ES2631605T3 - Polipéptidos con actividad de lisozima y polinucleótidos que codifican los mismos - Google Patents

Polipéptidos con actividad de lisozima y polinucleótidos que codifican los mismos Download PDF

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Abstract

Polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia a los aminoácidos 20 a 176 de SEQ ID N.º: 6; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 5; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de astringencia altas o muy altas con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 5, o el complemento en toda su longitud del mismo; (d) una variante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 6, que comprende una sustitución, deleción, y/o inserción en una o más (por ejemplo; diferentes) posiciones, donde los polipéptidos diferen de no más de 17 aminoácidos de los aminoácidos 20 a 176 de SEQ ID N.º: 6; y (e) un fragmento del polipéptido de (a); (b), (c) o (d) que tiene actividad de lisozima.

Description

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DESCRIPCION
Polipeptidos con actividad de lisozima y polinucleotidos que codifican los mismos REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS
[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en forma legible por ordenador.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Campo de la invencion
[0002] La presente invencion se refiere a polipeptidos teniendo actividad de lisozima, dominios catalfticos, y polinucleotidos que codifican los polipeptidos y dominios cataKticos. La invencion tambien se refiere a constructos de acidos nucleicos, vectores, y celulas huesped comprendiendo los polinucleotidos al igual que metodos de produccion y utilizacion de los polipeptidos y dominios catalfticos.
Descripcion de las tecnicas relacionadas
[0003] Lisozima es una O-glicosil hidrolasa producida como un mecanismo defensivo contra las bacterias por muchos organismos. La enzima provoca la hidrolisis de paredes celulares bacterianas dividiendo los enlaces glicosfdicos de peptidoglicano; una molecula estructural importante en las bacterias. Despues de tener sus paredes celulares debilitadas por la accion de las lisozimas, las celulas bacterianas lisan como resultado de la presion osmotica.
[0004] La lisozima se produce en muchos organismos tales como virus, plantas, insectos, pajaros, reptiles y mairnferos. En mamnferos, la lisozima ha sido aislada de secreciones nasales, saliva, lagrimas, intestinos, orina y leche. La enzima divide el enlace glicosfdico entre numero 1 de carbono de acido N-acetilmuramico y numero 4 de carbono de N-acetil-D-glucosamina. In vivo, estos dos carbohidratos se polimerizan para formar el polisacarido de pared celular.
[0005] Hay un interes en aumento en el potencial de enzimas lisozimas como agentes antimicrobianos. Por ejemplo, la actividad de lisozima ha sido mostrada contra los patogenos tal como Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Enterococcus faecium, Bacillus stearothermophilus, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium, sporogenes Clostridium tyrobutyricum, y Listeria monocytogenes.
[0006] La lisozima ha sido clasificada en cinco diferentes familias de glicosido hidrolasa (GH) (CAZy,
www.cazi.org): lisozima de clara de huevo de gallina (GH22), lisozima de clara de huevo de oca (Gh23), lisozima de bacteriofago T4 (GH24), protema Sphingomonas flagelar (GH73) y lisozimas Chalaropsis (GH25). Lisozimas de las familias Gh23 y GH24 son principalmente conocidas de bacteriofagos y no han sido identificadas en hongos. Tambien se ha encontrado que la familia de lisozima GH25 no esta relacionada estructuralmente con las otras familias de lisozima. La estructura de una lisozima GH25 de Aspergillus fumigatus se ha proporcionado por Korczynska en Crystallographica section F, Strucural Biology and Crystallisation Communications, 2010, 66(9), 973-977 y Wohlkonig et al han publicado un artfculo en: "Structural Relationships in the Lysozyme Superfamily: Significant Evidence for Glycoside Hydrolase Signature Motifs", PLoS ONE, 5, (l1), el5388-e15388. El uso de lisozima ha sido sugerido en pienso para animales (vease por ejemplo WO 00/21381 y WO 04/026334), en la produccion de queso (vease por ejemplo WO 05/080559), conservation alimenticia (WO2009/102755 y Hughey y Johnson (1987) Appl Environ Microbiol 53:2165), detergentes (vease por ejemplo US 5,041,236 y EP 0425016), en el cuidado bucal (ver por ejemplo US 4,355,022, WO 04/017988 y WO 08/124764), cosmetologfa y dermatologfa, anticoncepcion, urologfa, y ginecologfa (vease por ejemplo WO 08/124764); y como agentes antimicrobianos (WO 2011/104339).
[0007] Una lisozima GH25 ha sido proporcionada de Chalaropsis (Felsch JW, Ingagami T, y Hash JH. (1975), "The N,O-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species; V The complete amino acid sequence, J. Biol. Chem. 250(10):3713-3720).
[0008] Lisozima de clara de huevo de gallina que es el producto primario disponible en el mercado comercial, no disocia N,6-O-diacetilmuramidasa en por ejemplo paredes celulares de Staphylococcus aureus y es incapaz asf de lisar este patogeno humano importante entre otros (Masschalck B, Deckers D, Michiels CW (2002), "Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozyme under atmospheric and high hydrostatic pressure", J Food Prot. 65(12):1916-23).
[0009] Se ha observado que lisozimas diferentes tienen especificidades diferentes hacia microorganismos diferentes. Es por lo tanto deseable tener diferentes lisozimas disponibles con el objetivo de poder
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seleccionar enzimas adecuadas para cada aplicacion particular. Polipeptidos nuevos que tienen actividad de lisozima son por lo tanto deseados.
RESUMEN DE LA INVENCION
[0010] La presente invencion esta relacionada con polipeptidos fungicos aislados de las familias GH23 o GH24 y teniendo actividad de lisozima.
[0011] La presente invencion se refiere ademas a polipeptidos aislados que tienen actividad de lisozima seleccionada del grupo que consiste en: (a) un polipeptido con al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% identidad de secuencia a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6; (b) un polipeptido codificado por un polinucleotido con al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5; (c) un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida bajo condiciones de astringencia altas o muy altas con la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5, o el complemento de longitud completa del mismo; (d) una variante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6, que comprende una sustitucion, delecion, y/o insercion en una o mas (por ejemplo; diferentes) posiciones, donde los polipeptidos diferen de no mas de 17 aminoacidos de los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6; y (e) un fragmento del polipeptido de (a); (b), (c) o (d) que tiene actividad de lisozima.
[0012] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos de la presente invencion; constructos de acidos nucleicos; vectores de expresion recombinantes; celulas huesped recombinantes comprendiendo los polinucleotidos; y metodos de produccion de los polipeptidos.
[0013] La presente invencion tambien se refiere a los polipeptidos en la invencion que tienen actividad antimicrobiana y metodos de uso de los polipeptidos en la invencion como inhibidores de formacion de biopelfculas, en composiciones detergentes, en pienso para animales y para la extraccion de ADN genomico bacteriano.
Vision general del listado de secuencias
[0014] SEQ ID N.°: 1 es la secuencia de ADN del gen P8EH GH23 aislado de Aspergillus aculeatus CBS 172.66. SEQ ID N.°: 2 es la secuencia de aminoacidos deducida de SEQ ID N.°: 1. SEQ ID N.°: 3 es la secuencia de ADN del gen P242MS GH24 aislado de Acremonium alkalophilum CBS114.92. SEQ ID N.°: 4 es la secuencia de aminoacidos deducida de SEQ ID N.°: 3. SEQ ID N.°: 5 es la secuencia de ADN del gen P244A7 GH24 aislado de Acremonium alkalophilum CBS114.92. SEQ ID N.°: 6 es la secuencia de aminoacidos deducida de SEQ ID N.°: 5. SEQ ID N.°: 7 es la secuencia de ADN del gen P242M9 GH25 aislado de Acremonium alkalophilum CBS114.92. SEQ ID N.°: 8 es la secuencia de aminoacidos deducida de SEQ ID N.°: 7. SEQ ID N.°: 9 es el cebador sentido F-P8EH. SEQ ID N.°: 10 es el cebador antisentido R- P8EH. SEQ ID N.°: 11 es el cebador sentido F-P242MS. SEQ ID N.°: 12 es el cebador antisentido R- P242MS. SEQ ID N.°: 13 es el cebador sentido F-P244A7. SEQ ID N.°: 14 es el cebador antisentido R- P244A7.
Breve descripcion de las figuras
[0015] La Figura 1 muestra ensayos de difusion radial de lisozima GH24 de Acremonium alcalophilum (EXP03890, SEQ ID N.°: 6), lisozima GH25 de Acremonium alcalophilum (EXP03864, SEQ ID N.°: 8) y una lisozima de referencia de Aspergillus fumigatus GH25 en S. carnosus y E.coli.
DEFINICIONES
[0016] Lisozima: el termino actividad de "lisozima" se define aqu como una O-glicosil hidrolasa, que cataliza la hidrolisis del enlace glicosfdico entre dos o mas carbohidratos, o entre un carbohidrato y una fraccion sin carbohidratos. Las lisozimas disocian el enlace glicosfdico entre ciertos residuos en mucopolisacaridos y mucopeptidos de paredes celulares bacterianas, tal como 1,4-beta-enlaces entre acido N-acetilmuramico y residuos de N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano y entre residuos de N-acetil-D-glucosamina en citodextrinas, dando como resultado bacteriolisis. La lisozima pertenece a la clase enzimatica EC 3.2.1.17. Para los fines de la presente invencion, actividad de lisozima se determina segun el ensayo de turbidez descrito en ejemplo 5. En un aspecto, los polipeptidos de la presente invencion tienen al menos 20%, por ejemplo, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 100% de la actividad de lisozima del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6.
[0017] Variante alelica: el termino "variante alelica" significa cualquiera de dos o mas formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosomico. Variacion alelica surge naturalmente a traves de mutacion, y
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puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones geneticas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipeptido codificado) o puede codificar polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos alteradas. Una variante alelica de un polipeptido es un polipeptido codificado por una variante alelica de un gen.
[0018] Actividad antimicrobiana: el termino "actividad antimicrobiana" se define aqu como una actividad que mata o inhibe el crecimiento de microorganismos, tal como, algas, arquea, bacterias, hongos y/o protozoos. La actividad antimicrobiana puede por ejemplo ser bactericida significando la matanza de bacterias o bacteriostatica significando la prevention del crecimiento bacteriano. La actividad antimicrobiana puede incluir catalizando la hidrolisis de 1,4-beta-enlaces entre acido N-acetilmuramico y residuos de N- acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano y entre residuos de N-acetil-D-glucosamina en quitodextrinas. Actividad antimicrobiana puede tambien incluir la lisozima que se une a la superficie del microorganismo e que inhibe su crecimiento. El efecto antimicrobiano puede tambien incluir el uso de las lisozimas de la presente invencion para activacion de autolisinas bacterianas, como un inmunoestimulador, inhibiendo o reduciendo las toxinas bacterianas y por un efecto de opsonina. Para fines de la presente invention, la actividad antimicrobiana se determina segun el ensayo de difusion radial descrito en ejemplo 4.
[0019] Propiedad alterada/modificada: el termino "propiedad alterada/modificada" se define aqu como una caracteristica asociada a una variante que esta alterada o modificada, como comparado relativamente a la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada. La propiedad alterada o modificada puede ser una caracteristica asociada a una variante que es mejorada, a menos que se declare de otro modo, con respecto a otra lisozima de referencia o la lisozima progenitora. Ejemplos de propiedades que se pueden alterar/modificar o mejorar son dados a continuation.
[0020] Termoestabilidad: el termino "termoestabilidad" se refiere a la actividad de lisozima despues de un periodo de incubation a temperatura elevada relativa al progenitor o una secuencia de referencia identificada, bien en un tampon o bajo condiciones tales como las que existen durante el almacenamiento/transporte de producto o condiciones similares a aquellas que existen durante el uso industrial de la variante. Una variante puede o no puede mostrar un perfil de actividad termica alterada con respecto al progenitor. En un aspecto, la termoestabilidad de la variante con actividad de lisozima es al menos 1,0 veces, por ejemplo, al menos 1,1 veces, al menos 1,5 veces, al menos 1,8 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, y al menos 25 veces mas termoestable que la secuencia progenitora o de referencia en la temperatura seleccionada. Preferiblemente la actividad es evaluada utilizando el ensayo de actividad de turbidez de lisozima descrito en la section "Materiales y metodos".
[0021] Perfil de temperatura/Estabilidad de temperatura: el termino "perfil de temperatura/estabilidad de temperatura" se refiere la enzima variante que muestra un perfil de temperatura modificado en comparacion con la secuencia progenitora o de referencia identificada, donde el perfil de temperatura se determina como actividad de lisozima en funcion de la temperatura. La actividad a cada temperatura es preferiblemente indicada como actividad relativa (en %) normalizada al valor en la temperatura optima. La temperatura optima es aquella temperatura en las temperaturas evaluadas (es decir aquellas con saltos de 5-10°C ) donde la actividad es maxima.
[0022] Estabilidad de pH: el termino "estabilidad de pH" se refiere a la enzima variante que presenta estabilidad estructural relativa a la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada, despues de un periodo de incubacion a un pH que esta fuera del rango de pH donde la enzima es activa (rango de actividad de pH). Tal variante puede o no puede mostrar un perfil de actividad de pH alterado con respecto al progenitor. Por ejemplo, la variante no puede ser activa en el pH aumentado o disminuido, pero es capaz de mantener su estructura tridimensional y luego recuperar la actividad una vez que vuelve al campo de actividad de pH. Alternativamente, la variante puede tener una capacidad mejorada de repliegue con respecto al progenitor despues de la incubacion a pH aumentado o disminuido.
[0023] En un aspecto, el perfil de estabilidad de pH es alterado de manera que una variante de lisozima tiene estabilidad mejorada a pH acido. Como se utiliza en este caso, pH acido significa de pH 2 a 5,5, preferiblemente de 2,5 a 5,25, mas preferiblemente de 3 a 5, aun mas preferiblemente de 3,5 a 4. Preferiblemente, la lisozima variante mantiene al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, 60%, 70% o 80%, mas preferiblemente al menos 90%, aun mas preferiblemente al menos 95% de actividad residual tras la incubacion a un pH dado durante 1 hora cuando se compara con la variante que ha sido mantenida a pH 6,5 durante el mismo tiempo. Preferiblemente, la actividad residual de la lisozima variante es al menos 1,1 veces, al menos 1,3 veces, al menos 1,5 veces, preferiblemente al menos 2 veces, mas preferiblemente al menos 5 veces, de la forma mas preferible al menos 7 veces, e incluso de la forma mas preferible al menos 10 veces superior a la actividad residual de la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada que ha sido tratada bajo las mismas condiciones. Preferiblemente, la actividad es evaluada utilizando el ensayo de actividad de turbidez de lisozima descrito en la seccion "Materiales y Metodos".
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[0024] Perfil de actividad de pH: el termino "perfil de actividad de pH" se define aqu como una lisozima variante que presenta una alteracion del perfil de actividad dependiente del pH cuando se compara al perfil de actividad de pH de la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada. El perfil de actividad de pH proporciona una medida de la eficiencia de la enzima para prevenir el crecimiento microbiano, eliminar celulas microbianas y/o realizar la catalisis de una reaccion de hidrolisis sobre un rango de pH a condiciones dadas tal como temperatura y composicion de solvente. Una lisozima tiene un rango de pH especfico donde el polipeptido es estable y retiene su actividad enzimatica, fuera de este rango la lisozima se vuelve menos activa y potencialmente tambien menos estable. En el rango de pH allf hay generalmente un pH optimo, donde la lisozima muestra la actividad mas alta.
[0025] Una variante de lisozima con actividad mejorada a pH alcalino (por ejemplo de pH 7,5 a 12, preferiblemente de 8 a 11, mas preferiblemente de 8,5 a 10, aun mas preferiblemente de 9 a 9,5) sera capaz de funcionar en ambientes mas alcalinos tales como detergentes.
[0026] Una variante con actividad mejorada a pH acido (por ejemplo de pH 2 a 6,5, preferiblemente de 2,5 a 6, mas preferiblemente de 3 a 5,5, aun mas preferiblemente de 3,5 a 5) sera capaz de funcionar bajo condiciones mas acidas, tal como conservante en ciertos alimentos o como una molecula eubiotica en piensos.
[0027] En un aspecto, el perfil de actividad de pH es alterado de manera que una variante de lisozima tiene actividad mejorada a un pH mas alcalino. Preferiblemente, la actividad de la variante de lisozima a un pH al menos 0,5 unidades mayor, preferiblemente al menos 1,0 unidades de pH mayor, mas preferiblemente al menos 1,5 unidades de pH mayor, aun mas preferiblemente al menos 2,0 unidades de pH mayor es al menos 1,1 veces, preferiblemente al menos 1,5 veces, mas preferiblemente al menos 2 veces, aun mas preferiblemente al menos 5 veces y de la forma mas preferible al menos 10 veces superior que los de la enzima progenitora o una secuencia de referencia identificada. Preferiblemente, la variante de lisozima al mismo tiempo mantiene al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, 60%, 70% o 80%, o 90%, mas preferiblemente al menos 95%, aun mas preferiblemente al menos 100% de la actividad que presenta la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada a su pH optimo. Preferiblemente, la actividad es evaluada utilizando el ensayo de actividad de turbidez de lisozima descrito en la seccion de "Materiales y Metodos".
[0028] En otro aspecto, el perfil de actividad de pH es alterado de manera que una variante de lisozima tiene actividad mejorada a un pH mas acido. Preferiblemente, la actividad de la variante de lisozima a un pH al menos 0,5 unidades mas bajo, preferiblemente al menos 1,0 unidades de pH mas bajo, mas preferiblemente al menos 1,5 unidades de pH mas bajo, aun mas preferiblemente al menos 2,0 unidades de pH mas bajo es al menos 1,1 veces, preferiblemente al menos 1,5 veces, mas preferiblemente al menos 2 veces, aun mas preferiblemente al menos 5 veces y de la forma mas preferible al menos 10 veces superior que los de la enzima progenitora o una secuencia de referencia identificada. Preferiblemente, la variante de lisozima al mismo tiempo mantiene al menos 40%, preferiblemente al menos 50%, 60%, 70% o 80%, o 90%, mas preferiblemente al menos 95%, aun mas preferiblemente al menos 100% de la actividad que presenta la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada a su pH optimo. Preferiblemente, la actividad es evaluada utilizando el ensayo de actividad de turbidez de lisozima descrito en la seccion "Materiales y Metodos".
[0029] Susceptibilidad de glicacion: la glicacion no enzimatica es un proceso postraduccional espontaneo donde azucares reductores se enlazan de manera covalente a grupos amino libres en protemas principalmente en los residuos de lisina (K). La glicacion puede impactar la actividad de la lisozima. Conforme a la presente invencion, la susceptibilidad de la lisozima para glicacion no enzimatica se puede reducir por cambios aminoacidos espedficos.
[0030] Propiedades mejoradas tambien pueden incluir propiedades termicas, tal como estabilidad de granulacion, estabilidad de vapor, perfil de actividad de temperatura mas amplio. Ademas propiedades mejoradas pueden incluir sensibilidad de proteasa, y/o modelo de glicosilacion. Mejoras son preferiblemente evaluadas en relacion a las condiciones de aplicacion deseadas.
[0031] Dominio catalitico: el termino "dominio catalftico" significa la region de una enzima que contiene la maquinaria catalftica de la enzima.
[0032] ADNc: el termino "ADNc" significa una molecula de ADN que se puede preparar por transcripcion inversa a partir de una molecula de ARNm, madura, empalmada, obtenida a partir de una celula eucariotica o procariotica. ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genomico correspondiente. El transcrito inicial primario de ARN es un precursor para ARNm que se procesa a traves de una serie de pasos, incluyendo empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
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[0033] Secuencia codificante: el termino "secuencia codificante" significa un polinucleotido, que especifica directamente la secuencia de aminoacidos de un polipeptido. Los Kmites de la secuencia codificante se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codon iniciador tal como, ATG, GTG, o TTG y termina con un codon terminador tal como, TAA, TAG, o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genomico, ADNc, ADN sintetico, o una combinacion de los mismos.
