CN101918580A - 合酶抑制剂筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于选择至少一种宿主细胞的方法，所述细胞分泌一种或多种目的活性酶的，方法包括步骤：a)提供包含一种或多种合酶抑制剂的生长培养基，所述抑制剂抑制宿主细胞中至少一种必需化合物的合成，并且进一步包括一种或多种组分，其在存在一种或多种目的活性酶的情况下转化成至少一种必需化合物，从而允许宿主细胞生长；b)在步骤(a)的生长培养基中或培养基上培养宿主细胞；和c)选择能在步骤(a)的生长培养基中或培养基上生长的至少一种宿主细胞，所述宿主细胞分泌一种或多种目的活性酶。

Description

合酶抑制剂筛选方法

涉及序列表

本申请包含序列表。

发明领域

本发明涉及宿主细胞的选择，其在特定的生长条件下表达目的活性酶；在这些条件下，不表达活性酶的细胞不能生长。细胞中至少一种必需组分的合成受到向生长培养基加入的一种或多种合成抑制剂抑制，所以如果产生目的活性酶，必需组分只能由宿主细胞从培养基获得。

发明背景

商业的酶生厂者的目标是能进行快速而简单的选择方法，用于鉴定表达目的活性酶的那些宿主细胞。存在公开各种筛选方法的很多出版物，但是提供用于实际选择的方法的很少。大多数基于选择的方法传统地使用抗生素抗性标记物。对改进的选择方法的需要一直存在。

发明概述

在第一方面，本发明涉及用于选择分泌一种或多种目的活性酶的至少一种宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包含一种或多种合酶抑制剂的生长培养基，该抑制剂抑制宿主细胞中至少一种必需化合物的合成，并且进一步包括一种或多种组分，其在存在一种或多种目的活性酶的情况下可转化为至少一种必需化合物，从而允许宿主细胞生长；

b)在步骤(a)的生长培养基中或其上培养宿主细胞；和

c)选择能在步骤(a)的生长培养基中或其上生长的至少一种宿主细胞，所述宿主细胞分泌一种或多种目的活性酶。

发明详述

本发明的第一方面涉及用于选择分泌一种或多种目的活性酶的至少一种宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包含一种或多种合酶抑制剂的生长培养基，该抑制剂抑制宿主细胞中至少一种必需化合物的合成，并且进一步包括一种或多种组分，其在存在一种或多种目的活性酶的情况下可转化为至少一种必需化合物，从而允许宿主细胞生长；

b)在步骤(a)的生长培养基中或其上培养宿主细胞；和

c)选择能在步骤(a)的生长培养基中或其上生长的至少一种宿主细胞，所述宿主细胞分泌一种或多种目的活性酶。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体如前所述作为染色体整合体或自复制的染色体外载体而保持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其可由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是可用于本发明的多肽的重组生产的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括，但不限于，大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。可用于实施本发明的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。可用于实施本发明的链球菌属细胞包括，但不限于，似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。可用于实施本发明的链霉菌属细胞包括，但不限于，不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

宿主细胞也可以是真核细胞，比如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporie fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。

在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(OOmycota)亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningji)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

目的活性酶

本发明的活性酶可以是获得自任何属的微生物的多肽酶。就本发明而言，用于本文与给定的来源相关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在另一个优选的实施方案中，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。在一个优选的实施方案中，目的活性酶是异源或同源的。

本发明具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属或海洋芽孢杆菌属多肽，所述多肽具有酶活性；或革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属或脲原体属多肽，其具有酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。

本发明具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽如念珠菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽，其具有酶活性；或更优选丝状真菌多肽如枝顶孢霉属、伞草属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属、色二孢属(Diplodia)、瓣菌属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属、赤霉菌属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属、嗜热霉属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、草菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽，其具有酶活性。

在一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库成镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉、黄孢平革菌、Thielavia achromatica、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、Thielavia spededonium、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地得到，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽可以进一步包括切割位点。一旦分泌了融合蛋白质，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过Factor Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)。

此外，在本发明的优选实施方案中，目的活性酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶，并且更优选地，酶是淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶，并且更优选地，具有活性的酶选自下组：氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡聚糖转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化氢酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷酰胺酶或木聚糖酶。

脂肪酶的选择

可以使用任何脂肪酸合酶抑制剂选择可分泌活性脂肪分解酶的转化体，所述抑制剂如，三氯生(triclosan)、浅蓝菌素(cerulenin)、硫乳霉素(thiolactomycin)或diazaborin。脂肪分解酶可以是对于底物(如三甘油酯脂质、磷脂、半乳糖酯)中的酯键有活性的任何羧基-酯酶。

