CN106132995A - 蛋白质晶体在低pH下的再增溶 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了一种用于纯化发酵过程中制备的蛋白质产物的方法，其中感兴趣的蛋白质以固体、结晶或非晶形形式存在于发酵容器中，其中发酵液的pH被调节至低pH从而使感兴趣的蛋白质溶解并可以从不溶物中有效地分离出。

Description

蛋白质晶体在低pH下的再增溶
序列表的引用
本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及蛋白质纯化领域，具体涉及通过发酵过程制备的蛋白质的蛋白质纯化领域。
发明背景
工业蛋白生产的一个重要部分是将所希望的蛋白质从其中已经生成了蛋白质的产物混合物的其余部分中进行纯化。
在发酵工业中，蛋白质一般通过经设计或选择以产生大量所希望的蛋白质的特殊细胞产生。所生产的蛋白质可以被这些细胞分泌到细胞周围的体液中。已经在发酵期间产生蛋白质之后，一般在蛋白质处于预期形式和纯度之前在后续步骤中对其进行纯化。在纯化过程期间，通常将所产生的蛋白质从生产培养基的一种或多种组分中分离，并且通常涉及可溶性蛋白质从固体细胞物质中的分离。
如果蛋白质以足够高的量生产，那么其可以以结晶形式沉淀，这为通常发酵之后的纯化过程中造成了额外的挑战，因为蛋白质需要是可溶的以便从产物混合物的固体细胞物质和/或其他固体组分中分离。在这种情况下，可以用另外的水或能溶解已沉淀的蛋白质的其它流体稀释产物混合物。然而，即使稀释该产物混合物可以解决在产物混合物中沉淀的蛋白质的问题，但这是一个不太希望的解决方案，因为这也意味着体积增大，并且因此随后的纯化设备必须能够处理由于稀释产生的更大的体积，这通常意味着更多的投资和更高的操作花费是必需的，以应对增加的体积。
因此，需要一种使用于分离过程的蛋白质产物再增溶的方法，其中再增溶发生而不引发体积的高度增加。
发明既述
在第一方面，本发明涉及用于纯化如下过程中蛋白质产物的方法，其中该蛋白质的至少一部分具有位于该蛋白质表面上的2-6个组氨酸残基；该过程包括以下步骤：
a.提供发酵液，
b.任选地将pH调节至低于组氨酸侧链的pKa的值；
c.任选地保持该混合物一段时间；并且
d.从来自发酵液的至少一部分固体物质中分离溶解的蛋白质产物。
在第二方面，本发明涉及一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至一种或多种指导该感兴趣的蛋白的生产的控制序列上，和至少一种编码修饰蛋白的多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至一种或多种指导该修饰蛋白的生产的控制序列上。
在第三方面，本发明涉及一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至一种或多种指导该感兴趣的蛋白的生产的控制序列上，和至少一种编码修饰蛋白的多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至一种或多种指导该修饰蛋白的生产的控制序列上。
在另一方面，本发明涉及使用第二方面的重组微生物以产生蛋白产品，该蛋白产品包含感兴趣的蛋白和修饰蛋白，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白具有携带沿C-末端和/或N-末端延伸的2-6个组氨酸残基的相同氨基酸序列。
优选地，该感兴趣的蛋白是一种酶。
附图简要说明
图1A示出了SDS-page凝胶，该SDS-page凝胶显示来自溶菌酶发酵与发酵期间所取样本的上清液。图中的泳道1是标记物，泳道2-6分别为97小时后、120小时后、144小时后、169小时后以及192小时后来自溶菌酶发酵的发酵液的上清液样品；并且泳道7是纯化的溶菌酶标准。可以看出，由于沉淀，与144小时后相比在169小时后和192小时后溶菌酶的量降低。
图1B示出了SDS-page凝胶，该SDS-page凝胶显示来自溶菌酶发酵与发酵期间所取样本的上清液。图中的泳道1是标记物，泳道2-6分别为97小时后、120小时后、144小时后、169小时后以及192小时后来自溶菌酶发酵的发酵液的上清液样品；并且泳道7是纯化的溶菌酶标准。可以看出，在整个发酵过程期间溶菌酶的量增加。
发明详述
定义
编码序列：术语“编码序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)下述任何物质，包括但不限于任何酶、变异核酸、蛋白质、肽或辅因子，其中所述物质至少部分地从在自然界中与该物质结合的一种或多种或所有天然存在的组分移除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指呈其在翻译以及任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，所述修饰如N末端加工、C末端截断、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C末端和/或N末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
当今许多蛋白质产品在发酵过程中进行制备，其中微生物在发酵罐中使用特定底物和发酵方案进行发酵。这是众所周知的并且在本领域中已经描述了许多发酵方案。在发酵期间，微生物产生预期的蛋白质并分泌该蛋白质进入发酵液中。在发酵过程后，将包括已溶解的预期的蛋白质的液体部分从固体(如细胞、细胞碎片以及来自底物的固体残余)中分离，并且蛋白质产物可以使用本领域已知的技术从该液体部分中进一步纯化。在许多工业发酵中，然而却经历了所生产的预期的蛋白质产物的量过高，使得蛋白质沉淀从而形成结晶或非晶形固体，因为不易从固体部分中分离而造成了纯化中的问题。
可以用于在本发明的方法中的蛋白质在原则上是与在组氨酸侧链的pKa以上的pH值下的溶解度相比，在低于组氨酸侧链的pKa的pH值下具有较高溶解度的任何蛋白质。
优选地，低于组氨酸侧链的pKa的pH值是低于组氨酸侧链的pKa至少0.1个pH单位，优选地低于至少0.2个pH单位、优选地低于至少0.3个pH单位、优选地低于至少0.4个pH单位、优选地低于至少0.5个pH单位、优选地低于至少0.6个pH单位、优选地低于至少0.7个pH单位、优选地低于至少0.8个pH单位、优选地低于至少0.9个pH单位、优选地低于至少1.0个pH单位、优选地低于至少1.5个pH单位、优选地低于组氨酸侧链的pKa值至少2.0个pH单位。
高于组氨酸侧链的pKa的pH值是高于组氨酸侧链的pKa至少0.1个pH单位，优选地高于至少0.2个pH单位、优选地高于至少0.3个pH单位、优选地高于至少0.4个pH单位、优选地高于至少0.5个pH单位、优选地高于至少0.6个pH单位、优选地高于至少0.7个pH单位、优选地高于至少0.8个pH单位、优选地高于至少0.9个pH单位、优选地高于至少1.0个pH单位、优选地高于至少1.5个pH单位、优选地高于组氨酸侧链的pKa值至少2.0个pH单位。
将被理解的是，组氨酸具有三个pKa值，一个值针对羧基基团，一个值针对吡咯基团并且一个值针对NH2基团。在一种肽(如多肽或蛋白质)中，羧基基团和NH2基团中的至少一个以肽键结合至相邻的氨基酸上。
本说明书和权利要求中的组氨酸侧链的pKa旨在表示组氨酸分子的咪唑环的pKa。在25℃下该咪唑基团的pKa大约是6.0。技术人员将理解的是，该pKa将会随条件，如温度、浓度和溶剂的离子强度而轻微改变。对于涉及蛋白质的纯化的本说明来说，相关的条件是引起蛋白质的相对较小的变性的条件，即相对温和的条件。在这样的条件下，出于本发明的目的可以假定组氨酸侧链的pKa为6.0，并且除非另有具体说明在本说明书和权利要求书中进行假定。
这意味着，在pH低于6.0下的组氨酸(具体是暴露于蛋白质的表面上的组氨酸)上的咪唑基团，将主要被质子化并因此带正电荷，而在pH高于6.0下的组氨酸(具体是暴露于蛋白质的表面上的组氨酸)上的咪唑基，将主要被非质子化并因此不带电荷。
针对游离的组氨酸，组氨酸侧链的pKa大约是6.0。针对组氨酸侧链的pKa可受周围的氨基酸影响，具体针对位于蛋白质结构内部的组氨酸。有关本发明的组氨酸是位于感兴趣的蛋白的表面上的组氨酸，并且因此高度暴露于环境中，并且因此对于这些组氨酸的pKa中的变化会仅仅很小。因此，出于本发明的目的，针对组氨酸侧链的pKa可被认为是6.0独立于周围氨基酸。
因此，在一个实施例中，用于在本发明的方法中使用的这些蛋白质是与在pH 6.5下的溶解度相比，在pH 5.5下具有较高溶解度的蛋白质；或是与在pH 7.0下的溶解度相比，在pH 5.0下具有较高溶解度的蛋白质；或是与在pH 8.0下的溶解度相比，在pH 4.5下具有较高溶解度的蛋白质。
本发明基于以下发现：在其表面处具有2-6个组氨酸的蛋白质在低于组氨酸侧链的pKa的pH下典型地具有高溶解度，其中该组氨酸侧链或其重要部分是带正电的，与具有相同序列(除了2-6个组氨酸之外)的对应蛋白质相比。在高于组氨酸侧链的pKa的pH值下，该组氨酸侧链通常是不带电的，并且典型地这导致在此pH下的较低的溶解度。
具体而言，本发明涉及在蛋白质的表面区域通过插入或取代组氨酸残基而修饰的蛋白质，因此经修饰的蛋白质在表面上含有2-6个组氨酸。所述2-6个组氨酸可内在地位于一级序列，或者它们可以被附接至成熟蛋白质的C-末端或N-末端、或它们的任意组合。此类修饰的蛋白质在低于组氨酸侧链的pKa的pH下具有高溶解度的益处，大概由于在该pH下的组氨酸残基的正电荷；但在高于组氨酸侧链的pKa的pH下经修饰的蛋白质将与未经修饰的蛋白质具有相同的电荷，并且因此可以准确地作为未修饰的蛋白质使用。
