_，Gist-Brocades NV)，枯草杆菌蛋白酶309(SAVINASE_，NOVO NORDISK A/S)，枯草杆菌蛋白酶147(ESPERASE_，NOVO NORDISK A/S)，以及碱性弹性蛋白酶YaB。
枯草杆菌酶基因的随机和定点突变都来自于对该酶的物理和化学性质的了解，并归因于涉及枯草杆菌酶的催化活力、底物特异性、三级结构等信息(Wells等，(1987)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)84；1219-1223；Wells等(1986)Phil.Trans.R.Soc.Lond.A.317，415-423；Hwang和Warshel(1987)生物化学(Biochem.)26 2669-2637；Rao等(1987)自然(Nature)328 551-554)。
覆盖这一领域的较新的出版物是Carter等，(1989)蛋白质(Proteins)6，240-248，涉及切割底物中特定靶序列的变异体的设计(位点24和64)；Graycar等(1992)纽约科学院年报(Annals of the New YorkAcademy of Sciences)672，71-79，讨论了一系列以前发表的结果；以及Takagi(1993)国际生化杂志(Int.J.Biochem.)，25，307-312中也评述了以前的结果。
枯草杆菌蛋白酶基因的定点突变已引起很大的关注，以下专利申请和专利中描述了各种突变：
以前表征的蛋白酶变异体
许多资料描述了蛋白酶变异体的构建。为了对以前本领域的总体状况较容易地加以综观，将参考资料分为两部分。
第一部分文献描述目前被认为与本发明中公开的变异体无关的技术背景和蛋白酶变异体的鉴定。这些资料的引入主要是为了概述在为不同目的构建蛋白酶变异体这一领域内本领域的状况。
第二部分文献描述被认为与本发明的变异体有某种相关性的蛋白酶变异体的鉴定。
概述本领域的参考文献(第一部分)：
EP130756(GENENTECH)(相应于美国Reissue专利34，606(GENENCOR)涉及定点或随机产生的“羰基水解酶”突变及随后筛选具有不同性质的突变的酶，如Kcat/km比值、pH-活力范围和氧化稳定性。这些公开文本要求了枯草杆菌蛋白酶BPN’在特定位点的定点突变，即-1Tyr，32Asp，155Asn，104Tyr，222Met，166Gly，64His，169Gly，189Phe，33Ser，221Ser，217Tyr，156Glu或152Ala，以提供性质改变了的酶。因为除了位点-1以外，所有这些位点在该申请提交以前已知参与酶的功能，该申请无助于解决确定在何处引入突变以获得特定所需性质的酶这一问题。
EP 214435(HENKEL)涉及枯草杆菌蛋白酶Carlsberg及其两个突变体的克隆和表达。在该申请中未提供158Asp到158 Ser和161Ser到161Asp的突变的原因。
在WO 87/04461(AMGEN)中，设想减少在母体酶中的Asn-Gly序列的数目以获得表现出增强的pH和热稳定性的突变的酶，该申请的重点放在去除、诱变或改造枯草杆菌蛋白酶BPN’中的109Asn和218Asn残基。没有举出任何缺失或改造Gly-残基的实施例。
WO87/05050(GENEX)公开了许多枯草杆菌蛋白酶BPN’突变体的随机突变和随后筛选大量的改善性质的枯草杆菌蛋白酶BPN′突变体。在该申请中描述了在位点218Asn，131Gly，254Thr，166Gly，116Ala，188Ser，126Leu，和53Ser进行的突变。
EP 260105(GENENCOR)描述了对含有一个催化三体(Triad)的酶的某些性质的改造，即通过从催化三体中选择一个约15_之内的氨基酸残基并用另一个残基取代被选定的氨基酸残基。本发明书中描述的枯草杆菌酶型的酶特定地指属于含催化三体的一类酶。在枯草杆菌蛋白酶中位点222和217是替换的优选位点。
而且，Thomas、Russell和Fersht(1985)在自然318，375-376中指出在枯草杆菌蛋白酶BPN’中将99Asp换成99Ser改变了该酶的pH依赖性。
在后一篇文章(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193，803-813中，相同的作者还讨论了用156Ser替换156Glu。
所有这些突变都在距活性64His约15_的距离内。
在自然328，496-500(1987)中，Russel和Fersht讨论了他们实验的结果并提出了通过诱变酶以获得表面电荷的改变从而改变pH-活性范围的规则。
WO 88/08028(GENEX)和WO 88/08033(AMGEN)都涉及在枯草杆菌蛋白酶BPN’的钙结合位点上的氨基酸残基的改造。据说通过用更多带负电荷的残基替代原来的残基稳定了该酶。
WO95/27049(SOLVAY S.A)描述了具有下列突变的一个枯草杆菌蛋白酶309型的蛋白酶：N43R+N116R+N117R(BPN’编号)。数据显示，与野生型相比，相应的变异体具有更高的稳定性。
WO95/30011、WO95/30010和WO95/29979(PROCTER&GAMBLE公司)描述了在枯草杆菌蛋白酶BPN’和枯草杆菌蛋白酶309中的6个区域，特别是位点199-220(BPN’编号)，其经设计改变(即减小)酶对表面结合土的吸附。这提示减小酶对底物的吸附导致更佳的去污剂清洁效果。没有提供任何变异体或特定去污剂洗涤效果的数据。
与本发明具有某些相关性的以前表征的蛋白酶(第二部分)
在EP251 446(GENENCOR)中描述了如何应用在初级和三级结构上的同源分析以确定等效的氨基酸残基的保留与否。其要求保护这种信息以及发明者对枯草杆菌蛋白酶BPN’的三级结构的了解，这使得发明者选择许多突变敏感位点以期获得性质改变的突变体。这些位点确定为：
124Met，222Met，104Tyr，152Ala，156Glu，166Gly，169Gly，189Phe，217Tyr.Also 155Asn，21Tyr，22Thr，24Ser，32Asp，33Ser，36Asp，46Gly，48Ala，49Ser，50Met，77Asn，87Ser，94Lys，95Val，96Leu，107Ile，110Gly，170Lys，171Tyr，172Pro，197Asp，199Met，204Ser，213Lys，221ser，这些位点是根据期望影响该酶的不同性质而确定的。而且，列出了许多突变以支持这些建议。除了在这些位点的单突变外，发明者还进行了大量多重突变。发明者进一步确定了215Gly、67His、126Leu、135Leu和感兴趣的片段97-103、126-129，213-215和152-172内的氨基酸残基，但是任何一个这些位点的突变都没有举例。
对本发明的意图感兴趣的是，EP251 446的发明者建议替换170Lys(在枯草杆菌蛋白酶BPN’，类型I-S1中)，特别是他们建议在原来的Lys处引入Glu或Arg。产生了Glu变异体而且发现它对自身酶解性的降解高度敏感(参考第48,121,123页(表XXI包含一个明显的错误，但是说明自身酶解半寿期从86减小到13分钟)和图32)。
在WO 89/06279(NOVO NORDISK A/S)中指出，位点170是感兴趣的位点并建议用Tyr替代现有的残基。然而，没有给出关于这样的变异体的数据。在WO 91/00345(NOVO NORDISK A/S)中做了同样的建议，并指出枯草杆菌蛋白酶309(类型I-S2)中位点170的Tyr变异体表现出在大约pH8时提高了去污剂的洗涤效果(变异体S003，在表III、IV、V、VI、VIII、X中)。相同的替换并结合其它位点的替换也显示出提高了与所述申请一般概念相符的洗涤效果(s004，s011-s014，s022-s024，s019，s020，s203，s225，s227在相同的表和表VII中)。
在EP 525 610 A1(SOLVAY)中建议通过减小在其上特定表面区域的亲水性来提高酶对离子张力的稳定性(一种与枯草杆菌蛋白酶PB92密切相关的I-S2型枯草杆菌酶)。建议在位点164(170，如果以BPN’编号)以Gln替换Arg。该申请中没有公开含有这种替换的变异体。
在WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)中描述了I-S2型枯草杆菌蛋白酶PB92位点164(170，如果以BPN’编号)的许多变异体。给出的实施例说明了以Met、Val、Tyr和Ile替换原始的Arg。变异体的粉状去污剂中的洗净效果试验显示略有改善。特别是Ile变异体对可可子的洗涤效果试验显示提高了约20-30％。没有提供稳定性数据。
在PCT/DK96/00207(未公开)中描述了许多提高了洗涤效果和/或贮存稳定性的蛋白酶变异体。
发现通过将一个比原残基更疏水的氨基酸残基替换一个或多个母体枯草杆菌酶中或疏水结构域附近的氨基酸残基，可以获得洗涤效果提高的枯草杆菌酶变异体，所说的疏水结构域包括相应于BLS309(BASBPN编号)的残基I165、Y167、Y171的残基，所说的在其附近的残基包括相应于BLS309(BASBPN编号)的残基E136，G159，S16，R170，A19和G195的残基(PCT/DK96/00207)。
US5.543.302描述了在不同野生型蛋白酶中重要的蛋白自身酶解切割位点的鉴定(MILEZYME_，SAVlNASE_和ESPERASE_)。
本发明重点在特定的蛋白酶变异体，此变异体影响在我们的未决专利申请PCT/DK96/00207中描述的一组蛋白酶变异体的蛋白自身酶解切割位点的位置。与US5.543.302中描述的相应野生型蛋白酶的蛋白自身酶解降解模式相比，令人惊奇地发现本发明的变异体表现出不同的蛋白自身酶解降解模式。
发明概述
令人惊异地发现在位于相应于BLS309(BASBPN编号)残基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171的位点上的一个或多个氨基酸残基进行改造的枯草杆菌酶变异体与相应的野生型相比，具有改变了的蛋白自身酶解降解模式。基本的改变是明显位于残基132-133(BASBPN编号)之间的自身酶解切割位点。
SAVINASE_已知具有广泛的底物特异性并且在充分温育后在多个位点进行自我切割。然而开始的1-5切割位点(初级位点)与枯草杆菌蛋白酶的工业化应用高度相关。
所说的位于残基132-133的自身酶解切割位点现在据信是一个新的初级蛋白自身酶解切割位点。现在相信这个蛋白自身酶解切割位点是被第一次确定为枯草杆菌蛋白酶中的初级蛋白自身酶解切割位点。作为进一步详细参考此处给出了一个有效实施例(参见下文)。
因而在第一个方面，本发明涉及一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在残基132和133(BASBPN编号)之间具有蛋白自身酶解切割位点的前体枯草杆菌酶，其还通过在位于相应于BLS309(BASBPN编号)残基129、130、131、132、133、134、135、136位点上替换、插入或缺失一个或多个残基加以改造；籍此所说的变异体与该前体枯草杆菌酶相比表现出增强的蛋白自身酶解稳定性。
在另一方面，本发明涉及一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在相应于BLS309(BASBPN编号)的残基G159、S164、I165、Y167、R170、Y171位点上具有1个或多个氨基酸残基的改变的前体枯草杆菌酶变异体，其还通过在相应于残基129、130、131、132、133、134、135、136(BASBPN编号)的位点中替换、插入或缺失一个或多个残基加以改造；籍此所说的变异体与在任何所说的位点129-136上都没有改变的前体枯草杆菌酶变异体相比表现出增强的蛋白自身酶解稳定性。
US 5.543.302指出SAVINASE_在位于残基192-193(BASBPN编号)之间有一个蛋白自身酶解切割位点，并且建议在围绕该位点的广泛区域(残基180-210之间)进行改造以获得蛋白自身酶解稳定性增强的变异体。
本发明已经证实了在SAVINASE_和SAVINASE_变异体中残基192-193(BASBPN编号)之间的这个蛋白自身酶解位点，变异体具有在位于相应于BLS309(BASBPN编号)的残基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171上的一个或多个氨基酸的改变。本发明者建议特定的改造(突变)，是在残基192-193(BASBPN编号)之间蛋白自身酶解位点的附近，如S190P和G193A(BASBPN编号)。
这些特定的突变在US5.543.302中没有被讨论或指出过，其中只是描述了一个较广泛的区域(位于残基180-210之间)而且在US5.543.302中也没有公开导致增加蛋白自身酶解稳定性的特定突变。
作为进一步详细参考，此处给出了有效实施例(参见下文)。
因此，在第三个方面中本发明涉及一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在残基192和193之间(BASBPN编号)具有蛋白自身酶解切割位点的前体枯草杆菌酶，其还通过在位于相应于残基189、190、191、192、193、194、195和196(BASBPN编号)的位点上替换、插入或缺失一个或多个残基加以改造；籍此该变异体与前体枯草杆菌酶相比具有增强的蛋白自身酶解稳定性。
在第四个方面中本发明涉及一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在位于相应于BLS309(BASBPN编号)的残基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171上具有一个或多个氨基酸的改变的前体枯草杆菌酶变异体，其还通过在位于相应于BLS309(BASBPN编号)的189、190、191、192、193、194、195、196的位点上替换、插入或缺失一个或多个残基加以改造；籍此所说的变异体与在任何位点189-196上都没有改变的前体枯草杆菌酶变异体相比表现出增强的蛋白自身酶解稳定性。
在另一个方面中，本发明涉及能够表达本发明的酶的DNA构建体，当它以合适的方式插入到宿主细胞中随后表达第一个方面中的枯草杆菌蛋白酶。
在另一个方面中，本发明涉及本发明的枯草杆菌蛋白酶的生产，其通过根据第二方面将DNA构建体插入合适的宿主，培养宿主以表达所需的枯草杆菌酶并回收酶产物。
本发明部分涉及，但并不限于，表达I-S2亚组酶的突变基因和上述相应的酶变异体。
本发明包括的其它枯草杆菌酶基因变异体，诸如枯草杆菌酶I-S1亚组的酶，如枯草杆菌蛋白酶BPN′和枯草杆菌蛋白酶carlsberg基因，以及由其产生的变异体枯草杆菌蛋白酶BPN′、蛋白酶K和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，它们在浓缩的液体去污剂中表现出增强的稳定性。
本发明还包括枯草杆菌酶基因变异体如蛋白酶K和其它基因以及由其产生的变异体蛋白酶K和其它枯草杆菌酶，它们在浓缩的液体去污剂中表现出增强的稳定性。
根据本发明可以被改造的母体枯草杆菌酶的其它实例列于表I。
本发明还涉及突变酶在清洁用组合物和含有突变酶的清洁用组合物中的用途，特别是在含有突变的枯草杆菌蛋白酶的去污剂组合物中的用途。
根据本发明，这些去污剂组合物还可以含有一种或多种其它的酶，例如脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶等等。
缩写
氨基酸
A＝Ala＝                 丙氨酸
V＝Val＝                 缬氨酸
L＝Leu＝                 亮氨酸
I＝Ise＝                 异亮氨酸
P＝Pro＝                 脯氨酸
F＝Phe＝                 苯丙氨酸
W＝Trp＝                 色氨酸
M＝Met＝                 甲硫氨酸
G＝Gly＝                 甘氨酸
S＝Ser＝                 丝氨酸
T＝Thr＝                 苏氨酸
C＝Cys＝                 半胱氨酸
Y＝Tyr＝                 酪氨酸
N＝Asn＝                 天冬氨酸
Q＝Gln＝                 谷氨酰胺
D＝Asp＝                 天冬酰胺
E＝Glu＝                 谷氨酸
K＝Lys＝                 赖氨酸
R＝Arg＝              精氨酸
H＝His＝              组氨酸
X＝Xaa＝              任何氨基酸
核酸碱基
A＝                   腺嘌呤
G＝                   鸟嘌呤
C＝                   胞嘧啶
T＝                   胸腺嘧啶(仅在DNA中)
U＝                   尿嘧啶(仅在RNA中)
变异体
在描述根据本发明产生的或构思的不同酶变异体时，下列术语经修改以便于参考：
最初的氨基酸          位点          替代的氨基酸
据此，在位点195上的甘氨酸被谷氨酸替换命名为
            Gly195Glu或G195E
在同一位点缺失甘氨酸为：
            Gly195*或G195*
插入一个额外的氨基酸残基如赖氨酸则为：
            Gly195Glylys或G195GK
如果与用作编号的序列相比指出某一缺失，在该位点的插入记为
            *36Asp或*36D
表示在位点36上插入了一个天冬氨酸。
多重突变以加号相隔，即：
           Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E
表示在位点170和195分别由酪氨酸和谷氨酸替换精氨酸和甘氨酸的突变。
位点
在描述本申请中和所附权利要求书中的变异体时，排列了Siezen等(出处同前)中的多种枯草杆菌酶。在其它涉及枯草杆菌酶的申请中使用了特定酶的其它排列和编号。对本领域熟练技术人员来说在此处所用的编号中建立一个特定残基位点是常规操作。参照图1说明来自大量枯草杆菌酶的本发明相关的残基的排列。参照表I和WO91/00345显示了来自许多枯草杆菌酶的本发明相关的残基的排列。
表I
已建立的枯草杆菌(自Siezen等，出处同前)
生物                 cDNA       酶                           字首缩写基因
原核生物
细菌：革兰氏阳性
枯草芽孢杆菌168      aprA       枯草杆菌蛋白酶I168，apr      ABSS168
解淀粉芽孢杆菌       apr        枯草杆菌蛋白酶BPN’(NOVO)    BASBPN
枯草芽孢杆菌DY       -          枯草杆菌蛋白酶DY             BSSDY
地衣芽孢杆菌         +          枯草杆菌蛋白酶Carlsberg      BLSCAR
迟缓芽孢杆菌         +          枯草杆菌蛋白酶147            BLS147
嗜碱芽孢杆菌PB92     +          枯草杆菌蛋白酶PB92           BAPB92
DSM4828芽孢杆菌      -          碱性蛋白酶                   BDSM48
YaB芽孢杆菌          ale        碱性弹性蛋白酶YaB            BYSYAB
枯草芽孢杆菌168      epr        最小胞外蛋白质               BSEPR
枯草芽孢杆菌杆       Bpf        枯草杆菌肽酶F                BSBPF