[0034] Secuencias de control: el termino "secuencias de control" significa secuencias de acido nucleico necesarias para expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro de la presente invencion. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, desde el mismo gen) o foranea (es decir, a partir de un gen diferente) al polinucleotido que codifica el polipeptido o nativos o foraneos entre sn Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, una secuencia lfder, secuencia de poliadenilacion, secuencia de propeptido, promotor, secuencia de peptido senal, y terminador de la transcripcion. Como mmimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y senales de parada transcripcional y traduccional. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el proposito de introducir sitios de restriccion especficos facilitando el ligamiento de las secuencias de control con la region codificante del polinucleotido que codifica un polipeptido.
[0035] Expresion: el termino "expresion" incluye cualquier paso implicado en la produccion de un polipeptido incluyendo, pero no limitado a, transcripcion, modificacion postranscripcional, traduccion, modificacion postraduccional, y secrecion.
[0036] Vector de expresion: el termino "vector de expresion" significa una molecula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido y esta operativamente enlazada a secuencias de control que proveen su expresion.
[0037] Fragmento: el termino "fragmento" significa un polipeptido o un dominio catalftico con uno o mas (por ejemplo; varios) aminoacidos ausentes del termino amino y/o carboxilo terminal de un polipeptido maduro o dominio; donde el fragmento tiene actividad de lisozima. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 150 residuos de aminoacidos (por ejemplo, aminoacidos 24 a 173 de SEQ ID N.°: 6).
[0038] Celula huesped: el termino "celula huesped" significa cualquier tipo de celula que es susceptible de transformacion, transfeccion, transduccion, o similar con un constructo de acidos nucleicos o vector de expresion que comprende un polinucleotido de la presente invencion. El termino "celula huesped" abarca cualquier progenie de una celula madre que no es identica a la celula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicacion.
[0039] Aislado: el termino "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no se produce en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se produce de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluye, pero no se limita a, cualquier enzima, variante, acido nucleico, protema, peptido o cofactor, que es al menos parcialmente eliminado de uno o mas o todos los constituyentes de origen natural con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a esta sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (por ejemplo, copias multiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor mas fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica de la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentacion.
[0040] Polipeptido maduro: el termino "polipeptido maduro" significa un polipeptido en su forma final despues de la traduccion y cualquier modificacion postraduccional, tal como tratamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilacion, fosforilacion, etc. En un aspecto, el polipeptido maduro es aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 basado en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoacidos 1 a 19 de SEQ ID N.°: 6 son peptidos senal. Se conoce en la tecnica que una celula huesped puede producir una mezcla de dos o mas polipeptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoacido diferente C-terminal y/o N-terminal) expresado por el mismo polinucleotido.
[0041] Secuencia codificante del polipeptido maduro: el termino "Secuencia codificante del polipeptido maduro" significa un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro teniendo actividad de lisozima. En un aspecto, la secuencia codificante del polipeptido maduro es la secuencia unida de nucleotidos 58 a 133, nucleotidos 215 a 345 y nucleotidos 516 a 779 de SEQ ID N.°: 5 basado en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice nucleotidos. los nucleotidos 1 a 57 de la SEQ ID N.°: 5 codifican peptidos senal.
[0042] Constructo de acidos nucleicos: el termino "Constructo de acidos nucleicos" significa una molecula de acido nucleico, bien mono o bicatenaria, que es aislada de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de acidos nucleicos en cierto modo que de otro modo no existirian en la naturaleza o que es sintetico, que comprende una o mas secuencias de control.
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[0043] Operativamente enlazado: el termino "operativamente enlazado" significa una configuracion en la que una secuencia de control se coloca a una posicion apropiada relativa a la secuencia de codificacion de un polinucleotido de modo que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia codificante.
[0044] Identidad de secuencias: la relacion entre dos secuencias de aminoacido o entre dos secuencias de nucleotidos es descrita por el parametro "identidad de secuencias".
[0045] Para fines de la presente invencion, la identidad de secuencias entre dos secuencias de aminoacidos es determinada utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente version 5.0.0 o posterior. Los parametros usados son penalizacion por apertura de gap de 10, penalizacion por extension de gap de 0.5, y la matriz de sustiticuion EBLOSUM62 (version de EMbOsS de BLOSUM62). El resultado de Needle marcado "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief ) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Resiudos identicos x 100)/(Longitud de alineamiento - Numero total de Gaps en Alineamiento)
[0046] Para fines de la presente invencion, la identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleotidas es determinada utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se implementa en el programa de Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente version 5.0.0 o posterior. Los parametros usados son penalizacion por apertura de gap de 10, penalizacion por extension de gap de 0.5, y la matriz de sustitucion EDNAFULL (version de EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de Needle etiquetado "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleotidos identicos x 100)/(Longitud de alineamiento - Numero total de Gaps en Alineamiento)
[0047] Condiciones de astringencia: las condiciones de astringencia diferentes son definidas de la siguiente manera.
[0048] El termino "condiciones de astringencia muy baja" significa sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SsPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 25% de formamida, despues de procedimientos de Southern blot estandares durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 45°C.
[0049] El termino "condiciones de astringencia baja" significa sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 25% de formamida, despues de procedimientos de transferencia de Southern estandares durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 50°C.
[0050] El termino "condiciones de astringencia media" significa sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 35% de formamida, despues de procedimientos de Southern blot estandares durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 55°C.
[0051] El termino "condiciones de astringencia media-alta" para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 35% de formamida, despues de procedimientos de Southern blot estandares durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 60°C.
[0052] El termino "condiciones de astringencia alta" significa sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 50% formamida, despues de procedimientos de Southern blot estandares durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2% SDS a 65°C.
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[0053] El termino "condiciones de astringencia muy alta" significa sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 50% de formamida, despues de procedimientos de Southern blot estandares durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces cada uno durante 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2% SDS a 70°C.
[0054] Subsecuencia: el termino "subsecuencia" significa un polinucleotido que tiene uno o mas (por ejemplo; varios) nucleotidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipeptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de lisozima. En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos 450 nucleotidos (por ejemplo, la secuencia de conexion de nucleotidos 70 a 133, nucleotidos 215 a 345 y nucleotidos 516 a 770 de SeQ ID N.°: 5).
[0055] Polinucleotido sustancialmente puro: el termino "Polinucleotido sustancialmente puro" significa una preparacion de polinucleotido libre de otros nucleotidos extranos o no deseados y en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de produccion de polipeptidos geneticamente modificados. Asf, un polinucleotido sustancialmente puro contiene como mucho 10%, como mucho 8%, como mucho 6%, como mucho 5%, como mucho 4%, como mucho 3%, como mucho 2%, como mucho 1%, y como mucho 0,5% en peso de otro material de polinucleotido con el cual se asocia originalmente o recombinantemente. Un polinucleotido sustancialmente puro puede, sin embargo, incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como promotores y terminadores. Preferiblemente, el polinucleotido es al menos 90% puro, por ejemplo, al menos 92% puro, al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99% puro, y al menos 99,5% puro en peso. Los polinucleotidos de la presente invencion estan preferiblemente en una forma sustancialmente pura.
[0056] Polipeptido sustancialmente puro: el termino "polipeptido sustancialmente puro" significa una preparacion que contiene como mucho 10%, como mucho 8%, como mucho 6%, como mucho 5%, como mucho 4%, como mucho 3%, como mucho 2%, como mucho 1%, y como mucho 0,5% en peso de otro material de polipeptido con el cual se asocia originalmente o recombinantemente. Preferiblemente, el polipeptido es al menos 92% puro, por ejemplo, al menos 94% puro, al menos 95% puro, al menos 96% puro, al menos 97% puro, al menos 98% puro, al menos 99%, al menos 99,5% puro, y 100% en peso puro del material de polipeptido total presente en la preparacion. Los polipeptidos de la presente invencion estan preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Esto puede ser realizado, por ejemplo, preparando el polipeptido por metodos recombinantes bien conocidos o por metodos de purificacion tradicionales.
[0057] Variante: el termino "variante" significa un polipeptido con actividad de lisozima que incluye una alteracion, es decir, una sustitucion, insercion, y/o delecion, de uno o mas (varios) residuos de aminoacidos en una o mas (por ejemplo; varias) posiciones. Una sustitucion significa sustitucion del aminoacido que ocupa una posicion con un aminoacido diferente; una delecion significa la eliminacion del aminoacido que ocupa una posicion; y una insercion significa la adicion de 1, 2, o 3 aminoacidos adyacentes a e inmediatamente despues del aminoacido que ocupa la posicion. Una variante segun la invencion puede comprender de 1 a 5; de 1 a 10; de 1 a 15; es decir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 alteraciones.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Polipeptidos que tienen actividad de lisozima
[0058] En una forma de realization, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 90% que tienen actividad de lisozima.
[0059] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 91% que tienen actividad de lisozima.
[0060] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 92% que tienen actividad de lisozima.
[0061] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 93% que tienen actividad de lisozima.
[0062] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 94% que tienen actividad de lisozima.
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[0063] En una forma de realization, la presente invention se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencia a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 95% que tienen actividad de lisozima.
[0064] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencia a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 96% que tienen actividad de lisozima.
[0065] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 97% que tienen actividad de lisozima.
[0066] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 98% que tienen actividad de lisozima.
[0067] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencias a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 de al menos 99% que tienen actividad de lisozima.
[0068] En un aspecto, los polipeptidos diferen de no mas de 17 aminoacidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 o 16, de los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6.
[0069] Un polipeptido de la presente invencion preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID N.°: 6 o una variante alelica del mismo; o es un fragmento del mismo que tiene actividad de lisozima. En otro aspecto, el polipeptido comprende o consiste en los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6. En otro aspecto, el polipeptido comprende o consiste en los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6.
[0070] En otra forma de realizacion, la presente invencion se refiere a un polipeptido aislado teniendo actividad de lisozima codificada por un polinucleotido que se hibrida bajo condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media alta, condiciones de astringencia alta, o condiciones de astringencia muy alta con la secuencia codificante del polipeptido maduro de (i) SEQ ID N.°: 5, (ii) la secuencia de ADNc de la misma, o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edition, Cold Spring Harbor, New York).
[0071] El polinucleotido de SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5 o una subsecuencia de la misma, al igual que el polipeptido de SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 4 o SEQ ID N.°: 6 o un fragmento de la misma, se pueden utilizar para disenar sondas de acido nucleico para identificar y clonar polipeptidos codificantes de ADN que tienen actividad de lisozima de cepas de diferentes generos o especies segun metodos bien conocidos en la tecnica. En particular, tales sondas se pueden usar para hibridacion con el ADN genomico o ADNc de una celula de interes, despues de procedimientos de Southern blot estandares, para identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente mas cortas que la secuencia entera, pero deberian ser al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35, o al menos 70 nucleotidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de acidos nucleicos es al menos 100 nucleotidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleotidos, al menos 300 nucleotidos, al menos 400 nucleotidos, al menos 500 nucleotidos, al menos 600 nucleotidos, al menos 700 nucleotidos, al menos 800 nucleotidos, o al menos 900 nucleotidos de longitud. Tanto sondas de ADN como de ARN pueden usarse. Las sondas son tfpicamente marcadas para la detection del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina). Tales sondas estan comprendidas por la presente invencion.
[0072] Una biblioteca de ADN genomico o de ADNc obtenida a partir de tales otras cepas se pueden seleccionar para ADN que se hibrida con las sondas anteriormente descritas y codifica un polipeptido con actividad de lisozima. ADN genomico u otro de tales otras cepas se pueden separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras tecnicas de separation. ADN de las bibliotecas o el ADN separado se pueden transferir e inmovilizar en la nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que se hibrida con SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 3 o SEQ ID N.°: 5 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en un Southern blot.
[0073] Para fines de la presente invencion, hibridacion indica que el polinucleotido se hibrida a una sonda de acidos nucleicos marcada que corresponde con (i) SEQ ID N.°: 5; (ii) la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5; (iii) la secuencia de ADNc de la misma (iv) el complemento en toda la longitud de la misma; o (v) una subsecuencia de la misma; bajo condiciones de astringencia alta a muy alta. Las moleculas a las que la sonda de acidos nucleicos se hibrida bajo estas condiciones se pueden detectar usando, por ejemplo, pelfcula radiografica o cualquiera de los otros medios de deteccion conocidos en la tecnica.
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[0074] En un aspecto, la sonda de acidos nucleicos es nucleotidos 58 a 133, nucleotidos 215 a 345 o nucleotidos 516 a 779 de SEQ ID N.°: 5. En otro aspecto, la sonda de acidos nucleicos es un polinucleotido que codifica el polipeptido de SEQ ID N.°: 6; el polipeptido maduro de la misma; o un fragmento de la misma. En otro aspecto, la sonda de acidos nucleicos es SEQ ID N.°: 5 o la secuencia de ADNc de la misma.
[0075] En otra forma de realizacion, la presente invencion se refiere a un polipeptido aislado que tiene actividad de lisozima codificada por un polinucleotido con una identidad de secuencias a la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5 o la secuencia de ADNc del mismo de al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o 100%.
[0076] En una forma de realizacion adicional, la presente invencion se refiere a variantes de los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 que comprenden una sustitucion, delecion, y/o insercion en una o mas (por ejemplo; varias) posiciones. En una forma de realizacion, el numero de sustituciones de aminoacidos, deleciones y/o inserciones introducidas en los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6 no es mas de 17, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 o 16.
[0077] Los cambios de aminoacidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir sustituciones o inserciones conservadoras de aminoacidos que no afectan significativamente al doblamiento y/o actividad de la protema; deleciones pequenas, tfpicamente de 1-30 aminoacidos; pequenas extensiones amino o carboxilo terminales, tal como un residuo de metionina aminoterminal; un peptido de enlazador pequeno de hasta 2025 residuos; o una extension pequena que facilita la purificacion cambiando la carga neta u otra funcion, tal como un tracto de polihistidina, un epftopo antigenico o un dominio de union.
[0078] Ejemplos de sustituciones conservadoras estan en los grupos de aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina), aminoacidos acidos (acido glutamico y acido aspartico), aminoacidos polares (glutamina y asparagina), aminoacidos hidrofobicos (leucina, isoleucina y valina), aminoacidos aromaticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), y aminoacidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Sustituciones de aminoacidos que generalmente no alteran la actividad espedfica se conocen en la tecnica y estan descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly.
[0079] Alternativamente, los cambios aminoacidos son de tal naturaleza que las propiedades ffsicoqdmicas de los polipeptidos son alteradas. Por ejemplo, cambios aminoacidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipeptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH optimo, y similares.
[0080] Aminoacidos esenciales en un polipeptido se pueden identificar segun procedimientos conocidos en la tecnica, tal como mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis de escaneado de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la tecnica anterior, mutaciones de alanina unicas se introducen en cada residuo en la molecula, y las moleculas mutantes resultantes se evaluan para actividad de lisozima para identificar residuos de aminoacidos que son criticos para la actividad de la molecula. Vease tambien, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interaccion biologica puede tambien ser determinado por analisis ffsico de estructura, como se determina por tales tecnicas como resonancia magnetica nuclear, cristalograffa, difraccion electronica, o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutacion de aminoacidos de sitio de contacto putativo. Vease, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoacidos esenciales tambien pueden ser inferida de un alineamiento con un polipeptido relacionado.
[0081] Sustituciones de aminoacidos unicas o multiples, deleciones, y/o inserciones pueden ser hechas y evaluadas usando metodos conocidos de mutagenesis, recombinacion, y/o redistribucion, seguido de un procedimiento de seleccion pertinente, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros metodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentacion en el fago (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente estadounidense n° 5,223,409; WO 92/06204), y mutagenesis dirigida a la region (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0082] Metodos de mutagenesis/redistribucion se pueden combinar con alto rendimiento, metodos de seleccion automatizados para detectar actividad de polipeptidos clonados, mutagenizados expresados por celulas huesped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moleculas de ADN mutagenizadas que codifican polipeptidos activos se pueden recuperar de las celulas huesped y secuenciar rapidamente usando metodos estandar en la tecnica. Estos metodos permiten la determinacion rapida de la importancia de residuos de aminoacidos individuales en un polipeptido.
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[0083] El polipeptido puede ser un polipeptido hforido donde una region de un polipeptido se fusiona en el N- termino o el C-termino de una region de otro polipeptido.
[0084] El polipeptido puede ser un polipeptido de fusion o polipeptido de fusion escindible donde otro polipeptido se fusiona en el N-termino o el C-termino del polipeptido de la presente invencion. Un polipeptido de fusion se produce por la fusion de un polinucleotido que codifica otro polipeptido a un polinucleotido de la presente invencion. Tecnicas para producir polipeptidos de fusion se conocen en la tecnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipeptidos de modo que estas estan en marco y que la expresion del polipeptido de fusion esta bajo control del mismo promotor(es) y terminador. Polipeptidos de fusion tambien se pueden construir usando tecnologfa de interna donde los polipeptidos de fusion se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776779).
[0085] Un polipeptido de fusion puede ademas comprender un sitio de escision entre los dos polipeptidos. Tras la secrecion de la protema de fusion, el sitio es dividido liberando los dos polipeptidos. Ejemplos de sitios de escision incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Fuentes de polipeptidos que tienen actividad de lisozima
[0086] Un polipeptido con actividad de lisozima de la presente invencion se puede obtener de microorganismos de cualquier genero. Para fines de la presente invencion, el termino "obtenido de" como se utiliza en este caso en relacion con una fuente dada debe significar que el polipeptido codificado por un polinucleotido se produce por la fuente o por una cepa donde el polinucleotido de la fuente ha sido insertado. En un aspecto, el polipeptido obtenido a partir de una fuente dada es secretado extracelularmente.
[0087] El polipeptido puede ser un polipeptido fungico. Por ejemplo, el polipeptido puede ser un polipeptido fungico filamentoso tal como un polipeptido de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Humicola, Penicillium, Thielavia o Trichoderma.
[0088] En otro aspecto, el polipeptido es un polipeptido de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
[0089] En otro aspecto, el polipeptido es un polipeptido de Acremonium alcalophilum, por ejemplo, un polipeptido obtenido de Acremonium alcalophilum CBS 114.92.
[0090] Se entiende que para las especies anteriormente mencionadas, la invencion abarca los estados perfectos e imperfectos, y otros equivalentes taxonomicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Expertos en la tecnica reconoceran facilmente la identidad de equivalentes apropiados.
[0091] Cepas de estas especies son facilmente accesibles al publico en un numero de colecciones de cultivos, tales como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0092] El polipeptido se puede identificar y obtener de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente
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mencionadas. Tecnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente de habitats naturales se conocen en la tecnica. Un polinucleotido que codifica el polipeptido puede luego ser obtenido seleccionando de forma similar de una genoteca de ADN genomico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez que un polinucleotido que codifica un polipeptido ha sido detectado con la(s) sonda(s), el polinucleotido se puede aislar o clonar utilizando tecnicas que se conocen por aquellos tecnicos en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Polinucleotidos
[0093] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican un polipeptido de la presente invencion, como se describe en este caso.
[0094] Las tecnicas usadas para aislar o clonar un polinucleotido se conocen en la tecnica e incluyen aislamiento de ADN genomico o ADNc, o una combinacion de los mismos. La clonacion de los polinucleotidos de ADN genomico puede ser efectuada, por ejemplo, usando la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) bien conocida o seleccion de anticuerpos de bibliotecas de expresion para detectar fragmentos de ADN clonados con caracteristicas estructurales compartidas. Vease, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Otros procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos tal como reaccion en cadena de la ligasa (LCR), transcripcion activada por ligamiento (LAT) y amplification basada en polinucleotidos (NASBA) pueden ser utilizados. Los polinucleotidos se pueden clonar a partir de una cepa de Aspergillus o Acremonium, o un organismo relacionado y asf, por ejemplo, puede ser una variante alelica o de especie de la region codificante del polipeptido del polinucleotido.