蛋白质产物在原则上可以是在发酵过程中制备的任何蛋白质，并且本发明涉及分离过程，其中在给定条件下蛋白质以高于其溶解度的浓度存在，因此这导致处于结晶或无晶型形式的蛋白质产物的沉淀。
所述蛋白质可以是治疗性蛋白质或酶。该酶可以是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，该感兴趣的酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
蛋白酶
在一个优选实施方案中，所述蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶或金属蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶是一种使用了由Asp32、His64以及Ser221(枯草杆菌蛋白酶BPN'编号)组成的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。
枯草杆菌蛋白酶可根据肽酶分类描述为：宗族SB，家族S8，MEROPS ID：S08.001。
枯草杆菌蛋白酶描述于例如，Barrett等人，1998，蛋白水解酶手册(Handbook ofproteolytic enzymes)，学术出版社(Academic press)，289-294页中。西埃泽恩(Siezen)和洛因伊森(Leunissen)，蛋白质科学(Protein Science)，1997，6&501-523提供了枯草杆菌蛋白酶的描述。
对本发明的和/或用于本发明用途的蛋白酶的来源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括自然或野生型的蛋白酶，还包括展示其蛋白酶活性的任何突变体、变体、片段等等，以及合成的蛋白酶，例如改组的蛋白酶以及共有蛋白酶。这种基因工程蛋白酶可以按照本领域通常已知的制备，例如通过定点诱变，通过PCR(在PCR反应中，使用含有所希望的突变的PCR片段作为引物之一)，或者通过随机诱变。共有蛋白的制备在例如EP 897985中描述。
用于在本发明中使用的蛋白酶的实例包括野生型蛋白酶(如具有SEQ ID NO:2(Savinase)或SEQ ID NO:25(BPN’)的氨基酸序列的蛋白酶)或蛋白酶变体(如具有SEQ IDFNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的Savinase变体)。用于在本发明中使用的优选的蛋白酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25中的一个具有至少80％序列一致性，例如至少90％序列一致性、例如至少95％序列一致性、例如至少96％序列一致性、例如至少97％序列一致性、例如至少98％序列一致性、例如至少99％序列一致性的蛋白酶。
淀粉酶
适合的淀粉酶(a和/或β)包括细菌来源的那些。包括化学修饰的变体或蛋白质工程变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属(Bacillus)，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌(B.Licheniformis)的α菌株获得的α-淀粉酶。
纤维素酶
适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体(包括取代、插入和/或缺失)。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如由在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中公开的特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。
脂肪酶
适合的脂酶包括含有蛋白质工程化的突变体(包括取代、插入和/或缺失)的细菌或真菌来源的那些。适合的脂肪酶包括来自腐质霉属和根毛霉属的脂肪酶，例如产自柔毛腐质霉(Humocola lanuginose)和米黑根毛霉(Rhizomucor mihei)的真菌脂肪酶。
氧化还原酶
根据本发明处理的氧化还原酶包括过氧化物酶(EC 1.11.1.7)和氧化酶，如漆酶和过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)。
溶菌酶
在此将术语“溶菌酶”活性定义为一种催化两个或更多个碳水化合物之间、或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键的水解的O-糖基水解酶。溶菌酶裂解细菌细胞壁的黏多糖和黏肽中的某些残基之间的糖苷键，例如在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰基-D-葡糖胺残基之间以及在壳糊精中的N-乙酰基-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-键，这导致溶菌作用。溶菌酶属于EC 3.2.1.17酶类。
用于在本发明中使用的溶菌酶的实例包括披露于WO 2003/076253中的溶菌酶。用于在本发明中使用的优选的溶菌酶是与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，例如至少90％序列一致性、例如至少95％序列一致性、例如至少96％序列一致性、例如至少97％序列一致性、例如至少98％序列一致性、例如至少99％序列一致性的溶菌酶。
发酵液中的在发酵过程结束时的pH和低pH被选择，使得感兴趣的蛋白质的净电荷在发酵结束时的pH和低pH值之间变化。确保这一点的一种优选的方法是选择具有2-6个氨基酸(具有位于感兴趣的蛋白质的表面上的在发酵结束时的pH值和低pH值之间的pKa值)的感兴趣的蛋白质。
氨基酸残基(在适当的范围内具有采用常用的宿主细胞的pH耐受性和感兴趣的蛋白质的pH稳定性的pKa值)的优选实例可以举出具有约6.0的侧链的pKa的组氨酸。
在发酵液中的发酵结束时的pH可取决于几个参数，如宿主生物、发酵培养基的成分、供氧、过程期间pH调节的延伸以及一般来说发酵过程下的条件。然而，典型的工业发酵过程是pH调节的，并且在发酵结束时的pH由施加到具体过程的pH调节来确定。
用于根据本发明使用的蛋白质可以是天然的蛋白，理解为与在自然界中天然发现的蛋白质具有相同的氨基酸序列的蛋白质；或者它可以是工程化的蛋白质，其中氨基酸序列已经被人类改变，其结果是具有这样的氨基酸序列的蛋白质没有在自然界天然发现。
用于本发明的方法中使用的一类优选的这样的蛋白质是具有位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基的蛋白质。此类蛋白质可以是天然蛋白或者可以被工程化，例如工程化以在其表面上包含2-6个组氨酸。位于表面上的2-6个组氨酸残基可以内部位于蛋白质的一级氨基酸序列中或者它们可以位于蛋白质的氨基酸序列的一端或另一端，或者它甚至可以是其组合。
用于本发明的方法中使用的一类优选的工程化的蛋白质是具有附接至N-末端或C-末端或蛋白质的His标签的蛋白质。在本申请中，His-标签意在是指包含2-6个相邻的组氨酸残基的氨基酸的一小段。该His标签可包含蛋白酶切割位点，该位点允许在纯化包括his-标签的蛋白之后移除his-标签，并由此获得没有任何his标签残基的蛋白质。
用于在本发明的方法中使用的其他工程化蛋白质和酶被工程化以在一级氨基酸序列内部和位于该蛋白质的表面上包含2-6个组氨酸。此类蛋白质可按在欧洲专利局提交并命名为“酶变体及其多核苷酸编码”(通过引用包括在本文中)的共同待审的申请号14162434.6中所描述的被设计，并且其传授内容也应用于本说明书和权利要求中。
一般在发酵过程中的pH在过程期间被控制以获得最佳产品产量和质量。这在本领域中是熟知的。使用具有位于表面上的2-6个组氨酸的蛋白质可提供具体的益处使得通过控制pH影响感兴趣的蛋白的溶解度是可能的。因此可以通过降低pH至低于组氨酸侧链的pKa的pH值来增加溶解度，并可以通过升高pH至高于组氨酸侧链的pKa的pH值来降低溶解度。
这对于提供易感于蛋白酶降解的意向产物和此外提供结束发酵液的蛋白酶的发酵具有特别的益处。这种情况可以有益于在感兴趣的蛋白质在发酵期间沉淀于其中的条件下进行该过程，因为蛋白质一般在固体状态较少易感于蛋白酶降解，并且为了从固体部分分离意向蛋白质，在纯化期间溶解蛋白质。
已知的是，许多微生物在发酵期间生产蛋白酶，无论是作为意向产物、作为副活性或作为一些细胞的裂解的结果，这些全部可以导致感兴趣的意向蛋白质的某些降解，并从而导致产品的损失或产品质量的降低。具体而言，在蛋白酶生产的发酵中所产生的蛋白酶会降解存在的蛋白质，被称为蛋白质自水解，并且因此其可以有利于发酵期间蛋白酶沉淀于其中的条件下的蛋白酶发酵过程，并由此保护对抗蛋白质自水解，并且随后的蛋白质在纯化期间再增溶，在纯化中使用适合的分离技术从固体分离该产物。
这可根据本发明在至少一部分纯化期间通过在pH 6.0以上和低于pH 6.0的pH的发酵来完成。发酵可以例如在pH 6.0以上、例如6.2以上、例如6.5以上、例如7.0以上来进行并且至少一部分纯化可以在pH低于5.8、例如低于5.5、例如低于5.0下来进行。
