CN103003298A - 在丝状真菌中产生c4二羧酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产生C4二羧酸如苹果酸的方法,其包括:(a)培养包含编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸的宿主细胞;和(b)回收所述C4二羧酸。本发明亦涉及增加C4二羧酸产生的方法,以及包含所述多核苷酸的宿主细胞。
Description
涉及序列表
本申请包含计算机可读形式的序列表,其通过提述并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及用于在丝状真菌中改善C4二羧酸(例如苹果酸)的产生的方法。
背景技术
有机酸在多种工业中具有悠久历史的商业使用。举例而言,有机酸用于食品和饲料工业(柠檬酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸和葡糖酸),作为用于产生多种聚合物的单体(己二酸、乳酸、丙烯酸和衣康酸),作为金属螯合剂(葡糖酸)和作为“绿色”溶剂(乙酸)(Sauer等,2008,Trends in Biotechnology26:100-108)。有机酸自身可为商业产品或其可为用于制造其他化学品的化学构件(building block)。除了专门应用之外,长久以来公认C4二羧酸亦可充当构件化合物以供产生大体积的工业化学品,如1,4-丁二醇,四氢呋喃和γ-丁内酯。由于石油衍生构件的高成本,通过传统石油化学途径产生这些大体积工业化学品的成本显著增加。
有机酸在商业上是通过从石油衍生原料的化学合成(例如,延胡索酸、苹果酸、丙烯酸和己二酸)或通过微生物发酵(例如柠檬酸、乳酸、葡糖酸和衣康酸)产生的。一些有机酸如延胡索酸和苹果酸亦可通过微生物发酵来产生,但由于更低的生产成本,目前在商业上仍通过化学合成从石油化学原料产生。然而,石油衍生构件化学品的成本的日益升高,地缘政治的不稳定性对原油价格的影响,以及对实施利用来源于可再生资源的原料的制造工艺的期望,刺激了通过微生物发酵产生有机酸和其他化学品中的重建的兴趣。
虽然现在通过化学合成从石油化学原料商业性产生苹果酸,其亦可通过微生物发酵产生。苹果酸已在基因工程改造的酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisia))(Zelle等,2008,Appl.Environ.Microbiol.74:2766-2777)和天然存在的丝状真菌如曲霉属菌种(Aspergillus spp.)(美国专利号3,063,910;Bercovitz等,1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)中以高水平产生。Abe等(美国专利号3,063,910)和Bercovitz等(1990,Appl.Environ.Microbiol.56:1594-1597)报道了在几种曲霉属菌种中高水平的苹果酸产生。而且,Battat等(1991,Biotechnol.Bioengineering,37:1108-1116)报道了在优化条件下在搅拌的发酵罐中由黄曲霉(Aspergillus flavus)产生了高至113g/L的苹果酸。在WO2010/003728中描述了在酵母中通过微生物发酵产生二羧酸。亦在WO2009/011974和WO2009/155382中描述了通过微生物发酵产生苹果酸。通过对曲霉属(Aspergillus)进行遗传工程改造改善苹果酸产生会使得能够通过发酵经济地商业性生产苹果酸。
在曲霉属菌种(Aspergillus spp.)中的苹果酸过量产生在特定的培养条件(有氧条件和高C:N比;碳酸钙亦作为中和剂和作为用于苹果酸生物合成的CO2源添加)下发生。在这些条件下,通过胞质溶胶的、还原性三羧酸(TCA)循环的溢出代谢(overflow metabolism)导致增加的苹果酸生物合成和分泌入培养基。已在酿酒酵母中报道了通过使用遗传工程增加丙酮酸羧化酶(Bauer等,1999,FEMSMicrobiol Lett.179:107-113)或苹果酸脱氢酶(Pines等,1997,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:248-255)的水平和增加苹果酸转运蛋白的表达(Zelle等,2008,见上)增加苹果酸产生。基于生物化学证据,提出了在黄曲霉菌株ATCC13697中,苹果酸脱氢酶活性限制苹果酸产生(Peleg等,1988,Appl.Microbiol.Biotechnol.28:69-75)。2010年4月23日提交,标题为“Methods for Improving Malic AcidProduction in Filamentous Fungi”的美国临时申请号61/327,224(其内容通过提述以其整体并入本文)描述了在丝状真菌中的苹果酸产生。
在本领域中,在曲霉属中作为使用重组DNA技术的遗传工程改造的结果而改善C4二羧酸产生如苹果酸产生会是有益的。本发明提供了用于改善C4二羧酸产生(例如苹果酸产生)的方法等。
发明内容
本发明涉及产生C4二羧酸(例如苹果酸)的方法。在一个方面,该方法包括:(a)培养宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞),所述宿主细胞包含编码本文中所述的C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸;和(b)回收所述C4二羧酸(例如苹果酸)。在另一个方面,该方法包括(a)将编码本文中所述的C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸转化入宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞);(b)在培养基中培养经转化的生物;和(c)回收所述C4二羧酸(例如苹果酸)。
本发明还涉及宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞,如米曲霉(Aspergillusoryzae)),所述宿主细胞包含本文中所述的多核苷酸,其中所述宿主细胞分泌和/或能够分泌增加水平的C4二羧酸(例如苹果酸)。
附图说明
图1显示p41620ssjMAT275的限制图谱。
图2显示pShTh60的限制图谱。
图3显示pSaMF37的限制图谱。
图4显示日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)C4二羧酸转运蛋白基因的基因组密码子优化的DNA序列(CO),推导的氨基酸序列,和基因组野生型DNA序列(WT)(分别为SEQ ID NO:1、2和3)。
定义
C4二羧酸转运蛋白:术语“C4二羧酸转运蛋白”在本文中定义为可将苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸和/或延胡索酸转运至细胞外的二羧酸通透酶(Grobler等,1995,Yeast11:1485-1491;Camarasa等,2001,Applied andEnvironmental Microbiology67:4144-4151)。用于预测线粒体输入的蛋白及其靶向序列的计算方法由Claros和Vincens,1996,Eur.J.Biochem.241:779-786描述。
所述C4二羧酸转运蛋白具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的C4二羧酸转运蛋白活性(例如苹果酸转运蛋白活性)的至少20%,例如至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或至少100%。
苹果酸脱氢酶:术语“苹果酸脱氢酶”在本文中定义为在NADH+H+的存在下催化将草酰乙酸还原为苹果酸和NAD+的苹果酸:NAD+氧还酶(EC1.1.1.37)。就本发明而言,根据下述步骤确定苹果酸脱氢酶活性。测定溶液由1mM草酰乙酸,100mM Tris pH8.0,10mM NaHCO3,5mM MgCl2,和0.1mMNADH(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)组成。将不含草酰乙酸作为底物的测定溶液作为对照运行以测量背景NADH降解率。用双蒸水制备每种上清的1/100,1/500,1/2500和1/12500的稀释。将测定溶液的270μl的等分试样分配入96孔聚苯乙烯平底板。添加每种稀释的上清的30μl样品以起始测定。使用SPECTRAMAX340PC读板器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)以下述设定监测反应:340nm,动力学读取。使用NADH的浓度系列以构建标准曲线,并使用纯化的苹果酸脱氢酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)的稀释系列作为阳性对照。一单位的苹果酸脱氢酶活性等于能够在pH8.0,25℃每分钟将1微摩尔草酰乙酸和NADH+H+转化为苹果酸和NAD+的酶量。