枯草芽孢杆菌         ispl       胞内丝氨酸蛋白酶I            BSISP1
IF03013
枯草芽孢杆菌A50      -          胞内丝氨酸蛋白酶             BSIA50
苏云金芽孢杆菌       -          胞外丝氨酸蛋白酶             BTFINI
蜡状芽孢杆菌         -          胞外丝氨酸蛋白酶             BCESPR
达松维尔拟诺卡氏菌   -          碱性丝氨酸蛋白酶             NDAPII
普通高温放线菌       -        Thermitase              TVTHER
粪肠球菌             cylA     细胞溶素组分A           EFCYLA
表皮葡萄球菌         epiP     Epiderminlead蛋白酶     SEEPIP
化脓链球菌           scpA     C5A肽酶                 SPSCPA
乳酸乳杆菌SK11       prtP     SK11细胞壁蛋白酶        LLSK11
细菌：革兰氏阴性
Dichelobacter        +        基本蛋白酶              DNEBPR
nodosus
甘兰黑腐病菌         +        胞外蛋白酶              XCEXPR
粘质沙雷氏菌         +        胞外丝氨酸蛋白酶        SMEXSP
水生栖热菌YT-1       pstI     Aqualysin I             TAAQUA
栖热菌rT41A          +        T41A蛋白酶              TRT41A
溶藻性弧菌A          proA     蛋白酶A                 VAPROA
鲁特介斯链霉菌       -        蛋白酶D                 SRESPD
古细菌(Archaea)
嗜盐菌172P1          -        halophil胞外蛋白酶      ARB172
蓝细菌
(Cynobacteria)
可变项圈藻           prcA     钙依赖性蛋白酶          AVPRCA
低等真核生物
真菌
Tritirachium album   +        蛋白酶K                 TAPROK
limber
Tritirachium album   +        蛋白酶R                 TAPROR
Tritirachium album   proT     蛋白酶T                 TAPROT
米曲霉                +       碱性蛋白酶          AOALPR
Malbranchea           -       真核胞外酶          MPTHMY
pulchella
金色支顶孢            alp     碱性蛋白酶          ACALPR
酵母
乳酸克鲁维酵母        kex1    kex1丝氨酸蛋白酶    KLKEX1
酿酒酵母              kex2    kex2丝氨酸蛋白酶    SCKEX2
酿酒酵母              Prb1    蛋白酶B             SCPRB1
Yarrowia lipolytica   Xpr2    碱性胞外蛋白酶      LXPR2
高等真核生物
蠕虫
Caenorhabditis         Bli4   表皮蛋白酶          CEBLI4
elegans
昆虫
果蝇                   Fur1   furin1              DMFUR1
果蝇                   Fur2   furin2              DMFUR2
植物
黄瓜                   -      黄瓜素              CMCUCU
哺乳动物
人(及大鼠，小鼠)       Fur    furin               HSFUKI
人(及小鼠)             +      insulinoma PC2蛋白酶HSIPC2
鼠                     +      垂体  PC3蛋白酶     MMPPC3
人                     +      三肽酰肽酶II        HSTPP
表I中采用的参考文献
   氨基酸序列的参考资料(GenBan_/EMBL数据库登记号示于括号中)：
ARB172 Kamekura和Seno，(1990)生物化学与细胞生物学(Biochem.Cell Biol.)68，352-359(成熟蛋白酶残基1-35的氨基酸序列；残基I4没有确定)。
BSS168 Stahl.和Ferrari.(1984)细菌学杂志(J.Bacteriol.)。158，411-418(K01988)。Yoshimoto，Oyama等(I488)生物化学杂志(J.Biochem.)，103，1060-1065(来自B.amylosacchariticus的区别在于具有T130S和T162S的成熟枯草杆菌蛋白酶)。Svendsen等，(1986)FEBS Lett.196，228-232(PIR A23624；氨基酸测序；区别在于具有S85A，A88S，S89A，S183A和N259S的来自肠膜芽孢杆菌的成熟的碱性mesentericopeptidase)。
BASBPN Wells等(1983)核酸研究，11，7911-792(X00165)。Wasantha等，(1984)细菌学杂志，159，811-814(K02496)。
BSSDY Nedkov等(1983)Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.3641537-1540(PIR A00969；氨基酸测序)。
BLSCAR Jacobs等(1985)核酸研究，13 8913-8926(X03341)。Smith等(1968)生物化学杂志，243，2184-2191(PIR A00968；氨基酸测序；区别在于具有T103S，P129A，S158N，N161S和S212N的成熟蛋白酶序列)。
BLS147 Hastrup等(1989)PCT专利申请WO 8906279。公开日1989年7月13日。(来自迟缓芽孢杆菌的Esperase_)。Takami等(1990)应用微生物生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，33，519-523(来自芽孢杆菌AH-101的成熟的碱性蛋白酶残基1-20的氨基酸序列，该序列与BLS147的区别在于具有N11S)。
BABP92 van der Laan等(1991)应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)57，901-909.(Maxacal_)。Hastrup等(1989)PCT专利申请WO 8906279。公开日1989年7月13日。(枯草杆菌蛋白酶309。Savinase_来自迟缓芽孢杆菌，区别仅在于具有N87S)。Godette等(1991)第5次蛋白质学会讨论会摘要，6月，巴尔的摩：摘要M8(来自迟缓芽孢杆菌的高碱性蛋白酶区别在于具有N87S，S99D，S101R，S103A，V104I和G159S)。
BDSM48 Rettenmaier等(1990)PCT专利申请WO 90/04022，公开日1990年4月19。
BYSYAB Kaneko等(1989)细菌学杂志，171，5232-5236(M28537)。
BSEPR Sloma等(1998)细菌学杂志，170，5557-5563(M22407)。
Bruckner(1990)普通分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)221，486-490(X53307)。
BSBPF Sloma等(1990)细菌学杂志，172，1470-1477(M29035；修订)。Wu等(1990)生物化学杂志，265，6845-6850(J05400；此序列区别在于具有A169V和由于移码造成的586个短C-末端残基)。
BSISP1 Koide等(1986)，细菌学杂志，167，110-116(M13760)。
BSIA50 Strongin等，(1978)细菌学杂志，133，1401-1411(成熟蛋白酶残基1-54的氨基酸测序；残基3、39、40、45、46、49和50没有确定)。
BTFINI Chestuknina等(1985)，Biokhimiya 50，1724-1730(来自苏云金芽孢杆菌以色列变种的成熟蛋白酶残基1-14的，和幕虫变种的残基1-16和223-243氨基酸测序)。Kunitate等(1989)农业生物化学(Agric.Biol.Chem.)53，3251-3256(来自库斯塔克变种的成熟蛋白酶残基6-20的氨基酸测序。BTKURS)。
BCESPR Chestukhina等(1985)，Biokhimiya 50，1724-1730(成熟残基1-26和223-243的氨基酸测序)。
NDAPII Tsujibo等(1990)农业生物化学，54，2177-2179(成熟残基1-26的氨基酸测序)。
TVTHER Meloun等(1985)FEBS Lett.183，195-200(PIR A00973；成熟蛋白酶残基1-274的氨基酸测序)。
EFCYLA Segarra等(1991)感染免疫(Infect.Immun.)59，1239-1246。
SEEPIP Schnell等(1991)个人通讯(Sienen等，出处同前)。
SPSCPA Chen等(1990)生物化学杂志，265，3161-3167(J05224)。
DNEBPR Kortt等(1991)第5次蛋白质学会讨论会摘要，6月22-26日，巴尔的摩：摘要S76。
LLSK11 Vos等(1989)生物化学杂志，264，13579-13585(J04962)。Kok等(1988)应用环境微生物学，54，231-238(M24767)；来自菌株Wg2的序列区别在44个位点，包括蛋白酶结构域的18处不同，以及残基1617-1676的缺失。Kiwaki等(1989)分子微生物学(Mol. Microbiol.)，3，359-369(X14130；来自菌株NCD0763的序列区别在46个位点，包括蛋白酶结构域的22处不同，以及残基1617-1676的缺失)。
XCEXPR Liu等(1990)普通分子遗传学220，433-440。
SMEXSP Yanagida等(1986)细菌学杂志，166，937-994(M13469)。
TAAQUA Terada等(1990)生物化学，265，6576-6581(J05414)。
TRT41A McHale等(1990)第5次欧洲生物技术会议摘要，
Christiansen，Munck和Villadsen(编)，Munksgaard国际出版公司，哥本哈根。
VAPROA Deane等(1989)基因，76，281-288(M25499)。
SRESPD Lavrenova等(1984)苏联生物化学(Biochemistry USSR.)49，447-454(残基1-23的氨基酸测序；残基13、18和19没有确定)。
AVPRCA Maldener等(1991)普通分子遗传学225，113-120(发表的序列在靠近位点200-210处由于移码阅读错误具有28个未确定的残基)。
TAPROK Gunkel和Gassen(1989)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)179，185-194(X14688/XI4689)。Jany等(1986)生物化学杂志Hoppe-Seyler，367，87(PIRA24541；氨基酸测序；成熟蛋白酶区别在于具有S745G、SILST204-208DSL和VNLL264-267FNL)。
TAPROR Samal等(1990)分子微生物学，4，1789-1792(X56116)。
TAPROR Samal等(1989)基因，85，329-333。
AOALPR Tatsumi等(1989)普通分子遗传学，219，33-38。
Cheevadhanarah等(1991)EMBL数据库(X54726)。
MPTHMY Gaucher和Stevenson(1976)酶学方法，45，415-433(残基1-28的氨基酸测序，和具有活性位点丝氨酸的六肽LSGTSM)。
ACALPR Isogai等(1991)农业生物化学，55，471-477。Stepanov等(1986)国际生物化学杂志，18，369-375(残基1-27的氨基酸测序：成熟蛋白酶区别在于具有H13[1]Q，R13[2]N和S13[6]A)。
KLKEX1 Tanguy-Tougeau，Wesolowski-Liuvel和Fukuhara(1988)FEBS Lett.234，464-470(X07038)。
SCKEX2 Mizuno等(1988)生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)156，246-254(M24201)。
SCPRB1 Moehle等(1987)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)7，4390-4399(M18097)。
YLXYPR2 Davidow等(1987)细菌学杂志，169，4621-4629(M17741)。Matoba等(1988)分子细胞生物学，8，4904-4916(M23353)。
CEBL14 Peter和Rose(1991)蠕虫饲养者公告(The Worm Breeder’s Gazette)11，28。
DMFUR1 Roebroek等(1991)FEBS Lett.289，133-137(X59384)。
DMRUR2 Roebroek等(1992)267，17208-17215。
CMCUCU Kaneda等(1984)生化杂志，95，825-829(具有活性丝氨酸的八肽NIISGTSM的氨基酸测序)。
HSFURI van den Ouweland等(1990)核酸研究18，664(X04329)(鼠Furin的序列区别在51个位点，包括催化结构域的5个：A15E，Y21F，S223F，A232V和N258[2]D)。Misumi等(1990)核酸研究18，6719(X55660：大鼠furin的序列区别在49个位点，包括催化结构域的3个：A15E，Y21F，H24R)。
HSIPC2 Smeekens和Steiher(1990)生物化学杂志265，2997-3000(J05252)。Seidah等(1990)DNA细胞生物学(DNA Cell Boil.)9，415-424(鼠pituitary PC2蛋白酶区别在23个位点，包括蛋白酶结构域的7个：I4F，S42[2]Y，E45D，N76S，D133E，V134L和G239[1]D)。
MMPPC3 Smeekens等(1991)美国国家科学院院报88，340-344(M58507)。Seidah等(1990)DNA细胞生物学，9，415-424(M55668/M55669；部分序列)。
HSTPP Tomkinson和Jonsson(1991)生物化学(Biochemisty)，30，168-174(J05299)。
附图简述
图1表示表I中提到的许多枯草杆菌蛋白酶的序列比较
定义
在进一步详细讨论本发明之前，首先定义下列术语：
“改变的自身酶解稳定性”术语“改变的自身酶解稳定性”或“改变自身酶解稳定性”意在指与原始蛋白酶相比增强或减小的自身酶解稳定性。
“改变的蛋白自身酶解降解位点”术语“改变的蛋白自身酶解降解位点”意在指那些原始蛋白酶上改变了的蛋白自身酶解降解位点。此改变可能是完全的新位点的形成或是在原始蛋白酶中一个位点的去除。术语“改变的蛋白自身酶解降解位点”还意在指一个在原始蛋白酶中不是如初级或次级切割位点的蛋白自身酶解位点经改变降解模式后变成了如初级或次级蛋白自身酶解位点。
“蛋白自身酶解切割位点”术语“蛋白自身酶解切割位点”用于指出蛋白酶的一个位点，据信蛋白酶的蛋白自身酶解发生在该处。该位点可以被定义为如位于氨基酸残基X和Y之间。
通过下面步骤可鉴定切割位点：制备蛋白酶水溶液；迅速失活蛋白酶以防止由自身酶解产生的肽段的进一步降解；在防止蛋白酶复活的条件下分离肽段；以及鉴定所分离片段的N-端氨基酸。更详细的说明参见此处的有效实施例(参见下文)。
术语“蛋白自身酶解切割位点”可替代地称为“蛋白自身酶解断裂位点”。
“初级蛋白自身酶解切割位点”术语“初级蛋白自身酶解切割位点”意指蛋白酶切割自身的第一个1-5个初始切割位点。
“枯草杆菌酶变异体的改造”术语“改造”与此处讨论的枯草杆菌酶的改造联用，它被定义为包括化学改造以及遗传操作以减小自身酶解性降解的速率。改造可以通过在感兴趣的氨基酸处进行替换、缺失和/或插入。
当术语“改造”与在自身酶解切割位点附近的替换、缺失和/或插入联用时，它被定义为包括以减小自身酶解性降解的速率的改造。改造可能发生在某些氨基酸附近，它们含有那些氨基酸的敏感性的多肽键。词组“在……附近”在此定义为指在那些形成敏感键的氨基酸的上游或下游三个氨基酸以内的氨基酸。
“随机诱变”术语“随机诱变”用于以传统的方式加以理解，就是说，在母体酶的随机位点上引入一个或多个突变，或在选定的母体酶的位点或区域内引入随机的氨基酸残基。随机诱变通常伴随着筛选，用于选择与母体酶相比性质改善的突变的酶。引入随机突变和筛选改善的性质的合适技术在这里进行详细的讨论。
“洗涤效果”一种酶催化降解存在于待洗涤物质上的不同的天然底物的能力，其中常称为它的洗涤能力、洗涤力、去污性或洗涤效果。在整个本申请中术语洗涤效果用于包含这种性质。
“SAVINASE _”SAVINASE _ 由NOVO NORDISK A/S销售。它是来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶309，与BABP92的区别仅在于含有N98S(见这里的表I)。
“前体枯草杆菌酶”术语前体枯草杆菌酶是根据Siezen等(蛋白质工程4：719-737(1991))定义的枯草杆菌酶。详细情况参考这里描述的名为“枯草杆菌酶”的部分。前体枯草杆菌还可以是从自然资源中分离到的枯草杆菌酶，随后已对其进行改造但保留枯草杆菌酶的特征。“底物”术语“底物”与蛋白酶底物联用，可以根据它的最广泛的形式解释为包括一种化合物，该化合物含有至少一个对枯草杆菌蛋白酶的水解作用敏感的肽键。
“产物”术语“产物”与从蛋白酶反应得到的产物联用，根据本发明的上下文可将其解释为包含涉及枯草杆菌蛋白酶的水解反应的产物。一种产物可以是下一步水解反应的底物。
“枯草杆菌酶变异体”在本发明的上下文中，术语枯草杆菌酶变异体或突变的枯草杆菌酶指由一种生物产生的枯草杆菌酶，该生物表达一种来自母本微生物的突变基因，该母本微生物具有一个产生相应母体酶的原始的或母本基因，母本基因已被突变以产生突变基因，由此当它在合适的宿主中表达时产生所说的突变的枯草杆菌蛋白酶。
发明详述
具有改变的蛋白自身酶解降解模式的枯草杆菌酶变异体：
根据本发明，任何在位于或靠近残基132-133(BASBPN编号)处具有初级蛋白自身酶解位点的前体枯草杆菌酶，通过在位于残基132-133(BASBPN编号)的自身酶解切割位点上或在其附近(残基129-136之间)进行替换改造后，将表现出增强的自身酶解稳定性。
根据本发明，在残基132-133(BASBPN编号)之间有这种初级自身酶解切割位点的前体枯草杆菌酶可以是枯草杆菌酶变异体或野生型枯草杆菌酶。野生型枯草杆菌酶可以是表I中具有上述特定切割位点的那些酶的任何一种。枯草杆菌酶变异体可以是，但并不限于表II中描述的变异体。现在相信除了表II中讨论的那些外，其它枯草杆菌变异体也可以在残基132和133(BASBPN编号)之间具有初级自身酶解切割位点。