蛋白酶的选择

可以使用任何氨基酸合酶抑制剂选择可分泌活性蛋白水解酶的转化体，所述抑制剂如，5-硝基-2-苯并咪唑啉酮(5-nitro-2-benzimidazolinone)、草甘膦(glyphosate)、羧基甲氧基胺(carboxymethosylamin)、O-烯丙基羟胺(O-allylhydroxylamine)、吲哚丙烯酸(imidazolinones)、O-(羧甲基)羟胺半盐酸盐(O-(carboxymethyl)hydroxylamine hemihydrochloride)、咪唑啉酮(imidazolinones)或磺酰脲(sulfonyl urea)。通过加入氨基酸也可以抑制氨基酸合成。例如由于氨基酸合成途径的反馈抑制，大肠杆菌能通过加入酪氨酸和苯丙氨酸而对于色氨酸产生饥饿，这对于三种氨基酸很常见。蛋白水解酶可以是对于任何类型的肽键都有活性的任何蛋白酶。

糖酶的选择

可以使用任何抑制剂选择可分泌活性糖酶的转化体，所述抑制剂如，针对葡萄糖-6-磷酸酶的木白斯他汀(Mumbaistatin)、根皮素(phloretin)、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate)、theilavin A或2-羟基-5-硝基苯甲醛(2-hydroxy-5-nitrobenzaldehyde)；或针对果糖1，6 二磷酸酶的2，3-二氢-1H-环戊[b]喹啉(2，3-dihydro-1H-cyclopenta[b]quinoline)；或针对葡糖胺-6P-合酶的氨基连三唑(amitrole)或aptamine。糖酶可以是切割糖中的键释放例如葡糖胺-6P、葡萄糖或6-磷酸果糖的任何酶。

DNA导入

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，Nucleic Acids Res.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(Praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods 64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞的任何方法。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

因此，在一个优选的实施方案中，将宿主细胞转化；优选用包含至少一个编码一个或多个目的酶的多核苷酸的多核苷酸构建体转化宿主细胞。

多核苷酸构建体

术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或者所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

术语“修饰”在本文的意思是，对活性酶多肽或其同源序列的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。能够根据本领域已知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO95/17413；或WO 95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

本发明还涉及包含编码本发明活性酶的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从上述菌株之一，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上文中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-48描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，使该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝并由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。

合酶抑制剂

在本发明第一方面的优选实施方案中，一个或多个合酶抑制剂包括可抑制至少一种氨基酸和/或至少一种脂肪酸合成的抑制剂；优选地，一个或多个合酶抑制剂包括5-硝基-2苯并咪唑啉酮，草甘膦，羧基甲氧基羟胺，羧基甲氧基胺，O-烯丙基羟胺，吲哚丙烯酸，O-(羧甲基)羟胺半盐酸盐，咪唑啉酮或磺酰脲；更优选地，一个或多个合酶抑制剂包括可抑制甲硫氨酸合成的抑制剂，优选地，一个或多个合酶抑制剂包括羧基甲氧基羟胺；并且更优选地，一个或多个合酶抑制剂包括三氯生，浅蓝菌素，硫乳霉素或diazaborin。

在本发明第一方面的另一个优选的实施方案中，一个或多个合酶抑制剂包括可抑制葡萄糖-6-磷酸酶的抑制剂，优选地，一个或多个合酶抑制剂包括根皮素，磷酸吡哆醛，theilavin A，2-羟基5-硝基苯甲醛或木白斯他汀。

在本发明第一方面的另一个优选的实施方案中，一个或多个合酶抑制剂包括可抑制葡糖胺-6P合酶的抑制剂；优选地，一个或多个合酶抑制剂包括氨基连三唑或Aptamine。

另一个优选的实施方案涉及本发明第一方面的方法，其中一个或多个合酶抑制剂包括可抑制果糖1，6二磷酸酶的抑制剂；优选地，一个或多个合酶抑制剂包括2，3-二氢-1H-环己[b]喹啉。

实施例

实施例1：转化体的选择

这个实施例的目的是证明转化体的选择，其在特定的生长条件下表达目的活性酶；在这些条件下不表达活性酶的转化体不能生长。细胞中至少一个必需组分的合成受到向生长培养基中加入的一个或多个合成抑制剂的抑制，因此如果产生目的活性酶，必需组分只能由宿主细胞从培养基获得。

质粒pENI3659的构建

质粒pENI3659是pENI3420的进一步发展。质粒pENI3420包含来自曲霉属的中性淀粉酶2启动子，其在酵母中产生基因表达。质粒为pYES2.0的衍生物，其可以在酵母中复制并能通过ura3筛选而进行选择。