[0095] La modificacion de un polinucleotido que codifica un polipeptido de la presente invencion puede ser necesaria para la sintetizacion de polipeptidos sustancialmente similar al polipeptido. El termino "sustancialmente similar" al polipeptido se refiere a formas del polipeptido que no se producen de forma natural. Estos polipeptidos pueden diferir en alguna via disenada del polipeptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren de la actividad espedfica, termoestabilidad, pH optimo, o similar. Las variantes se pueden construir basandose en el polinucleotido presentado como la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5 o las secuencias de ADNc de la misma, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o introduciendo sustituciones de nucleotidos que no suponen un cambio en la secuencia de aminoacidos del polipeptido, pero que corresponden al uso del codon del organismo huesped destinado a la produccion de la enzima, o introduciendo sustituciones de nucleotidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoacidos diferente. Para una description general de sustitucion de nucleotidos, vease, por ejemplo Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Constructos de acidos nucleicos
[0096] La presente invencion tambien se refiere a constructos de acidos nucleicos que comprenden un polinucleotido de la presente invencion operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de la secuencia codificante en una celula huesped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0097] Un polinucleotido se puede manipular en una variedad de vfas para proveer la expresion del polipeptido. La manipulacion del polinucleotido antes de la insercion en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresion. Las tecnicas para la modificacion de polinucleotidos utilizando metodos de ADN recombinante se conocen en la tecnica.
[0098] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleotido reconocido por una celula huesped para la expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido de la presente invencion. El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresion del polipeptido. El promotor puede ser cualquier polinucleotido que muestra actividad transcripcional en la celula huesped incluyendo promotores mutantes, truncados, e dbridos, y puede ser obtenido de genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares bien homologos o heterologos a la celula huesped.
[0099] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcription de los constructos de acidos nucleicos de la presente invencion en una celula huesped bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa- amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), gen de amilasa maltogenica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen criIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. Coli, promotor trc de E. Coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), y gen de beta-lactamasa procariotica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores son descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific
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American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra. Ejemplos de promotores en serie se describen en WO 99/43835.
[0100] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de los constructos de acidos nucleicos de la presente invencion en una celula huesped fungica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en acido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus donde el lfder no traducido ha sido sustituido por un lfder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el lfder no traducido ha sido sustituido por un lfder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o de Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados, e hforidos de los mismos.
[0101] En un huesped de levadura, promotores utiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol deshidrogenasa/gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotionema de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores utiles para celulas huesped de levadura son descritas por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0102] La secuencia de control tambien puede ser un terminador de transcripcion, que se reconoce por una celula huesped para terminar la transcripcion. El terminador esta operativamente enlazado al termino 3' del polinucleotido que codifica el polipeptido. Cualquier terminador que es funcional en la celula huesped se puede utilizar en la presente invencion.
[0103] Los terminadores preferidos para celulas huesped bacterianas son obtenidos de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), y RNA ribosomico de Escherichia coli (rrnB).
[0104] Los terminadores preferidos para celulas huesped fungicas filamentosas son obtenidos de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0105] Los terminadores preferidos para celulas huesped de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), y gliceraldehfdo- 3-fosfato-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores utiles para celulas huesped de levadura son descritos por Romanos et al., 1992, supra.
[0106] La secuencia de control tambien puede ser una region de estabilizadora de ARNm corriente abajo de un promotor y corriente arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresion del gen.
[0107] Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuados se obtienen a partir de un gen criIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).
[0108] La secuencia de control tambien puede ser un lfder, una region no traducida de un ARNm que es importante para la traduccion por la celula huesped. El lfder esta operativamente enlazado al termino 5' del polinucleotido que codifica el polipeptido. Cualquier lfder que es funcional en la celula huesped puede ser utilizado.
[0109] Lfderes preferidos para celulas huesped fungicas filamentosas son obtenidos de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0110] Lfderes adecuados para celulas huesped de levadura son obtenidos de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae, y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
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[0111] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia operativamente enlazada al termino 3' del polinucleotido y, cuando se transcribe, se reconoce por la celula huesped como una senal para anadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilacion que es funcional en la celula huesped puede ser utilizada.
[0112] Secuencias de poliadenilacion preferidas para celulas huesped fungicas filamentosas son obtenidas de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa- glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0113] Secuencias de poliadenilacion utiles para celulas huesped de levadura son descritas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0114] La secuencia de control tambien puede ser una region codificante del peptido senal que codifica un peptido senal enlazado al N-termino de un polipeptido y dirige el polipeptido en la via secretora de la celula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleotido puede intrinsecamente contener una secuencia codificante del peptido senal naturalmente enlazada en el marco de lectura de traduccion con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipeptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del peptido senal que es foraneo a la secuencia codificante. Una secuencia codificante del peptido senal foraneo se puede requerir donde la secuencia codificante naturalmente no contiene una secuencia codificante del peptido senal. Alternativamente, una secuencia codificante del peptido senal foraneo puede sencillamente reemplazar la secuencia codificante del peptido senal natural para mejorar la secrecion del polipeptido. Sin embargo, cualquier secuencia codificante del peptido senal que dirige el polipeptido expresado en la via secretora de una celula huesped puede ser utilizada.
[0115] Secuencias codificantes del peptido senal eficaces para celulas huesped bacterianas son las secuencias codificantes del peptido senal obtenidas de los genes para amilasa maltogenica NCIB 11837 de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y prsA de Bacillus subtilis. Otros peptidos senal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0116] Las secuencias codificantes del peptido senal eficaces para celulas huesped fungicas filamentosas son las secuencias codificantes del peptido senal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa, y proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei.
[0117] Peptidos senal utiles para celulas huesped de levadura son obtenidos de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras secuencias codificantes del peptido senal utiles son descritas por Romanos et al., 1992, supra.
[0118] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia codificante del propeptido que codifica un propeptido posicionado en el N-termino de un polipeptido. El polipeptido resultante es conocido como una proenzima o propolipeptido (o un zimogeno en algunos casos). Un propolipeptido es inactivo generalmente y se puede convertir en un polipeptido activo por escision catalftica o autocatalftica del propeptido desde el propolipeptido. La secuencia codificante del propeptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0119] Donde ambas secuencias del peptido senal y del propeptido estan presentes, la secuencia del propeptido esta situada junto al N-termino de un polipeptido y la secuencia del peptido senal esta situada junto al N-termino de la secuencia del propeptido.
[0120] Tambien puede ser deseable anadir secuencias reguladoras que regulan la expresion del polipeptido con respecto al crecimiento de la celula huesped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que hacen activar o desactivar la expresion del gen en respuesta a una sustancia qufmica o estfmulo ffsico, con la presencia de un compuesto regulador. Sistemas reguladores en sistemas procarioticos incluyen los sistemas del operador lac, tac, y trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 puede ser utilizado. En hongos filamentosos, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae, y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser utilizados. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificacion genica. En sistemas eucarioticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes de metalotionema que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleotido que codifica el polipeptido seria operativamente enlazado con la secuencia reguladora.
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Vectores de expresion
[0121] La presente invencion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que comprenden un polinucleotido de la presente invencion, un promotor, y senales de parada transcripcional y traduccional. Las varias secuencias de nucleotidos y de control se pueden unir entre sf para producir un vector de expresion recombinante que puede incluir uno o mas sitios de restriction convenientes para permitir la insertion o sustitucion del polinucleotido que codifica el polipeptido en tales sitios. Alternativamente, el polinucleotido se puede expresar por la insercion del polinucleotido o un constructo de acidos nucleicos que comprende el polinucleotido en un vector apropiado para la expresion. En la creation del vector de expresion, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante es operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresion.
[0122] El vector de expresion recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plasmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresion del polinucleotido. La election del vector tfpicamente dependera de la compatibilidad del vector con la celula huesped en la que se debe introducir el vector. El vector puede ser un plasmido circular lineal o cerrado.
[0123] El vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomica, cuya replicacion es independiente de la replicacion cromosomica, por ejemplo, un plasmido, un elemento extracromosomico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicacion. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la celula huesped, se integra en el genoma y se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado. Ademas, un vector unico o plasmido o dos o mas vectores o plasmidos que juntos contienen el ADN total para ser introducido en el genoma de la celula huesped, o un transposon, puede(n) ser utilizado(s).
[0124] El vector contiene preferiblemente uno o mas marcadores seleccionables que permiten la selection facil de celulas transformadas, transfectadas, transducidas, o similar. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o vfrica, resistencia a metales pesados, prototroffa a auxotrofos, y similares.
[0125] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiotica tal como resistencia a la ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, o tetraciclina. Marcadores adecuados para celulas huesped de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Marcadores seleccionables para usar en una celula huesped fungica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos. Preferido para usar en una celula de Aspergillus son genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y un gen bar de Streptomyces hygroscopicus.
[0126] El vector contiene preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integration del vector en el genoma de la celula huesped o replication autonoma del vector en la celula independiente del genoma.
[0127] Para integracion en el genoma de la celula huesped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleotido que codifica el polinucleotido o cualquier otro elemento del vector para integracion en el genoma por recombination homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener polinucleotidos adicionales para dirigir la integracion por recombinacion homologa en el genoma de la celula huesped en una(s) ubicacion(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integracion en una ubicacion precisa, los elementos integracionales deberian contener un suficiente numero de acidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases, y 800 a 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencias a la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinacion homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homologa a la secuencia objetivo en el genoma de la celula huesped. Ademas, los elementos integracionales pueden ser polinucleotidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la celula huesped por recombinacion no homologa.
[0128] Para la replicacion autonoma, el vector puede comprender ademas un origen de replicacion permitiendo al vector replicarse autonomamente en la celula huesped en cuestion. El origen de replicacion puede ser cualquier replicador de plasmido que media la replicacion autonoma que funciona en una celula. El termino "origen de replicacion" o "replicador plasmido" significa un polinucleotido que permite que un plasmido o vector se replique in vivo.
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[0129] Ejemplos de origenes bacterianos de replication son los origenes de replication de los plasmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicacion en E. Coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAMR1 que permite la replicacion en Bacillus.
[0130] Ejemplos de origenes de replicacion para usar en una celula huesped de levadura son el origen de 2 micras de replicacion, ARS1, ARS4, la combination de ARS1 y CEN3, y la combination de ARS4 y CEN6.
[0131] Ejemplos de origenes de replicacion utiles en una celula fungica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). Aislamiento del gen AMA1 y construction de plasmidos o vectores que comprenden el gen se pueden realizar segun los metodos descritos en WO 00/24883.
[0132] Mas de una copia de un polinucleotido de la presente invention se puede insertar en una celula huesped para aumentar la production de un polipeptido. Un aumento en el numero de copias del polinucleotido puede ser obtenido por la integracion de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la celula huesped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleotido donde celulas que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto copias adicionales del polinucleotido, se pueden seleccionar por el cultivo de las celulas en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0133] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresion recombinantes de la presente invencion se conocen por un experto en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Celulas huesped
[0134] La presente invencion tambien se refiere a celulas huesped recombinantes, que comprenden un polinucleotido de la presente invencion operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion de un polipeptido de la presente invencion. Una construccion o vector que comprenden un polinucleotido se introduce en una celula huesped de modo que la construccion o vector semantenienen como un integrante cromosomico o como un vector extracromosomico que se duplica como se describe anteriormente. El termino "celula huesped" abarca cualquier progenie de una celula madre que no es identica a la celula madre debido a mutaciones que ocurren durante la replicacion. La election de una celula huesped en gran parte dependera del gen que codifica el polipeptido y su fuente.
[0135] La celula huesped puede ser cualquier celula util en la produccion recombinante de un polipeptido de la presente invencion, por ejemplo, un procariota o un eucariota.
[0136] La celula huesped procariotica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa. Bacterias gram-positivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, y Streptomyces. Bacterias gram-negativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, y Ureaplasma.
[0137] La celula huesped bacteriana puede ser cualquier celula de Bacillus incluyendo, pero no limitado a, celulas de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus, lentus Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis.
[0138] La celula huesped bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptococcus incluyendo, pero no limitado a, celulas de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.
[0139] La celula huesped bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptomyces incluyendo, pero no limitado a, celulas de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, y Streptomyces lividans.
[0140] La introduction de ADN en una celula de Bacillus se puede efectuar por transformation de protoplastos (ver, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformacion celular competente (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff- Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporation (vease, por ejemplo, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751)), o conjugation (vease, por ejemplo, Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introduccion de ADN en una celula de E. coli se puede efectuar por transformacion de protoplastos (vease, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporacion (vease, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introduccion de ADN en una celula de Streptomyces se puede efectuar por transformacion de protoplastos, electroporacion (vease, por ejemplo,
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Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugation (vease, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o transduction (vease, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introduction de ADN en una celula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporation (vease, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugacion (vease, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introduccion de ADN en una celula de Streptococcus se puede efectuar por competencia natural (vease, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformation de protoplastos (vease, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporacion (vease por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), o conjugacion (vease, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, cualquier metodo conocido en la tecnica para la introduccion de ADN en una celula huesped puede ser usado.
[0141] La celula huesped tambien puede ser un eucariota, tal como un mairnfero, insecto, planta, o celula fungica.
[0142] La celula huesped puede ser una celula fungica. "Hongos" como se utilizan en este caso incluye el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota al igual que Oomycota y todos los hongos mitosporicos (como definido por Hawksworth et al., en, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).
[0143] La celula huesped fungica puede ser una celula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporogena (Endomycetales), levadura basidioesporogenea, y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomycetys). Ya que la clasificacion de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invencion, levadura debe ser definida como se describe en la Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Serie de simposio n° 9,1980).
[0144] La celula huesped de levadura puede ser una celula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia, tal como una celula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, o Yarrowia lipolytica.
[0145] La celula huesped fungica puede ser una celula fungica filamentosa. "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivision Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos estan generalmente caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacaridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aerobico. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae es por el injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0146] La celula huesped fungica filamentosa puede ser una celula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophylum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma.
[0147] Por ejemplo, la celula huesped fungica filamentosa puede ser una celula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
[0148] Celulas fungicas se pueden transformar por un proceso que implica la formation de protoplastos, transformacion de los protoplastos, y regeneration de la pared celular en cierto modo conocido per se. Procedimientos adecuados para transformacion de Aspergillus y celulas huesped de Trichoderma estan descritos en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al.,
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1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Metodos adecuados para transformar especies de Fusarium estan descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y WO 96/00787. Levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pags. 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Metodos de produccion
[0149] La presente invencion tambien se refiere a metodos de produccion de un polipeptido de la presente invention, que comprende (a) cultivo de una celula huesped recombinante de la presente invencion bajo condiciones propicias para la produccion del polipeptido; y (b) recuperacion del polipeptido.
[0150] Las celulas huesped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la produccion del polipeptido usando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la celula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitation, o fermentation a escala pequena o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, en lote, lote alimentado, o de estado solido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten al polipeptido expresarse y/o aislarse. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrogeno y carbono y sales inorganicas, usando procedimientos conocidos en la tecnica. Medios adecuados estan disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar segun composiciones publicadas (por ejemplo, en catalogos de la American Type Culture Collection). Si el polipeptido se segrega en el medio nutritivo, el polipeptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipeptido no es segregado, se puede recuperar de lisatos celulares.
[0151] El polipeptido se puede detectar utilizando metodos conocidos en la tecnica que son espetificos para los polipeptidos por ejemplo el ensayo de manchas de lisozima como se describe a continuacion. Estos metodos de detection incluyen, pero de forma no limitativa, el uso de anticuerpos espetificos, formation de un producto enzimatico, o desaparicion de un sustrato enzimatico. Por ejemplo, un ensayo enzimatico se puede utilizar para determinar la actividad del polipeptido.
[0152] El polipeptido se puede recuperar utilizando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el polipeptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitados a, coleccion, centrifugation, filtration, extraction, secado por pulverization, evaporation, o precipitacion.
[0153] El polipeptido se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo, pero no limitados a, cromatograffa (por ejemplo, intercambio ionico, afinidad, cromatoenfoque hidrofobico, y exclusion de tamanos), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitation de sulfato amonico), SDS-PAGE, o extraccion (vease, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipeptidos sustancialmente puros.
[0154] En un aspecto alternativo, el polipeptido no es recuperado, sino que una celula huesped de la presente invencion que expresa el polipeptido se usa como una fuente del polipeptido.
Plantas
[0155] La presente invencion tambien se refiere a plantas aisladas, por ejemplo, una planta transgenica, parte de la planta, o celula vegetal, que comprende un polinucleotido de la presente invencion para expresar y producir un polipeptido o dominio en cantidades recuperables. El polipeptido o dominio se puede recuperar de la planta o parte de la planta. Alternativamente, la planta o parte de la planta con el polipeptido o dominio se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejora del valor nutricional, palatabilidad, y propiedades reologicas, o para destruir un factor antinutritivo.
[0156] La planta transgenica puede ser dicotiledonea (un dicot) o monocotiledonea (un monocot). Ejemplos de plantas monocotiledoneas son hierbas, tal como poa de prados (pasto azul, Poa), hierba forrajera tal como Festuca, Lolium, cesped templado, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y mafz (trigo)
[0157] Ejemplos de plantas dicotiledoneas son tabaco, legumbres, tales como altramuces, patata, remolacha azucarera, guisante, judfa y soja, y plantas crutiferas (familia Brassicaceae), tal como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo cercanamente relacionado Arabidopsis thaliana.
[0158] Ejemplos de partes de la planta son tallo, callo, hojas, rafz, frutas, semillas, y tuberculos al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesofilo, parenquima, tejidos vasculares, meristemas. Compartimentos de celulas vegetales espedficos, tales como cloroplastos,
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apoplastos, mitocondria, vacuolas, peroxisomas y citoplasma estan tambien considerados una parte de la planta. Ademas, cualquier celula vegetal, sea cual sea el origen del tejido, se considera para una parte de la planta. Asimismo, partes de la planta tales como tejidos especficos y celulas aisladas para facilitar la utilizacion de la invention son tambien consideradas partes de la planta, por ejemplo, embriones, endospermas, aleurona y revestimientos de semilla.
[0159] Incluido tambien dentro del campo de la presente invencion esta la progenie de tales plantas, partes de la planta, y celulas vegetales.
[0160] La planta transgenica o celula vegetal que expresa el polipeptido o dominio se puede construir conforme a metodos conocidos en la tecnica. En resumen, la planta o celula vegetal se construye por la incorporation de uno o mas constructos de expresion que codifican el polipeptido o dominio en el genoma del huesped de planta o genoma de cloroplasto y que propagan la planta modificada resultante o celula vegetal en una planta transgenica o celula vegetal.
[0161] El constructo de expresion es convenientemente un constructo de acidos nucleicos que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido o dominio operativamente enlazado con secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresion del polinucleotido en la planta o parte de la planta de eleccion. Ademas, el constructo de expresion puede comprender una etiqueta seleccionable util para la identification de celulas vegetales en las que el constructo de expresion ha sido integrado y secuencias de ADN necesarias para la introduction del constructo en la planta en cuestion (esto ultimo depende del metodo de introduction de ADN que se utilice).