在一个优选的实施例中，蛋白质产物通过工程化微生物来生产，该微生物被工程化以包含编码感兴趣的基因的一个或多个基因和编码感兴趣的基因的修饰变体的一个或多个基因，被修饰以使所编码的蛋白质在一级氨基酸序列的内部和位于该蛋白质的表面上包含2-6个组氨酸，或附接至蛋白质的N-末端和/或C-末端的2-6个组氨酸的His-标签；并且其中感兴趣的一个或多个基因和感兴趣的一个或多个修饰的基因在微生物的发酵期间被全部表达。已经令人惊奇地发现，由这种工程化的微生物生产的感兴趣的蛋白质与对应的不具有感兴趣的修饰的基因的微生物相比具有更高的溶解度，并且还有通过改变pH低于6.0，感兴趣的沉淀的蛋白质是容易溶解的。
在工程化的微生物中的感兴趣的基因和感兴趣的修饰的基因的拷贝数可在1-20的范围内，如1-10，如1-5。感兴趣的基因的拷贝数可以与或可以不与感兴趣的修饰的基因的拷贝数相同。在一个优选的实施例中，感兴趣的修饰的基因的拷贝数是1并且感兴趣的基因的拷贝数是1、2、3、4、5、6、7或8，在另一个优选的实施例中感兴趣的修饰的基因的拷贝数是2并且感兴趣的基因的拷贝数是1、2、3、4、5、6、7或8。
多核苷酸
本发明还涉及如在此描述的编码多肽的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以成熟多肽编码序列呈现的多核苷酸(该成熟多肽编码序列不会导致该多肽的氨基酸序列中的改变，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法)，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expressionand Purification)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶–样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其变异体、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
控制序列还可以是编码连接至多肽的N-末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。多核苷酸的编码序列的5’端本身可包含在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，该编码序列的5’末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文，描述了其他有用的信号肽编码序列。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N末端。
还可以希望添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调控序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
载体优选地包含允许该载体整合到宿主细胞的基因组或允许该载体在细胞中独立于基因组而自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法来完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。
该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在将来可能有变化，出于本发明的目的，酵母应如酵母生物学和活动性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会(Soc.App.Bacteriol.Symposium)系列第9期，1980)所述地进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及以本身已知的方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。酵母可以使用以下各文献中所描述的程序转化：贝克尔(Becker)和古伦特(Guarente)，在艾本尔森，J.N.(Abelson,J.N.)和塞蒙，M.I.(Simon,M.I.)编辑，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology)，酶学方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；埃托(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；及辛伦(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且可任选地，(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一方面，回收包含该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，该多肽未被回收，而是使用表达该多肽的本发明的宿主细胞作为该多肽来源。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括在例如通过离心除去微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的耗尽的培养基和细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶、以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀死全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
细胞杀死全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀死全培养液或组合物含有耗尽的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀死全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
发酵液
根据本发明的发酵液包含产生感兴趣的蛋白质的细胞，且感兴趣的蛋白质部分地作为晶体和/或非晶形沉淀存在。
可使用任何本领域中已知的细胞。所述细胞可为微生物或哺乳动物细胞。根据本发明的微生物可为任何属的微生物。
在一个优选的实施例中，感兴趣的蛋白质可从细菌或真菌来源获得。
例如，感兴趣的蛋白质可以从革兰氏阳性菌获得，如芽孢杆菌菌株，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属菌株，例如变铅青链霉菌或鼠灰链霉菌；或从革兰氏阴性细菌获得，例如大肠杆菌或假单胞菌菌属。在一个优选的实施方案中，该细胞是芽孢杆菌属细胞。
感兴趣的蛋白质可以从真菌来源获得，例如酵母菌株，如假丝酵母、克鲁维酵母、毕赤酵母、酵母属、裂殖酵母，或亚罗酵母属(Yarrowia)菌株，例如卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母菌株。
感兴趣的蛋白质可以从丝状真菌菌株获得，如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filobasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂糟菌属(Schizoptyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌株，具体地该感兴趣的多肽可以从以下获得：棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、Fusarium graminum、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、Fusarium sarcochroum、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉菌株。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau VoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural ResearchService Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
在一个优选实施方案中，本发明的细菌为单细胞。一些真菌可产生为酵母样形式。对真菌细胞亦可如WO 2005/042758中所述进行破碎和/或破坏。
出于本发明的目的，用于本文与给定的来源相联的术语“从……获得”，意思是感兴趣的蛋白质由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的基因的细胞产生。
细胞可通过本领域中任何已知的方法发酵。发酵培养基可为包含复合氮源和/或碳源的复合培养基，如大豆粉，棉籽粉，玉米浆，酵母提取物，酪蛋白水解物，糖蜜等。发酵培养基可以是在化学上定义的培养基，例如WO 98/37179中所定义的。
在发酵培养基中的几种商业成分是不溶的并含有在发酵期间将留在发酵培养基中的不消化的组分，并且其需要在发酵之后从所希望的蛋白质进行分离。因此本领域技术人员将会理解，在发酵后的发酵培养基将根据本发明包含若干种固体组分，这些固体组分包括处于部分结晶或非晶形形式的感兴趣的蛋白质、细胞和细胞碎片以及发酵培养基中的不溶性剩余物。
发酵可作为补料分批、重复的补料分批或连续发酵工艺进行。