丙酮酸羧化酶:术语“丙酮酸羧化酶”在本文中定义为在ATP和HCO3 -存在下催化将丙酮酸羧化为草酰乙酸、ADP和磷酸的丙酮酸:二氧化碳连接酶(ADP-形成)(EC6.4.1.1)。就本发明而言,根据针对丙酮酸羧化酶的SIGMAQuality Control Test方法(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA)的步骤确定丙酮酸羧化酶活性,只是该测定中使用的缓冲液为pH8.0的Tris缓冲液。一单位的丙酮酸羧化酶活性等于能够在pH7.8,30℃每分钟将1微摩尔的丙酮酸和CO2转化为草酰乙酸的酶量。
异源多核苷酸:术语“异源多核苷酸”在本文中定义为对于宿主细胞并非天然的多核苷酸;其中已对编码区进行结构修饰的天然多核苷酸;作为通过重组DNA技术(例如,不同的(外源)启动子)操纵DNA的结果其表达定量改变的天然多核苷酸;或其表达通过将一个或多个(例如,两个、几个)额外拷贝的多核苷酸导入宿主细胞而定量改变的天然多核苷酸。
分离的/纯化的:术语“分离的”和“纯化的”意指从至少一种与其天然结合(associated)的成分分离的多肽或多核苷酸。举例而言,如通过SDS-PAGE确定的,该多肽可为至少1%纯,例如至少5%纯,至少10%纯,至少20%纯,至少40%纯,至少60%纯,至少80%纯,至少90%纯,至少93%纯,至少95%纯,至少97%纯,至少98%纯,或至少99%纯;且如通过琼脂糖电泳确定的,该多核苷酸可为至少1%纯,例如至少5%纯,至少10%纯,至少20%纯,至少40%纯,至少60%纯,至少80%纯,至少90%纯,至少93%纯,至少95%纯,至少97%纯,至少98%纯,或至少99%纯。
成熟多肽:术语“成熟多肽”意指为以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽,所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面,基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至89是信号肽的InterProScan程序(The European Bioinformatics Institute),所述成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸90至450。在另一个方面,基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至57是信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6),所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸58至450。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”在意指为编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的成熟多肽的多核苷酸。所述成熟多肽编码序列可来自基因组DNA(“成熟多肽基因组编码序列”)或来自cDNA(“成熟多肽cDNA编码序列”)。在一个方面,基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至267编码信号肽的InterProScan程序(The European Bioinformatics Institute),所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸268至1353。在另一个方面,基于预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至171编码信号肽的SignalP程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering10:1-6),所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸172至1353。
序列同一性:两个氨基酸序列间或两个核苷酸序列间的相关性由参数“序列同一性”所描述。就本发明而言,两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10,缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的残基×100)/(比对长度-比对中缺口总数)
就本发明而言,两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套组(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite),Rice等,2000,见上)的Needle程序(优选为3.0.0版或之后的版本)中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上)确定的。所用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5,和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并如下计算:
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中缺口总数)。
片段:术语“片段”意指从成熟的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的多肽。在一个方面,所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。在另一个方面,片段包含SEQ ID NO:2的至少385个氨基酸残基,例如至少405个氨基酸残基或至少425个氨基酸残基。
亚序列:术语“亚序列”意指从成熟多肽编码序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(例如两个、几个)核苷酸的多核苷酸。在一个方面,所述亚序列编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。在另一个方面,亚序列包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的至少1155个核苷酸,例如至少1215个核苷酸或至少1275个核苷酸。
等位变体:术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生,并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
编码序列:术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框确定,所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始,并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成多核苷酸和/或重组多核苷酸。
cDNA:术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体,其通过一系列包括剪接的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。在一些情况下,cDNA序列可与基因组DNA序列完全相同。
核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子,其分离自天然存在的基因,或经修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段,或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调控序列(control sequence):术语“调控序列”意指编码本发明的多肽的多核苷酸的表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的多核苷酸可为天然的或外源的,或各个调控序列对于彼此可为天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况,调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置,使得调控序列指导编码序列的表达。