使用pENI3420作为模板，寡核苷酸180804L1(10微摩尔)、180804L2(0.1微摩尔)和180804L3(10微摩尔)，使用PWO聚合酶，按照生产商(Roche)的推荐，进行PCR。

180804L1：aagggatcctcgaggtaccacgcgtgaattcactagtgcatgcaagctt(SEQ ID NO：1)

180804L2：gtcaccctctagatctcgacttaattaagcttgcatgcactagtgaat(SEQ ID NO：2)

180804L3：gttccggttacctttgcggataag(SEQ ID NO：3)

用限制性酶BamHI和BstEII切割质粒pENI3420和产生的PCR片段。

从琼脂糖凝胶纯化切割的载体pENI3420和切割的PCR片段，连接并转化进入大肠杆菌菌株(Sambrook和Russell：Molecular cloning-a laboratory manual 2001 Cold spring Harbor laboratory press NY)。制备质粒制备物并测序。

正确的克隆在启动子之前包含多个连接头位点，从而使其适合于克隆理想的基因。

质粒pENI2419的构建

使用WO 92/05249 A1(Novozymes A/S)中公开的质粒pAHL为模板，并使用寡聚物Oligo21350，如WO 97/04079 A1(Novozymes A/S)中所示构建质粒pENI2419。

Oligo21350：gaacccttgtccccgtccggcgacgagacatcgtgaagatagaaggc(SEQ ID NO：4)

质粒pENI3791的构建

用BamHI/XhoI切割质粒pENI2419，并将包含脂肪酶基因的片段克隆入用BamHI/XhoI切割的质粒pENI3659，从而产生pENI3791。

质粒DENI4158的构建

使用PWO聚合酶进行两个PCR反应：

模板：pENI2419。寡聚物Oligo 170904L1和Oligo 190804L1

模板：pENI3420。寡聚物Oligo 190804L2和0603002j1

从琼脂糖凝胶分离并纯化两个PCR片段，并使用PWO聚合酶用于第三个PCR反应中：

模板：来自PCR反应a)和b)的PCR片段，连同寡聚物Oligo 170904L1和060302j1。

170904L1：ccatttcactactattatgc(SEQ ID NO：5)

190804L1：ctcggggaggtctcgcaggatctgtt(SEQ ID NO：6)

190804L2：gcgagacctccccgagggccagcttcccca(SEQ ID NO：7)

060302j1：agagcttaaagtatgtcccttg(SEQ ID NO：8)

用BamHI和MfeI切割第三个反应中产生的PCR片段和质粒pENI3791，从琼脂糖凝胶分离并纯化，连接，从而产生pENI4158。

实施例2：酵母中脂肪酸合成的浅蓝菌素(cerulinine)抑制

本实施例的目的是表明浅蓝菌素可通过抑制脂肪酸合成而抑制酵母生长，并且表明在甘油三酸酯存在的情况下脂肪酶的表达和分泌能在浅蓝菌素存在的情况下恢复酵母生长，这是由于脂肪酶在水解甘油三酸酯时产生了游离脂肪酸。

将质粒pENI3659(对照)和pENI4158(具有脂肪酶基因)转化入酵母菌株酿酒酵母JG 169(MAT-alpha；ura 3-52；leu 2-3，112；his 3-D200；pep 4-113；prc1::HIS3；prb1::LEU2)。将转化酵母在包含浅蓝菌素和橄榄油的平板上划线。

只有用pENI4158转化的酵母细胞，其表达活性脂肪酶，能在存在浅蓝菌素的情况下在甘油三酸酯平板上生长。

甘油三酸酯平板：

向450ml SC-ura-基本琼脂加入50ml 20％葡萄糖和10ml橄榄油。使用UltraTurax^TM超声发生器(IKA Labortechnik，德国)分散橄榄油。加入溶于1ml乙醇中的5mg浅蓝菌素和500微升氨苄青霉素(100mg/ml)。将混合物注入四个9cm培养皿中。

SC-ura-基本琼脂：7.5g不合氨基酸的酵母氮基，11.3g Bernstein，6.8gNaOH，5.6g酪蛋白水解物，0.1g L-色氨酸，20g琼脂，于总共900ml水。

实施例3：重排的脂肪酶的选择

将编码分泌并具有活性的脂肪酶的四种不同的野生型基因重排，所述脂肪酶的总体氨基酸序列同一性为32％(比较全部四种脂肪酶基因)：编码来自pENI2419的一种脂肪酶的基因(疏棉状腐质霉；实施例1)示于SEQ ID NO：9中，并且编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：10中。