根据本发明在一个或多个下面(见表II)提到的氨基酸残基上有改造的枯草杆菌酶变异体导致改变了的蛋白自身酶解降解位点，优选地是一个位于或靠近残基132-133(BASBPN编号)的初级蛋白自身酶解位点。
根据本发明，在表II中所示的任何一个氨基酸残基上具有一个或多个改造的枯草杆菌酶变异体，通过在位于残基132-133(BASBPN编号)的所述自身酶解切割位点上或在其附近进行替换加以改造后表现出增强的自身酶解稳定性。
在表II所示氨基酸残基上具有一个或多个改造的枯草杆菌酶变异体，通过位于残基192-193(BASBPN编号)之间的自身酶解切割位点上或在其附近进行替换加以改造后也表现出增强的自身酶解稳定性，而且根据本发明通过联合在132-133和192-193之间的蛋白自身酶解降解位点附近的改造可以获得双重好处。
表II当被改造后产生枯草杆菌酶变异体，其带有以增强的蛋白自身酶解降解模式的残基
位点/酶 BASBPN  BLSCAR  BLS309  BLS147  TVTHER
 129  P  P  P  T  T
 131  G  G  P  G  G
 136  K  K  E  E  Q
 159  S  S  G  Q  T
 164  T  T  S  G  A
 165  V  I  I  V  P
167 Y Y Y Y Y
 170  K  K  R  R  Y
 171  Y  Y  Y  Y  Y
表II是利用图1中所示的序列比较构建的。很明显一个相似的或更大的覆盖其它枯草杆菌酶的表可以很容易地被本领域熟练的技术人员制作出来。
表III进一步描述了在所提到的位于残基132-133(BASBPN编号)之间的自身酶解切割位点附近的特定氨基酸残基。很明显一个相似的或更大的覆盖其它枯草杆菌酶的表可以很容易地被本领域熟练的技术人员制作出来。
表III位于残基132-133(BASBPN编号)的蛋白自身酶解位点附近的残基
位点/酶 BASBPN  BLSCAR  BLS309  BLS147 TVTHER
 129   P   P   P   T   T
 130   S   S   S   S   V
 131   G   G   P   G   G
 132   S   S   S   S   N
 133   A   T   A   S   S
 134   A   A   T   T   G
 135   L   M   L   L   L
 136   K   K   E   E   Q
表III是利用图1中所示的序列比较构建的。
一个相似的描述位于残基192-193之间的蛋白自身酶解位点附近的残基的表可以容易地被本领域熟练的技术人员制作出来。
因而本发明涉及在一个或多个表II中所示的氨基酸残基上具有改造的枯草杆菌酶变异体，其中氨基酸序列进一步地在位于位点132-133(BASBPBN编号)之间的蛋白自身酶解位点附近(即位点129、130、131、132、133、134、135、136)的一个或多个氨基酸残基上具有改造；或者
涉及在一个或多个表II中所示的氨基酸残基上有改造的枯草杆菌酶变异体，其还在位于位点192-193之间的蛋白自身酶解位点附近(BASBPN编号))(即位点190、191、192、193、194、195、196)被改造；或
涉及在一个或多个表II中所示的氨基酸残基上有改造的枯草杆菌酶变异体，其还在位于上述两个蛋白自身酶解位点附近均被改造。
根据本发明，同时在位于132-133和192-193(BASBPN编号)的蛋白自身酶解位点或者在各自位点的蛋白自身酶解位点附近的许多特定的改造将为枯草杆菌酶提供增强的蛋白自身酶解稳定性。
原则上，改造可以是将位于切割位点附近的某个氨基酸残基替换为可导致所得变异体蛋白自身酶解稳定性增强的其它19种可能的氨基酸残基中的任何一个。相似地，此改造可以是将20种可能的氨基酸残基的任何一个或多个插入在切割位点附近，导致所得变异体蛋白自身酶解稳定性增强。改造还可以是缺失位于切割位点附近的任何一个氨基酸残基而导致所得变异体的蛋白自身酶解稳定性增强。
鉴定导致蛋白自身酶解稳定性增强的特定改造的策略是在一个切割位点和/或两个切割位点附近的整个区域进行定位随机诱变(例如在129-136和/或189-196之间的所有残基进行定位随机诱变)，然后进行筛选分析以鉴定导致稳定性增强的特定改造。为了说明这种策略，参见此处的有效实施例(参见下文)。
许多导致蛋白自身酶解稳定性增强的特定改造在此处被指出(见下面的“B”和“C”部分)。
通过如看表II或表III以及应用本发明的原则，许多蛋白自身酶解稳定性增强的候选枯草杆菌酶变异体变得清晰起来。
对于在残基132-133(BASBPN编号)之间具有蛋白自身酶解位点的BASBPN和BLSCAR的两个前体枯草杆菌酶变异体来说，适于在此蛋白自身酶解位点附近的任何位点上加以替换，以产生具有增强的蛋白自身酶解稳定性的变异体。
在本发明的上下文中，枯草杆菌酶根据Siezen等(出处同前)加以定义。在一个更窄的意义上，适用于本发明的许多实施方案的感兴趣的枯草杆菌酶属于亚组I-S1和I-S2。在一个更特定的意义上，本发明的许多实施方案涉及革兰氏阴性细菌的丝氨酸蛋白酶，其可产生初级结构与前面表I列出的枯草杆菌酶基本上清楚的同源性。
本发明还包括在上述位点的任何一个或多个替换与对母体酶氨基酸序列的任何其它替换、缺失或添加相结合。特别是包括与已知为该酶提供改善的性质的其它替换相结合。
这些结合包括位点：222(提高氧化稳定性)，218(提高热稳定性)，在稳定该酶的钙结合位点的替换，例如位点76，以及许多其它为先有技术显而易见的位点。
甚至与EP 405901中提到的变异体的结合也被特殊地构思过。
变异体
A：具有改变了132-133(BASBPN编号)之间的蛋白自身酶解切割位点的单变异体
单变异体包括下面提到的一个或多个突变。
枯草杆菌蛋白酶BPN′，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶168和枯草杆菌蛋白酶DY变异体：
A129V，A129I，A129L，A129M，A129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
K136V，K136I，K136L，K136M，K136F，
S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，
T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，
Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
K170V，K170I，K170L，K170M，K170F，
Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
Thermitase变异体
A129V，A129I，A129L，A129M，A129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，
T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，
A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，
Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F
枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和芽孢杆菌PB92蛋白酶变
异体：
T129V，T129I，T129L，T129M，T129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
E136V，E136I，E136L，E136M，E136F，
G159V，G159I，G159L，G159M，G159F，
G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，(BLS147)
S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，(BLS309和BAPB92)
Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W，
Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G，Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
R170W，R170A，R170H，R170N，R170P，R170Q，R170S，R170T，R170Y
(放弃BLS309)，R170V(放弃BAPB92)，R170I
(放弃BAPB92)，R170L，R170M(放弃BAPB92)，
R170F，R170G，R170C，
Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，Y171Q，Y171S，
Y171T，Y171G，Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
B：在位于位点132-133之间的蛋白自身酶解切割位点附近改造的变异体
在上面“A”部分下提到的任何一个单变异体还包括一个或多个任何下面的突变：
P129D，P129E，P129A(BLS309)
S130D，S130E，S130A(BLS309)
P131G，P131D，P131A(BLS309)
S132C，S132A，S132P(BLS309)
A133P(BLS309)
T134C，T134P，T134A(BLS309)
L135P，L135A(BLS309)
E136A，E136P，E136K(BLS309)
V104C+S132C(BLS309)
V104C+T134C(BLS309)
A108C+T134C(BLS309)
C：在位于位点192-193之间的蛋白自身酶解切割位点附近改造的变异体
在上面“A”部分下提到的任何一个单变异体还包括一个或多个任何下面的突变：
F189A，F189G，F189D，F189R，F189Y，F189E，F189N(BLS309)
S190P，S190D，S190T(BLS309)
Q191S，Q191T，Q191N，Q191A，Q191L，Q191D，Q191W(BLS309)
Y192A，Y192P，Y192D，Y192E，Y192V(BLS309)
G193A，G193N，G193P(BLS309)
A194P，A194D(BLS309)
G195E(BLS309)
L196A(BLS309)
D：在位于位点132-133和192-193之间的蛋白自身酶解切割位点附近改造的变异体
上面“A：”部分下提到的任何一个单变异体，还包括一个或多个“B：”部分下提到的突变和/或一个或多个上面“C：”部分下提到的突变的组合。
E：进一步组合变异体
构思了任何一个“B”部分、“C”部分和/或“D”部分下提到的上述变异体，如果同在下列任一位点的其它突变相结合，具有优越性：27，36，57，76，97，101，104，120，123，206，218，222，224，235和274。
特别地，在下面BLS309和BAPB92变异体中的突变被认为适合进行组合：
K27R，*36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A，V104N，V104Y，H120D，N123S，A194P，Q206E，N218S，M222S，M222A，T224S，K235L和T274A。
而且这种变异体包含一个或两个X167V，X167M，X167F，X167L，X167I，X170V，X170M，X170F，X170L和/或X170I的替换，其与上面提到的其它替换、缺失和/或插入相结合的这种变异体被认为比与“A”、“B”和/或“C”部分下提到的任何突变的结合更为优越。
此外，变异体包含任何一个突变V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A或这些突变的其它组合(V104N，S101G，K27R，V104Y，N123S，T274A，N76D，V104A)，其与任一个或多个上面的A、B和/C部分下的提到的替换，缺失和/或插入相结合的变异体被认为表现出改善的性质。
将要提到的特定的组合是：
A：Y167I+R170L+A133P
B：Y167I+R170L+T134P
C：Y167I+R170L+A133P+T134P
D：Y167I+R170L+V104C+S132C
E：Y167I+R170L+A108C+T134C
F：Y167A+R170S+F189A
G：Y167A+R170S+Y192A
H：Y167A+R170S+Y192P
I：Y167A+R170S+Y192A+A194P
J：Y167A+R170S+Y192P+A194P
K：Y167A+R170S+F189G
L：Y167A+R170S+F189E
M：Y167A+R170S+F189R
N：Y167I+R170L
M：Y167I+R170L+A194P
O：Y167A+R170S+A194P
P：Y167A+R170L+A194P
Q：Y167A+R170N+A194P
R：V104C+S132C+Y167I+R170L
S：A108C+T134C+Y167I+R170L
T：V104C+S132C+Y167A+R170S
U：V104C+S132C+Y167A+R170L
V：V104C+S132C+Y167A+R170N
X：A133D+Y167I+R170L
Y：P129K+Y167I+R170L
Z：A133P+Y167A+R170S+A194P
AA：T134P+Y167A+R170S+A194P
BB：A133P+T134P+Y167A+R170S+A194P
CC：A133P+Y167A+R170N+A194P
DD：T134P+Y167A+R170N+A194P
EE：A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P
FF：A133P+Y167A+R170L
GG：P129K+P131H+Y167I+R170L
HH：A133P+Y167A+R170S
II：A133P+Y167A+R170N
JJ：Y167A+R170S+F18 9K
KK：V104C+T134C+Y167A+R170S
枯草杆菌酶基因中产生突变的方法
许多向基因中引入突变的方法在本领域是众所周知的。在简单讨论一下克隆枯草杆菌酶基因之后，将要讨论在枯草杆菌酶内的随机位点和特定位点产生突变的方法。
克隆枯草杆菌酶基因
编码枯草杆菌酶的基因可从表I中所示的任何一种生物中，特别是从革兰氏阳性细菌或真菌中通过本领域所熟知的各种方法克隆到。首先必须用来自产生待研究的枯草杆菌酶的菌株中的染色体DNA或信使RNA建立DNA的基因组文库和/或cDNA文库。然后，如果该枯草杆菌酶的氨基酸序列已知，可合成同源的标记的寡核苷酸探针，并用于从细菌DNA基因组文库或cDNA文库中鉴定枯草杆菌蛋白酶编码克隆。或者，一个含有与来自另一个细菌或生物的枯草杆菌酶同源序列的标记寡核苷酸探针可用作探针鉴定枯草杆菌酶编码克隆，方法是用严格性较低的杂交和洗脱条件。
然而，另一个鉴定产生枯草杆菌酶克隆的方法：包括将基因组DNA插入到一种表达载体如质粒中，用形成的基因组DNA文库转化蛋白酶阴性细菌，然后将转化的细菌涂布在含有枯草杆菌酶底物如脱脂乳的琼脂上。那些含有耐受枯草杆菌酶的质粒的细菌因为由外泌的枯草杆菌酶消化脱脂乳将产生透明琼脂圈包围的菌落。
在枯草杆菌蛋白酶基因中产生随机突变
一旦枯草杆菌酶基因被克隆入合适的载体，如质粒，可用几种方法在该基因中引入随机突变。
例如，随机突变的进行可以通过使用合适的物理或化学诱变剂，使用适合的寡核苷酸，或者使DNA序列进行PCR诱变。此外，随机突变可以通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
诱变剂可以是，例如一种引起转换、颠换、倒位、重排(Scrambling)、缺失和/或插入的试剂。
适合本目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，对-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这些试剂时，诱变通常是通过将待诱变的编码母体酶的DNA序列与所选诱变剂一起在适合诱变发生的条件下进行温育，以及选择具有所需性质的突变的DNA。
当诱变是通过使用寡核苷酸进行时，可以在合成寡核苷酸过程中在有待改变位点上用三个非亲本核苷酸进行修饰(Doped或Spiked)。进行修饰可以避免不需要的氨基酸密码子。被修饰寡核苷酸可以通过任何已公开的技术如PCR、LCR或任何DNA聚合酶和连接酶掺入到编码蛋白酶的DNA中。
当使用PCR产生的诱变时，一个经化学处理的或未经处理的编码母体蛋白酶的基因在增加核苷酸错误掺入的条件下进行PCR。(Dexhler1992.Lenng等1989)
一个增变(mutator)大肠杆菌菌株(Fowler等1974)，酿酒酵母菌株或任何其它微生物菌株可用于编码蛋白酶的DNA的随机诱变，通过如转化一个含母体酶的质粒入增变菌株，培养含质粒的增变菌株以及从增变菌株中分离突变质粒。突变质粒可随后被转化到表达生物中。
待诱变的DNA序列可方便地存在于从表达母体蛋白酶的生物中制备的基因组文库中或cDNA文库中。或者，DNA序列可位于合适的载体如质粒或噬菌体上，它们可以与诱变剂一起温育或接触诱变剂。待诱变的DNA还可以通过整合到该细胞的基因组中或者通过存在于停泊(harboured)于该细胞的载体上存在于宿主细胞中。最后，待诱变的DNA可以以分离的形式存在。将要进行随机诱变的DNA序列优选地是cDNA或基因组DNA序列。
随机诱变可以优先地定位于目标母体蛋白酶的一部分。当该酶的某一区域被鉴定对该酶的某种性质特别重要时，以及当被改造后预期能够导致具有改善性质的变异体时，这样做有优越性。当母体酶的三级结构被阐明时，这种区域可被通常地鉴定且与该酶的功能相关。
定位随机诱变可以方便地通过利用上述PCR产生的诱变技术或任何其它合适的本领域已知的技术来进行。
或者，编码DNA序列待改造的部分的DNA序列可以被分离，例如，通过插入到合适的载体中，然后该部分可以再利用上述诱变方法的任何一种进行诱变。
定位随机诱变可以在一个或多个这些区域中进行，优选地在至少两个区域中进行。
在枯草杆菌酶中产生定点突变
一旦枯草杆菌酶被克隆，想要的突变位点被鉴定，而且用于替换原始残基的残基被确定，就可以利用合成的寡核苷酸引入这些突变。这些寡核苷酸含有想要的突变位点侧翼的核苷酸序列，在寡核苷酸合成时插入突变体核苷酸。在一个优选方法中，定点诱变是通过分别由Deng等《分析生物化学》(Anal.Biochem)200：81-88(1992)和Markvardsen等《生物技术》(Bio Techniques)18(3)：371-372(1995)描述的“单一位点消除技术”(USE)或“尿嘧啶单一位点消除技术”来进行。
重组表达载体
含有编码本发明的酶的DNA构建体的重组载体可以是可以任何方便地进行重组DNA步骤的载体，载体的选择经常依赖于它将被引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体形式存在的载体，它的复制是独立于染色体复制的，例如质粒。或者，当它被引入宿主细胞时载体可以以其部分或整体整合到宿主细胞的基因组中，并与它所整合的染色体一起复制。
载体优选地是表达载体，其中编码本发明的DNA序列有效地与DNA转录所需的额外片段连接在一起。通常表达载体衍生自质粒或病毒DNA，或者含有它们两者的元件。术语“有效地连接”是指该片段经过排列以使其为了预定目的而共同行使功能，例如，在启动子中起始转录，并在编码该酶的DNA序列上进行转录。
启动子可以是任何在选定的宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可以衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