表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体:术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子,其包含编码多肽的多核苷酸,并与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指任何细胞类型,所述细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸(例如编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语宿主细胞涵盖亲本细胞的任何后代,其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。
变体:术语“变体”意指在一个或多个位置包含改变即取代、插入和/或缺失一个或多个(例如两个、几个)氨基酸残基的,具有活性例如C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替换;缺失意指去除占据某位置的氨基酸;而插入意指在占据某位置的氨基酸的相邻处添加一个或多个,例如1-3个氨基酸。
在本文中,提及“约”某值或参数包括了涉及该值或参数本身的方面。举例而言,提及“约X”的描述包括了“X”的方面。
如用于本文中和所附权利要求中,除非上下文明确地表示相反,单数形式“一(个/种…)(a)”或“所述/该(the)”包括了对复数的提及。应理解本文中所述的发明的各方面包括了“由…组成(consisting)”和/或“基本上由…组成(consisting essentially of)”的方面。
除非另行定义或上下文明确指出,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常理解的相同的含意。
发明详述
本发明描述了特定基因在宿主细胞如丝状真菌例如曲霉属(Aspergillus)中的过量表达以增强C4二羧酸(例如苹果酸)的产生,其涵盖通过C4二羧酸转运蛋白将C4二羧酸转运至细胞外。在本发明中,所述C4二羧酸转运蛋白可为任何适于实施本发明的、所述的C4二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是在培养条件下过表达,以高效价产生C4二羧酸的转运蛋白。
在一个方面,本发明涉及产生C4二羧酸(例如苹果酸)的方法,其包括:(a)培养宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞),所述宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,其中所述宿主细胞与不具有所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞相比分泌增加水平的苹果酸,且其中所述转运蛋白选自:(i)C4二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性;(ii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:1或3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列杂交;(iii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性;(iv)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个氨基酸(例如两个、几个)的取代、缺失和/或插入;和(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸转运蛋白具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;和(b)回收所述C4二羧酸。
在另一个方面,本发明涉及用于增加C4二羧酸(例如苹果酸)产生的方法,该方法包括(a)将编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸转化入宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞),其中所述宿主细胞与不具有所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞相比分泌增加水平的苹果酸,且其中所述转运蛋白选自:(i)C4二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性;(ii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:1或3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列杂交;(iii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性;(iv)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个氨基酸(例如两个、几个)的取代、缺失和/或插入;和(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;(b)在培养基中培养经转化的生物;和(c)回收所述C4二羧酸。
在一些这些方面,所述C4二羧酸是苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、丙二酸或延胡索酸,或其组合。在一些方面,所述C4二羧酸是苹果酸、琥珀酸或延胡索酸,或其组合。在一些方面,所述C4二羧酸是苹果酸或延胡索酸,或苹果酸和延胡索酸的组合。在一些方面,所述C4二羧酸是苹果酸。
在任何这些方面,所述C4二羧酸转运蛋白具有C4二羧酸转运蛋白活性,并包含氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性程度。在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于十个氨基酸,例如十个氨基酸,例如不多于五个氨基酸,不多于四个氨基酸,不多于三个氨基酸,不多于两个氨基酸,或不多于一个氨基酸,如下文对变体的讨论中所述。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体,或前述的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体;或它们具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段,或由SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体;或它们具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段组成。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸58至450或由SEQ ID NO:2的氨基酸58至450组成。在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸90至450或由SEQ ID NO:2的氨基酸90至450组成。
在任何这些方面,所述C4二羧酸转运蛋白由下文中在关于分离的多核苷酸的部分中所述的多核苷酸编码。
在任何这些方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,低-中等严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,低-中等严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:1或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,低-中等严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:3或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3的多核苷酸,或亚序列;以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或其片段,可用于设计核酸探针,以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码C4二羧酸转运蛋白的DNA。具体而言,根据标准的Southern印迹方法,可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组DNA或cDNA杂交,以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列,例如长度上为至少14,至少25,至少35,或至少70个核苷酸。优选所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度。举例而言,所述核酸探针可为至少200个核苷酸,例如至少300个核苷酸,至少400个核苷酸,或至少500个核苷酸的长度,可使用甚至更长的探针,如至少600个核苷酸,例如至少700个核苷酸,至少800个核苷酸,或至少900个核苷酸的长度的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以供检测相应的基因(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。