编码第二种脂肪酶的基因(ND002444丛赤壳属菌种(Nectria sp))示于SEQ ID NO：11，并且氨基酸序列示于SEQ ID NO：12中。

编码第三种脂肪酶的基因(ND002119镰孢属菌种)示于SEQ ID NO：13，并且氨基酸序列示于SEQ ID NO：14中。

编码第四种脂肪酶的基因(ND002652玉米赤霉(Gibberella zeae))示于SEQ ID NO：15，并且氨基酸序列示于SEQ ID NO：16中。

按照生产商(Roche)的推荐，使用PWO聚合酶进行下述PCR，引物序列示于序列表中：

表1：包括模板和引物的PCR设置

PCR片段编号	模板	正向引物(SEQ ID NO：#)	反向引物(SEQ ID NO：#)
				1	ND002444	060302j1(8)	220506L1rev(17)
2	ND002444	220506L1fwp(18)	220506L2rev(19)
				3	ND002444	220506L2fwp(20)	220506L3rev(21)
4	ND002444	220506L3fwp(22)	220506L4rev(23)
				5	ND002444	220506L4fwp(24)	220506L5rev(25)
6	ND002444	220506L5fwp(26)	220506L6rev(27)
				7	ND002444	220506L6fwp(28)	230506L1(29)
8	ND002119	060302j1(8)	220506L7rev(30)
				9	ND002119	220506L7fwp(31)	220506L8rev(32)
10	ND002119	220506L8fwp(33)	220506L9rev(34)
				11	ND002119	220506L9fwp(35)	220506L10rev(36)

12	ND002119	220506L10fwp(37)	220506L11rev(38)
				13	ND002119	220506L11fwp(39)	220506L12rev(40)
14	ND002119	220506L12fwp(41)	230506L1(29)
				15	pENI2419	060302j1(8)	220506L13rev(42)
16	pENI2419	220506L13fwp(43)	220506L14rev(44)
				17	pENI2419	220506L14fwp(45)	220506L15rev(46)
18	pENI2419	220506L15fwp(47)	220506L16rev(48)
				19	pENI2419	220506L16fwp(49)	220506L17rev(50)
20	pENI2419	220506L17fwp(51)	220506L18rev(52)
				21	pENI2419	220506L18fwp(53)	230506L1(29)
22	ND002652	230506L2(54)	220506L19rev(55)
				23	ND002652	220506L19fwp(56)	220506L20rev(57)
24	ND002652	220506L20fwp(58)	220506L21rev(59)
				25	ND002652	220506L21fwp(60)	220506L22rev(61)
26	ND002652	220506L22fwp(62)	220506L23rev(63)
				27	ND002652	220506L23fwp(64)	220506L24rev(65)
28	ND002652	220506L24fwp(66)	230506L3(67)

按照生产商(Roche)的推荐，使用PWO聚合酶在100微升的总体积中进行下述PCR：

10微升PCR片段编号：1、7、8、14、15、21、22、28

1微升PCR片段编号：2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27。

用KpnI和SpeI切割PCR片段并克隆入用相同的酶切割的pENI3659。获得约30,000个大肠杆菌克隆。

从这些克隆制得DNA制备物，并转化入酵母(选择的在5-FOA平板上为Ura阴性的ATCC 26787(MATa，SUC2，mal，gal2，CUP1))中，获得约120,000个酵母转化体。

将文库涂布在甘油三酸酯平板(参见实施例2)上。很多酵母转化体在这些平板上生长。

使用Bio101-系统(FastDNA spinkit目录号6560-200)，按照生产商的推荐，从酵母转化体分离质粒DNA。将DNA制备物转化入大肠杆菌，并且从大肠杆菌转化体制备DNA。通过对质粒测序而鉴定所选择的重排的脂肪酶。

实施例4：分泌蛋白酶的芽孢杆菌属的平板选择

在这个实施例中选择转化体，其能在给定的生长条件下表达活性蛋白酶。选择机制是基于转化体细胞中一种或多种必需组分的合成受到生长培养基中存在的合成抑制剂的抑制。只有在转化子产生目的蛋白质，使其能在抑制剂存在的条件下生长时才能获得必需组分。

我们想要找到只允许分泌蛋白酶的芽孢杆菌属菌落在小肽met-gly-met-met(MGMM)存在的条件下生长的羧基甲氧基羟胺(CMA)的浓度。CMA抑制芽孢杆菌属细胞中甲硫氨酸的合成，严重影响它们的生长。然而，在存在MGMM时，分泌蛋白酶的芽孢杆菌属细胞能在包含CMA的培养基上生长。分泌的蛋白酶降解MGMM肽，从而释放游离的甲硫氨酸残基，后者由分泌蛋白酶的芽孢杆菌属细胞摄取并用于蛋白质合成。