[0162] La election de secuencias reguladoras, tales como secuencias del promotor y del terminador y opcionalmente secuencias senal o de transito, se determina, por ejemplo, basandose en cuando, donde, y como el polipeptido o dominio se desea expresar. Por ejemplo, la expresion del gen que codifica un polipeptido o dominio puede ser constitutiva o inducible, o puede ser espetifica del desarrollo, fase o tejido, y el producto genico puede ser dirigido a un tejido espedfico o parte de la planta tal como semillas u hojas. Secuencias reguladoras son, por ejemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
[0163] Para la expresion constitutiva, el 35S-CaMV, la ubiquitina-1 de mafz, o el promotor de actina de arroz 1 se pueden utilizar (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et a/., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores espedficos de un organo pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tuberculos de patata, y frutas (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumidero metabolicos tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor espedfico de semilla como la glutelina, prolamina, globulina, o promotor de albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de protema de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una protema corporal del aceite de semillas (Chen et al., 1998, Physiol de celula vegetal. 39: 935-941), el promotor napA de la protema de almacenamiento de Brassica napus, o cualquier otro promotor espedfico de semilla conocido en la tecnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Ademas, el promotor puede ser un promotor espedfico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus de chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), o un promotor inducible de herida como el promotor pin2 de patata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor se puede inducir por tratamientos abioticos tal como temperatura, sequfa, o alteraciones en la salinidad o inducidas por sustancias aplicadas exogenamente que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrogenos, hormonas vegetales tal como etileno, acido absdsico, y acido giberelico, y metales pesados.
[0164] Un elemento intensificador del promotor tambien se puede usar para conseguir expresion mas alta de un polipeptido o dominio en la planta. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intron que es colocado entre el promotor y el polinucleotido que codifica un polipeptido o dominio. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, revelan el uso del primer intron del gen de actina de arroz 1 para mejorar la expresion.
[0165] El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes del constructo de expresion se pueden elegir de aquellos disponibles en la tecnica.
[0166] El constructo de acidos nucleicos se incorpora en el genoma de la planta segun tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, incluyendo transformation mediada por Agrobacterium, transformation mediada por virus, microinyeccion, bombardeo de partmulas, transformacion biolfstica, y electroporation (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
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[0167] La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es un metodo para generar dicotiledoneas transgenicas (para una revision, vease Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 1538) y para la transfomacion de monocotiledoneas, aunque otros metodos de transformacion se pueden utilizar para estas plantas. Un metodo para generar monocotiledoneas transgenicas es el bombardeo de parriculas (parriculas de oro microscopico o de tungsteno recubiertas con el ADN transformante) de callos embriogenicos o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotecnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Tecnology 10: 667-674). Un metodo alternativo para transformacion de monocotiledoneas se basa en la transformacion de protoplastos como se describe por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Metodos de transformacion adicionales incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense Nos. 6,395,966 y 7,151,204.
[0168] Despues de la transformacion, los transformantes que han incorporado el constructo de expresion se seleccionan y regeneran en plantas enteras segun metodos bien conocidos en la tecnica. Frecuentemente el procedimiento de transformacion se disena para la eliminacion selectiva de genes de seleccion bien durante la regeneration o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformacion con dos constructos de T-ADN separados o escision especfica del sitio del gen de seleccion por una recombinasa especfica.
[0169] Ademas de la transformacion directa de un genotipo de planta particular con una construction de la presente invencion, las plantas transgenicas pueden ser hechas cruzando una planta que tiene la construccion con una segunda planta que carece de la construccion. Por ejemplo, una construccion que codifica un polipeptido o dominio se puede introducir en una variedad de plantas particulares por el cruce, sin la necesidad de siempre transformar directamente una planta de esta variedad dada. Por lo tanto, la presente invention abarca no solo una planta directamente regenerada de celulas que han sido transformadas conforme a la presente invencion, sino tambien la progenie de tales plantas. Como se utiliza en este caso, progenie puede referirse a la progenie de cualquier generation de una planta progenitora preparada conforme a la presente invencion. Tal progenie puede incluir un constructo de ADN preparado conforme a la presente invencion. El cruce resulta en la introduction de un transgen en una lmea vegetal por polinizacion cruzada de una lmea precursora con una lmea vegetal donadora. Ejemplos no limitativos de tales pasos se describen en la patente estadounidense n° 7,151,204.
[0170] Las plantas se pueden generar a traves de un proceso de conversion de retrocruce. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas referidas como un genotipo, lmea, engendro, o hfbrido convertido retrocruzado.
[0171] Marcadores geneticos se pueden utilizar para asistir en la introgresion de uno o mas transgenes de la invencion de un antecedente genetico en otro. La seleccion asistida por marcador ofrece la ventaja con respecto al cultivo convencional de que se puede usar para evitar errores provocados por variaciones fenoripicas. Ademas, marcadores geneticos pueden proporcionar datos con respecto al grado relativo de germoplasma de elite en la progenie individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta con una caracteristica deseada de lo contrario tiene un contexto genetico no deseable agronomicamente se cruza con un progenitor de elite, los marcadores geneticos se pueden utilizar para seleccionar la progenie que no solo posee la caracteristica de interes, sino que tambien tiene una proportion relativamente grande del germoplasma deseado. De esta manera, el numero de generaciones requerido para la introgresion de uno o mas rasgos en un contexto genetico particular es minimizado.
[0172] La presente invencion tambien se refiere a metodos de production de un polipeptido o dominio de la presente invencion que comprende (a) cultivo de una planta transgenica o una celula vegetal que comprende un polinucleotido que codifica el polipeptido o dominio bajo condiciones propicias para la produccion del polipeptido o dominio; y (b) recuperacion del polipeptido o dominio.
Usos
[0173] Ejemplos de usos preferidos de la lisozima o sus composiciones de la presente invencion se dan a continuacion. La dosificacion de la lisozima y otras condiciones bajo las cuales se usa la lisozima se pueden determinar basandose en metodos conocidos en la tecnica.
[0174] Los polipeptidos de la invencion son utiles ripicamente en cualquier locus sujeto a contamination por bacterias, hongos, levadura o algas. Tfpicamente, los loci estan en sistemas acuosos tales como sistemas de agua de refrigeration, agua de enjuague de lavanderia, sistemas de aceite tales como aceites de corte, lubricantes, campos de aceite y similares, donde se desea matar los microorganismos o al menos controlar su crecimiento. Sin embargo, la presente invencion tambien se puede usar en todas las aplicaciones para las que las composiciones de lisozimas conocidas son utiles, tal como proteccion de madera, latex, adhesivo, pegamento, papel, carton, textil cuero, plasticos, calafateo, y piensos.
[0175] Una lisozima, o una composition de la misma, de la presente invencion se puede utilizar en diferentes aplicaciones para degradar un material que comprende un peptidoglicano o una quitodextrina tratando el material con la lisozima o composicion de la misma (vease por ejemplo Proctor and Cunningham, (1988)
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Critical Reviews in Food Science and Nutrition 26:359-395; Carini et al. (1985) Microbiol. Alimen. Nutr. 3:299320; Hughey y Johnson (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:2165-2170; Cunningham et al. (1991) World's Poultry Science Journal 47:141-163). Usos de lisozimas de la invencion para limpieza y/o detergentes
[0176] Una lisozima de la presente invencion es preferiblemente incorporada en y/o usada junto con composiciones detergentes como se describe abajo. Cuando el lavado se realiza reiteradamente a temperaturas inferiores a 60°C hay un riesgo aumentado de mal olor en la lavadora (lavado de la ropa al igual que lavavajillas) y en los tejidos o artmulos lavados a maquina. Este mal olor es posible que sea provocado por organismos microbianos tales como bacterias, hongos, algas u otros organismos unicelulares que crecen en la lavadora.
[0177] Ademas, la invencion se refiere a un procedimiento para el lavado de tejidos que comprende tratar los tejidos con una solucion de lavado con una composicion de detergente y una lisozima o una composicion de lisozima de la invencion. El tratamiento para el lavado de ropa puede por ejemplo efectuarse en un proceso de lavado a maquina o en un proceso de lavado a mano. La solucion de lavado puede por ejemplo ser una solucion de lavado acuosa que contiene la composicion de detergente y con un pH entre 3 y 12.
[0178] Los tejidos sometidos a los metodos de la presente invencion pueden ser colada lavable convencional, por ejemplo colada domestica. Preferiblemente, la parte principal de la colada son prendas y tejidos, incluyendo de punto, tejidos, telas vaqueras, de hilo, y de rizo, hechos de algodon, de mezcla de algodon o de celulosa natural o artificial (por ejemplo, originados de pulpa de madera) o mezclas de los mismos. Ejemplos de mezclas son las mezclas de algodon o rayon/viscosa con uno o mas material acompanante tal como lana, fibras sinteticas (por ejemplo, fibras de poliamida, fibras acrilicas, fibras de poliester, fibras de alcohol polivimlico, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida), y fibras con celulosa (por ejemplo, rayon/viscosa, ramio, lino, yute, fibras de acetato de celulosa, liocel).
[0179] La presente invencion proporciona un metodo para reducir la contamination microbiana en una superficie, tal como una prenda textil o superficie dura tal como metal, plastico o partes de caucho en una lavadora o lavavajillas, azulejos para cuarto de bano, suelos, tableros de mesa, drenajes, fregaderos y lavabo, tratando la superficie contaminada de forma microbiana con una lisozima o composicion de lisozima de la presente invencion. Tal tratamiento esta tambien previsto para reducir el mal olor en tejidos y superficies duras que contienen contaminacion microbiana.
[0180] La reduction de contaminacion microbiana se puede evaluar en diferentes vfas, por ejemplo, dejando una evaluation de panel si el olor ha sido disminuido, alternativamente una muestra puede tomarse desde la superficie y cultivarse para valorar si el recuento microbiano ha sido reducido como resultado del tratamiento en comparacion con un tratamiento sin lisozima. Usos de lisozimas de la invencion en pienso para animales
[0181] Una lisozima de la invencion tambien se puede usar en pienso para animales. En una forma de realization, la presente invencion proporciona un metodo para preparar una composicion de pienso para animales que comprende anadir una lisozima de la presente invencion a uno o mas ingredientes de pienso para animales.
[0182] Una lisozima de la presente invencion puede por ejemplo ser usada estabilizar la microflora sana de animales, en particular ganado tal como, pero no limitado a, oveja, cabras, ganado (incluyendo, pero no limitado a, ganado vacuno, vacas, y terneros jovenes), ciervo, cerdos o puercos (incluyendo, pero no limitados a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas), aves (incluyendo, pero no limitados a, ocas, pavos, patos y pollo tales como pollos para asar, polluelos y gallinas ponedoras); caballos, alces y conejos pero tambien en pescado (incluyendo pero no limitado a salmon, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustaceos (incluyendo pero no limitado a langostinos y gambas)). En una forma de realizacion preferida, la lisozima reemplaza antibioticos en dietas para animales. En otra forma de realizacion una lisozima de la presente invencion se usa como un aditivo de pienso, donde este puede proporcionar un efecto positivo en el equilibrio microbiano del tracto digestivo de pollo y de esta manera mejorar el rendimiento animal.
[0183] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en pienso para animales como enzimas mejoradoras del pienso que mejoran la digestibilidad del pienso para aumentar la eficiencia de su utilization segun WO 00/21381 y WO 04/026334.
[0184] En otra forma de realizacion una lisozima de la presente invencion se puede utilizar como un aditivo de pienso, donde este puede proporcionar un efecto positivo en el tracto digestivo de los animales y de esta manera mejorar el rendimiento animal de acuerdo con el aumento de peso, mdice de conversion alimenticia (FCR), o salud del animal mejorada tal como mdice de mortalidad disminuido. FCR se calcula como el consumo de pienso en g/animal con respecto al aumento de peso en g/animal.
Usos de lisozimas de la invencion como agentes antimicrobianos
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[0185] Una lisozima de la presente invention se puede utilizar como agentes antimicrobianos. Un aspecto de la presente invencion es un metodo para reducir la contamination microbiana, que comprende tratar una superficie contaminada microbiana con una lisozima de la presente invencion.
[0186] Para valorar si una lisozima de la presente invencion es capaz de actuar como un agente antimicrobiano se puede evaluar en un ensayo de turbidez. En este ensayo se evalua si la lisozima es capaz de degradar celulas microbianas por ejemplo un sustrato seco de celulas de Exiguobacterium undae (aisladas a partir de un calcetm maloliente) o celulas de Micrococcus luteus disueltas en el tampon o detergente, y asf reducir la densidad optica (OD) a por ejemplo 540 nm, cuando se compara con una suspension microbiana solo tratada con tampon.
Usos de lisozimas de la invencion para desinfeccion o como un desinfectante
[0187] Una lisozima de la presente invencion puede ser util como un desinfectante o usada para desinfeccion, por ejemplo, para el tratamiento de infecciones en el ojo o la boca, o para limpiar y desinfectar lentes de contacto, y para prevenir o eliminar biopelfcula en una superficie segun la patente estadounidense n° 6,777,223.
[0188] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en cuidado bucal. Por ejemplo, la lisozima se puede usar sola o en combinacion con otras enzimas o incluso peptidos antimicrobianos en la pasta dental u otros productos de cuidado bucal. Los polipeptidos se pueden introducir en la cavidad bucal o aplicar a un artfculo que se debe introducir en la cavidad bucal. Vease por ejemplo WO 08/124764.
[0189] En general se contempla que los polipeptidos de la presente invencion son utiles para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento microbiano en cualquier superficie. Ejemplos de superficies, que pueden ventajosamente ser contactadas con los polipeptidos de la invencion son las superficies de equipo de procesamiento usado por ejemplo en lecherias, plantas de procesamiento qufmico o farmaceutico, sistemas de saneamiento de agua, plantas de procesamiento de aceite, plantas de procesamiento de pasta de papel, plantas de tratamiento de agua, y torres de enfriamiento. Los polipeptidos de la invencion deberian ser usados en una cantidad, que es eficaz para limpiar, desinfectar o inhibir el crecimiento microbiano en la superficie en cuestion.
[0190] Los polipeptidos de la invencion pueden adicionalmente ser usados para limpiar superficies y utensilios de cocina en las plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier area donde se preparan o sirven alimentos tales como hospitales, clmicas y restaurantes.
Usos de lisozimas de la invencion en aplicaciones alimenticias
[0191] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar para inhibir selectivamente el crecimiento descontrolado de Clostridium tyrobutyricum durante la maduracion de quesos, en particular aquellos hechos de cuajadas prensadas y cocinadas, por ejemplo, queso suizo, parmesano, Edam, Gouda, Cheddar, y muchos otros.
[0192] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en la fabrication de vino, para controlar o inhibir la contaminacion microbiana.
Usos de lisozimas de la invencion como tratamientos
[0193] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en tratamiento local de lesiones distroficas e inflamatorias de la piel y tejidos blandos. Vease por ejemplo Palmieri y Boraldi (1977) Arch. Sci. Med. (Torino) 134:481-485.
[0194] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en el cuidado de la piel. Por ejemplo, el polipeptido se aplica a la piel de un paciente que sufre una infection de la piel, tal como acne. La lisozima tambien se puede usar en un vendaje de heridas, que se aplica a la piel herida, por ejemplo, para ayudar en la curacion de la herida. Vease, por ejemplo, solicitud estadounidense n° 20080254079.
[0195] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en lapiz de labios, balsamo de labios, gel de labios, o brillo de labios. Por ejemplo, tales productos se pueden usar para el tratamiento de una infeccion localizada en el labio, por ejemplo, un herpes labial. Vease, por ejemplo, solicitud estadounidense n° 20080254079.
[0196] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar en el tratamiento de enfermedades broncopulmonares.
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[0197] Una lisozima de la presente invention tambien se puede usar como enzimas digestivas o ayuda digestiva. Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar para mejorar el uso de bacterias muertas/vivas como una fuente alimenticia, por ejemplo, controlando los contaminantes microbianos indeseables.
[0198] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar como un agente terapeutico en un humano u otro animal, por ejemplo, para controlar o inhibir el crecimiento excesivo bacteriano en los intestinos de un humano que sufre una enfermedad, por ejemplo, enfermedad pancreatica o un paciente inmunocomprometido.
Usos de lisozimas de la invencion para extraer el ADN genomico bacteriano
[0199] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar para ayudar en la extraction de ADN genomico bacteriano. Con el objetivo de ser capaz de secuenciar el ADN bacteriano, la pared celular bacteriana necesita ser descompuesta para aislar el ADN dentro de esta. La pared celular especialmente de bacterias gram positivas puede ser diffcil de descomponer.
[0200] Lisozima de clara de huevo de gallina es la enzima estandar usada para aislamiento de ADN de bacterias gram positivas y funciona hidrolizando las cadenas de peptidoglicano presentes en la pared celular asf ayudando en la degradation de las paredes celulares. Sin embargo, algunas paredes celulares gram positivas no se degradan por lisozimas de clara de huevo de gallina. Por ejemplo, se recomienda que celulas de por ejemplo Staphylococcus aureus se lisan con lisostafina como se describe por Pitcher y Saunders (1989), App. Environ. Microbiol. 56(3): 782-787. Sin embargo, estos metodos no funcionan para todos los tipos de bacterias gram positivas y lisozimas nuevas asf potencialmente ofreciendo acceso a genomas nuevos que no se pueden aislar con soluciones de lisozimas comerciales
Otros usos de lisozimas de la invencion
[0201] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar para controlar el crecimiento microbiano en un proceso de fermentation, tal como, en la fabrication de etanol u otros productos de biomasa. Vease, por ejemplo, WO 2007/109750. Por consiguiente, la lisozima puede ser utilizada, por ejemplo, en un proceso para producir un producto de fermentacion que comprende (a) licuefaccion y/o sacarificacion de un material de carbohidrato y (b) fermentacion usando un organismo de fermentacion, donde una lisozima de la presente invencion se aplica al proceso de fermentacion antes, durante y/o despues de las concentraciones de fermentacion suficientes para matar y/o inhibir el crecimiento de celulas bacterianas.
[0202] Una lisozima de la presente invencion tambien se puede usar para controlar el crecimiento microbiano en una piscifactoria o granja de langostinos.
[0203] Otros usos incluyen conservation de alimentos, bebidas, cosmeticos tales como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champus, acondicionadores, antitranspirante, desodorantes, formulaciones enzimaticas, o ingredientes alimenticios.
Composiciones
[0204] En otro aspecto ulterior, la presente invencion se refiere a composiciones que comprenden un polipeptido de la presente invencion que tiene actividad antimicrobiana y/o de lisozima.
[0205] La composition puede comprender un polipeptido de la invencion como el componente enzimatico principal, por ejemplo, una composicion monocomponente. Alternativamente, la composicion puede comprender actividades enzimaticas multiples, tal como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-alactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta- glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolftica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolftica, ribonucleasa, transglutaminasa, o xilanasa.
[0206] Las composiciones se pueden preparar conforme a metodos conocidos en la tecnica y pueden estar en forma de un lfquido o una composicion seca. Por ejemplo, la composicion de polipeptido puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. El polipeptido que debe ser incluido en la composicion se puede estabilizar conforme a metodos conocidos en la tecnica.
[0207] Ejemplos son dados a continuacion de usos preferidos de las composiciones de polipeptido de la invencion. La dosificacion de la composicion de polipeptido de la invencion y otras condiciones bajo las cuales se usa la composicion se pueden determinar basandose en metodos conocidos en la tecnica.
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Composiciones de pienso para animales
[0208] La presente invention esta tambien dirigida a metodos para utilizar los polipeptidos de la presente invention que tienen actividad de lisozima en el pienso para animales, al igual que a composiciones alimenticias y aditivos alimenticios que comprenden las lisozimas de la invencion.
[0209] El termino animal incluye todos los animales, incluyendo seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes, y rumiantes. Animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como oveja, cabras, y ganado, por ejemplo, ganado vacuno y vacas. En una forma de realization particular, el animal es un animal no rumiante. Animales no rumiantes incluyen animales monogastricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluyendo, pero no limitados a, lechones, cerdos en crecimiento, y cerdas); aves tales como pavos, ocas, patos y pollo (incluyendo pero no limitado a pollos para asar, gallinas ponedoras); caballos (incluyendo pero no limitados a, de sangre caliente, de sangre fria y de sangre templada), terneros jovenes; y pescado (incluyendo pero no limitados a salmon, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustaceos (incluyendo pero no limitado a langostinos y gambas).