在发酵期间感兴趣的蛋白质产生并且对于有效的工业发酵，经常观察到感兴趣的蛋白质形成沉淀，因为它是在感兴趣的蛋白质的溶解度以上的浓度中产生的。
在发酵后的感兴趣的蛋白质的纯化期间，感兴趣的蛋白质的沉淀为本领域技术人员提供了挑战，其中细胞、细胞碎片以及生长培养基的固体剩余物通过固体/流体分离的已知的方法(如过滤)从流体进行分离。如果感兴趣的蛋白质是完全或部分可用于固体形式，它将以这种分离跟随固体并从而降低产量。
本发明的方法提供了用于纯化感兴趣的蛋白质的方法，其中感兴趣的蛋白质以固体形式、以结晶形式或以非晶形形式或其混合物存在。本领域熟知的是，从当蛋白质的浓度超过了溶解度的极限时，蛋白质连同其他化学化合物从溶液中沉淀。因此当以高量生产感兴趣的蛋白质时，本发明的方法是特别有用的。因此优选地，在发酵液中的感兴趣的蛋白质的浓度优选地高于3g/l，如高于4g/l，如高于5g/l，如高于6g/l，如高于7g/l，如高于8g/l，如高于9g/l，如高于10g/l，如高于11g/l，如高于12g/l，如高于13g/l，如高于14g/l，如高于15g/l，如高于16g/l，如高于17g/l，如高于18g/l，如高于19g/l，如高于20g/l。
在本说明书和权利要求书中的术语固体形式用于描述当感兴趣的蛋白质的生产已经达到超过了具体蛋白质的溶解度极限的足够高的水平时，在发酵液中发现的固体形式。固体形式可以通过处于结晶形式意指这些分子规则地排列于结构中，该结构通过规则的形状和角度来表征，并在贯穿整个结构中具有分子的同一组织。由于晶体的常规组织，通常晶体可以按固定角度衍射光。固体形式还可以处于被理解为较少规则结构的非晶形形式，其中分子比晶体中发现的更少规则排列并且从结构的一部分到结构的其它部分分子的组织不同。固体形式还可以处于部分结晶形式，其中所述材料的一部分处于结晶形式，其与处于非晶形形式的所述固体材料的其他部分混合。发酵液中的固体形式(感兴趣的蛋白质存在于其中)不以任何方式限制本发明，与此相反，本发明的方法适用于在低pH下具有更可溶的特性的任何感兴趣的蛋白质，与在此pH下发酵液的溶解度相比。
针对pH的调节，几乎可以使用任何酸。该酸可为无机或有机的。一些实例为盐酸、硫酸、亚硫酸、亚硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸和甲酸。出于本发明的目的，基于成本和考虑关于哪些酸将在以下纯化方法中是可接受的，一般技术人员将能够选择适合的酸。优选的酸为磷酸、甲酸、柠檬酸和乙酸。
当发酵液的pH被调节到低pH值时，感兴趣的蛋白质将开始再增溶，因为蛋白质的溶解度由于pH的变化已经增加。固体形式的感兴趣的蛋白质的溶解可以是快速的或其可以是缓慢的，取决于容器内的具体条件和具体蛋白质的性质。像其他的溶解方法一样，与相应的情况下不搅拌混合物相比，该混合物被加速搅拌例如通过搅拌混合物。
在pH调节后采用保持时间段，以便允许感兴趣的蛋白质溶解，之后将发酵液用后处理方法处理，例如用一个或另外的纯化步骤。保持时间段应足够长，以确保后处理前感兴趣的蛋白质的令人满意的溶解。典型地，该保持时间段将是至少5分钟，例如至少10分钟，例如至少20分钟，例如至少30分钟，例如至少40分钟，例如至少50分钟，例如至少60分钟，例如至少70分钟，例如至少80分钟，例如至少90分钟，例如至少100分钟，例如至少110分钟，例如至少120分钟。
在pH调节和任选的保持时间段之后，具有感兴趣的蛋白质的发酵液被后处理以便得到最终所希望的产物。典型地，后处理的第一个步骤分离过程，其中将溶液中的含有感兴趣的蛋白质的发酵液的液体部分从不溶部分(如细胞和细胞碎片以及生长培养基的剩余物)分离。本发明并不限于任何具体类型的分离方法，但能够从不溶物中分离流体的任何类型的分离方法原则上可以使用，如过滤、离心或倾析。分离后可以采用另外的步骤以便得到处于所希望的形式、纯度以及配制品的感兴趣的蛋白质，这些步骤如浓缩、色谱、稳定化、喷雾干燥、造粒。
本发明的方法可以进一步包括在固/液分离之前将发酵液预处理，如稀释步骤，其中将发酵液用水或水性溶液稀释，在纯化期间添加盐或添加具有有益效果的其它化合物，如聚合物或稳定剂等。该预处理步骤可以发生在调节pH至低于组氨酸的pKa值之前或之后。
优选实施例
现在，通过以下实施例来描述本发明：
1.用于纯化如下过程中蛋白质产物的方法，其中该蛋白质的至少一部分具有位于该蛋白质表面上的2-6个组氨酸残基；该过程包括以下步骤：
a.提供发酵液，
b.任选地将pH调节至低于组氨酸侧链的pKa的值；
c.任选地保持该混合物一段时间；并且
d.从来自发酵液的至少一部分固体物质中分离溶解的蛋白质产物。
2.如实施例1所述的方法，其中组氨酸侧链的pKa是6.0。
3.如实施例1或2所述的方法，其中位于蛋白质的表面上的所述2-6个组氨酸位于一级序列内部。
4.如实施例3所述的方法，其中在感兴趣的蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基中的至少一个通过取代或插入被提供。
5.如实施例1或2所述的方法，其中位于蛋白质的表面上的所述2-6个组氨酸处于该蛋白质的C-末端和/或N-末端延伸的形式。
6.如实施例1-5所述的方法，其中该蛋白质产物是酶。
7.如实施例6所述的方法，其中该酶选自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶。
8.如实施例7所述的方法，其中该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
9.如实施例8所述的方法，其中该酶是蛋白酶，选自金属蛋白酶和枯草杆菌酶。
10.如实施例9所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少80％序列一致性的蛋白酶。
11.如实施例10所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少85％序列一致性的蛋白酶。
12.如实施例11所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少90％序列一致性的蛋白酶。
13.如实施例12所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少95％序列一致性的蛋白酶。
14.如实施例13所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少96％序列一致性的蛋白酶。
15.如实施例14所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少97％序列一致性的蛋白酶。
16.如实施例15所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少98％序列一致性的蛋白酶。
17.如实施例16所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少99％序列一致性的蛋白酶。
18.如实施例8所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性的溶菌酶。
19.如实施例18所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少85％序列一致性的溶菌酶。
20.如实施例19所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少90％序列一致性的溶菌酶。
21.如实施例20所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少95％序列一致性的溶菌酶。
22.如实施例21所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少96％序列一致性的溶菌酶。
23.如实施例22所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少97％序列一致性的溶菌酶。
24.如实施例23所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少98％序列一致性的溶菌酶。
25.如实施例24所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少99％序列一致性的溶菌酶。
26.如前述实施例中的任一项所述的方法，其中感兴趣的蛋白质在pH 4.5下的溶解度高于pH 7.0下的溶解度至少10％，优选地高于至少20％，优选地高于至少30％，优选地高于至少40％，优选地高于至少50％，优选地高于至少60％，优选地高于至少70％，优选地高于至少80％，优选地高于至少90％，优选地高于至少100％。
27.根据前述实施例中的任一项所述的方法，其中发酵液中的蛋白质产物的浓度是至少3g/l，如至少4g/l，如至少5g/l，如至少6g/l；如至少7g/l，如至少8g/l，如至少9g/l；如至少10g/l，如至少11g/l，如至少12g/l；如至少13g/l，如至少14g/l，如至少15g/l；如至少16g/l，如至少17g/l，如至少18g/l；如至少19g/l，如至少20g/l。
28.根据前述实施例中的任一项所述的方法，其中步骤b)中的pH被调节至低于6.0，优选地低于5.5，优选地低于5.0，优选地低于4.5的pH值。
29.根据前述实施例中的任一项所述的方法，该方法包括步骤c中的保持时间段，并且其中该保持时间段在10秒至90分钟的范围内，优选地在1分钟至90分钟的范围内，优选地在1分钟至60分钟的范围内，优选地在1分钟至30分钟的范围内，如在5分钟至30分钟的范围内，并且最优选地在10分钟至20分钟的范围内。