实验描述：

融化500ml LB琼脂并放在培养箱中，直至琼脂到达60℃。向琼脂加入5ml met-gly-met-met(MGMM，Sigma M4786-250MG)(5mg/ml)和300微升1％氯霉素(溶于70％乙醇)。

用25ml Stripette^TM将4×25ml培养基转移至干净的25ml Nunc^TM容器中。如下述方案中所示向培养基加入不同量的CMA(Aldrich C13408-1g)。将全部25ml培养基注入9cm培养皿中，并在洁净工作台上干燥；“平板上涂布6×CMA”时除外，此时将25ml培养基注入9cm培养皿上并干燥，之后将600微升CMA(0.56mg/ml)涂布在平板上。

表2.

名称	0.56mg/ml CMA	平板中CMA的浓度，mg/L
			不含CMA的对照	0	0
平板中含5×CMA	500	11.2
			平板中含6×CMA	600	13.4
平板上涂布6×CMA	600	13.4
			平板中含7×CMA	700	15.7

平板中含8×CMA

800

17.9

将分泌标注为“10R”的野生型蛋白酶(WO 2004/111220)的芽孢杆菌属菌株和分泌失活的10R蛋白酶(在10R氨基酸序列中包含取代S143A)的芽孢杆菌属菌株两者接种于来自冷冻储液的200微升LB-液体培养基(bouillon)中。将这两种微生物在6种不同类型的平板上划线。在37℃倒置过夜培养所有平板。结果示于下面的表3中。

表3.

由表3可以清楚得知，在平板中具有11.2mg/L CMA以及MGMM的LB琼脂能用于只选择芽孢杆菌属转化体细胞，其分泌活性10R蛋白酶，因为只有它们能在给定条件下在平板上生长。

Claims (14)

1.用于选择至少一种分泌一种或多种目的活性酶的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包含一种或多种合酶抑制剂的生长培养基，该抑制剂抑制所述宿主细胞中至少一种必需化合物的合成，并且进一步包括一种或多种组分，其在存在所述一种或多种目的活性酶的情况下可转化为至少一种必需化合物，从而允许所述宿主细胞生长；

b)在步骤(a)的生长培养基中或其上培养所述宿主细胞；和

c)选择能在步骤(a)的生长培养基中或其上生长的至少一种宿主细胞，所述宿主细胞分泌一种或多种目的活性酶。

2.权利要求1的方法，其中将所述宿主细胞转化；优选用多核苷酸构建体转化所述宿主细胞，所述构建体包含编码一种或多种目的酶的至少一个多核苷酸。

3.权利要求1或2的方法，其中所述宿主细胞是微生物的宿主细胞。

4.权利要求3的方法，其中所述宿主细胞是原核的，优选所述宿主细胞是革兰氏阳性的，更优选所述宿主细胞是芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，并且最优选所述宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

5.权利要求3的方法，其中所述宿主细胞是真核的，优选所述宿主细胞是酵母细胞，更优选所述宿主细胞是酵母属(Saccharomyces)细胞，并且最优选所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述一种或多种目的活性酶为异源的或同源的。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述一种或多种目的活性酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和/或连接酶；优选所述一种或多种目的活性酶包括脂肪酶和/或蛋白酶。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括可抑制至少一种氨基酸和/或至少一种脂肪酸的合成的抑制剂。

9.权利要求8的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括5-硝基-2-苯并咪唑啉酮、草甘膦、羧基甲氧基羟胺、羧基甲氧基胺、O-烯丙基羟胺、吲哚丙烯酸、O-(羧基甲基)羟胺半盐酸盐、咪唑啉酮或磺酰脲。

10.权利要求8的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括可抑制甲硫氨酸合成的抑制剂，优选所述一种或多种合酶抑制剂包括羧基甲氧基羟胺。

11.权利要求8的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括三氯生、浅蓝菌素、硫乳霉素或diazaborin。

12.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括可抑制葡萄糖-6-磷酸酶的抑制剂，优选所述一种或多种合酶抑制剂包括根皮素、磷酸吡哆醛、theilavin A、2-羟基-5-硝基苯甲醛或木白斯他汀(Mumbaistatin)。

13.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括可抑制葡糖胺-6P合酶的抑制剂，优选所述一种或多种合酶抑制剂包括氨基连三唑或aptamine。

14.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述一种或多种合酶抑制剂包括可抑制果糖1，6二磷酸酶的抑制剂，优选所述一种或多种合酶抑制剂包括2，3-二氢-1H-环戊[b]喹啉。