可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,或通过其它分离技术分离来自这些其它株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或它们的亚序列同源的克隆或DNA,所述载体材料可用于Sounthern印迹。
就本发明而言,杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交,所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3或其全长互补链的成熟多肽编码序列;或前述的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面,核酸探针是编码SEQ ID NO:2或其片段的多核苷酸。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个方面,核酸探针是SEQ ID NO:3。
对于长度至少100个核苷酸的长探针,将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃,在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中,并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺,根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性),在50℃(低严格性),在55℃(中严格性),在60℃(中-高严格性),在65℃(高严格性),和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次,每次15分钟。
对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针,将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)计算的Tm低大约5℃至大约10℃,在0.9M NaCl,0.09M Tris-HCl pH7.6,6mM EDTA,0.5%NP-40,1×Denhardt溶液,1mM焦磷酸钠,1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate),0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中,根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料在6×SSC加0.1%SDS中最终洗涤一次15分钟,并用6×SSC在比计算的Tm低5℃至10℃的温度洗涤两次,每次15分钟。
在这些方法的任何方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。在这些方法的一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。在这些方法的另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
在任何这些方面,C4二羧酸转运蛋白为变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。优选地,氨基酸改变的性质是较不重要的(of a minor nature),即保守的氨基酸取代或插入,其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性;通常为1至大约30个氨基酸的小缺失;小的氨基或羧基末端延伸,例如氨基末端甲硫氨酸残基;多至大约20-25个残基的小接头肽;或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸,如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。
保守取代的实例是在以下组之内:碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的,并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
或者,氨基酸改变具有这样的性质:使多肽的物理化学性质改变。例如,氨基酸改变可改善多肽的热稳定性,改变底物特异性,改变最适pH等。
能够根据本领域已知的方法,例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中,将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基,并且测试所得突变分子的C4二羧酸转运蛋白活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定,如通过以下这些技术:如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记,连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science255:306-312;Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等,1992,FEBSLett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断,所述多肽与亲本多肽相关。
能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法接着进行有关的筛选方法,例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57;Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,Lowman等,1991,Biochemistry30:10832-10837;美国专利No.5,223,409;WO92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145;Ner等,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子,并且使用本领域中的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一些方面,SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于10,例如不多于1,2,3,4,5,6,7,8或9。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:2的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。在一个方面,所述片段含有SEQ IDNO:2的至少385个氨基酸残基,例如优选至少405个氨基酸残基,或至少425个氨基酸残基。