在细菌宿主细胞中使用的合适的启动子的实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilis)生麦芽糖淀粉酶基因，地衣芽孢杆菌α淀粉酶基因，解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因，或者是短小芽孢杆菌的木糖酶基因，或者是λ噬菌体PR或PL启动子或大肠杆菌lac、trp或tac启动子。
如果需要的话，编码本发明的酶的DNA序列还可以有效地与合适的终止子相连。
本发明的重组载体可进一步含有使载体在该宿主中复制的DNA序列。
载体还可以含有一种选择性标记，例如：一个基因，其产物互补了宿主细胞中的缺陷；或者一个基因，它编码如对抗生素，象卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等等的抗性，或者对重金属或除草剂的抗性。
为了指导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径，在重组载体中可提供一种分泌信号序列(又叫引导序列，前蛋白序列(prepro)或前序列(pre Sequence))。分泌信号序列以正确的阅读框连接到编码该酶的DNA序列上。分泌信号序列通常定位在编码该酶的DNA序列的5’端。分泌信号序列通常与该酶有关，或是来自编码其它分泌蛋白的基因。
分别用连接编码该酶的DNA序列、启动子和任选的终止子以及/或分泌信号序列的步骤，或通过合适的PCR扩增系统组装这些序列，并将它们插入含有复制或整合所必要的信息之合适载体中去的步骤为本领域熟练技术人员周知(例如参考Sambrook等，Op.cit)。
宿主细胞
引入宿主细胞的编码本发明的酶的DNA序列可与宿主同源或异源。如果与宿主细胞同源，即天然产自宿主细胞，它可以一般有效地与其自然环境中所没有的另一个启动子序列或，如果可行的话，与另一个分泌信号序列和/或终止子序列相连。术语“同源”意在包括编码宿主生物天然的酶的DNA序列。术语“异源”意在包括为宿主细胞天然所不表达的DNA序列。因此，DNA序列可以是来自另一种生物，或者是一个合成的序列。
引入本发明的DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以是任何能够产生该酶的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
经培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌菌株，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌，或链霉菌菌株，如浅青紫霉菌或鼠灰链霉菌(S.murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌。细菌的转化可以通过原生质体转化、电穿孔、接合或用感受态细胞以自知的方式来实现(参考Sambrook等，出处同前)。
当在细菌如大肠杆菌中表达酶时，该酶可以留在胞质中，通常为不溶性粒子(已知为包涵体)，或者被细菌分泌序列指导进入周质区。在前一种情况中，将细胞裂解，回收粒子并变性，然后通过将变性剂稀释使酶重新折叠。在后一种情况中，可以通过破坏细胞从周质区回收该酶，例如通过超声波或渗透冲击以释放周质区的内含物并回收酶。
当在革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌或链霉菌菌株中表达酶时，该酶留在胞质中，或被细菌分泌序列指导进入胞外培养基中。在后一种情况中，可以根据下面的描述从培养基中回收。
产生枯草杆菌酶的方法
本发明提供一种方法以产生分离的根据本发明的酶，其中用编码该酶的DNA序列转化的合适宿主细胞被培养在允许产生该酶的条件下，并从培养液中回收所产生的酶。
根据此处的定义，分离的多肽是基本上没有其它非枯草杆菌酶多肽的多肽，例如通过SDS-PAGE测定至少20％纯度，优选地至少40％纯度，更优选地至少60％纯度，更更优选地约80％纯度，最优选地约90％纯度，更最优选地约95％纯度。术语“分离的多肽”可以替代地命名为“纯化的多肽”。
当含有编码该酶的DNA序列的表达载体被转化到一个异源宿主细胞中时，有可能使异源重组体产生本发明的酶。
因此有可能制备高度纯化的枯草杆菌酶组合物，其特征在于不含有同源的不纯物。
在本文中同源的不纯物是指来自同源细胞的任何不纯物(例如除了本发明的酶的其它多肽)，其来源于的细胞是本发明的酶最初来源于的细胞的同源细胞。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是任何适合于宿主细胞生长的传统培养基。表达的枯草杆菌酶可以方便地分泌到培养基中，且可通过已知的步骤加以回收，如离心和过滤从培养基中分离细胞，通过盐法如硫酸铵沉淀培养基中的蛋白质组分，然后再通过层析步骤例如离子交换层析、亲和层析等等。
含有该突变酶的去污剂组合物
本发明也可包括本发明的酶在清洁用组合物和去污剂组合物中的用途，这种组合物包含突变的枯草杆菌蛋白酶。这种清洁用组合物和去污剂组合物如下详细描述。
去污剂的公开内容和实施例
表面活性剂体系
根据本发明的去污剂组合物包括一个表面活性剂体系，该表面活性剂可选自于非离子和/或阴离子和/或阳离子和/或两性的和/或两性离子的和/或半极性表面活性剂。
表面活性剂的量一般占总重量的0.1％到60％。
表面活性剂优选的与该组合物中存在的酶相容地配制。在液态或胶态组合物中表面活性剂最优选的以促进、或至少不降低这些组合物中任何酶的稳定性的方式配制。
本发明所用的表面活性剂的优选体系包括如本文所述的一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧丙烯醚、聚氧丁烯醚适用于作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂，优选的是聚氧乙烯醚，这些化合物包括烷基酚与环氧化物的缩合产物，其具有一个包含具有直链或支链构型的从约6至约14个碳原子的烷基基团，约8至约14个碳原子是优选的。在优选的实施方案中，环氧化物的量等于每摩尔烷基酚约2到约25摩尔环氧化物，更优选的为约3到约15摩尔。这种类型的商品化的非离子表面活性剂包括GAF公司销售的IgepalTM CO-630；Rohm & Haas公司销售的TritonTM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂一般归于烷基酚烷氧基化物(如烷基酚乙氧基化物)。
由伯和仲脂族醇与约1到约25摩尔环氧乙烷的缩合产物适合用作本发明的非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂。脂族醇的烷基链可以是直链也可是支链，可为伯醇也可为仲醇，一般包括从约8至约22个碳原子。优选的醇与环氧乙烷的缩合产物中，醇的烷基基团含有从约8到约20个碳原子，更优选的烷基基团含约10到18个碳原子，每摩尔醇与从约2到约10摩尔环氧乙烷缩合。所述的缩合产物中每摩尔醇与约2到约7摩尔环氧乙烷缩合，最优选的与约2到约5摩尔环氧乙烷。这种类型的商品化的非离子表面活性剂包括Union Carbide公司销售的TergitolTM15-S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、TergitolTM24-L-6NMW(窄分子量分布的C12-C14初级醇与6摩尔环氧乙烷的缩合物)；Shell Chemical公司销售的NeodolTM45-9(C14-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM23-3(C12-C13直链醇与3.0摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM45-7(C14-C15直链醇与7摩尔环氧乙烷的缩合物)、NeodolTM(C14-C15直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)；Procter & Gamble公司销售的KyroTM EOB(C13-C15醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；Hoechst销售的Genapol LA 050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物中优选的HLB范围是从8到11，最优选的范围从8到10。
公开于US4,565,647的烷基多糖也用作本发明的表面活性剂体系的非离子表面活性剂，其具有一个含从约6到约30个碳原子的疏水性基团，优选的从约10到16个碳原子以及一个多糖如聚糖苷，亲水基团含有从约1.3到约10、优选的从约1.3到约3、最优选的从约1.3到约2.7个糖单位。可用任何含有5或6个碳原子的还原糖，如葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分取代葡萄糖基部分(疏水基团任选地连接于2-、3-、4-等位置，产生不同于葡萄糖苷或半乳糖苷的葡萄糖或半乳糖)。糖内部键可位于如添加的糖单位的某一位置和位于其前面的糖单位的2-、3-、4-和/或6位之间。
优选的烷基聚糖苷的化学式如下：
R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中，R2选自烷基、烷基苯基、羟烷基、羟烷基苯基和其混合的基团，其中烷基基团含有从约10到约18个碳原子，优选的含从约12到约14个碳原子；n为2或3，优选为2；t可从0到约10，优选为0；X可从约1.3到约10，优选从约1.3到约3，最优选从约1.3到约2.7。糖基优选获自葡萄糖。要制备这些化合物，需先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后再与葡萄糖或葡萄糖源反应，形成葡萄糖苷(连接于1位)。添加的糖基单位的1位再与前面糖基单位的2-、3-、4-和/或6位相连，优选的主要在2位。
由环氧丙烷同丙二醇缩合而成的疏水骨架与环氧乙烷形成的缩合产物也适合用作本发明的另外的非离子表面活性剂体系。这些化合物的疏水部分优选的具有从约1500到约1800的分子量，且表现出水不溶性。在疏水部分上添加的聚氧乙烯部分有助于增加整个分子的水溶性，产物的液态性质一直保留，直到聚氧乙烯含量占缩合产物总重量的约50％，相当于同直到约40摩尔的环氧乙烷缩合。这种类型化合物的实例包括BASF销售的某些商品化的PluronicTM表面活性剂。
由环氧乙烷与由环氧丙烷和乙二胺反应产物缩合的产物也适合用作本发明的非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂。这些产物的疏水部分含有由乙二胺与过量环氧丙烷的反应产物，一般分子量从约2500到约3000。该疏水部分再与环氧乙烷缩合直到缩合产物中所含聚氧乙烯占重量的从约40％到约80％，分子量从约5000到约11000。这种类型非离子表面活性剂的实例包括BASF销售的某些商品化的TetronicTM化合物。
优选的用作本发明的表面活性剂体系的非离子表面活性剂有烷基酚-聚氧乙烯醚、伯和仲脂族醇与从约1到约25摩尔环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖和它们的混合物。最优选的为具有3到15个乙氧基的C8-C14烷基酚的乙氧基化物和具有从2到10个乙氧基(优选约10个)的C8-C18醇的乙氧基化物以及它们的混合物。
高度优选的非离子表面活性剂是多羟基脂肪酸酰胺表面活性剂，化学式如下：
Figure A20031011956800541
其中R1为H，或R1为C1-4烃基、2-羟乙基、2-羟丙基或它们的混合物，R2为C5-31烃基、Z为具有至少直接连在链上的3个羟基的直链烃基链的多羟基烃，或它的烷氧化衍生物。优选的R1为甲基，R2为直链C11-15烷基或C16-18烷基或诸如椰子烷基的链烯基链或它们的混合物，且Z为获自还原胺化反应中的诸如葡萄糖、果糖、麦芽糖或乳糖的还原糖。
高度优选的阴离子表面活性剂包括烷氧基化的硫酸烷基酯表面活性剂。其实例为化学式为RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R为未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基组分的羟烷基基团，优选C12-C20烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，A为乙氧基或丙氧基单位，m大于零，一般约在0.5与约6之间，更优选地在约0.5与约3之间，M为H或一种阳离子，如金属阳离子(如，钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代的铵阳离子。此处构思了乙氧基化硫酸烷基酯以及丙氧基化硫酸烷基酯。取代的铵离子的具体实例包括甲基、二甲基、三甲基铵离子和诸如四甲基铵的季铵离子和二甲基哌啶鎓阳离子以及诸如乙基胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的烷基胺的衍生物等等。典型的表面活性剂有C12-C18烷基聚乙氧基(1.0)硫酸酯(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(2.25)硫酸酯(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(3.0)硫酸酯(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基(4.0)硫酸酯(C12-C18E(4.0)M)，其中M一般选自于钠和钾。
应用的合适的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括根据“美国油化学家协会杂志”(The Journal of the American oilChemists Society)，52(1975)，pp.323-329，用气态SO3磺化C8-C20羧酸(如，脂肪酸)产生的线性酯。合适的起始原料包括获自动物脂肪、棕榈油等的天然脂肪物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂，特别是用于洗衣的，包括如下结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：
Figure A20031011956800551
其中R3为C8-C20烃基，优选为烷基或它们的组合，R4为C1-C6烃基，优选烷基或它们的组合，M为与烷基酯磺酸盐形成水溶性盐的阳离子。合适的成盐阳离子包括诸如钠、钾和锂的金属离子，以及诸如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的取代或未取代的铵阳离子。优选的，R3为C10-C10烷基，R4为甲基、乙基或异丙基。特别优选的为R3是C10-C16烷基的甲基酯磺酸盐。
其它的合适的阴离子表面活性剂包括化学式为ROSO3M的水溶性盐或酸的烷基硫酸盐表面活性剂，其中R优选为C10-C24烃基，优选具有C10-C20烷基组分的烷基或羟烷基，更优选C12-C18烷基或羟烷基，M为H或阳离子，如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或铵或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子和诸如四甲基铵的季铵阳离子和二甲基哌啶鎓阳离子和获自诸如单乙胺、二乙胺、三乙胺以及它们混合物的烷基胺的季胺阳离子，等等)。通常，C12-C16烷基链优选适用于较低的洗涤温度(如低于约50℃)，C16-C18烷基链优选适用于较高的洗涤温度(如高于约50℃)。
其它用于洗涤目的的阴离子表面活性剂也可包括于本发明的洗衣用去污剂组合物中。它们包括皂盐(包括如钠、钾、铵和诸如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺盐的取代铵盐)、C8-C22初级或次级烷基磺酸盐、C8-C24烯属磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物磺化制备的磺化的多羧酸盐(如英国专利说明书NO.1,082,179中所述)，C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸盐(包含多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂酰基甘油磺酸盐、脂肪油酰甘油硫酸盐、烷基酚环氧乙烷醚硫酸盐，链烷烃磺酸盐、烷基磷酸盐、诸如酰基羟乙磺酸盐的羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸盐单酯(主要是饱和及不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸双酯(主要是饱和及不饱和C6-C12双酯)，酰基肌氨酸盐、诸如烷基多糖苷的硫酸盐的烷基多糖硫酸盐(非离子非硫酸盐化合物，见下文)、支链的初级烷基硫酸盐和诸如具有结构式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的烷基聚乙氧基羧酸盐，其中R为C8-C22烷基，K为一个从1到10的整数，M为形成可溶性盐的阳离子。树脂酸和氢化的树脂酸也适合，如松香、氢化松香和存在于或获自木浆浮油的树脂酸和氢化树脂酸。
烷基苯磺酸盐是高度优选的。特别优选线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)，其中烷基基团优选的包含从10到18个碳原子。
另外的实施例可见“表面活性剂和去污剂”(卷I和II，作者Schwartz，Perry和Berch)。种种这样的表面活性剂也公开于US3,929,678(23栏58行直到29栏23行，此处引入作为参考)。
如果包括在本文，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约1％到约40％，优选重量从约3％到约20％的这种阴离子表面活性剂。
本发明的洗衣用去污剂组合物也可包含阳离子、两性的、两性离子和半极性表面活性剂，以及除了文中已描述之外的非离子和/或阴离子表面活性剂。
适用于本发明的洗衣用去污剂中的阳离子洗涤用表面活性剂，其具有一个长链烃基基团。这些阳离子表面活性剂的实例包括诸如烷基三甲基铵卤化物的铵表面活性剂，和那些化学式如下的表面活性剂：
[R2(OR3)y[R4(OR3)y]2R5N+X-
其中R2为烷基链中有约8到约18个碳原子的烷基或烷基苄基基团，每一个R3都选自于由-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-以及它们混合物组成的一组基团；每个R4选自于由C1-C4烷基、C1-C4羟烷基、由两个以R4基团连接形成的苄基环结构、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6为任何己糖或分子量低于约1000的己糖聚合物)、和氢(当y不为零时)组成的一组基团；R5与R4相同或为烷基链，其中总碳原子数或R2加R5碳原子数不超过约18；每个y从0到大约10，y值的和从0到大约15；X为任何可相容的阴离子。
高度优选的阳离子表面活性剂为可用于本组合物的水溶性季铵化合物，具有以下化学式：
R1R2R3R4N+X-(i)
其中R1为C8-C16烷基，R2、R3和R4为独立的C1-C4烷基、C1-C4羟烷基、苄基和-(C2H40)xH，其中X的值从2到5，X为一种阴离子。R2、R3和R4中至多一个为苄基。
R1优选的烷基链长度为C12-C15，尤其是烷基基团为获自椰子或棕榈仁脂肪的多种链长的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成衍生而来。