30.如前述实施例中的任一项所述的方法，其中通过在生长培养基中培养微生物来提供发酵液。
31.如实施例30所述的方法，其中该微生物选自细菌和真菌。
32.如实施例31所述的方法，其中该微生物选自属于芽胞杆菌属的细菌，如枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌。
33.如实施例31所述的方法，其中该微生物选自属于曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属的真菌，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、里氏木霉、长枝木霉或绿色木霉；或优选地选自属于酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉森酵母属(Hanensula)、克鲁维酵母属(Klyveromyces)的酵母；如酿酒酵母、葡萄汁酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母。
34.如前述实施例中的任一项所述的方法，其中使用过滤、离心或倾析进行步骤d中的分离。
35.根据前述实施例中的任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在步骤d中的分离之前的预处理步骤。
36.如实施例35所述的方法，其中该预处理步骤选自稀释、添加盐以及添加聚合物。
37.如前述实施例中的任一项所述的方法，其中该蛋白产物包含具有给出的氨基酸序列的感兴趣的蛋白质和除了2-6个组氨酸残基的C-末端和/或N-末端延伸外具有相同氨基酸序列的修饰的蛋白质。
38.如实施例37所述的方法，其中通过用重组微生物发酵底物来提供发酵液，该重组微生物包含编码感兴趣的蛋白质的基因的一个或多个拷贝和编码修饰的蛋白质的修饰的基因的一个或多个拷贝，该修饰的蛋白质由2-6个组氨酸残基的C-和/或N-末端延伸的感兴趣的蛋白质的序列组成。
39.如实施例38所述的方法，其中该重组微生物包含编码感兴趣的蛋白质的基因的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝和修饰的基因的一个或两个拷贝。
40.如前述实施例中的任一项所述的方法，该方法包括步骤c中的保持时间段，并且其中该保持时间段在10秒至90分钟的范围内，优选地在1分钟至90分钟的范围内，优选地在1分钟至60分钟的范围内，优选地在1分钟至30分钟的范围内，如在5分钟至30分钟的范围内，并且最优选地在10分钟至20分钟的范围内。
41.一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至指导该感兴趣的蛋白的生产的一个或多个控制序列上；和编码修饰蛋白的至少一种多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至指导该修饰蛋白的生产的一个或多个控制序列上。
42.如实施例41所述的重组微生物，该重组微生物是原核细胞，优选地是革兰氏阳性细胞，更优选地是芽胞杆菌属细胞；最优选地是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌细胞。
43.如实施例41所述的重组微生物，该重组微生物是真核细胞，优选地是真菌细胞，更优选地是曲霉属、木霉属或酵母属或毕赤酵母属细胞；最优选地是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、里氏木霉、哈茨木霉、绿色木霉、酿酒酵母、葡萄汁酵母、或巴斯德毕赤酵母细胞。
44.如实施例41-43中任一项所述的重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的至少两个拷贝，优选地至少三个拷贝，更优选地至少四个拷贝并且最优选地编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的至少五个拷贝。
45.如实施例41-44中任一项所述的重组微生物，其包含编码同一个感兴趣的蛋白质的至少两个不同的多核苷酸，优选地至少三个，更优选地至少四个并且最优选地至少五个编码同一个感兴趣的蛋白质的多核苷酸。
46.根据实施例41至45中任一项所述的重组微生物，其中感兴趣的蛋白质是一种酶。
47.如实施例46所述的重组微生物，其中该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶。
48.如实施例47所述的重组微生物，其中该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
49.如实施例48所述的重组微生物，其中该酶是蛋白酶；优选地该蛋白酶是金属蛋白酶或枯草杆菌酶。
50.如实施例49所述的重组微生物，其中该蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25中的一个具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
51.如实施例50所述的重组微生物，其中该蛋白酶选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25。
52.如实施例48所述的重组微生物，其中该酶是溶菌酶；优选地该溶菌酶是GH25溶菌酶。
53.如实施例52所述的重组微生物，其中该溶菌酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
54.如实施例53所述的重组微生物，其中该溶菌酶具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
55.如实施例41-54中任一项所述的重组微生物，其中这些多核苷酸被整合到宿主细胞染色体的不同基因座中。
56.一种生产酶的方法，所述方法包括在有益于产生所述酶的条件下培养如实施例41-54中的任一项所定义的细胞的步骤。
57.如实施例56所述的方法，该方法进一步包括回收该酶的步骤。
58.一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至指导该感兴趣的蛋白的生产的一个或多个控制序列上；和编码修饰蛋白的至少一种多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至指导该修饰蛋白的生产的一个或多个控制序列上。
59.如实施例58所述的蛋白质产物，其中该修饰的蛋白质包含附接至蛋白质的C-末端和/或N-末端上的2-6个组氨酸残基。
60.如实施例58或59所述的蛋白质产物，其中感兴趣的蛋白质是一种酶。
61.如实施例60所述的蛋白质产物，其中该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶。
62.如实施例61所述的蛋白质产物，其中该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
63.如实施例62所述的蛋白质产物，其中该酶是蛋白酶；优选地该蛋白酶是金属蛋白酶或枯草杆菌酶。
64.如实施例63所述的蛋白质产物，其中该蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25中的一个具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
65.如实施例64所述的蛋白质产物，其中该蛋白酶选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25。
66.如实施例62所述的蛋白质产物，其中感兴趣的酶是溶菌酶；优选地该溶菌酶是GH25溶菌酶。
67.如实施例66所述的蛋白质产物，其中该蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
68.如实施例67所述的蛋白质产物，其中该溶菌酶具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
现在进一步用实例描述本发明，这些实例仅提供说明并且不应理解为以任何方式限定。
实例
材料与方法
蛋白酶测定(Suc-AAPF-pNA测定)
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。
温：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 9.0。
将20μl蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO并且用0.01％Triton X-100进一步稀释45x)起始测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
溶菌酶活性(LSU(A)DV)的测定
溶菌酶(EC 3.2.1.17)是降解在革兰氏阳性细菌细胞壁中的肽聚糖的酶。在溶菌酶的分析中，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)ATCC号4698(Sigma M3770)被降解，其中在表1中的条件下测量的在450nm处的吸光度降低。吸光度的降低与呈现于样品中的LSU(A)DV酶活性成正比。
表1.