[0210] El termino pienso o composition de pienso significa cualquier compuesto, preparation, mezcla, o composition adecuada para, o destinada para la ingesta por un animal. En el uso segun la invencion la lisozima se puede alimentar al animal antes, despues, o simultaneamente con la dieta. El ultimo es preferido. Tales composiciones de lisozima pueden por supuesto estar mezcladas con otras enzimas.
[0211] La lisozima se puede anadir al pienso en cualquier forma, ser esta como una lisozima relativamente pura o en mezcla con otros componentes previstos para la adicion a pienso para animales, es decir en forma de aditivos de pienso, tal como las denominadas premezclas para pienso para animales. En otro aspecto la presente invencion se refiere a composiciones para usar en el pienso para animales, tal como pienso para animales, y aditivos de pienso, por ejemplo, premezclas.
[0212] Aparte de la lisozima de la invencion, los aditivos de pienso de la invencion contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.
[0213] Ademas, ingredientes de aditivo de pienso opcionales son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tal como beta-caroteno, astaxantina, y lutema; estabilizadores; aditivos de mejora de crecimiento y compuestos/aromatizantes de aroma, por ejemplo creosol, anetol, deca, undeca-y/o dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilideno ftalida, butilideno ftalida, capsaicina y/o tanina; acidos grasos poliinsaturados (PUFA); especies generadoras de oxfgeno reactivo; tambien, un soporte se puede utilizar que puede contener, por ejemplo, 40- 50% en peso de fibras de madera, 8-10% en peso de estearina, 4-5% en peso de polvo de curcuma, 4-58% en peso de polvo de romero, 22- 28% en peso de piedra caliza, 1-3% en peso de una goma, tal como goma arabiga, 5-50% en peso de azucar y/o almidon y 5-15% en peso de agua.
[0214] Un pienso o un aditivo de pienso de la invencion tambien puede comprender al menos otra enzima seleccionada entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa- galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).
[0215] Ejemplos de acidos grasos poliinsaturados son C18, C20 y C22 acidos grasos poliinsaturados, tal como acido araquidonico, acido docosahexaenoico, acido eicosapentanoico y acido gamma-linolenico.
[0216] Ejemplos de especies generadoras de oxfgeno reactivo son productos qunriicos tal como perborato, persulfato, o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.
[0217] Vitaminas liposolubles e hidrosolubles, al igual que oligoelementos forman parte de una denominada premezcla destinada para adicion al pienso, mientras que macrominerales son normalmente anadidos por separado al pienso. Cualquiera de estos tipos de composicion, cuando se enriquecen con una proteasa de la invencion, es un aditivo de pienso de la invencion.
[0218] En una forma de realizacion particular, el aditivo de pienso de la invencion se destina a estar incluido (o prescrito como teniendo que ser incluido) en dietas para animales o pienso para animales a niveles de 0,1 ppm a 1000 ppm, preferiblemente 0,5 ppm a 200 ppm y mas preferiblemente 1 ppm a 100 ppm. Los niveles de dosificacion anteriormente mencionados tambien pueden usarse para premezclas.
[0219] La composicion de pienso para animales de la invencion puede contener al menos una protema vegetal, tal como aquella derivada de u originada de un vegetal, incluyendo protemas modificadas y derivados de protema. Protemas vegetales se pueden derivar de fuentes de protema vegetal, tales como
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leguminosas y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tal como harina de soja, harina de lupino y comida de semilla de colza. Alternativamente, la fuente de protema vegetal es material de una o mas plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa. Otros ejemplos de fuentes de protema vegetal son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodon, y repollo y cereales tal como cebada, trigo, centeno, avena, mafz (trigo), arroz, triticale, y sorgo.
[0220] La composicion de pienso para animales de la invencion tambien puede contener protema animal, tal como harina de carne y hueso, harina de plumas, y/o harina de pescado, tfpicamente en una cantidad de 025%. La composicion de pienso para animales de la invencion tambien puede comprender granos de destileria con solubles (DDGS), tfpicamente en cantidades de 0-30%.
[0221] En otras formas de realization particulares, la composicion de pienso para animales de la invencion contiene 0-80% mafz; y/o 0-80% sorgo; y/o 0-70% trigo; y/o 0-70% cebada; y/o 0-30% avena; y/o 0-40% harina de soja; y/o 0-25% harina de pescado; y/o 0-25% harina de carne y hueso; y/o 0-20% suero de leche.
[0222] Dietas para animales pueden por ejemplo ser fabricadas como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado. Tfpicamente, los materiales de pienso molidos se mezclan y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales se agregan segun las especificaciones para las especies en cuestion. Las enzimas se pueden anadir como formulaciones enzimaticas solidas o Kquidas. Por ejemplo, para triturar una formulation solida o Kquida enzimatica se puede adicionar antes o durante la etapa de mezcla de ingredientes. Para granular la preparation de lisozima/enzima (Kquida o solida) tambien se puede anadir antes o durante la etapa de ingrediente de pienso. Tfpicamente una preparacion de lisozima/enzima Kquida se anade despues de la etapa de granulation. La enzima tambien se puede incorporar en un aditivo de pienso o premezcla.
[0223] La concentration enzimatica final en la dieta esta en la gama de 0.01-200 mg de protema enzimatica por kg de dieta, por ejemplo, en el rango de 0.5-25 mg de protema enzimatica por kg de dieta animal.
Composiciones de limpieza o detergentes
[0224] La lisozima de la invencion se puede anadir a y por tanto volverse un componente de una composicion de detergente, particularmente en un detergente lfquido con un pH de 7 o inferior.
[0225] La composicion de detergente de la invencion puede por ejemplo ser formulada como un detergente de lavado de la ropa a mano o a maquina que incluye una composicion de aditivo de colada adecuado para pretratamiento de tejidos manchados y una composicion de suavizante anadida al enjuague, o ser formulada como una composicion de detergente para usar en operaciones de limpieza de superficies duras del hogar en general, o ser formulada para operaciones de lavado de la vajilla a mano o a maquina.
[0226] En un aspecto espetifico, la invencion proporciona un aditivo de detergente que comprende la lisozima de la invencion. El aditivo de detergente al igual que la composicion de detergente puede comprender una o mas enzimas adicionales tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o una peroxidasa.
[0227] En general las propiedades de la enzima(s) elegida deberian ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir pH optimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimaticos y no enzimaticos, etc.), y la(s) enzima(s) deberia(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.
[0228] En una forma de realizacion, la invencion se dirige a composiciones de limpieza o detergentes que comprenden una enzima de la presente invencion en combinacion con uno o mas componentes de limpieza adicionales. La election de componentes de limpieza adicionales esta en la habilidad del experto e incluye ingredientes convencionales, incluidos los componentes no limitativos ejemplares expuestos a continuation.
[0229] La eleccion de componentes puede incluir, para el cuidado de textiles, la consideration del tipo de textil que se debe limpiar, el tipo y/o grado de la suciedad, la temperatura en la que debe ocurrir la limpieza, y la formulacion del producto detergente. Aunque los componentes mencionados a continuacion se categorizan segun una funcion particular, esto no deberia ser interpretado como una limitation ya que el componente puede tener una o mas funcionalidades adicionales que el experto en la materia apreciara.
[0230] La composicion de limpieza o de detergente se puede adecuar para el lavado de tejidos tal como por ejemplo tejidos, telas o lino, o para limpiar superficies duras tales como por ejemplo suelos, mesas, o lavado de la vajilla.
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[0231] La invencion tambien se refiere a polinucleotidos que codifican los polipeptidos, constructos de acidos nucleicos, vectores, y celulas huespedes que comprenden los polinucleotidos al igual que metodos de production y utilization de los polipeptidos.
Tensioactivos
[0232] La composition de detergente puede comprender uno o mas tensioactivos, que puede ser anionico y/o cationico y/o no ionico y/o semipolar y/o zwitterionico, o una mezcla de los mismos. En una forma de realization particular, la composicion de detergente incluye una mezcla de uno o mas tensioactivos no ionicos y uno o mas tensioactivos anionicos. El(los) tensioactivo(s) esta(n) tfpicamente presente(s) a un nivel de aproximadamente 0,1 % a 60% en peso, tal como aproximadamente 1% a aproximadamente 40%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 20%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 10%. El(los) tensioactivo(s) es(son) elegido(s) con base en la aplicacion de limpieza deseada, e incluye cualquier tensioactivo(s) convencional(es) conocido(s) en la tecnica. Cualquier tensioactivo conocido en la tecnica para usar en detergentes puede ser utilizado.
[0233] Cuando se incluye en este el detergente normalmente contendra de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% en peso, tal como de aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, incluyendo de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, o de aproximadamente 20% a aproximadamente 25% de un tensioactivo anionico. Ejemplos no limitativos de tensioactivos anionicos incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS), isomeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanosulfonatos, alfa-olefinsulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos, alquilsulfatos (AS) tal como dodecil sulfato de sodio (SDS), sulfatos de alcohol graso (FAS), sulfatos de alcohol primario (PAS), etersulfatos alcoholicos (AES o AEOS o FES, conocidos tambien como etoxisulfatos alcoholicos o sulfatos de eter de alcohol graso), alcanosulfonatos secundarios (SAS), sulfonatos de parafina (PS), sulfonatos de ester, esteres de glicerol de acido graso sulfonatado, metil esteres de alfa-sulfo acido graso (alfa-SFMe o SES) incluyendo sulfonato de ester metflico (MES), acido alquil- o alquenilsuctinico, acido dodecenil/tetradecenil suctinico (DTSA), derivados de acido graso de aminoacidos, diesteres y monoesteres de acido sulfo-succrnico o jabon, y combinaciones de los mismos.
[0234] Cuando se incluyen aqu el detergente normalmente contendra de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo cationico. Ejemplos no limitativos de tensioactivos cationicos incluyen quat de alquildimetiletanolamina (ADMEAQ), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC), y alquilbencildimetilamonio, compuestos de amonio cuaternario de alquilo, compuestos de amonio cuaternario alcoxilado (AQA) , y combinaciones de los mismos.
[0235] Cuando se incluye aqu el detergente normalmente contendra de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 40% en peso de un tensioactivo no ionico, por ejemplo, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 30%, en particular de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 10%, tal como de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, o de aproximadamente 8% a aproximadamente 12%. Ejemplos no limitativos de tensioactivos no ionicos incluyen etoxilatos de alcohol (AE o AEO), propoxilatos de alcohol, alcoholes grasos propoxilados, esteres alquflicos de acido graso (PFA) alcoxilado, tales como esteres alquNicos de acido graso etoxilado y/o propoxilado, etoxilatos de alquilfenol (APE), etoxilatos de nonilfenol (NPE), alquilpoliglucosidos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de acido graso (FAM), dietanolamidas de acido graso (FADA), monoetanolamidas de acido graso etoxilado (EFAM), monoetanolamidas de acido graso propoxilado (PFAM), amidas de acido graso de polihidroxi alquilo, o derivados de N-acil N-alquil glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de acido graso, FAGA), al igual que productos disponibles bajo los nombres comerciales SPAN y TWEEN, y combinaciones de los mismos.
[0236] Cuando se incluyen en la presente, el detergente normalmente contendra de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo semipolar. Ejemplos no limitativos de tensioactivos semipolares incluyen oxidos de amina (AO) tal como oxido de alquildimetilamina, oxido de N-(coco alquil)- N,N-dimetilamina y oxido de N-(sebo-alquil)-N,N-bis(2-hidroxietil)amina, alcanolamidas de acido graso y alcanolamidas de acido graso etoxilado, y combinaciones de los mismos.
[0237] Cuando se incluyen en la presente, el detergente normalmente contendra de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo zwitterionico. Ejemplos no limitativos de tensioactivos zwitterionicos incluyen betama, alquildimetilbetama, sulfobetama, y combinaciones de los mismos.
Hidrotropos
[0238] Un hidrotropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrofobicos en soluciones acuosas (o por el contrario, sustancias polares en un ambiente no polar). Tfpicamente, hidrotropos tienen un caracter hidrofilico y uno hidrofobico (llamadas propiedades anfifflicas como se conoce de los tensioactivos); sin
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embargo, la estructura molecular de los hidrotropos generalmente no favorece la autoagregacion espontanea, vease por ejemplo revision por Hodgdon y Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Los hidrotropos no muestran una concentracion critica por encima de la cual ocurre la autoagregacion, como se ha descubierto para tensioactivos y Kpidos que forman fases micelares, laminares u otras mesofases bien definidas. En cambio, muchos hidrotropos muestran un proceso de agregacion de tipo continuo donde los tamanos de los agregados crecen segun aumenta la concentracion. Sin embargo, muchos hidrotropos alteran las propiedades de comportamiento de fase, de estabilidad, y coloidales de sistemas que contienen sustancias de caracter polar y no polar, incluyendo mezclas de agua, aceite, tensioactivos, y poKmeros. Hidrotropos se usan clasicamente a traves de industrias farmaceuticas, de cuidado personal, alimentarias, para aplicaciones tecnicas. El uso de hidrotropos en composiciones detergentes permiten por ejemplo formulaciones mas concentradas de tensioactivos (como en el proceso de compactar detergentes Kquidos eliminando el agua) sin inducir fenomenos no deseados tal como separation de fase o alta viscosidad.
[0239] El detergente puede contener 0-5% en peso, tal como aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, de un hidrotropo. Cualquier hidrotropo conocido en la tecnica para usar en detergentes puede ser utilizado. Ejemplos no limitativos de hidrotropos incluyen benceno sulfonato de sodio, p-tolueno sulfonato de sodio (STS), xileno sulfonato de sodio (SXS), cumeno sulfonato de sodio (SCS), cimeno sulfonato de sodio, oxidos de amina, alcoholes y poliglicoleteres, hidroxinaftoato de sodio, hidroxinaftaleno sulfonato de sodio, etilhexil sulfato de sodio, y combinaciones de los mismos.
Constructores y Co-constructores
[0240] La composicion de detergente puede contener aproximadamente 0-65% en peso, tal como aproximadamente 5% a aproximadamente 45% de un constructor de detergente o co-constructor, o una mezcla de los mismos. En un detergente de lavavajillas, el nivel de constructor es tfpicamente 40-65%, particularmente 50-65%. El adyuvante y/o co-adyuvante puede particularmente ser un agente quelante que forma complejos hidrosolubles con Ca y Mg. Cualquier adyuvante y/o co-adyuvante conocido en la tecnica para usar en los detergentes para la rop pueden ser utilizados. Ejemplos no limitativos de constructores incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos tal como trifosfato de sodio (STP o tripolifosfato sodico), carbonatos tales como carbonato de sodio, silicatos solubles tal como metasilicato de sodio, silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst), etanolaminas tales como 2-aminoetan-1-ol (MEA), dietanolamina (DEA, conocida tambien como iminodietanol), trietanolamina (TEA, conocida tambien como 2,2',2"-nitrilotrietanol), y carboximetilo de inulina (CMI), y combinaciones de los mismos.
[0241] La composition de detergente tambien puede contener 0-20% 0-20% en peso, tal como aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, de un co-constructor de detergente, o una mezcla de los mismos. La composicion de detergente puede incluir un co-constructor solo, o en combinacion con un constructor, por ejemplo, un constructor de zeolita. Ejemplos no limitativos de co-constructores incluyen homopoKmeros de poliacrilatos o copolfmeros de los mismos, tales como acido poli(acrilico) (PAA) o acido copoli(acrilico)/acido maleico (PAA/PMA). Otros ejemplos no limitativos incluyen citrato, queladores tales como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y acido alquil o alquenilsuccmico. Ejemplos especficos adicionales incluyen acido 2,2',2"-nitrilotriacetico (NTA), acido etilenodiaminatetraacetico (EDTA), acido dietilenotriaminopentaacetico (DTPA), acido iminodisuccrnico (IDS), acido etilenodiamina-N,N'- disuccrnico (EDDS), acido metilglicinadiacetico (MGDA), acido glutamico N,N-diacetico (GLDA), acido 1- hidroxietano-1,1-difosfonico (HEDP), acido etilenodiaminatetra-(metilenofosfonico) (EDTMPA), acido dietilenotriaminapentakis(metilenofosfonico) (DTPMPA o DTMPA), acido N-(2-hidroxietil)iminodiacetico (EDG), acido aspartico-N-acido monoacetico (ASMA), acido aspartico N,N-acido diacetico (ASDA), acido aspartico-N-acido monopropionico (ASMP), acido iminodisuccrnico (IDA), acido N-(2-sulfometil)-aspartico (SMAS), acido N-(2-sulfoetil)-aspartico (SEAS), acido N-(2-sulfometil)-glutamico (SMGL), acido N-(2-sulfoetil)- glutamico (SEGL), acido N-metiliminodiacetico (MIDA), acido a-alanina-N,N-diacetico (a-ALDA), acido serina- N,N-diacetico (SEDA), acido isoserina-N,N-diacetico (ISDA), acido fenilalanina-N,N-diacetico (PHDA), acido antranNico-N,N-acido diacetico (ANDA), acido sulfanNico-N, N- acido diacetico (SLDA), acido taurina N, N- diacetico (TUDA) y acido sulfometil-N,N-diacetico (SMDA), N-(2-hidroxietil)-etilidenodiamina-N, N', N'- triacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), acido dietilentriamina penta(metilenofosfonico) (DTPMP), acido aminotris(metilenofosfonico) (ATMP), y combinaciones y sales derivadas. Otros constructores y/o co- constructores ejemplares son descritos en, por ejemplo, WO 09/102854, US 5977053.
Sistemas blanqueadores
[0242] El detergente puede contener 0-50% en peso, tal como aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25%, de un sistema blanqueador. Se puede utilizar cualquier sistema blanqueador conocido en la tecnica de uso en los detergentes para la ropa. Componentes de sistema blanqueador adecuados incluyen catalizadores del blanqueamiento, fotoblanqueadores, activadores de blanqueamiento, fuentes de peroxido de hidrogeno tal como percarbonato de sodio y perboratos de sodio, peracidos preformados y sus mezclas derivadas. Peracidos preformados adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, acidos y sales peroxicarboxNicos,
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acidos y sales percarbonicos, acidos y sales periirndicos, acidos y sales peroximonosulfuricos, por ejemplo, oxona (R), y sus mezclas derivadas. Ejemplos no limitativos de sistemas blanqueadores incluyen sistemas blanqueadores basados en peroxido, que pueden comprender, por ejemplo, una sal inorganica, incluyendo sales de metal alcalino tales como sales de perborato de sodio (normalmente mono- o tetrahidrato), percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato, en combinacion con un activador blanqueador formador de peracido. El termino activador de blanqueamiento se entiende aqu como un compuesto que reacciona con blanqueador de peroxfgeno como peroxido de hidrogeno para formar un peracido. El peracido asf formado constituye el blanqueador activado. Activadores de blanqueamiento adecuados para ser usados aqu incluyen aquellos de la clase de amidas, imidas o anhfdridos de esteres. Ejemplos adecuados son tetracetiletileno diamina (TAED), sulfonato de 4-[(3,5,5-trimetilhexanoil)oxi]benceno de sodio (ISONOBS), acido diperoxi dodecanoico, 4-(dodecanoiloxi)bencenosulfonato (LOBS), 4-(decanoiloxi)bencenosulfonato, 4- (decanoiloxi)benzoato (DOBS), 4-(nonanoiloxi)-bencenosulfonato (NOBS), y/o aquellos descritos en WO98/17767. Una familia particular de activadores de blanqueamiento de interes fue descrita en EP624154 y particularmente preferido en esta familia es acetil trietil citrato (ATC). ATC o un triglicerido de cadena corta como triacetina tiene la ventaja que es respetuoso con el medioambiente ya que se degrada finalmente en acido dtrico y alcoholico. Ademas acetil trietil citrato y triacetina tiene una buena estabilidad hidrolftica en el producto despues del almacenamiento y es un activador del blanqueamiento eficaz. ATC finalmente proporciona una buena capacidad de construccion al aditivo de lavanderia. Alternativamente, el sistema de blanqueamiento puede comprender peroxiacidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida, o sulfona. El sistema blanqueador tambien puede comprender peracidos tal como acido 6-(ftalimido)peroxihexanoico (PAP). El sistema blanqueador tambien puede incluir un catalizador de blanqueamiento. En algunas formas de realizacion del componente blanqueador puede ser un catalizador organico seleccionado del grupo que consiste en catalizadores organicos que tienen las formulas siguientes:
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(iii) y sus mezclas derivadas; donde cada R1 es independientemente un grupo de alquilo ramificado conteniendo de 9 a 24 carbonos o grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos, preferiblemente cada R1 es independientemente un grupo alquilo ramificado conteniendo de 9 a 18 carbonos o grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos, mas preferiblemente cada R1 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecilo e iso-pentadecilo. Otros sistemas blanqueadores ejemplares son descritos, por ejemplo en WO2007/087258; WO2007/087244; WO2007/087259 y WO2007/087242. Fotoblanqueadores adecuados pueden por ejemplo ser ftalocianina de zinc sulfonatada.