R2、R3和R4优选的基团为甲基和羟乙基基团。阴离子X可选自卤离子、甲硫酸根、乙酸根和磷酸根离子。
用于此处具有化学式(i)的合适的季铵化合物有：
椰子三甲基氯(或溴)化铵；
椰子甲基二羟乙基氯(或溴)化铵；
癸基三乙基氯化铵；
癸基二甲基羟乙基氯(或溴)化铵；
C12-C15二甲基羟乙基氯(或溴)化铵；
椰子二甲基羟乙基氯(或溴)化铵；
十四烷基三甲基甲基硫酸铵；
十二烷基二甲基苄基氯(或溴)化铵；
十二烷基二甲基(乙氧基)4氯(或溴)化铵；
胆碱酯(R1为
Figure A20031011956800571
烷基，R2、R3、R4为甲基的化学式(i)的化合物)
二烷基咪唑啉[化学式(i)的化合物]
用于此处的其它阳离子表面活性也可见于US 4,228,044和EP000224。
如果包括在本文，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约25％，优选重量从约1％到约8％的这种阳离子表面活性剂。
两性的表面活性剂也适合用于本发明的洗衣用去污剂组合物中。这些表面活性剂广义地说有仲胺或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲胺和叔胺的脂族衍生物，其中脂基可为直链或支链。脂族取代基中有一个包含至少约8个碳原子，一般为从约8到约18个碳原子，并且至少有一个包含一种阴离子水溶性基团，如羧基、磺酸根、硫酸根。两性表面活性剂的实例见US3,929,678(19栏，18-35行)。
如果此处包含的话，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约15％，优选重量从约1％到约10％的这种两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适合用于本发明的洗衣用去污剂组合物中。这些表面活性剂广义地说有仲胺和叔胺的衍生物，杂环仲胺和叔胺的衍生物，或季铵的衍生物，季鏻或叔锍化合物。两性离子表面活性剂的实例见US3,929,678(19栏38行到22栏48行)。
如果此处包含的话，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约15％，优选重量从约1％到约10％的这种两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是非离子表面活性剂的一个特殊类型，其包括水溶性氧化胺，其含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分和两个选自于含有从约1到约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分；水溶性氧化膦，含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分和两个选自于含有从约1到约3个碳原子的烷基和羟烷基的部分；以及水溶性亚砜，含有一个从约10到约18个碳原子的烷基部分和选自于含有约1到3个碳原子的烷基和羟烷基的部分。
半极性非离子去污剂用表面活性剂包括氧化胺表面活性剂，其化学式如下：
其中R3为包含有从约8到约22个碳原子的烷基、羟烷基、或烷基苯基基团、或它们的混合物；R4为含从约2到约3个碳原子的亚烷基或羟亚烷基基团或它们的混合物；X从0到约3；每个R5为含约1到约3个碳原子的烷基或羟烷基，或含从约1到约3个环氧乙烷基团的聚环氧乙烷基团。R5的基团可互相连接，如，通过一个氧或氮原子形成一个环状结构。
这些氧化胺表面活性剂尤其包括C10-C18烷基二甲基氧化胺和C8-C12烷氧乙基二羟乙基氧化胺。
如果此处包含的话，本发明的洗衣用去污剂组合物一般包含总重量的从约0.2％到约15％，优选从约1％到约10％的这种半极性非离子表面活性剂。
助洗剂体系
本发明的组合物另外也可包含助洗剂体系。适用于此的常规助洗剂体系包括硅铝酸盐物质，硅酸盐，多羧化物和脂肪酸，诸如乙二胺四乙酸盐的物质，诸如氨基聚膦酸盐的金属离子螯合剂，尤其是乙二胺四亚甲基膦酸和二乙三胺五亚甲基膦酸。虽然因为环境原因而较少优选，但磷酸盐助洗剂也可用于此。
合适的助洗剂可以是无机离子交换物质，一般为无机水合的硅铝酸盐物质、尤其是诸如水合的沸石A、X、B、HS或MAP的水合的合成沸石。
另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐，如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是包含硅酸钠(Na2Si2O5)的结晶层状硅酸盐。
包含有一个羧基基团的合适的多羧化物包括乳酸、乙醇酸以及它们的醚衍生物，见比利时专利NO.831,368；821,369和821,370。含二个羧基基团的多羧化物包括水溶性琥珀酸盐、丙二酸盐、(亚乙二氧基)双乙酸盐、马来酸盐、二乙二醇酸盐、酒石酸盐、丙醇二酸盐和富马酸盐、以及德国专利说明书2,446,686和2,446,487,US3,935,257中所述的醚羧化物和描述于比利时专利NO.840,623中的亚硫酰基羧化物。含三个羧基基团的多羧化物包括，特别是水溶性柠檬酸盐，乌头酸盐和柠康酸盐以及诸如英国专利NO.1,379,241中所述的羧甲氧基琥珀酸盐的琥珀酸盐衍生物，荷兰申请7205873中所述的乳氧基琥珀酸盐，和英国专利NO.1,387,447中所述的诸如2-氧杂-1，1，3-丙烷三羧酸盐的羟基多羧化物。
含四个羧基基团的多羧化物包括：英国专利NO.1,261,829中所公开的氧二琥珀酸盐，1，1，2，2-乙烷四羧酸盐，包含磺基取代基的1，1，3，3-丙烷四羧酸盐，包括英国专利NOs,1,398,421和1,398,422以及US3,936,448中公开的磺化琥珀酸盐衍生物，和英国专利NO.1,082,179中所述的磺化的热解的柠檬酸盐，而包含膦取代基的多羧化物则公开于英国专利NO.1,439,000。
脂环族和杂环族多羧化物包括：环戊烷-顺，顺-顺-四羧酸盐；环戊二烯五羧酸盐；2，3，4，5-四氢呋喃-顺，顺，顺-四羧酸盐；2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸盐；1，2，3，4，5，6-已烷-六羧酸盐和诸如山梨醇、甘露醇和木糖醇的多元醇的羧甲基衍生物。芳香族多羧化物包括公开于英国专利NO.1,425,343中的苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和苯二甲酸衍生物。
综上所述，优选的多羧化物为每分子包含多达3个羧基基团的羟基-羧酸盐，特别是柠檬酸盐。
用于本组合物的优选的助洗剂体系包括：诸如沸石A的水不溶性硅铝酸盐助洗剂混合物或层状硅酸盐(SKS-6)及诸如柠檬酸的水溶性羧酸盐螯合剂的混合物。
根据本发明的去污剂组合物中的合适的螯合剂有乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)或它的碱金属、碱土金属、铵或取代的铵盐，或它们的混合物。优选的EDDS化合物为其游离酸形式和它的钠或镁盐。优选的EDDS钠盐的实例包括Na2EDDS和Na4EDDS。优选的EDDS镁盐的实例包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐存在于本发明之组合物中是最优选的。
优选的助洗剂体系包括：诸如沸石A的水不溶性硅铝酸盐助洗剂的混合物，和诸如柠檬酸的水溶性羧酸盐螯合剂的混合物。
其它构成助洗剂体系组成部分用于颗粒状组合物中的助洗剂材料包括：诸如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐的无机材料，和诸如有机膦酸盐，氨基聚亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐的有机材料。
其它的合适的水溶性有机盐有均聚或共聚酸或它们的盐，其中多羧酸包括至少两个相互之间隔开最多两个碳原子的羧基基团。
这种类型的聚合物公开于GB-A-1,596,756。这种盐的实例有分子量为2000-5000的聚丙烯酸酯，和它们与马来酐的共聚物，这些共聚物的分子量从20,000到70,000，尤其是约40,000。
洗涤用助洗剂盐含量一般占组合物重量的5％到80％。液态去污剂优选的助洗剂量从5％到30％。
酶
优选的去污剂组合物，除本发明制备的酶之外，还包括其它用于提供清洁效果和/或保护织物的酶。
这些酶包括：蛋白酶、角质酶、其它的脂酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(如漆酶)。
蛋白酶：任何适合用于碱性溶液中的蛋白酶均可使用。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的酶。微生物来源是优选的。化学地或遗传修饰的变异体也包括在内。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例有枯草杆菌蛋白酶，尤其是获自芽孢杆菌属如枯草杆菌蛋白酶NOVO，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶309，枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(见WO89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶有胰蛋白酶(如获自猪或牛的)和WO89/06270中描述的镰孢菌属蛋白酶。
优选的商品化蛋白酶包括：NOVO Nordisk A/S(丹麦)销售的商品名为Alcalase、Savinase，Primase，Durazym和Esperase的蛋白酶，Gist-Brocades销售的商品名为Maxatase，Maxacal，Maxapem和Properase的蛋白酶，Genencor International销售的商品名为Purafect和Purafect OXP的蛋白酶，和Solvay Enzymes销售的商品名为Opticlean和Optimase的蛋白酶。加入本发明组合物中蛋白酶蛋白质的量可占组合物重量的0.0001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
脂酶：任何适用于碱性溶液中的脂酶均可使用。合适的脂酶包括细菌来源或真菌来源的。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。
适用的脂酶实例包括：Humicola Ianuqinosa脂酶，如EP258068和EP305216中所述；Rhizomucor miehei脂酶，如EP 238 023中所述；假丝酵母(Candida)脂酶，诸如C.antarctica脂酶，如EP214 761中所述的C.antantica脂酶A或B；如EP218 272中所述的假单胞菌脂酶，诸如产碱假单胞菌(P.alcacaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂酶；如EP331376中所述的洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂酶；如GB1,372,034中公开的施氏假单胞菌(P.stutzeri)的脂酶；荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂酶；芽孢杆菌脂酶，如枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)脂酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophysica acta 1131 253-260)；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)脂酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)脂酶(WO 91/16422)。
另外，很多克隆的脂酶也可使用，包括Yamaguchi等人(1991)，基团103，61-67)中所述的沙门柏干酪青霉(Peniciilim camembertii)脂酶；Geotricum candidum脂酶(Schimada，Y.等人，(1989)，生物化学杂志(J.Biochem.)，106，383-388)，和诸如R.delemar脂酶(Hass.M.J等人，(1991)，基因109，117-113)，雪白根霉(R.niveus)脂酶(Kugimiya等人，(1992)，Biosci.Biotech.Biachem.56，716-719)和米根霉(R.oryzae)脂酶的根霉菌脂酶。
诸如角质酶的其它的类型的脂解酶也可使用，如WO88/09367中所述的获自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶，或获自Fusarium solani pisi的角质酶(如，WO90/09446中所述)。特别适用的脂酶诸如：M1 LipaseTM，Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor)，LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NOVO Nordisk A/S)，和脂酶P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
一般加入去污剂组合物中的脂酶蛋白质的量占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
淀粉酶：任何适合用于碱性溶液中的淀粉酶(α和/或B)均可使用。合适的淀粉酶包括细菌或真菌来源的淀粉酶。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。淀粉酶包括：如GB1,296,839中详细描述的获自地衣芽孢杆菌的特定菌株的α-淀粉酶。商品化的淀粉酶有DuramyTM，TermamylTM，FungamylTM和BANTM(Novo Nordisk A/S有售)和RapidaseTM和Maxamyl PTM(Genencor有售)。
一般加入去污剂组合物中的淀粉酶蛋白质的量占组合物重量的0.0001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
纤维素酶：任何合适用于碱性溶液中的纤维素酶均可使用。合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的纤维素酶。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。合适的纤维素酶公开于US4,435,307，其中公开了产生于Humicola insolens的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有保护颜色的益处的纤维素酶。这些纤维素酶的实例有欧洲专利申请NO.0495257中所述的纤维素酶。
商品化的纤维素酶包括产生于Humicola insolens菌株的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)，和KAC500(B)TM(Kao公司)。
一般加入去污剂组合物中的酶蛋白质的量占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选的占组合物重量的0.001％到0.5％，十分优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其来源(如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)结合使用。氧化酶与氧结合使用。两种类型的酶均用于“溶液漂白”，如当织物一起在洗涤液中洗涤时阻止染色的织物上的染料转移到另一件织物上，优选与如WO94/12621和WO95/01426中所述的增强剂一起使用。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的酶。化学或遗传修饰的变异体也包括在内。
一般加入去污剂组合物中的过氧化物酶和/或氧化酶的蛋白质的量占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的0.0001％到1％，更优选的占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
上述酶的混合物都包含在本文中，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂酶和/或纤维素酶混合物。
本发明的酶或任何其它加入去污剂组合物中的酶，通常加入去污剂组合物中的量一般占组合物重量的0.00001％到2％，优选占组合物重量的的0.0001％到1％，更优选的占组合物重量的0.001％到0.5％，甚至更优选占组合物重量的0.01％到0.2％。
漂白剂：包含于本发明的去污剂组合物中的附加的去污剂组分可包括诸如PB1，PB4和大小为400-800微米的过碳酸盐漂白剂。这些漂白剂组分可包括一种或多种氧漂白剂和根据漂白剂选择的一种或多种白活化剂。氧漂白剂的量一般在从约1％到约25％。一般漂白化合物在非液态制剂中是任选添加的组分，如在颗粒状去污剂中。
用于此处的漂白剂组分可以是任何可用于去污剂组合物中的漂白剂，包括氧漂白剂以及本领域中熟知的其它漂白剂。
适用于本发明中漂白剂可以是活化的或非活化的漂白剂。
可应用的一类氧漂白剂包括过羧酸漂白剂以及它们的盐。这类漂白剂合适的实例包括：六水合单过氧邻苯二甲酸镁，间氯过苯甲酸镁，4-壬氨基-4-氧代过氧丁酸镁盐和双过氧十二双酸镁盐。这些漂白剂公开于US4,483,781，US740,446，EP0133354和US4,412,934。十分优选的漂白剂也包括如US4,634,551中所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
可应用的另一类漂白剂包括卤漂白剂。次卤化物漂白剂的实例包括如三氯异氰尿酸和二氯异氰尿酸钠和钾，以及N-氯和N-溴烷基氨磺酰钠和钾。这些材料一般加入量为终产物重量的0.5％-10％，优选占重量的1％-5％。
过氧化氢释放剂与漂白活化剂联合使用，如四乙酰乙二胺(TAED)，壬酰羟苯磺酸盐(NOBS，见US4,412,934)，3，5-三甲基-己酰氧苯磺酸盐(ISONOBS，见EP 120591)或五乙酰葡萄糖(PAG)，它们经全水解后形成过酸作为活性漂白剂，以改善漂白效果。另外，十分合适的漂白剂活化剂有C8(6-辛酰胺基-己酰基)氧苯磺酸盐，C9(6-壬酰胺基-己酰基)氧苯磺酸盐和C10(6-癸酰胺基-己酰基)氧苯磺酸盐或它们的混合物。其它合适的活化剂有，如公开于欧洲专利申请No.91870207.7.中酰化的柠檬酸酯。
实用的漂白剂，包括过氧酸和专利申请USSN 08/136,626中所述的漂白体系，包含用于本发明清洁去污剂组合物中的漂白活化剂和过氧漂白化合物。
过氧化氢也可通过加入酶体系(如酶与其底物)而产生，其能在洗衣和/或漂洗过程开始或过程中产生过氧化氢。该酶体系公开于欧洲专利申请EP 0 537 381中。
除了氧漂白剂外的漂白剂也在本领域熟知，也可用于此。一种特别重要的非氧漂白剂包括诸如磺化的锌和/或铝酞菁的光活化的漂白剂。这些物质在洗涤过程中沉积于作用物上，经光照和氧存在条件下，如衣服白天悬挂于室外晾干时，磺化的锌酞菁被激活，随之作用物就被漂白了。优选的锌酞菁及其光活化漂白过程公开于US 4,033,718。一般去污剂组合物中包含占重量的约0.025％到1.25％的磺化的锌酞菁。
漂白剂中也可包含锰催化剂。锰催化剂可以是例如一种描述于“低温漂白的有效锰催化剂”，自然(Nature)369，1994，pp.637-639中的化合物。