所述C4二羧酸转运蛋白可为融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一种多肽融合于本发明多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的,并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中,并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的调控下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建,其中融合物在翻译后产生(Cooper等,1993,EMBO J.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以包含在两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合多肽,就切割所述位点,释放所述两个多肽。切割位点的实例包括,但不限于,公开于Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;和Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381;Eaton等,1986,Biochem.25:505-512);Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987;Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;以及Stevens,2003,Drug Discovery World4:35-48中的位点。
多核苷酸
用于本文中提及的任何方面(例如,SEQ ID NO:2用于产生C4二羧酸的方法,增加C4二羧酸产生的方法,或其宿主细胞的任何方面)的用于分离或克隆编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸的技术是本领域内已知的,包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段,从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见,例如,Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法,如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligated activatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)菌株,或其他或相关生物体克隆所述多核苷酸,并且因此可为例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。
在一个方面,所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3组成。在另一个方面,所述分离的多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的C4二羧酸转运蛋白。本发明亦涵盖编码包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成的多肽的核苷酸序列(或任何其相关的方面),所述核苷酸序列由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3不同。本发明还涉及SEQ ID NO:1的亚序列,其编码SEQ ID NO:2的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸可为突变的多核苷酸,其SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中包含或仅具有(consist of)至少一个突变,其中所述突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO:2。
在另一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列。在一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:1或其全长互补链的成熟多肽编码序列。在另一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸在非常低严格条件,低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:3或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1或3的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性,并编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。在一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性,并编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。在另一个方面,所述分离的多核苷酸包含或组成为核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少60%,例如至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%的序列同一性,并编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的多肽。
在另一个方面,所述编码具有C4二羧酸转运蛋白活性的C4二羧酸转运蛋白的分离的多核苷酸通过以下获得:(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中等-高、高或非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列;和(b)分离所述杂交的多核苷酸。
C4二羧酸转运蛋白的来源
所述C4二羧酸转运蛋白可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”应意指由多核苷酸编码的C4二羧酸转运蛋白由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白转运至外膜。
所述C4二羧酸转运蛋白可为细菌C4二羧酸转运蛋白。例如,所述C4二羧酸转运蛋白可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)C4二羧酸转运蛋白;或革兰氏阴性细菌多肽,如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)C4二羧酸转运蛋白。
在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)C4二羧酸转运蛋白。
所述C4二羧酸转运蛋白可为真菌C4二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述真菌C4二羧酸转运蛋白为酵母C4二羧酸转运蛋白,如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是裂殖酵母属C4二羧酸转运蛋白,如日本裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白。在一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:2的日本裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是丝状真菌C4二羧酸转运蛋白,如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)C4二羧酸转运蛋白。
在另一个方面,所述C4二羧酸转运蛋白是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、黄曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Asperigullus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)C4二羧酸转运蛋白。
可理解的是对于前述的种,本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states),和其它分类学的等同物(equivalent),例如无性型(anamorph),而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。
这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得,所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。