Polimeros
[0243] El detergente puede contener 0-10% en peso, tal como 0,5-5%, 2-5%, 0,5-2% o 0,2-1% de un polnmero. Cualquier polnmero conocido en la tecnica para el uso en detergentes puede ser utilizado. El polnmero puede funcionar como un co-constructor como se ha mencionado anteriormente, o puede proporcionar antirredeposicion, protection de fibras, elimination de suciedad, inhibicion de transferencia de tinte, limpieza de grasa y/o propiedades antiespumantes. Algunos polnmeros pueden tener mas de una de las propiedades anteriormente mencionadas y/o mas de uno de los motivos mencionados abajo. Polnmeros ejemplares incluyen (carboximetil)celulosa (CMC), alcohol polivinilico (PVA); poli(vinilpirrolidona) (PVP), poli(etilenglicol) u oxido de polietileno (PEG), poli(etilenoimina) etoxilada, inulina de carboximetilo (CMI), y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA, acido poliaspartico, y copolnmeros de lauril metacrilato/acido acrilico, CMC modificado hidrofobicamente (HM-CMC) y siliconas, copolnmeros de acido tereftalico y glicoles oligomericos, copolnmeros de poli(etileno tereftalato) y poli(oxieteno tereftalato) (PET-POET), PVP, poli(vinilimidazol) (PVI); poli(vinilpiridina-N-oxido) (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI). Otros polnmeros ejemplares incluyen policarboxilatos sulfonatados, oxido de polietileno y oxido de polipropileno (PEO-PPO) y diquaternium etoxi sulfato. Otros polnmeros ejemplares se describen en, por ejemplo, WO 2006/130575. Sales de los polnmeros anteriormente mencionados son contempladas tambien.
Agentes de matizado de tejidos
[0244] Las composiciones detergentes de la presente invencion tambien pueden incluir agentes de matizado de tejidos tales como colorantes o pigmentos, que cuando se formulan en composiciones detergentes pueden depositar sobre un tejido cuando dicho tejido se contacta con una solution de lavado comprendiendo dichas
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composiciones detergentes y asf alterando el tinte de dicho tejido a traves de la absorcion/reflexion de luz visible. Agentes blanqueadores fluorescentes emiten al menos alguna luz visible. En cambio, agentes de matizado de tejido alteran el tinte de una superficie ya que absorben al menos una porcion del espectro de luz visible. Agentes de matizado de tejido adecuado incluyen colorantes y conjugados de tinte-arcilla, y tambien pueden incluir pigmentos. Colorantes adecuados incluyen colorantes de molecula pequena y colorantes polimericos. Colorantes de molecula pequena adecuados incluyen colorantes de molecula pequena seleccionados del grupo que consiste en colorantes que caen en las clasificaciones del mdice de color (C.I.) de Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet and Basic Red, o mezclas derivadas, por ejemplo, como se describe en WO2005/03274; WO2005/03275; WO2005/03276 y EP1876226. La composicion de detergente preferiblemente comprende de aproximadamente 0,00003 % en peso a aproximadamente 0,2 % en peso, de aproximadamente 0.00008 % en peso a aproximadamente 0,05 % en peso, o incluso de aproximadamente 0,0001 % en peso a aproximadamente 0,04 % en peso de agente de matizado de tejido. La composicion puede comprender de 0,0001 % en peso a 0.2 % en peso agente de matizado de tejido, esto se puede preferir especialmente cuando la composicion esta en forma de una bolsa de dosis unitaria. Agentes de matizado adecuados son tambien descritos en, por ejemplo WO 2007/087257 y WO2007/087243.
Enzimas adicionales
[0245] En un aspecto, la presente invencion proporciona un aditivo de detergente que comprende una lisozima de la presente invencion. El aditivo de detergente al igual que la composicion de detergente puede comprender una o mas enzimas [adicionales] tal como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o peroxidasa.
[0246] En general las propiedades de la(s) enzima(s) seleccionada(s) deberia(n) ser compatible(s) con el detergente seleccionado, (es decir, pH optimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimaticos y no enzimaticos, etc.), y la(s) enzima(s) deberia(n) estar presente(s) en cantidades eficaces.
[0247] Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fungico. Mutantes quumicamente modificados o creados geneticamente de protemas estan incluidos. Celulasas adecuadas incluyen celulasas de los generos Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fungicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y WO 89/09259.
[0248] Celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado de color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como los descritos en WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
[0249] Celulasas disponibles comercialmente incluyen Celluzyme™, y Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, y Puradax HA™ (Genencor International Inc.), y KaC-500(B)™ (Kao Corporation).
[0250] Proteasas: proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal u origen microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Mutantes quumicamente modificados o creados geneticamente de protemas estan incluidos. La proteasa puede ser una proteasa serinica o una metaloproteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, especialmente aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descrita en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583.
[0251] Ejemplos de proteasas utiles son las variantes descritas en WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o mas de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, y 274.
[0252] Enzimas proteasicas disponibles comercialmente preferidas incluyen Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™, y Kannase™ (Novozymes A/S), Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™, y FN3™ (Genencor International Inc.).
[0253] Lipasas y cutinasas: lipasas y cutinasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fungico. Enzimas mutantes modificadas qufmicamente o disenadas de protemas estan incluidas. Ejemplos incluyen lipasa de Thermomyces, por ejemplo de T. Lanuginosus (anteriormente llamada Humicola lanuginosa) como se describe en EP258068 y EP305216, cutinasa de Humicola, por ejemplo H. Insolens (WO96/13580), lipasa de cepas de Pseudomonas (algunas de estas ahora redenominadas Burkholderia), por ejemplo P.
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alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. Sp. Cepa SD705 (WO95/06720 & WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), lipasas de Streptomyces de tipo GDS L(WO10/065455), cutinasa de Magnaporthe grisea (WO10/107560), cutinasa de Pseudomonas mendocina (US5,389,536), lipasa de Thermobifida fusca (wOll/084412), lipasa de Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417) lipasa de Bacillus subtilis (WO11/084599), y lipasa de Streptomyces griseus (WO11/150157) y S. pristinaespiralis (WO12/137147).
[0254] Otros ejemplos son variantes de lipasa tales como los descritos en EP407225; WO92/05249; WO94/01541; WO94/25578; WO95/14783; WO95/30744; WO95/35381; WO95/22615; WO96/00292; WO97/04079; WO97/07202; WO00/34450; WO00/60063; WO01/92502; WO07/87508 y WO09/109500.
[0255] Productos de lipasa comercial preferidos incluyen incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente de Gist- Brocades).
[0256] Otros ejemplos son lipasas a veces referidas como aciltransferasas o perhidrolasas, por ejemplo aciltransferasas con homologfa a lipasa A de Candida antarctica (WO10/111143), aciltransferasa de Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhidrolasas de la familia Ce 7 (WO09/67279), y variantes de perhidrolasa de M. smegmatis en particular la variante S54V usada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).
[0257] Amilasas: amilasas adecuadas (a y/o b) incluyen aquellas de origen bacteriano o fungico. Mutantes quumicamente modificados o creados geneticamente de protemas estan incluidos. Amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita con mas detalle en GB 1,296,839.
[0258] Ejemplos de amilasas utiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o mas de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391,408, y 444.
[0259] Amilasas disponibles comercialmente son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme™, Natalase™ y BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.).
[0260] Peroxidasas/oxidasas: peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen vegetal, bacteriano o fungico. Mutantes quumicamente modificados o creados geneticamente de protemas estan incluidos. Ejemplos de peroxidasas utiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de las mismas como aquellas descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Peroxidasas disponibles comercialmente incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S).
[0261] La(s) enzima(s) detergente(s) se puede(n) incluir en una composicion de detergente anadiendo aditivos separados que contienen una o mas enzimas, o anadiendo un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invencion, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede ser formulado, por ejemplo, como un granulado, lfquido, lodo, etc. Formulaciones de aditivo de detergente preferidas son granulados, en particular granulados no en polvo, lfquidos, en particular Kquidos estabilizados, o suspensiones acuosas.
[0262] Granulados no en polvo se pueden producir, por ejemplo, como se describe en US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden opcionalmente ser recubiertos por metodos conocidos en la tecnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso son productos de oxido de poli(etileno) (polietilenoglicol; PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; nonilfenoles etoxilados teniendo de 16 a 50 unidades de oxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados donde el alcohol contiene de 12 a 20 atomos de carbono y en el cual hay 15 a 80 unidades de oxido de etileno; alcoholes grasos; acidos grasos; y mono- y di- y trigliceridos de acidos grasos. Ejemplos de materiales de recubrimiento que forman pelmulas adecuados para aplicacion por tecnicas de lecho fluidificado se dan en GB 1483591. Preparaciones enzimaticas Kquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas anadiendo un poliol tal como propilenglicol, un azucar o alcohol de azucar, acido lactico o acido borico segun metodos establecidos. Enzimas protegidas se pueden preparar segun el metodo descrito en EP 238,216.
Materiales complementarios
[0263] Cualquier componente detergente conocido en la tecnica para usar en los detergentes de lavanderia tambien pueden ser utilizados. Otros componentes de detergente opcionales incluyen agentes anticorrosivos, agentes anti encogimiento, agentes antirredeposicion de suciedad, agentes antiarrugas, bactericidas, ligantes, inhibidores de corrosion, agentes desintegrantes/de desintegracion, colorantes, estabilizadores enzimaticos (incluyendo acido borico, boratos, CMC, y/o polioles tal como propilenglicol), acondicionadores
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de tejidos incluyendo arcillas, productos de relleno/ayudantes del tratamiento, agentes blanqueadores fluorescentes/abrillantadores opticos, potenciadores de espuma, reguladores de espuma, perfumes, agentes suspensores de suciedad, suavizantes, supresores de espuma, inhibidores de decoloracion, y agentes de efecto mecha, bien solos o en combinacion. Cualquier ingrediente conocido en la tecnica para usar en los detergentes de lavanderia puede ser utilizado. La eleccion de tales ingredientes esta bien en la habilidad del experto.
[0264] Dispersantes: las composiciones detergentes de la presente invention tambien pueden contener dispersantes. En particular detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Materiales organicos hidrosolubles adecuados incluyen acidos homo- o co-polimericos o sus sales, donde el acido policarboxNico comprende al menos dos radicales de carboxilo separados entre sf por no mas de dos atomos de carbono. Dispersantes adecuados son por ejemplo descritos en Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.
[0265] Agentes inhibidores de transferencia de tinte: las composiciones detergentes de la presente invencion pueden tambien incluir uno o mas agentes inhibidores de transferencia de tinte. Agentes inhibidores de transferencia de tinte polimericos adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, polnmeros de polivinilpirrolidona, polfmeros n-oxido de poliamina, copolnmeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas y polivinilimidazolas o mezclas derivadas. En caso de existir en una composicion de sujeto, los agentes de inhibition de transferencia de tinte pueden estar presentes a niveles de aproximadamente 0,0001 % a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 5% o incluso de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 3% en peso de la composicion.
[0266] Agente blanqueador fluorescente: las composiciones detergentes de la presente invencion
preferiblemente tambien contendran componentes adicionales que pueden tenir artfculos que son limpiados, tal como agente blanqueador fluorescente o blanqueador optico. Cuando esta presente el abrillantador esta preferiblemente a un nivel de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%. Cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para usar en una composition de detergente para ropa se puede utilizar en la composicion de la presente invencion. Los agentes blanqueadores fluorescentes usados mas frecuentemente son aquellos pertenecientes a las clases de derivados de acido sulfonico-diaminoestilbeno, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenilo-distirilo. Ejemplos del tipo de derivado de acido sulfonico de diaminoestilbeno de agentes blanqueadores fluorescentes incluyen las sales de sodio de: 4,4'-bis-(2- dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2,4-dianilino-s-triazin-6-
ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(N-metil-N-2-hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino)
estilbeno-2,2'-disulfonato, 4,4'-bis-(4-fenil-2,1,3-triazol-2-il)estilbeno-2,2'-disulfonato; 4,4'-bis-(2-anilino-4(1- metil-2-hidroxi-etilamino)-s-triazin-6-ilamino)estilbeno-2,2'-disulfonato y 2-(estilbil-4"-nafto-1.,2':4,5)-1,2,3-
trizol-2"-sulfonato. Agentes blanqueadores fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS disponibles de Ciba-Geigy AG, Basilea, Suiza. Tinopal DMS es la sal disodica de 4,4'-bis-(2-morfolino-4 anilino-s-triazin-6-ilamino)estilbeno disulfonato. Tinopal CBS es la sal disodica de 2,2'-bis-(fenil-estiril) disulfonato. Preferidos tambien como agente blanqueador fluorescente es el Parawhite KX, provisto por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, India disponible comercialmente. Otro fluorescente adecuado para usar en la invencion incluye las 1-3-diaril pirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas. Niveles de abrillantador fluorescente adecuados incluyen niveles inferiores de aproximadamente 0,01, de 0,05, de aproximadamente 0.1 o incluso de aproximadamente 0,2 % en peso a niveles superiores de 0,5 o incluso 0,75 % en peso.
[0267] Polimeros de elimination de suciedad: las composiciones detergentes de la presente invencion pueden tambien incluir uno o mas polfmeros de eliminacion de suciedad que ayudan a la eliminacion de suciedad de tejidos tal como algodon y tejidos a base de poliester, en particular la eliminacion de suciedad hidrofobica de tejidos a base de poliester. Los polfmeros de eliminacion de suciedad pueden por ejemplo ser polnmeros no ionicos o a base de tereftalato anionico, polivinil caprolactama y copolnmeros relacionados, copolnmeros de injerto de vinilo, poliamidas de poliester, vease por ejemplo capftulo 7 en Powdered Detergents, Surfactant science series volumen 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polnmeros de eliminacion de suciedad son polfmeros de limpieza de grasa alcoxilados anfifNicos que comprenden una estructura de nucleo y una pluralidad de grupos de alcoxilato fijados a esta estructura de nucleo. La estructura de nucleo puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina como se describe en detalle en WO 2009/087523. Copolnmeros de injerto aleatorio ademas son polfmeros de eliminacion de suciedad adecuados. Copolimeros de injerto adecuados son descritos con mas detalle en WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314. Otros polfmeros de eliminacion de suciedad son estructuras de polisacarido sustituidas especialmente estructuras celulosicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificados tales como los descritos en EP 1867808 o WO 2003/040279. Polnmeros celulosicos adecuados incluyen celulosa, eteres de celulosa, esteres de celulosa, amidas de celulosa y sus mezclas derivadas. Polnmeros celulosicos adecuados incluyen celulosa modificada anionicamente, celulosa modificada no ionicamente, celulosa modificada cationicamente, celulosa modificada zwitterionicamente, y sus mezclas derivadas. Polnmeros celulosicos adecuados incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa,
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etilcelulosa, hidroxil etilcelulosa, hidroxil propil metilcelulosa, ester de carboximetilcelulosa, y sus mezclas derivadas.
[0268] Agentes de antirredeposicion: las composiciones detergentes de la presente invencion pueden tambien incluir uno o mas agentes de antirredeposicion tal como carboximetilcelulosa (CMC), alcohol polivinNico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG), homopoKmeros de acido acrilico, copolnmeros de acido acrilico y acido maleico, y polietilenoiminas etoxiladas. Los polnrieros a base de celulosa descritos arriba bajo polfmeros de eliminacion de suciedad tambien pueden funcionar como agentes de antirredeposicion.
[0269] Otros materiales complementarios adecuados incluyen, pero de forma no limitativa, agentes de antirretraccion, agentes antiarrugas, bactericidas, ligantes, portadores, colorantes, estabilizadores enzimaticos, suavizantes, productos de relleno, reguladores de espuma, hidrotropos, perfumes, pigmentos, supresores de espuma, solventes, y estructurantes para detergentes Kquidos y/o agentes de elastizacion de estructura.
Biopeliculas
[0270] Microorganismos que crecen en biopeliculas son menos susceptibles a todos los tipos de agentes antimicrobianos que los mismos microorganismos cuando crecen en los cultivos de suspension convencionales.
[0271] Es bien conocido que bacterias subalimentadas pueden ser mucho menos susceptibles a una variedad de desaffos antimicrobianos. Por ejemplo, un numero de antibioticos tradicionales tal como penicilina, funcionan mal en bacterias de division lenta o sin division. Como la lisozima ataca y destruye la capa de peptidoglicano independientemente del estado de crecimiento de las bacterias, permanece eficaz.
Control de biopelicula; ejemplo lineas de agua dental:
[0272] La acumulacion de biopelicula dentro de una lmea de agua dental puede contener biopeliculas consistentes en Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Legionella sp. por nombrar unas pocas. Hay tambien la posibilidad de colonizacion de especies generalmente encontradas en la cavidad bucal como resultado del fallo de valvulas antirretraccion en el sistema. El riesgo de infeccion cruzada se vuelve aun mas un riesgo potencial por supuesto cuando pacientes inmunocomprometidos se implican y en este dfa y edad los numeros de pacientes dentro de esta categoria continua aumentando firmemente. La necesidad existe para un control eficaz de acumulacion de biopelicula bacteriana en las lmeas de agua dental. Una revision de biopeliculas puede ser encontrada: Watnick P y Kolter R (2000), "Biofilm, city of microbes", J Bacteriol.;182(10):2675-9.
[0273] Un ejemplo tfpico de un producto de pastilla para la garganta comercial es Lysopaine producido por: BOEHRINGER INGELHEIM FRANCE
Ingredientes activos:
BACITRACINA 200 U.I. (hasta 65 Ul/mg)
PAPAfNA 2 mg hasta 30 NK / mg CLORHIDRATO DE LISOZIMA 5 mg
hasta 26000 U FIP / mg: unidades determinadas midiendo la cinetica OD de lisis de bacterias suspendidas en el tampon. La determinacion de unidad fue medida por lisis inducida por cambio en la turbidez de un cultivo bacteriano suspendido en el tampon.
Ingredientes no activos:
Excipiente de SACARINA
Excipiente de ESTEARATO DE MAGNESIO
Aromatizante de Mentol
Excipiente de SORBITOL
[0274] Para tratamiento local de infecciones de puntos limitado a las membranas bucales de la orofaringe. Precaucion, si las indicaciones clmicas de una infeccion bacteriana general son evidentes, se aconseja terapia antibiotica.