抑泡剂：另一个任选的组分为抑泡剂.如聚硅氧烷和硅石-聚硅氧烷混合物。聚硅氧烷一般为烷基化的聚硅氧烷材料，而常用的硅石一般为如硅石空气凝胶和干凝胶以及各种类型的疏水性硅石的细小颗粒。这些物质可以颗粒形式加入，在其中，抑泡剂便利地可释放地加入水溶性或水分散的、基本上非表面活性剂不可渗透的载体中。抑泡剂也可溶解或分散在液态载体中，然后通过喷洒于一种或多种其它组分上而使用。
优选的聚硅氧烷抑泡剂公开于US 3,933,672中。其它的特别有用的抑泡剂有自乳化聚硅氧烷抑泡剂，公开于德国专利申请DTOS2,646,126中。这种化合物的一个实例为DC-544，可从Dow Corning购得，它是硅氧烷一乙二醇共聚物。特别优选的抑泡剂是包含硅油和2-烷基-链烷醇的混合物的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇为2-丁基-辛醇，其商品名为Isofol 12R。
该抑泡剂体系描述于欧洲专利申请EP 0 593841中。
特别优选的硅氧烷抑泡剂描述于欧洲专利申请No.92201649.8.中。该组合物可包括与诸如Aerosil_的熏制无孔硅石结合的聚硅氧烷/硅石混合物。
上述抑泡剂一般用量为组合物重量的0.001％到2％，优选为0.01％到1％。
其它组分：用于去污剂组合物中的其它组分可采用诸如污垢悬浮剂、污垢释放剂、光亮剂、研磨剂、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂、和/或包封的或不包封的香料。
特别适用的包封材料为水溶性胶囊，其由多糖及多羟基化合物基质组成，如GB1,464,616中所述。
其它适用的水溶性包封材料，包括获自非凝胶化淀粉的取代二羧酸酸性酯的糊精，如US3,455,838中所述。这些酸性酯糊精优选由蜡状玉米、蜡样高粱、西米、木薯淀粉和马铃薯淀粉制备。合适的上述包封材料的实例包括National Starch生产的N-Lok。N-Lok包封材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。这种淀粉通过添加诸如辛烯基琥珀酸酐的单功能取代基改性。
适用于此的抗再沉积剂和污垢悬浮剂包括诸如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素的纤维素衍生物，和均聚或共聚的多羧酸或它们的盐。这种类型的聚和物包括前述用作助洗剂的聚丙烯酸酯类和马来酐丙烯酸共聚物，以及马来酐与乙烯、甲基乙烯基醚或异丁烯酸的共聚物。马来酸酐组成至少20％摩尔百分含量的共聚物。这些材料用量占组合物重量的0.5％到10％，更优选为0.75％到8％，最优选占1％到6％。
优选的光亮剂为阴离子，其实例有4，4′-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)茋-2:2′-二磺酸二钠，4，4′-双(2-吗啉代-4-苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)茋-2:2′二磺酸二钠，4，4′-双-(2，4-二苯胺基-均三嗪基-6-基氨基)茋-2:2′-二磺酸二钠，4′4″-双-(2，4-二苯胺基-均三嗪-6-基氨基)茋-2-磺酸钠，4，4′-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙胺基)-均三嗪-6-基氨基)茋-2，2′-二磺酸二钠，4，4′-双-(4-苯基-2，1，3-三唑基-2-基)茋-2，2′-二磺酸二钠，4，4′-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙胺基)-均三嗪基-6-基氨基)茋-2，2′-二磺酸二钠，2(茋基-4″-(萘并-1′，2′:4，5)-1，2，3，-三唑-2″-磺酸钠和4，4′-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物材料为聚乙二醇，尤其是分子量范围1000-10000的聚乙二醇，更优选分子量范围2000到8000，最优选分子量为约4000的聚乙二醇。其用量为重量的0.20％到5％，更优选为0.25％到2.5％。这些聚合物和前述的均聚或共聚多羧酸盐，并且需在过渡金属杂质存在下可用于增白、织物灰尘沉积，以及增加对尘土、蛋白质和可氧化污垢的清洁效果。
本发明组合物中有用的污垢释放剂一般为对苯二酸与乙二醇和/或丙二醇单位按各种方式组合的共聚体或三元聚合物。这些聚合物的实例公开于US,4,116,885和4,711,730和EP0 272 033中。根据EP 0272033，特别优选的聚合物化学式如下：(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25-((PEG)43CH3)0.75
其中PEG为-(OC2H4)O-，PO为(OC3H6O)，T为(POOC6H4CO)。
改性的聚酯也非常实用，其为对苯二酸二甲基酯，磺基间苯二酸二甲基酯、乙二醇和1，2-丙二醇的无规则共聚物，其端基主要由苯甲酸磺基酯组成，其次为乙二醇和/或1，2-丙二醇单酯组成。目的是要获得两端均由苯甲酸磺基酯基团封端的聚合物，“主要”根据上下文是指所述共聚合物大多由苯甲酸磺基酯封端。然而有些共聚合物没有完全封端，因此它们的端基可由乙二醇和/或1，2-丙二醇单酯组成，因此组成“次要的”种类。
此处所选用的聚酯包含占重量约46％的对苯二羧酸二甲基酯，约16％的1，2-丙二醇，约10％的乙二醇，约13％的磺基苯甲酸二甲基酯和约15％磺基间苯二甲酸，分子量约为3000。这些聚酯及其制备方法详细公开于EP311342。
柔顺剂：织物柔顺剂也可加入本发明的洗衣用去污剂组合物中。这些柔顺剂可为无机型或有机型。无机柔顺剂有公开于GB-A-1 400898和US5,019,292中的绿土。有机织物柔顺剂包括：公开于GB-A1 514276和EP 0 011 340中的水不溶性叔胺和公开于EP-B-O026528中的它们与单C12-C14季铵盐的混合物以及公开于EP0242919中的双长链酰胺。织物柔顺剂体系中的其它有用的有机组分包括公开于EP 0 299575和0 313 146中的高分子量的聚环氧乙烷材料。
绿土的用量一般为5％到15％，更优选占重量的8％到12％，其以干燥的混合组分加入制剂剩余物中。诸如水不溶的叔胺或双长锭酰胺物质的有机织物柔顺剂的用量为重量的0.5％到5％，一般为1％到3％，而高分子量的聚环氧乙烷物质和水溶性阳离子物质的用量为重量的0.1％到2％，一般为重量的0.15％到1.5％。这些物质一般加入组合物的喷雾干燥部分中，在有些实施例中也可更方便地以干混颗粒加入，或以熔化的液体形式喷入组合物中其它固体组分上。
聚合的染料转移抑制剂：本发明的去污剂组合物也可包括占重量0.001％到10％，优选0.01％到2％，更优选0.05％到1％的聚合的染料转移抑制剂。一般去污剂组合物中加入所述聚合的染料转移抑制剂用于抑制染料由染色的织物转移到与之一起洗涤的织物上。在洗涤过程中，在从染色的织物上洗出的染色剂有机会吸附于其它物品之前这些聚合物能络合或吸附它们。
特别适用的聚合的染料转移抑制剂有聚胺N-氧化聚合物，N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑共聚物，聚乙烯基吡咯烷酮聚合物，聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或它们的混合物。
这些聚合物的加入也能增强本发明的酶的功效。
本发明的去污剂组合物可以是液体、糊状、凝胶、棒状或颗粒等形式。无粉尘颗粒可根据如公开于US4,106,991和4,661,452(都是NovoInclustri A/S的)生产，可任选地用本领域熟知的方法包衣。蜡状包衣材料的实例有：聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)，其平均分子量1000至2000；具有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；醇部分包含12到20个碳原子且具有15到80个环氧乙烷的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸甘油单、双和三酯。适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例可见于GB1483591中。
本发明的颗粒状组合物也可是“致密形式”，如可比常规颗粒状去污剂具有相对较高的密度，如从550g/l到950g/l；这样，本发明的颗粒去污剂组合物与常规颗粒去污剂相比，将含有较低量的“无机填料盐”；典型的填料盐为碱土金属硫酸盐和盐酸盐，一般为硫酸钠；“致密”去污剂一般包含不超过10％的填料盐。本发明的液体去污剂组合物也可是“浓缩形式”，这样，本发明的液体组合物与常规液体去污剂相比，将包含较少量的水。一般浓缩的液体去污剂水含量少于重量的30％，更优选少于20％，最优选少于去污剂组合物重量的10％。
本发明的组合物可例如制成机洗和手洗的洗衣用去污剂组合物，包括洗衣添加组合物和适用于污染织物的预处理的组合物，漂洗添加的织物柔顺剂组合物，以及用于一般家庭坚硬表面的清洗和洗碟的组合物。
下面的实施例是解释本发明组合物的举例，但并不意味限制或另外地限定本发明的范围。
在去污剂组合物中，缩写的部分名意思如下：
LAS：线性C12烷基苯磺酸钠
TAS：动物脂烷基硫酸钠
XYAS：C1x-C1y烷基硫酸钠
SS：化学式2-丁基辛酸次级皂表面活性剂
25EY：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的C12-C15主要为线性的伯醇
45EY：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的C14-C15主要为线性的伯醇
XYEZS：每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C1x-C1y烷基硫酸钠
Nonionic：由BASF Gmbh销售的商品名为Plurafax LF404的乙氧基化平均程度为3.8，丙氧基化平均程度为4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪醇。
CFAA：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAA：C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸盐：无定形硅酸钠(SiO2∶Na2O＝2.0)
NaSKS-6：分子式为δ-Na2Si2O5的结晶层状硅酸盐
碳酸盐：无水碳酸钠
磷酸盐：三聚磷酸钠
MA/AA：1∶4马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约80,000
聚丙烯酸酯：由BASF Gmbh销售的商品名为PA30的平均分子量为8000的聚丙烯酸酯均聚物
沸石A：初级粒子大小范围为1到10微米的分子式为Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅铝酸钠
柠檬酸盐：二水合柠檬酸三钠
柠檬酸：柠檬酸
过硼酸盐：无水的过硼酸钠一水化漂白剂，实验式NaBO2·H2O2
PB4：无水的四水合过硼酸钠
过碳酸盐：实验式为2Na2CO3·3H2O2的无水的过碳酸钠漂白剂
TAED：四乙酰基乙二胺
CMC：羧甲基纤维素钠
DETPMP：Monsanto销售的商品名为Dequest 2060的二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)
PVP：聚乙烯吡咯烷酮聚合物
EDDS：亚乙基二胺-N，N′-二琥珀酸，钠盐形式的[S，S]异构体
抑泡剂：熔点为50℃的链烷烃蜡25％，疏水硅石17％，石蜡油58％。
颗粒抑泡剂：硅氧烷/硅石12％，十八烷醇18％，颗粒状淀粉70％
硫酸盐：无水硫酸钠
HMWPEO：高分子量聚环氧乙烷
TAE25：乙氧基化动物脂肪醇(25)
去污剂实施例I
本发明的一种颗粒状织物清洗剂组合物可按如下制备：
线性C12烷基苯磺酸钠              6.5
硫酸钠                            1.05
沸石A                             26.0
次氮基三乙酸钠                    5.0
本发明的酶                        0.1
PVP                               0.5
TAED                              3.0
硼酸                              4.0
过硼酸盐                          18.0
苯酚磺酸盐                        0.1
其它                      加到100
去污剂实施例II
本发明的一种致密颗粒状织物清洗剂组合物可按如下制备：
45AS                       8.0
25E3S                      2.0
25E5                       3.0
25E3                       3.0
TFAA                       2.5
沸石A                      17.0
NaSKS-6                    12.0
柠檬酸                     3.0
碳酸盐                     7.0
MA/AA                      5.0
CMC                        0.4
本发明的酶                 0.1
TAED                       6.0
过碳酸盐                   22.0
EDDS                       0.3
颗粒抑泡剂                 3.5
水/其它                    加到100％
去污剂实施例III
本发明的特别适用于有色织物洗涤的颗粒状清洗剂组合物可按如下制备：
LAS                              10.7            -
TAS                              2.4             -
TFAA                             -               4.0
45AS                             3.1             10.0
45E7                              4.0            -
25E3S                             -              3.0
68E11                             1.8            -
25E5                              -              8.0
柠檬酸                            15.0           7.0
碳酸盐                            -              10
柠檬酸                            2.5            3.0
沸石A                             32.1           25.0
Na-SKS-6                          -              9.0
MA/AA                             5.0            5.0
DETPMP                            0.2            0.8
本发明的酶                        0.10           0.05
硅酸盐                            2.5            -
硫酸盐                            5.2            3.0
PVP                               0.5            -
聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/        -              0.2
乙烯基咪唑与乙烯基吡咯烷酮共聚物
过硼酸盐                          1.0            -
苯酚磺酸盐                        0.2            -
水/其它                           加到100％
去污剂实施例IV
本发明的具有“在洗涤过程中软化”能力的颗粒状织物清洁剂组合物按如下制备：
45AS                               -             10.0
LAS                                7.6           -
68AS                               1.3           -
45E7                               4.0           -
25E3                               -             5.0
椰子烷基-二甲基羟乙基氯化铵            1.4         1.0
柠檬酸盐                               5.0         3.0
Na-SKS-6                               -           11.0
沸石A                                  15.0        15.0
MA/AA                                  4.0         0.4
DETPMP                                 0.4         0.4
过硼酸盐                               15.0        -
过碳酸盐                               -           15.0
TAED                                   5.0         5.0
绿土                                   10.0        10.0
HMWPEO                                 -           0.1
本发明的酶                             0.10        0.05
硅酸盐                                 3.0         5.0
碳酸盐                                 10.0        10.0
颗粒状抑泡剂                           1.0         4.0
CMC                                    0.1         0.1
水/其它                                加到100％
去污剂实施例V
本发明的高效液态织物清洗组合物按如下制备：
                                       I           II