亦可使用上述的探针从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述C4二羧酸转运蛋白。用于从天然生境(habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的。然后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸。一旦用如本文中所述的合适探针检测到编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸,就能够使用本领域普通技术人员已知的技术将所述序列分离或克隆(参见,例如,J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York)。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体,所述核酸构建体包含编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸,如编码苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)与一个或多个(例如两个、几个)调控序列连接,所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。在一个方面,所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对该多核苷酸外源的启动子。在一个方面,编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对该多核苷酸外源的启动子。在一个方面编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对该多核苷酸外源的启动子。
可以用许多方式操作多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体,在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
调控序列可为启动子序列,其是由用于表达编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸(或其它本文中所述的多核苷酸,如编码苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸,包括突变的、截短的和杂合的启动子,并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子:解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA75:3727-3731),以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteinsfrom recombinant bacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中;和在Sambrook等,1989,见上文中描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶,以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子,其来自在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因,其中未翻译的前导序列已由在曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代;非限制性实例包括修饰的启动子,其来自在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因,其中未翻译的前导序列已由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代);和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中,有用的启动子从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列,其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列,当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得:酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列,其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列,并且在转录时,宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区,其编码与多肽的N端相连的信号肽,并且指导多肽进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列,其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是,编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者,外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而,可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列:芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是前肽编码序列,其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的,并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE),枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时,将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端,并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。
同样理想的是添加调节序列,其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物,包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中,可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中,这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因,和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下,编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体,所述重组表达载体包含编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸(或本文中所述的其它多核苷酸,如编码苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸)、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体,所述表达载体可以包括一个或多个(例如两个、几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是,可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中,将编码序列置于载体中,从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA步骤,并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体(entity)存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者,载体可以是一种当被引入宿主细胞中时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒,其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA),或可以使用转座子(transposon)。
载体可含有一个或多个(例如两个、几个)选择性标记,其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因,其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或赋予抗生素抗性的标记,所述抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