Pasta dental:
[0275] La lisozima se puede usar sola o en combinacion con otras enzimas o incluso peptidos antimicrobianos. Ejemplos de otras enzimas son oxidasa de glucosa y lactoperoxidasa.
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[0276] Una composicion de pasta dental tfpica incluyendo lisozima es "Biotene" por Laclede, Inc., 2030 East University Drive, Rancho Domiguez, CA 90220, EE.UU.
Ingredientes activos
[0277] Contiene: lactoperoxidasa (100gm)
Ingredientes no activos
[0278] Glucosa-oxidasa, lisozima, monofluorofosfato de sodio, Sorbitol, glicerina, pirofosfato de calcio, sNice hidratada, Zylitol, goma de celulosa, aroma, benzoato sodico, beta-D-glucosa, tiocianato potasico
[0279] La presente invencion es posteriormente descrita por los ejemplos siguientes que no deberian ser interpretados como limitacion del ambito de la invencion.
EJEMPLOS
Cepas
[0280] Aspergillus aculeatus CBS 172.66 fue usado como la fuente de ADN para obtener la region codificante que codifica el candidato de la lisozima GH23. Segun Central Bureau vor Schnimmelkulture, Aspergillus aculeatus CBS 172.66 fue aislada por K.B. Raper en 1962 de suelo tropical.
[0281] La cepa MT3568 de Aspergillus oryzae fue usada para la expresion del gen de A. Aculeatus que codifica la enzima. A. oryzae MT3568 es un derivado de gen interrumpido de amdS (acetamidasa) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) donde auxotroffa de pyrG fue restaurada por la interruption de la acetamidasa del gen (amdS) de A. oryzae con el gen pyrG. Segun Central Bureau vor Schnimmelkulture, Acremonium alkalophilum CBS 114.92 fue aislado por A. Yoneda en 1984 desde el lodo de compost de heces de cerdo cerca del lago Tsukui, Japon.
Medios y soluciones
[0282] Medio YP fue compuesto por 10 g de extracto de levadura, 20 g de bactopeptona, y agua desionizada a 1 litro.
[0283] Medio LB fue compuesto por 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro sodico, y agua desionizada a 1 litro.
[0284] Medio de agar Horikoshi fue compuesto por: 1% (p/v) dextrosa, 1% almidon soluble, 0.5% (p/v) peptona, 0.5% extracto de levadura de (p/v), 0.02% (p/v) MgSO4-7H2O, 0.1% (p/v) K2HPO4, y 15 g (p/v) de Bacto-agar. 1 % (p/v) Na2CO3 fue anadido separadamente despues de la esterilizacion.
[0285] Placas de agar PDA fueron compuestas por infusion de patata (infusion de patata fue hecha por ebullition de 300 g de patatas cortadas (lavadas pero no peladas) en agua durante 30 minutos y luego decantando o colando el caldo a traves de estopilla. Agua destilada fue luego anadida hasta que el volumen total de la suspension fue un litro, seguido de 20 g (p/v) de dextrosa y 20 g (p/v) de polvo de agar. El medio fue esterilizado por la autoclave a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a edition, Revision A, 1998).
[0286] Placas de sacarosa de COVE fueron compuestas por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 ml de solution salina de COVE, y agua desionizada hasta 1 litro. El medio fue esterilizado por la autoclave a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a edicion, Revision A, 1998). El medio fue enfriado hasta 60°C y 10 mM acetamida, 15 mM CsCl y Triton X-100 (50 |jl/500 ml) fueron anadidos.
[0287] Placas de LB agar fueron compuestas por 37 g de LB agar y agua desionizada hasta 1 litro.
[0288] Solucion salina de COVE fue compuesta por 26 g de MgSO4^7H2O, 26 g de KCL, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solucion de metal traza de COVE, y agua desionizada hasta 1 litro.
[0289] Solucion de metal traza de COVE fue compuesto por 0,04 g de Na2B4Oz^10H2O, 0.4 g de CuSO4^5H2O, 1,2 g de FeSO4^7H2O, 0,7 g de MnSO4^O, 0.8 g de Na2MoO4^2H2O, 10 g de ZnSO4^7H2O, y agua desionizada hasta 1 litro.
[0290] Medio Dap-4C fue compuesto por 20 g de dextrosa, 10 g de maltosa, 11 g de MgSO4'7H2O, 1 g de KH2PO4, 2 g de acido titrico, 5.2 g de K3PO4 H2O, 0.5 g de extracto de levadura (Difco), 1 ml de
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antiespumante, 0,5 ml solucion de metales traza KU6, 2,5 g de CaCO3, y agua desionizada hasta 1 litro. El medio fue esterilizado por autoclave a 15 psi durante 15 minutes (Bacteriological Analytical Manual, 8a edicion, Revision A, 1998). Antes del uso, 3,5 ml de 50% (NH^HPO4 esteril y 5 ml de 20% acido lactico esteril fueron anadidos por 150 ml de medio.
[0291] Medio de glucosa YP+2% fue compuesto por 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de glucosa.
Ejemplo 1: ensayo de lisozima
[0292] Xanthomonas campestris es el organismo de production para toda la production de goma xantana. La separation de celulas de Xanthomonas desde la solucion de xantano altamente viscoso es un proceso de alto coste en la produccion industrial (Homma et al., EP690072, Murofushi et al., EP718311, US5702927). Hoy en dfa, el metodo favorecido para recuperar el xantano del lfquido de fermentation es precipitation con alcohol, principalmente isopropanol, despues de pasteurization para destruir las celulas bacterianas y enzimas (Cottrell, W. I.; Kang, S. K. Dev. (1978), "Xanthan gum: A unique bacterial polysaccharide for food applications", Ind. Microbiol, 19:177). Posteriormente el precipitado de xantano/detrito celular es secado por atomizacion y molido hasta obtener un polvo. El alcohol se recupera por destilacion. Debido a las cantidades significativas de detrito de pared celular de Xanthomonas en algunas preparaciones comerciales de goma xantana, y este detrito es material de pared celular de Xanthomonas rico en peptidoglicano, la goma se puede usar como un ensayo conveniente para la actividad de degradation de peptidoglicano.
Ensayo de placa solida:
[0293] Goma xantana preparada comercialmente (Sigma #G-1253) es disuelta en una solucion tamponada o medios de crecimiento bacteriano a 0,5% p/v en presencia de 0,7% agarosa y luego sometida a autoclave. Preparaciones enzimaticas, sobrenadantes u organismos enteros son bien depositados en pocillos retirados de las placas de agar Bacto o depositados directamente en la superficie de los medios. Las preparaciones son capaces de formar zonas de aclaramiento en las placas. Estas zonas de aclaramiento pueden indicar degradacion del material de la pared celular bacteriana.
Ensayo de aclarado liquido:
[0294] Goma xantana preparada comercialmente es disuelta en una solucion tamponada en presencia o ausencia de cloruro sodico. La solucion se somete a autoclave y se usa para estudios de compensacion de goma xantana. Preparaciones enzimaticas, sobrenadantes u organismos enteros se agregan al medio de ensayo y se incuban. Tratamientos resultantes se miden en un espectrofotometro para determinar el OD de la solucion. Tfpicamente se usa una longitud de onda de 600nm.
Ejemplo 2: clonacion y caracterizacion de lisozima GH23 de Aspergillus aculeatus (SEQ ID N.°: 2)
[0295] Information de la secuencia genomica fue generada por el U.S. Department of Energy Joint Genome Institute (JGI). Segun Central Bureau vor Schnimmelkulture, Aspergillus aculeatus CBS 172.66 fue aislada por K.B. Raper en 1962 de suelo tropical. Un ensamblaje preliminar del genoma fue descargado de JGI y analizado utilizando el Pedant-ProTM Sequence Analysis Suite (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemania). Modelos de gen construidos por el software fueron usados como un punto de partida para la detection de homologos de GH23 en el genoma. Modelos geneticos mas precisos fueron construidos manualmente utilizando secuencias protemicas de GH23 multiples conocidas como una gufa.
[0296] Para generar ADN genomico para amplification de PCR, Aspergillus aculeatus CBS 172.66 fue propagado en placas de agar PDA por el crecimiento a 26°C durante 7 dfas. Esporas cosechadas de las placas de PDA fueron usadas para inocular 25 ml de medio de glucosa YP+2% en un matraz de agitation disipado e incubadas a 26°C durante 48 horas con agitacion a 200 r.p.m.
[0297] ADN genomico fue aislado segun un protocolo modificado de FastDNA® SPIN (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA). En resumen, un equipo FastDNA® SPIN Kit for Soil (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, EE.UU) fue usado en un Sistema de Homogeneizacion FastPrep® 24 (MP Biosciences, Santa Ana, CA, USA). Dos ml de material fungico de los cultivos anteriores fueron cosechados por centrifugation a 14,000 x g durante 2 minutos. El sobrenadante fue quitado y el granulado resuspendido en 500 |jl de agua desionizada. La suspension fue transferida a un tubo Lysing Matrix E FastPrep® (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, EE.UU) y 790 jl de tampon de fosfato sodico y 100 jl de tampon MT del equipo de FastDNA® SPIN fueron anadidos al tubo. La muestra fue luego fijada en el instrumento FastPrep® (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, EE.UU) y procesada durante 60 segundos a una velocidad de 5,5 m/seg. La muestra fue luego centrifugada a 14000 x g durante dos minutos y el sobrenadante transferido a un tubo EPPENDORF® limpio. Un volumen de 250 jl de reactivo PPS del equipo FastDNA® SPIN fue anadido y luego la muestra fue mezclada suavemente por inversion. La muestra fue centrifugada nuevamente a 14000 x g durante 5
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Construccion de un vector de expresion de Aspergillus oryzae que contiene la secuencia genomica de CBS 172.66 de Aspergillus aculeatus que codifica un polipeptido P24DZF de la familia GH23 que tiene actividad de lisozima.
[0298] Dos cebadores oligonucleotidos sinteticos mostrados en la tabla 1 a continuacion fueron disenados para amplificar por PCR el gen P8EH GH23 de CBS 172.66 de Aspergillus aculeatus del ADN genomico. Un equipo IN-FUSION™ Cloning (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU) fue usado para clonar el fragmento directamente en el vector de expresion pDau109 (WO 2005/042735).
Tabla 1: cebadores ^ usados para amplificacion por PCR de GH23
Gen GH23
Cebador sentido especifico Cebador antisentido especifico
Aspergillus aculeatus CBS 172.66
F- P8EH 5’-ACACAACT GGGGATCCACCATGCA GTTGAACAACTTCCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 9) R- P8EH 5’-AGATCTCGAGAAGCTTACTATGCG CTCAGGGTGCACT-3’ (SEQ ID NO: 10)
[0299] Letras en negrita representan secuencia codificante. La secuencia subrayada es homologa a los sitios de insercion de pDau109.
[0300] La reaccion por PCR (25 jl) fue compuesta por 12,5 jl de 2X IPROOF™ HF Master Mix, 0,5 jl de cebador F- P24DZF (100 jM), 0,5 jl de cebador R- P24DZF (100 jM), 0,5 jl de genomico (100 ng/jl), y 11 jl de agua desionizada. La reaccion por PCR fue incubada en un DYAD® Dual-Block Thermal Cycler (MJ Research Inc., Waltham, MA, EE.UU) programado para 1 ciclo a 98°C durante 30 segundos; 30 ciclos cada uno a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 10 segundos, y 72°C durante 60 segundos; y 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos. Las muestras fueron enfriadas a 10°C antes de la eliminacion y posterior tratamiento.
[0301] Cinco jl de la reaccion por PCR fueron analizados por 1% electroforesis en gel de agarosa usando tampon TAE donde un producto de aproximadamente 770 bp fue observado. La reaccion por PCR restante fue purificada utilizando un equipo ILLUSTRA™ GFX™ PCR DNA y Gel Band Purification segun las instrucciones del fabricante.
[0302] El fragmento fue luego clonado en pDau109 digerido con Hind III y Bam HI utilizando un equipo INFUSiOn™ Cloning dando como resultado el plasmido pP8EH. Clonacion del gen P24DZF en pDau109 digerido con Hind III-Bam HI resulto en la transcripcion del gen P24DZF de Aspergillus aculeatus bajo el control de un promotor doble NA2-tpi. NA2-tpi es un promotor modificado del gen que codifica la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el lfder no traducido ha sido sustituido por un lfder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0303] El protocolo de clonacion fue realizado segun las instrucciones del equipo IN-FUSION™ Cloning que genera un constructo de P24DZF GH23. El plasmido e inserto tratados fueron transformados en celulas de E. coli Fusion Blue™ (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU) segun el protocolo del fabricante y colocados en placas LB suplementadas con 50 jg de ampicilina por ml. Despues de incubacion a 37°C durante toda la noche, las colonias fueron vistas crecer bajo seleccion en las placas de ampicilina LB. Diez colonias transformadas con el constructo P24DZF GH23 fueron cultivadas en el medio LB suplementado con 50 jg de
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ampicilina por ml y el plasmido fue aislado utilizando un FASTPlasmid mini kit de 5Prime (5 PRIME GmbH, Konigstrasse 4a, 22767 Hamburg, Alemania) segun las instrucciones del fabricante.
[0304] Plasmidos aislados fueron secuenciados con cebadores de vector y para determinar un clon de expresion de plasmido representativo que fue libre de errores de PCR.
Caracterizacion de las secuencias genomicas de CBS 172.66 de Aspergillus aculeatus que codifican el polipeptido GH23
[0305] Secuenciacion del ADN del clon genomico P24DZF GH23 de CBS172.66 de Aspergillus aculeatus fue realizada con un modelo de Applied Biosystems Model 3730xl Automated DNA Sequencer usando la version 3.1 de qufmica de terminador BIG-DYE™ (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE.UU) y estrategia de paseo con cebador. Datos de la secuencia de nucleotidos fueron escutrinados para calidad y todas las secuencias fueron comparadas una con la otra con asistencia de software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). La secuencia obtenida fue identica a la secuencia del JGI y se muestra en SEQ ID N.°: 1.
[0306] La secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoacidos deducida del gen P24DZF GH23 de Aspergillus aculeatus se muestra en SEQ ID N.°: 1 y SEQ ID N.°: 2, respectivamente. La secuencia codificante es 862 bp incluyendo el codon de terminacion y se interrumpe por un intron unico de 67 bp (nucleotidos 572 a 638). La protema predicha codificada tiene 264 aminoacidos y se muestra en SEQ ID N.°: 2. Utilizando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), un peptido senal de 19 residuos fue predicho. La protema madura predicha contiene 245 aminoacidos.
[0307] La cepa MT3568 de Aspergillus oryzae fue usada para todos los experimentos. MT3568 de Aspergillus oryzae es un derivado interrumpido de amdS (acetamidasa) de A. Oryzae JaL355 (WO 2002/40694) donde la auxotroffa de pyrG fue restaurada en el proceso de eliminacion del gen amdS de A. Oryzae. Protoplastos MT3568 de A. oryzae fueron preparados segun el metodo de patente europea, EP0238023, paginas 14-15. Protoplastos frescos MT3568 de A. Oryzae fueron preparados y transformados con el plasmido P24DZF GH23. ADN plasmido del procedimiento mini prep fue usado para transformar MT3568 de A. Oryzae.
[0308] Seis ul que contienen aproximadamente 3.0 |jg de ADN total fueron usadoa para la transformacion. El ADN fue suavemente anadido a 100 jl de protoplastos MT3568 de A. Oryzae y 250 jl de PEG 4000 al 60% (Sigma-Aldrich cat. N° 95904). El 60% de PEG 4000 (p/v) fue preparado de la siguiente manera: polvo PEG 4000 fue disuelto en H2O destilado doble y luego calentado durante 10-20 segundos en un horno microondas a 800 vatios hasta disolverse. La solucion disuelta fue enfriada hasta temperatura ambiente y luego ajustada con solucion CaCl2 y solucion Tris-HCl (pH 7.5) hasta una concentracion final de 10mM de cada una. Despues de anadir la solucion de PEG 4000 al 60%, el tubo fue suavemente mezclado e incubado a 37°C durante 30 minutos. La mezcla se anadio a 6 ml de agar blando con 10 mM acetamida y se coloco en placas de COVE-sorbitol con 10 mM de acetamida.
[0309] Las placas fueron incubadas a 37°C durante 3 o mas dfas y luego se movieron a 26°C durante dos dfas. Esporas de 8 colonias individuales fueron escogidas primero sumergiendo un eje de inoculacion blanco de 10 jl (Nunc A/S, Dinamarca) en una solucion de TWEEN® 80 al 0.1%, contactando la colonia de esporulacion en la placa de seleccion, y reestriando con el eje sobre placas de sorbitol COVE reciendtes conteniendo 10 mM de acetamida. Despues de 5 dfas a 26°C, las esporas de las colonias reestriadas fueron usadas para inocular una placa profunda de 96 pocillos (NUNC, cat. N° 260251, Thermoscientific, USA). Los pocillos de la placa profunda contenida 500uls de bien YP + 2% glucosa o medios DAP4C. La placa inoculada fue sellada con cinta permeable a los gases (89009-656, VWR.com). Placas fueron incubadas fijas a 30 C durante 5 dfas. Expresion fue verificada por analisis de 20 uls de fluido de cultivo cosechado en SDS- PAGE utilizando un NUPAGE® gel Bis-Tris al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU) y coloracion con azul Coomassie. Un transformante fue seleccionado para otro trabajo y designado EXP03899 de A. Oryzae.
[0310] Esporas de EXP03899 fueron inoculadas en ambos medios de glucosa YP+2% y medio DAP-4C-1 (100mls en matraz de agitacion de Erlenmeyer de 500ml con deflectores). Los cultivos fueron incubados a 26°C y 150 r.p.m., 3 dfas y si fuera necesario 4 dfas. Un gel SDS fue ejecutado como anteriormente para probar la cantidad de protema.
Prueba de placas para la actividad de lisozima
[0311] Un ensayo de manchas fue realizado con Goma xantana, a pH 5, 7 y 8 como se describe en la seccion ensayo de placas de lisozima.
[0312] Una solucion de agarosa al 1.5% (Invitrogen cat. 15510-027, calidad de electroforesis) fue preparada en los siguientes tampones:
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pH ~5 - en agua
pH ~7 - en 0.02M de fosfato potasico
pH 7 PH ~8 - en 0.02M de fosfato potasico pH 8
[0313] La agarosa fue sometida a autoclave durante 20 minutos a 121°C. 0,5% de goma xantana (Sigma G1253) fue disuelta en la agarosa derretida al 1,5 % y la mezcla vertida en placas petri. Cuando las placas fueron preparadas, los pocillos de aplicacion de muestra fueron hechos con una punta de pipeta P-1000 (corte a un diametro de 3 mm) fijada a una lmea de vado.
[0314] 20ul del fluido de cultivo de EXP03899 fue depositado en los pocillos de aplicacion e incubado a 37°C durante la noche. Muestras con actividad de lisozima fueron observadas por zonas de aclaramiento donde el detrito celular en la goma xantana fue observado. Fluidos de cultivo de EXP03899 presentaron esta zona de aclaramiento mientras el huesped MT3568 de transformacion no transformado de Aspergillus oryzae no produjo una zona de aclaramiento perceptible. El fluido de cultivo restante EXP03899 fue filtrado a traves de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0,22 |jm y almacenado en partes alfcuotas a -20°C hasta un uso posterior.
Ejemplo 3: clonacion y caracterizacion de dos genes codificantes de lisozima GH24 de Acremonioum alkalophilum (SEQ ID NOs: 4 y 6)
[0315] La informacion de la secuencia genomica fue generada por el U.S. Department of Energy Joint Genome Institute (JGI). Segun Central Bureau vor Schnimmelkulture, Acremonium alkalophilum CBS 114.92 fue aislada por A. Yoneda en 1984 del lodo de compost de heces de cerdo cerca del lago Tsukui, Japon. Un conjunto preliminar del genoma fue descargado de JGI y analizado utilizando el Pedant-ProTM Sequence Analysis Suite (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemania). Modelos geneticos construidos por el software fueron usados como un punto de partida para detectar los homologos GH24 en el genoma. Modelos de gen mas precisos fueron construidos manualmente utilizando secuencias de protema GH24 conocidas multiples como una gufa.