酸型LAS                                -           25.0
柠檬酸                                 5.0         2.0
酸型25AS                               8.0         -
酸型25AE2S                             3.0         -
25AE7                                  8.0         -
CFAA                                   5           -
DETPMP                                 1.0         1.0
脂肪酸                                 8           -
油酸                            -           1.0
乙醇                            4.0         6.0
丙二醇                          2.0         6.0
本发明的酶                      0.10        0.05
椰子烷基二甲基羟乙基氯化铵      -           3.0
绿土                            -           5.0
PVP                             2.0         -
水/其它                         加到100％
材料和方法
菌株：
迟缓芽孢杆菌309和147是迟缓芽孢杆菌的特定菌株，保藏于NCIB，编号为NCIB 10309和10147，在美国专利3,723,250中有描述，在此引入作为参考。
大肠杆菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物学杂志138.179-207)通过传统方法制成r-，m+型，也在美国专利申请系列号039,298中有描述。
质粒：
pJS3：含有编码枯草杆菌酶309的合成基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体(由Jacob Schiodt等在《蛋白质和肽通讯》(Protein andPeptide Letters)3：39-44(1996)中描述)。
PSX222：枯草芽孢杆菌表达载体(在PCT/DK96/00207中有描述)。
常用的分子生物学方法：
除非另外提到，DNA的操作和转化是利用分子生物学的标准方法进行的(Sambrook等(1989)《分子克隆实验手册》(Molecularcloning：Alaboratory manual)(冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Ausubel，F.M.等编著、《分子生物学中的现代方法》(Current protocolsin Molecular Biology)(John Wiley和Sons，1995)；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.编著、《芽孢杆菌的分子生物学方法》(MolecularBiological Methods for Bacillus)(John wiley和Sons，1990)。
用于DNA操作的酶根据供应商的说明使用。
用于DNA操作的酶
除非另外提到，用于DNA操作的所有的酶，如限制性内切酶、连接酶等，均购自新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc)。
随机诱变文库的构建
进行定位随机诱变
合成诱变引物(寡核苷酸)，除了相应于待诱变的氨基酸密码子的核苷酸以外它还相应于待诱变的DNA序列部分。
然后，产生的诱变引物与合适的反向引物(opposite primer)被用于PCR反应。产生的PCR片段经纯化并消化后克隆到穿梭载体中。
如果需要的话，产生的PCR片段还作为引物与另一个合适的反向引物被用于另一个PCR反应，将被诱变的区域消化并克隆到穿梭载体中。PCR反应在正常的条件下进行。
蛋白酶解活性
在本发明的上下文中，蛋白酶解活性以Kilo Novo蛋白酶单位(KNPU)表示。该活性是相对于标准酶(SAVINASEO)测定的，测定是根据在标准条件下，即50℃，pH8.3，9分钟反应时间，3分钟检测时间，由蛋白酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液进行的。手册(folder)AF220/1可以向Novo Nordisk A/S，丹麦索取，该手册在此引入作为参考。
一个GU是一个甘氨酸单位，被定义为蛋白酶活性，即在标准条件下，经过15分钟40℃温育，以N-乙酰酪蛋白为底物，产生相当于1mmole甘氨酸的NH2-基的量。
酶活性还可以根据在“美国石油化学家学会杂志”(the Journal ofAmerican Oil Chemists Society)Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.，和Smith，L.A.，(1988)中描述的一个用琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对-硝基苯酚的反应，用PNA法进行测定。
发酵：
枯草杆菌酶的发酵是将含有100毫升BPX培养基的500毫升带挡板的Erlenmeyer摇瓶在30℃下，在旋转摇床上(300转/分)上培养5天。
为了得到如2升发酵液，20个Erlenmeyer摇瓶同时发酵。
具有增强的蛋白自身酶解稳定性的蛋白酶的测试分析：
含有蛋白酶的样品是通过将菌株(包括参考菌株)在微滴板上或在摇瓶中生长在合适的允许表达蛋白酶的培养基上得到的。
将每一个含蛋白酶的样品进行等分，向每一等份中加入1/10体积的2M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；pH10，将各等份分别在4℃和55℃温育3个小时。
温育后，蛋白酶活性用0.6克/升底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-对-硝基苯酚在下述缓冲液中进行测定：
150mM氯化钾，50mM硼酸钠；pH调至9.0。
将20微升样品和180微升底物在96孔微滴板上混合。
在405nm形成颜色在一个微量培养板读数仪中测定。
以Savinase_为标准测定活性。
样品的残余活性计算为55℃温育时等份的蛋白酶活性占4℃温育时等份的蛋白酶活性的百分比。
鉴定了表现出增强的残余活性的蛋白酶。
培养基：BPX：组成(每升)
        土豆淀粉                      100克
        大麦粉                        50克
     黄豆粉                   20克
     十二水合磷酸氢二钠       9克
     Pluronic                 0.1克
     酪蛋白酸钠               10克
培养基中的淀粉用α淀粉酶加以液化并在120℃加热灭菌45分钟。灭菌后培养基的pH通过加入0.1M的碳酸氢钠调至9。
实施例
为了产生根据本发明的酶变异体，采用与下面资料相同的材料和方法，如WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)，EP 130,756(Genentech)，EP479,870(Novo Nordisk A/S)，EP 214,435(Henkel)，WO 87/04461(Amgen)，WO 87/05050(Genex )，EP申请87303761(Genentech)，EP 260,105(Genencor)，WO 88/06624(Gist-Brocades NV)，WO 88/07578(Genentech)，WO 88/08028(Genex)，WO 88/08033(Amgen)，WO88/08164(Genex)，Thomas等，(1985)自然，318,375-376；Thomas等，(1987)分子生物学杂志，193，803-813；Russel和Fersht(1987)自然，328，496-500。本领域中建立的其它方法也可以采用。
实施例1
酶变异体的构建和表达
枯草杆菌酶309定点变异体是分别由Deng等，生物化学年报，200：81-88(1992)和Markvardsen等，生物技术，18(3)：371-372(1995)描述的“单一位点消除USE”或“尿嘧啶-单一位点消除”技术得到的。
模板质粒为pJS3，或其含有枯草杆菌酶309的变异体的类似物，例如“单一位点消除”诱变是在pJS3的类似物上进行的，该类似物含有编码Y167I+R170L变异体的基因，且用寡核苷酸指导构建A194P变异体，产生最终的Y167I+R170L+A194P枯草杆菌309变异体。
在pJS3中构建的枯草杆菌309变异体再利用限制性酶KpnI和MluI亚克隆至枯草芽孢杆菌pSX222表达载体中。
将此构建体转化到感受态枯草芽孢杆菌菌株以纯化在含10微克/毫升氯霉素(CAM)的培养基中按上述发酵的蛋白酶。
实施例二
酶变异体的纯化：
此步骤涉及2升发酵规模的枯草杆菌蛋白酶147酶、枯草杆菌蛋白酶309酶或其突变体的纯化。
大约1.6升发酵液在1升杯中经5000转/分钟离心35分钟。上清液用10％乙酸调pH至6.5并用Seitz(出处同前)S100过滤板过滤。
滤液用装有Amicon S1Y10 UF筒的Amicon CH2A UF设备浓缩至大约400毫升。UF浓缩液经离心和过滤后在pH7，室温下被吸附到杆菌肽亲和柱上。蛋白酶从杆菌肽柱上在室温下用25％2-丙醇和1M氯化钠在有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙(pH调至7)的缓冲液中被洗脱下来。
将从杆菌肽纯化步骤得到的具有蛋白酶活性的级分合并后上750毫升Sephadex G25柱(直径5厘米)，此柱已用pH调至6.5的含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡。
将从Sephadex G25柱得到的具有蛋白活性的级分合并后上150毫升CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径5厘米)，此柱用pH调至6.5的含有0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙的缓冲液平衡。
蛋白酶用0-0.1M线性梯度的氯化钠在2升相同的缓冲液(对枯草杆菌蛋白酶147采用0-0.2M氯化钠)中洗脱。
在最后纯化步骤中，将从CM Sepharose柱得到的含有蛋白酶的级分合并再用装有GR81PP膜的Amicon超滤杯(购自丹麦糖厂公司)进行浓缩。
通过使用实施例1的构建技术和上面的分离步骤，产生并分离了下面的枯草杆菌蛋白酶309变异体：
A：Y167I+R170L+A133P
B：Y167I+R170L+T134P
C：Y167I+R170L+A133P+T134P
D：Y167I+R170L+V104C+S132C
E：Y167I+R170L+A108C+T134C
F：Y167A+R170S+F189A
G：Y167A+R170S+Y192A
H：Y167A+R170S+Y192P
I：Y167A+R170S+Y192A+A194P
J：Y167A+R170S+Y192P+A194P
K：Y167A+R170S+F189G
L：Y167A+R170S+F189E
M：Y167A+R170S+F189R
N：Y167I+R170L
M：Y167I+R170L+A194P
O：Y167A+R170S+A194P
P：Y167A+R170L+A194P
Q：Y167A+R170N+A194P
R：V104C+S132C+Y167I+R170L
S：A108C+T134C+Y167I+R170L
实施例3
自身酶解切割位点的鉴定：
Savinase_变异体N：167I+R170L(按上述纯化后)的级分通过SDS-PAGE分析发现含有两个带，推测由自身酶解降解产生。两个带分别以12kDa和10kDa的迁移率(Mr′s)迁移。构成这两个带的肽的N-端氨基酸序列通过SDS-PAGE和电印迹转移到PVDF膜上测定。
发现以12kDa的迁移率迁移的带的N-端氨基酸序列为丙氨酸-谷氨酰氨-丝氨酸-缬氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-，与N：Y167I+R170L的N-端氨基酸序列相同。
发现以10kDa的迁移率迁移的带的N-端氨基酸序列为甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-，与N：Y167I+R170L的氨基酸残基187-195(在以BPN编号中为残基193和201)的氨基酸序列相同。这样鉴定了在N：Y167I+R170L中氨基酸残基186和187(以BPN编号为残基192和193)之间的肽键为自身酶解切割位点。
矩阵辅助激光解吸离子化飞行时间质谱法显示两个组分的质量分别为12,997.5kDa±13kDa和8,397.8kDa±8kDa。
含有N：Y167I+R170L中氨基酸残基187至269(在BPN编号中为残基193至275)的自身酶解片段的理论质量为8,397.3kDa，因此证实了没有其它的自身酶解切割发生在C末端至残基186。
利用较大片段的质量值(12,997.5kDa)，有可能推测出其它自身酶解切割发生在N：Y167I+R170L中的氨基酸残基130和131(以BPN编号为残基132和133)之间。含有N：Y167I+R170L中氨基酸残基1至130(以BPN编号为残基1至132)的自身酶解片段的理论质量为12,699.1kDa。
为了证实这些在N：Y167I+R170L中自身酶解切割位点的发现，将蛋白酶在37℃以2毫克/毫升的浓度在0.1M磷酸钠中温育，pH7.5温度。在从0分钟到6小时的不同的时间点，从温育混合液中取20微升样品，加入80微升1％TFA导致N：Y167I+R170L的蛋白酶活性的不可逆的抑制。样品置于冰箱中直到进行矩阵辅助激光解吸离子化飞行时间质谱法分析。
质谱法的结果清楚地显示出质量分别为12698.9kDa±13kDa和8396.1kDa±8kDa片段的数量稳定的增加，以及质量为26607.0kDa±26kDa的组分稳定的减少。N：Y167I+R170L的理论质量为26605.4kDa。
实施例4
随机蛋白酶变异体的构建
在蛋白自身酶解切割位点132-133的附近构建3个随机文库。在三个文库的每一个中，用BLS309变异体Y167I+R170L作为模板。
氨基酸1)129-131，2)132-133，3)134-135三个文库的构建根据上述材料与方法中的描述制备。
合成一个寡核苷酸，在待诱变的氨基酸密码子处，其第一个和第二个碱基是四种碱基中每一种碱基占25％。密码子的第三个核苷酸(摆动碱基)的合成采用50％G/50％C，为用一个或两个密码子改变氨基酸提供更大的可能性。
诱变引物和一个合适的反向引物被用于PCR反应，以质粒pJS3：(Y167I+R170L)为模板。产生的PCR片段被纯化并作为引物与另一个合适的反向引物用于另一个PCR反应。这个步骤的优点是能够将诱变的区域消化并克隆到pJS3穿梭载体中。
区域129-131、132-133、134-135的文库已被制备，每个文库含有10000到80000个克隆。
十个随机选择的克隆被测序以证实设计的突变。
实施例5
具有增强的蛋白自身酶解活性的蛋白酶变异体的鉴定
根据实施例4所述构建的文库中的克隆按上述方法测验蛋白自身酶解稳定性。
对每个文库500个独立的克隆在微滴板中含10微克/毫升氯霉素(CAM)的200微升LB培养基中37℃培养过夜。
以SAVINASE_变异体N：Y167I+R170L作为参照菌株，鉴定了两个具有相对增强的蛋白自身酶解稳定性的变异体，X：A133D+Y167I+R170L，Y：P129K+Y167I+R170L，和GG：P129K+P131H+Y167I+R170L。
这说明位于132-133之间蛋白自身酶解切割位点附近的替换(P129K，P131H，A133D)提供了增强的蛋白自身酶解稳定性。
实施例6
用具有增强的蛋白自身酶解稳定性的变异体进行比较性发酵实验
在发酵实验中SAVINASE_的变异体“M：Y167I+R170L+A194P”与其前体变异体相比较其前体变异体“N：Y167I+R170L”没有在192-193之间蛋白自身酶解切割位点附近的A194P的替换。
两个变异体都克隆在pSX222表达载体背景中，并按上述在含有10微克/毫升氯霉素的100毫升BPX培养基中发酵。
经过5天发酵，将1.5毫升BPX发酵培养基离心，上清液按上述进行蛋白酶活性测定。
含有“M：Y167I+R170L+A194P”变异体的发酵培养基与含有“N：Y167I+R170L”变异体的发酵培养基相比具有明显较高水平的蛋白酶活性。
现在相信两个变异体具有相同的比活性，所以现在认为含有“M：Y167I+R170L+A194P”变异体的发酵培养基的较高的蛋白酶活性水平是由于与没有A194P替换的“N：Y167I+R170L”前体变异体相比，“M：Y167I+R170L+A194P”变异体具有相对增强的蛋白自身酶解稳定性。
用变异体O：Y167A+R170S+A194P，P：Y167A+R170L+A194P和Q：Y167A+R170N+A194P与其相应的没有A194P突变的前体变异体相比，也得到了相似的结果。
另外，用变异体HH：A133P+Y167A+R170S与其相应的没有A133P突变的前体变异体相比也得到了相似的结果，显示出替换A133P提供增强的蛋白自身酶解活性。

Claims (32)

1.一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在残基132和133(以BASBPN编号)之间具有蛋白自身酶解切割位点的前体枯草杆菌酶，其还通过在位于相应于BLS309的残基129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN编号)位点的一个或多个残基的替换、插入或缺失进行改造；籍此该变异体与其前体枯草杆菌酶相比显示出增强的蛋白自身酶解稳定性。
2.一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在相应于BLS309的残基G159、S164、I165、Y167、R170、Y171(以BASBPN编号)位点上具有一个或多个残基的改造的前体枯草杆菌酶变异体，其还通过在相应于残基129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN编号)位点中一个或多个残基的替换、插入或缺失进行改造；籍此该变异体与其在任何所说的位点129-136上都没有改造的前体枯草杆菌酶变异体相比显示出增强的蛋白自身酶解稳定性。
3.一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在残基192和193(以BASBPN编号)之间具有蛋白自身酶解切割位点的前体枯草杆菌酶，其还通过在位于相应于残基189、190、191、192、193、196(以BASBPN编号)位点的一个或多个残基的替换、插入或缺失进行改造；籍此该变异体与其前体枯草杆菌酶相比显示出增强的蛋白自身酶解稳定性。
4.一种枯草杆菌酶变异体，其特征在于衍生自在位于相应于BLS309的残基P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171(以BASBPN编号)位点上具有一个或多个残基的改造的前体枯草杆菌酶变异体，其还通过在位于相应于BLS309的残基189、190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN编号)位点的一个或多个残基的替换、插入或缺失进行改造；籍此该变异体与其在任何所说的位点189-196上都没有改造的前体枯草杆菌酶变异体相比显示出增强的蛋白自身酶解稳定性。