标准(193-81114:23000LSU(A)DV/g)
0.5000g/100ml醋酸盐0.1M，NaCl 50mM，Triton–X1000.1％，pH 4.5
常规分子生物学方法
PCR、克隆、连接核苷酸等的一般方法是本领域普通技术人员熟知的并且可以例如发现于“分子克隆：实验室手册(Molecular cloning:A laboratory manual)”，萨拉布鲁克(Sambrook)等人(1989)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor lab.)，冷泉港，纽约；奥苏贝尔(Ausubel)，F·M等人(编辑)；“分子生物学实验指南(Current protocols in MolecularBiology)”，约翰威立父子公司(John Wiley and Sons)，(1995)；哈伍德(Harwood)，C·R和卡廷(Cutting)，S·M(编辑)；“DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)，I和II卷”，D.N.格洛弗(Glover)编辑(1985)；“寡核苷酸合成”(OligonucleotideSynthesis)，M.J.盖特(Gait)编辑(1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”，B.D.黑姆斯(Hames)&S.J.希金斯(Higgins)编辑(1985)；“分子克隆实用指南(A PracticalGuide To Molecular Cloning)”，B.帕柏尔(Perbal)(1984)。
表2.通用PCR条件：
3步循环：
培养基和试剂
用于缓冲液和底物的化学品是分析等级的商品：
-Cove：342.3g/L蔗糖、20ml/L COVE盐溶液、10mM乙酰胺、30g/L诺布尔(noble)琼脂。
-Cove顶层琼脂：342.3g/L蔗糖、20ml/L COVE盐溶液、10mM乙酰胺、10g/L低熔点琼脂糖
-Cove-2：30g/L蔗糖、20ml/L COVE盐溶液、10mM乙酰胺、30g/L诺布尔琼脂。
-COVE盐溶液由以下构成：26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4和50ml Cove痕量金属，水补足至1升。
-用于COVE的痕量金属溶液由以下构成：0.04g NaB4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、1.0g的MnSO4·H2O、0.8g的中性淀粉酶II MoO2·2H2O、和10.0g的ZnSO4·7H2O，水补足至1升。
-淀粉糖苷酶痕量金属溶液由以下构成：6.8g ZnCl2·7H2O、2.5g CuSO4·5H2O、0.24g NiCl2·6H2O、13.9g FeSO4·7H2O、13.5g MnSO4·H2O和3g柠檬酸，水补足至1升。
-YPG由以下构成：4g的酵母提取物、1g的KH2PO4、0.5g的MgSO4·7H2O和15g的葡萄糖(pH 6.0)，水补足至1升。
-STC缓冲液由以下构成：0.8M的山梨醇、25mM的Tris(pH 8)、和25mM的CaCl2，水补足至1升。
STPC缓冲液由以下构成：在STC缓冲液中的40％PEG4000。
黑曲霉转化
如克里斯滕森(Christensen)等人；生物技术(Biotechnology)19886 1419-1422所述，完成曲霉属转化。以下描述了优选程序。
将黑曲霉宿主菌株接种至100ml的补充有10mM尿苷的YPG培养基上，并且在32℃下在80rpm下孵育16hr。将球粒进行收集并且用0.6M Kcl洗涤，并且将其重悬于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEXTM，诺维信公司(Novozymes A/S)，鲍斯韦(Bagsvaerd)，丹麦)的20ml0.6M KCl(终浓度为20mg/ml)中。将悬浮液在32℃下在80rpm下孵育直到形成原生质体，并且然后用STC缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数，并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重悬并调整至终浓度为2.0x 107个原生质体/ml。将大约4μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体悬浮液中，轻轻混合，并且在冰上孵育30分钟。添加1ml的SPTC，并且将原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加10ml的50℃Cove顶层琼脂糖之后，将反应液倾例于Cove琼脂板上，并且将板于32℃下孵育5天。
SDS-PAGE
用于溶菌酶分析使用的SDS凝胶是来自伯乐公司(BioRad)的任何kDTM TGX无染色TM凝胶。在凝胶上，上样十六ul的样品(八μl的每种样品与8ul的上样缓冲液混合)。也采用十ul的MW标记物：(针对SDS电泳的低分子量定标用具箱#17-0446-01，来自安玛西亚公司(Amersham))。将凝胶在200V的恒定电压下在1x SDS缓冲液(伯乐公司)中电泳25min，并通过使用伯乐公司标准系统按制造商推荐的进行分析。
实例1
变体的制备和表达
下面总结了突变和表达盒到枯草芽孢杆菌的引入。所有DNA操纵是通过PCR(例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人；分子克隆(Molecular Cloning)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))进行并且可以由本领域每位技术人员重复。
使用编码枯草杆菌酶变体的重组枯草杆菌构建体来接种含有富营养培养基(例如，PS-1:100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/L Na2HPO412H2O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L替换-Dowfax63N10(陶氏化学(Dow))的摇瓶。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。
生成以下蛋白质
实例2
将参照物和实施例1中产生的变体在标准实验室规模的发酵罐中使用EP1 520012B1、实施例2中描述的方法进行发酵，不添加MGP。
在发酵期间观察到这些变体形成沉淀。发酵中的活性显示，参照物、1HIS、2HIS、3HIS以及4HIS的发酵给出了大致相同的产量，而3intHIS变体发酵给出了比参照物低的产量。
实例3
将来自实例2的发酵液用水稀释三倍并使用HCl将pH调节至在40℃下的pH 4.5，并将发酵液搅拌60分钟。
在pH调节后立即测定上清液中的蛋白酶活性并在60分钟后使用以上的蛋白酶测定。在pH调节设定为1后，立即测定相对于参照物中的浓度的蛋白酶浓度。结果示于表3中
表3.获得的相对活性：
T＝0 T＝60
参照物 1 1,4
1HIS 5.8 8.8
2HIS 45 59
3HIS 56 59
4HIS 54 57
3IntHIS 1.5 5
结果清楚地表明，本发明的所有变体在低pH下与亲本(＝参照物)相比具有更高的溶解度。数据还表明，即使对于本发明的变体的溶解度是从一开始就高，但是在60分钟的保持时间段内甚至更多酶进入溶液中。
实例4
变体的制备和表达
下面总结了突变和表达盒到地衣芽孢杆菌的引入。所有DNA操纵是通过PCR(例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人；分子克隆(Molecular Cloning)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))进行并且可以由本领域每位技术人员重复。
制备两个重组体地衣芽孢杆菌。通过将编码Savinase(SEQ ID No:2)的表达盒转化为地衣芽孢杆菌宿主菌株，并选择具有用Savinase基因整合的表达盒的5个拷贝的转化体来制备参照菌株，并且一种菌株具有表达盒的5个拷贝，该表达盒包含编码Savinase的用附接N-末端的4个氨酸残基修饰的基因。
重组生物体和参照生物体在标准的实验室发酵罐中发酵，并在发酵期间观察到蛋白质沉淀。在发酵中的活性表明，参照物和4HIS的发酵给出大致相同的产量。
实例5
纯化
将来自实例4的发酵液用水稀释六倍并使用乙酸将pH调节至在40℃下的pH 4.5，添加盐以控制导电性并将发酵液在水浴中在40℃下搅拌60分钟。
在pH调节后立即测定上清液中的蛋白酶活性并在60分钟后使用以上的蛋白酶测定。在pH调节设定为1后，立即测定相对于参照物中的浓度的蛋白酶浓度。
表4.获得的相对活性(％)：
结果清楚地表明，与仅用感兴趣的基因转化的参照重组微生物相比，使用具有修饰的基因的5个拷贝的重组微生物导致了在低pH下的更高溶解度。数据还表明，即使对于本发明的变体的溶解度是从一开始就高，但是在60分钟的保持时间段内甚至更多酶进入溶液中。
实例6
下面总结了突变和表达盒到地衣芽孢杆菌的引入。所有DNA操纵是通过PCR(例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人；分子克隆(Molecular Cloning)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))进行并且可以由本领域每位技术人员重复。
两种表达盒，一种具有编码Savinase变体(SEQ ID No:3)的基因和一种具有修饰的Savinase变体，该Savinase变体具有SEQ ID NO:3的序列，用4个组氨酸残基(SEQ ID NO:3+His-标签)延伸的C-末端。
通过将编码Savinase变体(SEQ ID No:3)的表达盒和包含修饰的基因的表达盒转化为地衣芽孢杆菌宿主菌株，并选择具有用Savinase变体基因和修饰基因(用4个组氨酸残基延伸)的一个拷贝整合的表达盒的5个拷贝的转化体来制备重组菌株。
重组生物体在标准的实验室发酵罐中发酵，并在发酵期间观察到蛋白质沉淀。
将发酵液用水稀释六倍并使用乙酸将pH调节至在40℃下的pH4.5，并将发酵液在水浴中在40℃下搅拌60分钟。