载体可含有元件,其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组,载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者,载体可以含有额外的多核苷酸,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件应含有足够数量的核酸,如100至10,000碱基对,400至10,000碱基对,和800至10,000碱基对,其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列,其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外,整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面,可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点,其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator),其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点,和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点,ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合,和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67;Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175;WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得:将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组,或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸,其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝,且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞,其包含本文中所述的多核苷酸(例如编码C4二羧酸转运蛋白,苹果酸脱氢酶,和/或丙酮酸羧化酶的多核苷酸),所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(例如两个、几个)调控序列,所述调控序列指导本文中所述的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞,使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代,其由于在复制中发生的突变不同于亲本细胞。在一些情况下,宿主细胞的选择依赖于编码多肽的基因及其来源。下文中所述的方面适用于宿主细胞本身,以及使用宿主细胞的方法。
所述宿主细胞可为任何能够重组产生本发明的多肽的细胞,例如原核细胞或真核细胞,和/或任何能够重组产生C4二羧酸(例如苹果酸)的细胞(例如任何丝状真菌细胞)。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于,芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于,弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞,包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞,包括但不限于,似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞,包括但不限于,不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞:例如原生质体转化(参见,例如,Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115),使用感受态细胞(参见,例如,Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221),电穿孔(参见,例如,Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见,例如,Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞:例如原生质体转化(参见,例如,Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见,例如,Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞:例如原生质体转化和电穿孔(参见,例如,Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405),接合(参见,例如,Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585),或转导(参见,例如,Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞:例如电穿孔(参见,例如,Choi等,2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(参见,例如,Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞:例如天然感受态(natural competence)(参见,例如,Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297),原生质体转化(参见,例如,Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207),电穿孔(参见,例如,Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见,例如,Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而,可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物,如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
所述宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门:子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
所述真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变,就本发明而言,将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞,如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。
所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文,所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行,而碳分解代谢可以是发酵的。
所述丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
所述丝状真菌宿主细胞可为棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
在一个方面,所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。在另一个方面,所述宿主细胞是米曲霉。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母:Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York;Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163;和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920。