[0316] Acremonium alkalophilum CBS 114.92 fue propagado en agar Horikoshi, pH9 durante 7 dfas a 30 C. Micelios fueron cosechados directamente desde la placa y ADN fue aislado segun el equipo FastDNA SPIN Kit for Soil (
www.mpbio.com). El ADN fue eluido en 100 ul 10mM tampon TRIS, 0.1 mM EDTA, pH 7,5 y almacenado a 4 C hasta el uso.
[0317] Los pares de cebadores oligonucleotidos sinteticos mostrados en la tabla 2 a continuation fueron disenados para amplificar por PCR el gen P242MS GH24 de CBS114.92 de A. Alkalophilum o el gen P244A7 GH24 del ADN genomico de A. Alkalophilum descrito en el ejemplo 2 arriba.
Tabla 2: cebadores usados para amplification por PCR de GH24 y GH25
Gen GH24
Cebador directo especifico Cebador inverso especifico
A. alkalophilum CBS114.92 GH24 P242MS
F- P242MS 5’-ACACAACTGGGGATCCACC ATGGCCAAGGTCTCTACCCT- 3’ (SEQ ID NO: 11) R- P242MS 5’-AGAT CTCGAGAAG CTT ACT AAGAACAA
GCAGGGAGGGC-3’ (SEQ ID NO: 12)
A. alkalophilum CBS114.92 GH24 P244A7
F- P244A7 5’-ACACAACTGGGGATCCACC ATGGTCTCTTTCAAGCAGCT C-3’ (SEQ ID NO: 13) R- P244A7 5’-AGAT CTCGAGAAGCTT ACTAAGAGCAA
GCAGGCAGAGC-3’ (SEQ ID NO: 14)
[0318] Las letras en negrita representan la secuencia codificante. La secuencia subrayada es homologa a los sitios de insercion de pDau109.
[0319] La secuenciacion del ADN de los clones genomicos GH24 de CBS114.92 de Acremonium alkalophilum fue realizada con un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosysttems modelo 3730xl usando la qufmica de terminador BIG-DYE™ version 3.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE.UU) y estrategia de paseo con cebador. Los datos de las secuencias de nucleotidos fueron escutrinados para calidad y todas las secuencias fueron comparadas una con otra con asistencia del software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA). Las secuencias obtenidas fueron identicas a las secuencias del JGI.
Gen P242MS GH24
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[0320] La secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoacidos deducida del gen GH24 de Acremonium alkalophilum se muestran en SEQ ID N.°: 3 y SEQ ID N.°: 4, respectivamente. La secuencia codificante es 628 bp incluyendo el codon de terminacion y se interrumpe por un intron unico de 67 bp (nucleotidos 268 a 334). La protema predicha codificada es de 186 aminoacidos. Utilizando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), un peptido senal de 20 residuos fue predicho. La protema madura predicha contiene 166 aminoacidos.
Gen P244A7 GH24
[0321] La secuencia de nucleotidos y secuencia de aminoacidos deducida del gen P244A7 GH24 de Acremonium alkalophilum se muestran en SEQ ID N.°: 5 y SEQ ID N.°: 6, respectivamente. La secuencia codificante es de 782 bp con el codon de terminacion y se interrumpe por dos intrones de 81 bp (nucleotidos 134 a 214) y 170bp (nucleotidos 346-515). La protema predicha codificada tiene 176 aminoacidos. Utilizando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), un peptido senal de 19 residuos fue predicho. La protema madura predicha contiene 157 aminoacidos.
[0322] Los plasmidos para P242MS y P244A7 producidos y transformados en Aspergillus oryzae como en el ejemplo 2. Transformantes con fluidos de cultivo que produjeron producto protemico recombinante fueron identificados por SDS-PAGE como en el ejemplo 2 y designados: EXP03865, en el caso de P242MS, y EXP03890 en el caso de P244A7. Fluidos de cultivo de EXP03865 y EXP03890 fermentados en medios de glucosa YP+ 2% y DAP4C fueron manchados en las placas de detrito celular bacteriano de xantano. Se identifico que DAP4C produjo la mejor expresion de la protema mientras YP + 2% glucosa produjo la mejor expresion para EXP03890 tanto en el analisis de SDS-PAGE como en la actividad de ensayo de manchas.
Ejemplo 4: RDA (ensayos de difusion Radial)
[0323] Inicialmente, la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de cultivo y fracciones purificadas con las lisozimas recombinantemente expresadas fue confirmada utilizando un RDA como se describe previamente por Lehrer et al. (Lehrer RI, Rosenman M, Harwig SS et al. (1991), "Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides", J Immunol Methods, 137:167-73), con diferentes modificaciones. En resumen, 30 mL de 1/10 caldo Mueller-Hinton derretido (MHB) (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con 1% agarosa fue enfriado a 42°C, suplementado a 5.0x105 cfu/mL con S. Carnosus ATCC 51365 o E. Coli DSM682 (ATCC 10536) y fue vertido en una placa Omnitray (NUNC) de pocillo individual. La placa omnitray fue cubierta con una placa TSP (NUNC) y dejada solidificar. Despues de 1 h, la placa TSP fue quitada; dejando 96 pocillos de 1-mm en los que 10 |jL del compuesto de interes podrian ser evaluados.
[0324] 10 jl de la solucion de prueba son manchados por pocillo y las placas son incubadas O/N a 37°C. Al dfa siguiente, las zonas de aclaramiento no indicaron ningun crecimiento de bacterias de prueba ni por tanto de actividad antimicrobiana. Las zonas de aclaramiento fueron visualizadas por la coloracion con MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro, un tertrazol amarillo), que se reduce a formazan purpura en celulas vivas (Mosmann, Tim (1983), "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", Journal of Immunological Methods 65 (1-2): 55-63). Esta coloracion proporciona una coloracion oscura de celulas vivas y ninguna coloracion de las zonas de aclaramiento sin celulas vivas.
[0325] La lisozima GH25 de Aspergillus fumigatus (preparada como se describe en Korczynska et al, Acta Cryst. (2010) F66,973-977) fue incluida en la prueba como una referencia. Las muestras purificadas en la tabla 3 a continuacion han sido evaluadas en el ensayo RDA.
Tabla 3: Ensayo de difusion radial de lisozima GH24
Lisozima
Conc. madre. Dilucion 0.7 ug/ul Dilucion 0.35 ug/ul
A.alcalophilum GH24 SEQ ID NO: 6
1.4ug/ul 37.5ul enz. + 37.5ul agua 18.8ul enz. + 56.2ul agua
A. alcalophilum GH25 SEQ ID NO: 8
0.77ug/ul 68.2ul enz. + 6.8ul agua 34.1ul enz. + 40.9ul agua
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A.fumigatus GH25 (referencia)
12.2ug/ul 4.3ul enz. + 70.6ul agua 2.2ul enz. + 72.8ul agua
Medicion de zonas de aclaramiento
[0326] El experimento fue realizado por triplicado con todo dando como resultado las mismas zonas de aclaramiento/zonas de inhibicion medidas, vease figura 1. La Tabla 4 a continuacion muestra las zonas de aclaramiento en mm
Tabla 4: Zonas de aclaramiento antimicrobiano de Lisozima GH24 contra Staphylococcus carnosus y
Escherichia coli.
0.7 jg/jl S. carnosus 0.35 jg/jl S. carnosus 0.7 |jg/|jl E. coli 0.35 jg/jl E. coli
A.alcalophilum GH24 SEQ ID NO: 6
12 10 16 14
A. alcalophilum GH25 SEQ ID NO: 8
Debil Debil 8 (turbio) 6 (turbio)
A.fumigatus GH25 (referencia)
11 10 10 8
[0327] La lisozima purificada teniendo SEQ ID N.°: 6 mostro actividad antimicrobiana contra las celulas viables de las bacterias gram positivas Staphylococcus carnosus y las bacterias gram negativas Escherichia coli.
[0328] La actividad antimicrobiana no esta presente en sobrenadantes del cultivo desde el huesped de production de Aspergillus no transformado (resultados no mostrados).
[0329] Zonas de aclaramiento grandes con bordes no definidos fueron observadas rodeando la zona de aplicacion para GH24 de A. alcalophilum (SEQ ID N.°: 6). El experimento indica que la lisozima de A. alcalophilum (SEQ ID N.°: 6) y la lisozima de referencia GH25 de Aspergillus fumigatus tienen actividad diferente y especificidad contra las dos bacterias evaluadas en este ejemplo.
Ejemplo 5: ensayo de turbidez
[0330] La actividad de lisozima fue determinada por la medicion de la reduction (cafda) en la absorbencia/densidad optica de una solution de Micrococcus lysodeikticus resuspendida ATTC n° 4698 (Sigma-Aldrich M3770) o Exiguobacterium undea (DSM14481) medida en un espectrofotometro a 540 nm.
Preparation de sustrato de Micrococcus lysodeikticus
[0331] Antes de usar las celulas fueron resuspendidas en el tampon de fosfato - acido titrico pH 6.5 hasta una concentration de 0.5 mg celulas/ml y la densidad optica (OD) a 540 nm fue medida. La suspension celular fue luego ajustada de modo que la concentracion celular igualo una OD540 = 1.0. La suspension celular ajustada fue luego almacenada en frio antes de usar. Celulas resuspendidas fueron usadas dentro de 4 horas.
Preparacion de tampon fosfato - acido citrico pH 6.5
[0332] 29 mL 0.1 M acido titrico fue mezclado con 61 mL 0.2 M Na2HPO4, y el pH fue ajustado con HCl o NaOH a pH 6.5.
Preparacion de celulas secadas de Exiguobacterium undae (el sustrato)
[0333] Un cultivo de E. undae (DSM14481) fue crecido en 100 mL de medio LB (Fluka 51208,25 g/L) en un matraz de agitation de 500 mL a 30°C, 250 r.p.m. durante toda la noche. El cultivo durante toda la noche fue luego centrifugado a 20°C y 5000g durante 10 minutos, y el granulado fue lavado dos veces en agua milliQ esteril, y resuspendido en agua Milli-Q. Las celulas lavadas fueron centrifugadas durante 1 minuto a 13000 r.p.m. y en lo posible el sobrenadante fue decantado. Las celulas lavadas fueron secadas en un vatio
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centrifugo durante 1 hora. El granulado celular fue resuspendido en el tampon de fosfato - acido dtrico pH 6.5 de modo que la densidad optica (OD) a 540nm = 1.
Medicion de actividad antimicrobiana de lisozima en el ensayo de turbidez
[0334] La muestra de lisozima para ser medida fue diluida a una concentracion de 100-200 mg de protema enzimatica/L en tampon fosfato - acido dtrico pH 6.5, y mantenida en hielo hasta el uso. En una placa de microtitulacion (NUNC) de 96 pocillos 200|jL del sustrato se anadio a cada pocillo, y la placa fue incubada a 25°C o 37°C durante 5 minutos en un lector de microplacas VERSAmax (Molecular Devices). Despues de la incubacion, la absorbancia de cada pocillo fue medida a 540 nm (valor inicial). Para iniciar la medicion de la actividad, 20 jL de la muestra de lisozima diluida se anadio a cada sustrato (200 jL) y la medicion cinetica de absorbancia a 540 nm fue iniciada durante mmimo 30 minutos hasta 24 horas a 25°C o 37°C. La absorbancia medida a 540 nm fue monitoreada para cada pocillo y a lo largo del tiempo se ve una cafda en la absorbancia si la lisozima tiene actividad de lisozima.
[0335] La lisozima GH25 de Aspergillus fumigatus (Korczynska et al (2010) supra.) fue incluida en la prueba como una referencia y los resultados se muestran en la tabla 5 a continuacion.
Tabla 5: Actividad de lisozima de lisozimas GH25 contra el Micrococcus lysodeikticus y Exiguobacterium undea como se mide por la caida de la densidad optica
Micrococcus lysodeikticus Exiguobacterium undae
Temperatura
37°C 25°C 37°C
A.alcalophilum GH24 (SEQ ID NO: 4)
NT - -
A.alcalophilum GH24 (SEQ ID NO: 6)
+ + + + +
A.fumigatus GH25 (referencia)
+ ++ + + + +
NT significa no testado - significa ningun efecto + significa efecto pequeno ++ significa efecto medio +++ significa efecto grande
Ejemplo 6: expresion de protema GH24 P242MS y protema GH24 P244A7 en Aspergillus oryzae
[0336] Los constructos que comprenden el gen de lisozima pertinente fueron usados para construir vectores de expresion para Aspergillus. Los vectores de expresion de Aspergillus consisten en un casete de expresion basado en el promotor de amilasa II neutra de Aspergillus niger II fusionado a la secuencia lfder no traducida de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de amiloglicosidasa de Aspergillus niger (Tamg). Tambien estaba presente en el plasmido el marcador amdS selectivo de Aspergillus de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento en la acetamida como unica fuente de nitrogeno. Los plasmidos de expresion fueron transformados en Aspergillus como se describe en el ejemplo 3. Para cada uno de los constructos 10-20 cepas fueron aisladas, purificadas y cultivadas en frascos de agitacion.
Ejemplo 7: purificacion de protema GH24 P242MS y protema GH24 P244A7 en Aspergillus oryzae
Purificacion de proteina GH24 de P242MS
[0337] El sobrenadante de fermentacion con la lisozima fue filtrado a traves de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 jm. El pH fue ajustado a 7.5 con 0.1 M NaOH y la solucion resultante fue concentrada (volumen reducido por un factor de 8) en una unidad de filtracion Ultra (Sartorius) con una membrana cortada de 5 kDa.
[0338] Despues de pretratamiento, aproximadamente 55 ml de la solucion que contiene lisozima fue purificado por cromatograffa en Q Sepharose, aproximadamente 50 ml en una columna XK26, que usa como tampon A 50 mM TRIS pH 7.5, y como tampon B 50 mM TRIS + 1 M pH de NaCl 7.5. Las fracciones desde la
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columna fueron agrupadas basadas en el cromatograma (absorcion a 280 y 254 nm) y analisis SDS-PAGE. Las fracciones agrupadas fueron cambiadas de tampon en 50 mM Na-acetato, pH 5.5 y concentradas en un Vivacell 250 ml, 5 kDa filtro PES.
[0339] El peso molecular, como estimado de SDS-PAGE, fue aproximadamente 20 kDa y la pureza fue > 95%.
Purificacion de proteina P244A7 GH24
[0340] El sobrenadante de fermentacion con la lisozima fue filtrado a traves de un sandwich de cuatro filtros de microfibra de vidrio de Whatman (2.7, 1.6, 1.2 y 0.7 micrometros) y luego a traves de un filtro superior de Fast PES Bottle con un corte de 0,22 |jm. El pH fue ajustado a 4.5 con 10% acido acetico. Despues del ajuste de pH la solucion se volvio un poco turbia y se quito por filtracion a traves de un filtro superior de Fast PES Bottle con un corte de 0,22 jm.
[0341] Despues del pretratamiento aproximadamente 970 ml de la solucion que contiene lisozima fue purificado por cromatografia en la SP Sepharose, aproximadamente 50 ml en una columna XK26, usando como tampon A 50 mM Na-acetato pH 4,5, y como tampon B 50 mM Na-acetato + 1 M NaCl pH 4,5. Las fracciones desde la columna fueron agrupadas basadas en el cromatograma (absorcion a 280 y 254 nm) y analisis de SDS-PAGE. Las fracciones agrupadas fueron cambiadas de tampon en 50 mM Na-acetato, pH 5.5 y concentradas usando filtros giratorios de Amicon con un corte de 10 kDa.
[0342] El peso molecular, como se estimo de SDS-PAGE, fue aproximadamente 20 kDa y la pureza fue > 90%.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0343]
<110> Novozymes A/S
<120> POLYPEPTIDES HAVING LYSOZYME ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME <130> 12166-EP-EPA <160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 862 <212> DNA
<213> Aspergillus aculeatus
<220>
<221> CDS <222> (1)..(571)
<220>
<221> sig_peptide <222> (1)..(57)
<220>
<221> CDS <222> (639)..(859)
<400> 1

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
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    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Polipeptido aislado que tiene actividad de lisozima, seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) un polipeptido con al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia a los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6;
    (b) un polipeptido codificado por un polinucleotido con al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% identidad de secuencia a la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5;
    (c) un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida bajo condiciones de astringencia altas o muy altas con la secuencia codificante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 5, o el complemento en toda su longitud del mismo;
    (d) una variante del polipeptido maduro de SEQ ID N.°: 6, que comprende una sustitucion, delecion, y/o insercion en una o mas (por ejemplo; diferentes) posiciones, donde los polipeptidos diferen de no mas de 17 aminoacidos de los aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6; y
    (e) un fragmento del polipeptido de (a); (b), (c) o (d) que tiene actividad de lisozima.
  2. 2. Polipeptido segun la reivindicacion 1, que comprende o consiste en SEQ ID N.°: 6, el polipeptido maduro de SeQ ID N.°: 6 y/o aminoacidos 20 a 176 de SEQ ID N.°: 6.
  3. 3. Composition que comprende el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  4. 4. Composicion de detergente que comprende uno o mas componentes seleccionados del grupo que comprende tensioactivos, constructores, hidrotropos, sistemas blanqueadores, poKmeros, agentes de matizado de tejido, materiales complementarios, dispersantes, agentes de inhibition de transferencia de tinte, agentes blanqueadores fluorescentes, polfmeros liberadores de suciedad y agentes antirredeposicion.
  5. 5. Composicion de detergente segun la reivindicacion 4, donde la composicion comprende unas o mas enzimas adicionales seleccionadas del grupo que comprende proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasas, xiloglucanasas, pectinasas, pectina liasas, xantanasas, peroxidasas, haloperoxigenasas, catalasas y mananasas, o cualquier mezcla de las mismas.
  6. 6. Composicion de pienso para animales que comprende el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  7. 7. Composicion de pienso para animales segun la reivindicacion 6, que comprende ademas una o mas amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-glactosidasas; proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de las mismas.
  8. 8. Aditivo de pienso que comprende al menos un polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; y al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento.
  9. 9. Aditivo de pienso para animales segun la reivindicacion 8, que comprende ademas una o mas amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-glactosidasas; proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de las mismas.
  10. 10. Uso del polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 como un inhibidor de formation de biopelfcula.
  11. 11. Uso del polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en una composicion dental, en una composicion detergente o en el pienso para animales.
  12. 12. Uso de un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para la descomposicion de las paredes celulares de las bacterias.
  13. 13. Polinucleotido aislado que codifica el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  14. 14. Constructo de acidos nucleicos o vector de expresion que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 13 operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion del polipeptido en un huesped de expresion.
  15. 15. Celula huesped recombinante que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 13 operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion del polipeptido.
  16. 16. Metodo para producir un polipeptido con actividad de lisozima, que comprende:
    (a) cultivo de la celula huesped segun la reivindicacion 15 bajo las condiciones conductoras para la produccion del polipeptido; y
    (b) recuperacion del polipeptido.
    5
    RDA con 10 n Lisozimas 0.7ug/u
  17. 0.35ug/ul manchados contra S.carnoSUS 05.10.11
    E.coli
    C.7ug/ul enzima RD.A. S.Carrosus AID#2 71
  18. 0.35i:g/ul enzima RDA: S.Carnosiis AID#271
    imagen1
    imagen2
    G.-35ttgAtl enzima
    RDA; C.co i AIDfi213
    Qr7ug/ttl enzima.
    RDA. E.coli AIDK213
    Fig. 1
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