在pH调节后立即测定上清液中的蛋白酶活性并在120分钟后使用以上的蛋白酶测定。在pH调节设定为1后，立即测定相对于参照物中的浓度的蛋白酶浓度。
表5.获得的相对活性(％)：
结果表明，使用的感兴趣的蛋白酶(SEQ ID No:3)的5个拷贝和相同的蛋白酶的His-标记的变体的一个拷贝的组合导致沉淀的蛋白酶的高溶解并且几乎完全溶解。相比较而言，当感兴趣的蛋白酶单独发酵(在生产菌株中没有His-标签变体的副本)时，在pH降低至4.5后显著地更少的蛋白酶溶解，并且在测试条件下甚至120分钟后只有更小部分的产物溶解。
结果证实，与只包含含有感兴趣的蛋白酶的表达盒的对照微生物相比，使用包含含有感兴趣的蛋白酶的表达盒的5个拷贝和含有具有附接至C-末端的4个组氨酸的感兴趣的蛋白酶的表达盒的一个拷贝的重组微生物，可以在低pH下获得更好的溶解性的益处。
实例7
下面总结了突变和表达盒到地衣芽孢杆菌的引入。所有DNA操纵是通过PCR(例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人；分子克隆(Molecular Cloning)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press))进行并且可以由本领域每位技术人员重复。
两种表达盒，一种具有编码Savinase变体(SEQ ID No:3)的基因和一种具有修饰的Savinase变体，该Savinase变体具有SEQ ID NO:4的序列，用4个组氨酸残基(SEQ ID NO:4+His-标签)延伸的C-末端。
通过将编码Savinase变体(SEQ ID No:4)的表达盒和包含修饰的基因的表达盒转化为地衣芽孢杆菌宿主菌株，并选择具有用Savinase变体基因和修饰基因(用4个组氨酸残基延伸)的一个拷贝整合的表达盒的5个拷贝的转化体来制备重组菌株。
重组生物体在标准的实验室发酵罐中发酵，并在发酵期间观察到蛋白质沉淀。
将发酵液用水稀释六倍并使用乙酸将pH调节至在40℃下的pH 4.5，并将发酵液在水浴中在40℃下搅拌60分钟。
在pH调节后立即测定上清液中的蛋白酶活性并在120分钟后使用以上的蛋白酶测定。在pH调节设定为1后，立即测定相对于参照物中的浓度的蛋白酶浓度。
表6.获得的相对活性(％)：
结果表明，使用的感兴趣的蛋白酶(SEQ ID No:3)的5个拷贝和相同的蛋白酶的His-标记的变体的一个拷贝的组合导致沉淀的蛋白酶的高溶解并且几乎完全溶解。相比较而言，当感兴趣的蛋白酶单独发酵(在生产菌株中没有His-标签变体的副本)时，在pH降低至4.5后显著地更少的蛋白酶溶解，并且在测试条件下甚至120分钟后只有更小部分的产物溶解。
结果证实，与只包含含有感兴趣的蛋白酶的表达盒的对照微生物相比，使用包含含有感兴趣的蛋白酶的表达盒的5个拷贝和含有具有附接至C-末端的4个组氨酸的感兴趣的蛋白酶的表达盒的一个拷贝的重组微生物，可以在低pH下获得更好的溶解性的益处。
实例8黑曲酶中的溶菌酶表达
曲霉属表达盒pJaL1470的构建。
通过在844bp、2972bp、3514bp、155bp、1548bp以及2633bp上的以下6种PCR片段通过引物集oJaL519(GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTCATCTTGAAGTTCCTA，SEQ ID NO:5)/oJaL522(CTGGCCGTCGTTTTAC，SEQ ID NO:6)、oJaL521(GGATTTAGTCTTGATCGCGGCCGCACCATGCGTTTCATTTC，SEQ ID NO:7)/oJaL524(ATCAAGACTAAATCCTC，SEQ ID NO:8)、oJaL523(TGGAAGTTACGCTCGCATTCTGTAAACGGGC，SEQID NO:9)/oJaL526(CGAGCGTAACTTCCACC，SEQ ID NO:10)、oJaL525(GAGGGGATCGATGCGTCCGCGGGCGGAGAAGAAG，SEQ ID NO:11)/oJaL528(CGCATCGATCCCCTCGTC，SEQ ID NO:12)、oJaL527(GATATCGGAGAAGCGTCCGCAGTTGATGAAGG，SEQ ID NO:13)/oJaL530(GCTTCTCCGATATCAAG，SEQ ID NO:14)以及oJaL529(AGCTTGGCGTAATCATG，SEQ ID NO:15)/oJaL520(ACCATGATTACGCCAAGCTGCATGCATTAATTAACTTG，SEQ ID NO:16)分别扩增，使用质粒pHUda1260作为模板，来制造表达载体pJaL1468。通过根据生产说明注入克隆将这6种PCR片段连接在一起，并从而创建质粒pJaL1468。
对于编码GH25溶菌酶SEQ ID NO:18的嗜碱枝顶菌基因(SEQ ID NO:17)而言，将含有内含子的编码区(SEQ ID NO:17)按照878bp上的PCR片段(SEQ ID NO.:19)通过引物集oJaL513(CAACTGGGGGCGGCCGCACCATGAAGCTTCTTCCCTCC，SEQ ID NO:20)和oJaL514(GTGTCAGTCACCGCGATCGCTTAGTCTCCGTTAGCGAG，SEQ ID NO:21)使用嗜碱枝顶菌基因组DNA作为模板而被扩增。将该878bp PCR片段用AsiSII和NotII消化，产生852bp片段。将该852bpAsiSI-NotI片段克隆进pJaL1468中的对应位点，给出质粒pJaL1470。
pHUda1260的构建
通过从构巢曲霉乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因(pyrG)改变为在pRika147中的构巢曲霉乙酰胺酶基因(amdS)构建质粒pHUda1260。
质粒pRika147(在WO 2012160093中的实施例9中描述)用SphI和SpeI消化，并且遵循制造商的方案(NEB，新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs,Inc.))通过使用T4DNA聚合酶将其两端填充。将片段通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中将9,241bp片段从凝胶切离并使用凝胶提取试剂盒进行提取。
质粒pHUda1019(在WO 2012160093中的实施例2中描述)用XbaI和AvrII消化，并且遵循制造商的方案(NEB，新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs,Inc.))通过使用T4DNA聚合酶将其两端填充。将片段通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，其中含有amdS基因、米曲霉tef1(翻译延长因子1)启动子和米曲霉niaD(硝酸还原酶)终止子的3,114bp片段从凝胶切出，并使用凝胶提取试剂盒进行提取。将9241bp片段与3,114bp片段在反应中连接，该反应由1μl的9241bp片段、3μl的3,114bp片段、1μl的5X连接酶缓冲液，5μl的2X连接酶缓冲液以及1μl的连接酶(罗氏(Roche)快速DNA连接试剂盒)组成。将连接反应物在室温下孵育10分钟。将五μl的连接混合物转化到DH5-α化学感受肽的大肠杆菌细胞中。将转化体涂布在LB加氨比西林平板上并在37℃下孵育过夜。使用QIA小量制备试剂盒将质粒DNA从若干种转化体进行纯化。通过使用适当的限制性内切酶，随后通过使用TAE缓冲液的0.8％琼脂糖凝胶电泳将质粒DNA进行筛选用于正确连接。一种质粒被指定为pHUda1260。
表达质粒pHiTe158的构建
将来自嗜碱枝顶菌的溶菌酶基因的0.85kb区域从质粒pJaL1470通过PCR用引物对HTJP-483(agtcttgatcggatccaccatgaagcttcttccctccttg，SEQ ID NO:22)和HTJP-504(cgttatcgtacgcaccacgtgttagtggtggtggtggtctccgttagcgagagc，SEQ ID NO:23)进行扩增。
将获得的0.85kb DNA片段通过HD克隆试剂盒(克隆技术实验室有限公司(Clontech Laboratories，Inc))连接进入pHiTe50(NZ 12683)中，该pHiTe50用BamHI和PmlI消化以创建pHiTe158。
黑曲霉中的溶菌酶基因的转化
如WO 2012/160093中所描述的，用具有amdS选择性标记的C末端四个组氨酸标签基因(pHiTe158)进行染色体插入天然溶菌酶(pJaL1470)的黑曲霉(描述于WO 2012/160093中的NN059280的衍生物)或其变体。将生长良好的菌株进行纯化，并且经受Southern印迹分析以确认在pJaL1470或pHiTe158中的溶菌酶基因是否正确引入在NA1、NA2、SP288或PAY基因座处。以下用以制备非放射性探针的引物组被用来分析所选择的转化体。
对于溶菌酶编码区：
HTJP-483 Agtcttgatcggatccaccatgaagcttcttccctccttg(SEQ ID NO:22)
HTJP-513 Ctggtagcagtggtaggg(SEQ ID NO:24)
将从所选择的转化体提取的基因组DNA通过SpeI和PmlI消化，然后用溶菌酶编码区进行探测。通过正确基因引入事件，以上所描述的探测观察通过SpeI和PmlI消化的5.1kb(NA1)、1.9kb(SP288)、3.1kb(NA2)和4.0kb(PAY)大小的杂交信号。
在给出NA1、NA2、SP288以及PAY基因座处的基因的4个拷贝的正确的整合事件的菌株中，选择具有天然溶菌酶(1470-C3085-11)的一个菌株和具有his-标记的变体(158-C3085-2)的一个菌株。
实例9.在溶菌酶的C-末端添加四个组氨酸标签对蛋白质溶解度的作用。
具有his-标记的溶菌酶的菌株和具有天然溶菌酶基因的参照菌株在实验室规模的罐中发酵。
用于溶菌酶生产的实验室规模罐培养
按分批补料发酵来完成发酵(H.佩德森(Pedersen)2000，应用微生物学与生物技术(Appl Microbiol Biotechnol)，53:272-277)。将所选择菌株在液体培养基中预培养，然后将生长的菌丝体转移到罐中用于酶产生的进一步培养。在pH 4.75下在34℃下培养7天，用葡萄糖和铵进行给料而不过度给予(其阻止酶产生)。使用离心后的培养液和上清液用于酶测定