5.根据权利要求1到4中任一项的枯草杆菌酶变异体，其中所说的前体枯草杆菌酶在两处进行改造：
i)在位于相应于BLS309残基129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN编号)位点上的一个或多个残基，以及
ii)在位于相应于BLS309的残基189、190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN编号)位点上的一个或多个残基。
6.权利要求1到5中任一项的变异体，其中前体枯草杆菌酶选自I-S1亚组。
7.权利要求6的变异体，其中前体枯草杆菌酶选自包括ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR，或者是其保留了I-S1亚组特征的功能性变异体的组。
8.权利要求1到5中任一项的变异体，其中前体枯草杆菌酶选自I-S2亚组。
9.权利要求8的变异体，其中前体枯草杆菌酶选自包括BLS147、BLS309、BAPB92和BYSYAB，或者是其保留了I-S2亚组特征的功能性变异体的组。
10.权利要求8的变异体，其中母体枯草杆菌酶为TVTHER或者是其保留了I-S2亚组特征的功能性变异体。
11.权利要求1到10中任一项的变异体，其中所说的替换与在至少一个其它位点的替换、插入或缺失相结合。
12.  权利要求11的变异体，其中所说的替换与任何一个或多个在位点36、222、218、76的替换、插入或缺失相结合。
13.权利要求1到12中任一项的变异体，其是下列任何一个的组合
T129V，T129I，T129L，T129M，T129F
A129V，A129I，A129L，A129M，A129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
K136V，K136I，K136L，K136M，K136F，
S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，
T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，
K170V，K170I，K170L，K170M，K170F，
Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，
T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，
A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，
Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，
Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，
Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G
Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
E136V，E136I，E136L，E136M，E136F，
G159V，G159I，G159L，G159M，G159F，
G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，
S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，
Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W，
Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G
Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
R170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170W
R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G
R170V，R170I，R170L，R170M，R170F，
与在任何一个下列位点129、130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN编号)的一个或多个改造相结合。
14.权利要求1到12中任一项的变异体，其是任何一个下列改造的组合
T129V，T129I，T129L，T129M，T129F
A129V，A129I，A129L，A129M，A129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
K136V，K136I，K136L，K136M，K136F，
S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，
T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，
K170V，K170I，K170L，K170M，K170F，
Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，
T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，
A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，
Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，
Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，
Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G
Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
E136V，E136I，E136L，E136M，E136F，
G159V，G159I，G159L，G159M，G159F，
G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，
S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，
Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W，
Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G
Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
R170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170W
R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G
R170V，R170I，R170L，R170M，R170F，
与在任何一个下列位点189、190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN编号)的一个或多个改造相结合。
15.权利要求1到12中任一项的变异体，是任何一个下列改造的组合
T129V，T129I，T129L，T129M，T129F
A129V，A129I，A129L，A129M，A129F
G131V，G131I，G131L，G131M，G131F
K136V，K136I，K136L，K136M，K136F，
S159V，S159I，S159L，S159M，S159F，
T164V，T164I，T164L，T164M，T164F，
K170V，K170I，K170L，K170M，K170F，
Q136V，Q136I，Q136L，Q136M，Q136F，
T159V，T159I，T159L，T159M，T159F，
A164V，A164I，A164L，A164M，A164F，
Y170V，Y170I，Y170L，Y170M，Y170F，
Y171A，Y171H，Y171N，Y171P，Y171C，Y171W，
Y171Q，Y171S，Y171T，Y171G
Y171V，Y171I，Y171L，Y171M，Y171F
E136V，E136I，E136L，E136M，E136F，
G159V，G159I，G159L，G159M，G159F，
G164V，G164I，G164L，G164M，G164F，
S164V，S164I，S164L，S164M，S164F，
Y167A，Y167H，Y167N，Y167P，Y167C，Y167W，
Y167Q，Y167S，Y167T，Y167G
Y167V，Y167I，Y167L，Y167M，Y167F
R170A，R170H，R170N，R170P，R170C，R170W
R170Q，R170S，R170T，R170Y，R170G
R170V，R170I，R170L，R170M，R170F；
与在任何一个下列位点的一个或多个改造相结合：
i)130、131、132、133、134、135、136(以BASBPN编号)以及
ii)190、191、192、193、194、195、196(以BASBPN编号)。
16.权利要求1到15中任一项的变异体，其中所说的变异体与在任何一个下列位点的进一步的替换、缺失和/或插入相结合：27、36、57、76、97、101、104、120、123、206、218、222、224、235和274。
17.权利要求16的变异体，其中所说的枯草杆菌酶属于I-S2亚组，所说的进一步的改变选自K27R、*36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
18.权利要求17的变异体，它包括任何一个变异体V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或N76D+V104A，或这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它组合，与在权利要求1到17的任何一个中提到的任何一个或多个替换、缺失和/插入相结合。
19.权利要求1到12中任一项的变异体，选自包括至少下列突变的变异体组：
A：Y167I+R170L+A133P
B：Y167I+R170L+T134P
C：Y167I+R170L+A133P+T134P
D：Y167I+R170L+V104C+S132C
E：Y167I+R170L+A108C+T134C
F：Y167A+R170S+F189A
G：Y167A+R170S+Y192A
H：Y167A+R170S+Y192P
I：Y167A+R170S+Y192A+A194P
J：Y167A+R170S+Y192P+A194P
K：Y167A+R170S+F189G
L：Y167A+R170S+F189E
M：Y167A+R170S+F189R
N：Y167I+R170L
M：Y167I+R170L+A194P
O：Y167A+R170S+A194P
P：Y167A+R170L+A194P
Q：Y167A+R170N+A194P
R：V104C+S132C+Y167I+R170L
S：A108C+T134C+Y167I+R170L
T：V104C+S132C+Y167A+R170S
U：V104C+S132C+Y167A+R170L
V：V104C+S132C+Y167A+R170N
X：A133D+Y167I+R170L
Y：P129K+Y167I+R170L
Z：A133P+Y167A+R170S+A194P
AA：T134P+Y167A+R170S+A194P
BB：A133P+T134P+Y167A+R170S+A194P
CC：A133P+Y167A+R170N+A194P
DD：T134P+Y167A+R170N+A194P
EE：A133P+T134P+Y167A+R170N+A194P
FF：A133P+Y167A+R170L
GG：P129K+P131H+Y167I+R170L
HH：A133P+Y167A+R170S
II：A133P+Y167A+R170N
JJ：Y167A+R170S+F189K
KK：V104C+T134C+Y167A+R170S
20.一种鉴定表现蛋白自身酶解稳定性的蛋白酶变异体的方法，其包括在至少一个或多个相应于BLS309的氨基酸P129、P131、E136、G159、S164、I165、Y167、R170、Y171的位点上(以BASBPN编号)诱变编码枯草杆菌酶或其前体酶或前原酶的DNA；方法是：
用该突变的DNA转化芽孢杆菌菌株；
选择产生这种蛋白酶变异体的菌株；
发酵/培养该菌株；
回收所述蛋白酶变异体，以及
检测提高的储存稳定性和/或在去污剂中的洗涤效果。
21.一种产生突变体枯草杆菌酶的方法，其包括根据权利要求20的步骤进行鉴定后生产具有需要的增强的蛋白自身酶解稳定性的突变体枯草杆菌酶。
22.一种编码权利要求1到19中任一项的枯草杆菌酶变异体的DNA序列。
23.一种含有权利要求22的DNA序列的载体。
24.一种用权利要求23的载体转化的微生物宿主细胞。
25.权利要求24的微生物宿主，它是一种细菌，优选地是芽孢杆菌，特别是迟缓芽孢杆菌。
26.权利要求24的微生物宿主，它是一种真菌或酵母，优选地是丝状真菌，特别是曲霉。
27.一种产生权利要求1到19中任一项的变异体的方法，其中权利要求24到26的任一项的宿主培养在有助于表达和分泌该变异体的条件下，并回收所述变异体。
28.一种含有根据权利要求1到19中任一项的枯草杆菌酶变异体的组合物。
29.根据权利要求28的组合物，它额外地含有纤维素酶、脂肪酶、角质酶、氧化还原酶、另一种蛋白酶，或淀粉酶。
30.根据权利要求28或29的组合物，其中的组合物是去污剂组合物。
31.根据权利要求1到19中任一项的枯草杆菌酶变异体或根据权利要求28到30中任一项的酶组合物在洗衣用去污剂和/或洗盘用去污剂中的用途。
32.权利要求1到12中任一项的变异体，其选自包括至少下列突变并与一个或两个A194P和/或A133P突变相结合的变异体组；
R170A
R170C
R170F
R170G
R170H
R170I
R170L
R170N
R170M
R170P
R170Q
R170S
R170T
R170V
R170Y
Y167A+R170A
Y167C+R170A
Y167F+R170A
Y167G+R170A
Y167H+R170A
Y167I+R170A
Y167L+R170A
Y167M+R170A
Y167N+R170A
Y167P+R170A
Y167Q+R170A
Y167S+R170A
Y167T+R170A
Y167V+R170A
Y167A+R170C
Y167C+R170C
Y167F+R170C
Y167G+R170C
Y167H+R170C
Y167I+R170C
Y167L+R170C
Y167M+R170C
Y167N+R170C
Y167P+R170C
Y167Q+R170C
Y167S+R170C
Y167T+R170C
Y167V+R170C
Y167A+R170F
Y167C+R170F
Y167F+R170F
Y167G+R170F
Y167H+R170F
Y167I+R170F
Y167L+R170F
Y167M+R170F
Y167N+R170F
Y167P+R170F
Y167Q+R170F
Y167S+R170F
Y167T+R170F
Y167V+R170F
Y167A+R170G
Y167C+R170G
Y167F+R170G
Y167G+R170G
Y167H+R170G
Y167I+R170G
Y167L+R170G
Y167M+R170G
Y167N+R170G
Y167P+R170G
Y167Q+R170G
Y167S+R170G
Y167T+R170G
Y167V+R170G
Y167A+R170H
Y167C+R170H
Y167F+R170H
Y167G+R170H
Y167H+R170H
Y167I+R170H
Y167L+R170H
Y167M+R170H
Y167N+R170H
Y167P+R170H
Y167Q+R170H
Y167S+R170H
Y167T+R170H
Y167V+R170H
Y167A+R170I
Y167C+R170I
Y167F+R170I
Y167G+R170I
Y167H+R170I
Y167I+R170I
Y167L+R170I
Y167M+R170I
Y167N+R170I
Y167P+R170I
Y167Q+R170I
Y167S+R170I
Y167T+R170I
Y167V+R170I
Y167A+R170L
Y167C+R170L
Y167F+R170L
Y167G+R170L
Y167H+R170L
Y167I+R170L
Y167L+R170L
Y167M+R170L
Y167N+R170L
Y167P+R170L
Y167Q+R170L
Y167S+R170L
Y167T+R170L
Y167V+R170L
Y167A+R170M
Y167C+R170M
Y167F+R170M
Y167G+R170M
Y167H+R170M
Y167I+R170M
Y167L+R170M
Y167M+R170M
Y167N+R170M
Y167P+R170M
Y167Q+R170M
Y167S+R170M
Y167T+R170M
Y167V+R170M
Y167A+R170N
Y167C+R170N
Y167F+R170N
Y167G+R170N
Y167H+R170N
Y167I+R170N
Y167L+R170N
Y167M+R170N
Y167N+R170N
Y167P+R170N
Y167Q+R170N
Y167S+R170N
Y167T+R170N
Y167V+R170N
Y167A+R170P
Y167C+R170P
Y167F+R170P
Y167G+R170P
Y167H+R170P
Y167I+R170P
Y167L+R170P
Y167M+R170P
Y167N+R170P
Y167P+R170P
Y167Q+R170P
Y167S+R170P
Y167T+R170P
Y167V+R170P
Y167A+R170Q
Y167C+R170Q
Y167F+R170Q
Y167G+R170Q
Y167H+R170Q
Y167I+R170Q
Y167L+R170Q
Y167M+R170Q
Y167N+R170Q
Y167P+R170Q
Y167Q+R170Q
Y167S+R170Q
Y167T+R170Q
Y167V+R170Q
Y167A+R170S
Y167C+R170S
Y167F+R170S
Y167G+R170S
Y167H+R170S
Y167I+R170S
Y167L+R170S
Y167M+R170S
Y167N+R170S
Y167P+R170S
Y167Q+R170S
Y167S+R170S
Y167T+R170S
Y167V+R170S
Y167A+R170T
Y167C+R170T
Y167F+R170T
Y167G+R170T
Y167H+R170T
Y167I+R170T
Y167L+R170T
Y167M+R170T
Y167N+R170T
Y167P+R170T
Y167Q+R170T
Y167S+R170T
Y167T+R170T
Y167V+R170T
Y167A+R170V
Y167C+R170V
Y167F+R170V
Y167G+R170V
Y167H+R170V
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