在对于天然溶菌酶的发酵液中观察到晶体形成，但在对于His-标签形式的发酵液中没有观察到晶体形成。遵循以上所述的这些方法测量它们的酶活性(LSU活性)；结果示于下面的表7中。
表7
假设：培养物的密度约是1kg/L。
这些菌株的LSU活性，其中来自1470-C3085-11中的发酵液(在192h的发酵下制备)的溶菌酶产率被标准化为1.00。通过在用水稀释培养液后在50℃下热处理1小时，在发酵期间形成于1470-C3085-11中的不溶的溶菌酶(晶体)是(部分地)可溶的。将来自pHiTe158的转化体中的不具有晶体的样品进行相等的处理。
将来自黑曲霉菌株的发酵的上清液样品经受SDS-PAGE分析，以查看和比较溶菌酶的溶解程度。正如预期的，在整个发酵中，由于结晶，来自1470-C3085-11的样品中的溶菌酶显著地降低(图1A，泳道2-6和表8A)，而来自158-C3085-2的样品中的那些持续增加(图1B，泳道2-6和表8A)，这表明溶菌酶的溶解度被条件下的his-标签添加而强烈地增强。
表8A
这些菌株的LSU活性，其中来自1470-C3085-11中的上清液(在97h的发酵下制备)的溶菌酶产率被标准化为1.00。
表8B
这些菌株的LSU活性，其中来自158-C3085-2中的上清液(在97h的发酵下制备)的溶菌酶产率被标准化为1.00。

Claims (32)

1.一种用于纯化如下过程中蛋白质产物的方法，其中该蛋白质的至少一部分具有位于该蛋白质表面上的2-6个组氨酸残基；该过程包括以下步骤：
a.提供发酵液，
b.任选的调节pH至低于6.0的值；
c.任选地保持该混合物一段时间；并且
d.从来自该发酵液的至少一部分固体物质中分离溶解的蛋白质产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中位于该蛋白质的表面上的2-6个组氨酸位于一级序列的内部，或其中位于该蛋白质的表面上的2-6个组氨酸处于该蛋白质的C-末端和/或N-末端延伸的形式。
3.如权利要求2所述的方法，其中在感兴趣的蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基中的至少一个通过取代或插入被提供。
4.如权利要求1-3所述的方法，其中该蛋白质产物是选自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶中的一种酶；如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性的蛋白酶。
6.如权利要求4所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性的溶菌酶。
7.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中感兴趣的蛋白质在pH 4.5下的溶解度高于pH 7.0下的溶解度至少10％，优选地高于至少20％，优选地高于至少30％，优选地高于至少40％，优选地高于至少50％，优选地高于至少60％，优选地高于至少70％，优选地高于至少80％，优选地高于至少90％，优选地高于至少100％。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中发酵液中的蛋白质产物的浓度是至少3g/l，如至少4g/l，如至少5g/l，如至少6g/l；如至少7g/l，如至少8g/l，如至少9g/l；如至少10g/l，如至少11g/l，如至少12g/l；如至少13g/l，如至少14g/l，如至少15g/l；如至少16g/l，如至少17g/l，如至少18g/l；如至少19g/l，如至少20g/l。
9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中步骤b)中的pH被调节至低于6.0，优选地低于5.5，优选地低于5.0，优选地低于4.5的pH值。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，该方法包括步骤c中的保持时间段，并且其中该保持时间段在10秒至90分钟的范围内，优选地在1分钟至90分钟的范围内，优选地在1分钟至60分钟的范围内，优选地在1分钟至30分钟的范围内，如在5分钟至30分钟的范围内，并且最优选地在10分钟至20分钟的范围内。
11.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中通过在生长培养基中培养微生物来提供该发酵液。
12.如权利要求11所述的方法，其中该微生物选自属于芽孢杆菌属的细菌，如枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，或选自属于曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属的真菌，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、里氏木霉、长枝木霉或绿色木霉；或优选地选自属于酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉森酵母属(Hanensula)、克鲁维酵母(Klyveromyces)属的酵母；如酿酒酵母、葡萄汁酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母。
13.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中使用过滤、离心或倾析进行步骤d中的分离。
14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在步骤d中的分离之前的预处理步骤，如稀释、添加盐以及添加聚合物。
15.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中该蛋白产物包含具有给出的氨基酸序列的感兴趣的蛋白质和除了2-6个组氨酸残基的C-末端和/或N-末端延伸外具有相同氨基酸序列的修饰的蛋白质。
16.如前述权利要求中的任一项所述的方法，该方法包括步骤c中的保持时间段，并且其中该保持时间段在10秒至90分钟的范围内，优选地在1分钟至90分钟的范围内，优选地在1分钟至60分钟的范围内，优选地在1分钟至30分钟的范围内，如在5分钟至30分钟的范围内，并且最优选地在10分钟至20分钟的范围内。
17.一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至指导该感兴趣的蛋白的生产的一个或多个控制序列上；和编码修饰蛋白的至少一种多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至指导该修饰蛋白的生产的一个或多个控制序列上。
18.如权利要求17所述的重组微生物，该重组微生物是原核细胞，优选地是革兰氏阳性细胞，更优选地是芽胞杆菌属细胞；最优选地是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌细胞。
19.如权利要求17所述的重组微生物，该重组微生物是真核细胞，优选地是真菌细胞，更优选地是曲霉属、木霉属或酵母属或毕赤酵母属细胞；最优选地是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、里氏木霉、哈茨木霉、绿色木霉、酿酒酵母、葡萄汁酵母、或巴斯德毕赤酵母细胞。
20.如权利要求17-19中任一项所述的重组微生物，该重组微生物包含编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的至少两个拷贝，优选是至少三个拷贝，更优选是至少四个拷贝并且最优选是编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸的至少五个拷贝。
21.如权利要求17-20中的任一项所述的重组微生物，该重组微生物包含编码同一个感兴趣的蛋白质的至少两个不同的多核苷酸，优选地至少三个，更优选地至少四个并且最优选地至少五个编码同一个感兴趣的蛋白质的多核苷酸。
22.根据权利要求17至21中的任一项所述的重组微生物，其中感兴趣的蛋白质是一种酶，优选地是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
23.如权利要求22中的任一项所述的重组微生物，其中该酶是蛋白酶；优选地该蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:25中的一个具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
24.如权利要求22中的任一项所述的重组微生物，其中该酶是溶菌酶；优选地具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
25.如权利要求17-24中的任一项所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到宿主细胞染色体的不同基因座中。
26.一种生产酶的方法，所述方法包括在有益于产生该酶的条件下培养如权利要求17-25中的任一项所定义的细胞的步骤。
27.如权利要求26所述的方法，该方法进一步包括回收该酶的步骤。
28.一种蛋白质产物，包含感兴趣的蛋白质和修饰的蛋白质，与该感兴趣的蛋白质相比该修饰的蛋白质被修饰为在蛋白质的表面上具有2-6个组氨酸残基。
29.如权利要求28所述的蛋白质产物，其中该修饰的蛋白质包含附接至蛋白质的C-末端和/或N-末端上的2-6个组氨酸残基。
30.如权利要求28或29所述的蛋白质产物，其中感兴趣的蛋白质是一种酶，优选地是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
31.如权利要求30所述的蛋白质产物，其中该酶是蛋白酶；优选地该蛋白酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:25中的一个具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
32.如权利要求30所述的蛋白质产物，其中该感兴趣的酶是溶菌酶；优选地该溶菌酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性。
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