在一些方面,所述宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸,并能够如本文中的方法所述产生C4二羧酸(例如苹果酸)。在一个方面,所述宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞)包含编码本文中所述的C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,其中所述宿主细胞与不具有所述C4二羧酸转运蛋白的丝状真菌宿主细胞当在相同条件下培养时相比分泌和/或能够分泌增加水平的C4二羧酸(例如苹果酸)。
在一个方面,所述宿主细胞包含编码本文中所述的C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸(例如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3或其任何所述的方面)和编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸。在本发明中,所述苹果酸脱氢酶可为任何适于实施本发明的苹果酸脱氢酶。具体而言,所述苹果酸脱氢酶可为存在于宿主细胞胞质溶胶中的酶。
可用于实施本发明的苹果酸脱氢酶包括但不限于:烟曲霉苹果酸脱氢酶(AFUA_2G13800;Nierman等,2005,Nature438:1151-1156);构巢曲霉苹果酸脱氢酶(AN5031.1,AN6499.1;Sims等,2004,Mycol.Res.108:853-857);黑曲霉苹果酸脱氢酶(An11g07190,An12g00160,An15g00070;Pel等,2007,NatureBiotechnology25:221-231);米曲霉NRRL3488苹果酸脱氢酶(SEQ ID NO:19的基因组DNA和SEQ ID NO:20的推导的氨基酸序列);Phytophthorainfestans苹果酸脱氢酶(PITG15476.1;Calcagno等,2009,Mycological Research113:771-781);和酿酒酵母苹果酸脱氢酶(YOL126C;Minard和McAlister-Henn,1991,Mol.Cell.Biol.11:370-380;YDL078C;McAlister-Henn等,1995,Journalof Biological Chemistry270:21220-21225)。
所述苹果酸脱氢酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为由多核苷酸编码的苹果酸脱氢酶由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌苹果酸脱氢酶。在另一个方面,所述苹果酸脱氢酶为米曲霉苹果酸脱氢酶。
亦可从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从天然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述苹果酸脱氢酶,如上文中所述。所述苹果酸脱氢酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文中所述。在一个方面,所述苹果酸脱氢酶是亲本苹果酸脱氢酶的变体,其包含氨基酸序列的一个或多个(例如两个、几个)修饰,这减少苹果酸脱氢酶的体内线粒体输入。用于分离或克隆编码苹果酸脱氢酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
在另一个方面,所述宿主细胞包含编码本文中所述的C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸(例如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3或其任何所述的方面)和编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。在本发明中,所述丙酮酸羧化酶可为任何适于实施本发明的丙酮酸羧化酶。具体而言,所述苹丙酮酸羧化酶可为存在于宿主细胞胞质溶胶中的酶。
可用于实施本发明的丙酮酸羧化酶包括但不限于:棒曲霉(Aspergillusclavatus)NRRL1丙酮酸羧化酶(XP_001271664;Direct Submission,Submitted(26-OCT-2006),The Institute for Genomic Research,9712Medical Center Drive,Rockville,MD20850,USA);烟曲霉Af293丙酮酸羧化酶(XP_752054;Nierman等,2005,Nature438:1151-1156);构巢曲霉FGSC A4丙酮酸羧化酶(XP_662066;Galagan等,2005,Nature438:1105-1115);黑曲霉丙酮酸羧化酶(An15g02820;Pel等,2007,Nature Biotechnology25:221-231;ASPNG5061;Panneman等,(JUL-1998)提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库);土曲霉丙酮酸羧化酶(O93918;Direct Submission,Submitted(OCT-1998)The Institute for Genomic Research,9712Medical Center Drive,Rockville,MD20850,USA);Magnaporthe grisea70-15丙酮酸羧化酶(XP_367852;Direct Submission,Submitted(26-SEP-2005)Broad Instituteof MIT and Harvard,320Charles Street,Cambridge,MA02142,USA);粗糙脉孢菌OR74A丙酮酸羧化酶(XP_965636;Galagan等,2003,Nature422:859-868);米根霉(Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶(RO3G_06931.1);酿酒酵母丙酮酸羧化酶(NP_009777;Gaffeau等,1996,Science274:546-547);粟酒裂殖酵母丙酮酸羧化酶(NP_595900;Direct Submission,Submitted(29-JUN-2007)EuropeanSchizosaccharomyces genome sequencing project,Sanger Institute,The WellcomeTrust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB101SA);和玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)丙酮酸羧化酶(um01054;McCann和Snetselaar,2008,FungalGenetics and Biology45:S77-S87)。
所述丙酮酸羧化酶可以获得自任何属的微生物。就本发明而言,用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”,意思应为由多核苷酸编码的丙酮酸羧化酶由所述来源产生,或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的细胞产生。在一个方面,所述丙酮酸羧化酶可为从本文中所述的微生物获得的细菌、酵母或丝状真菌丙酮酸羧化酶。在另一个方面,所述丙酮酸羧化酶为米曲霉丙酮酸羧化酶。
亦可从其它来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等)分离的微生物,或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述丙酮酸羧化酶,如上文中所述。所述丙酮酸羧化酶亦可包括融合多肽或可切割的融合多肽,如上文中所述。所述丙酮酸羧化酶亦可为线粒体丙酮酸羧化酶的变体,使得减少进入线粒体的体内输入,从而增加胞质溶胶中的丙酮酸羧化酶变体的水平。用于分离或克隆编码丙酮酸羧化酶的多核苷酸的技术如上文中所述。
在另一个方面,所述宿主细胞包含本文中所述的编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸(例如SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3或其任何所述的方面),编码苹果酸脱氢酶的异源多核苷酸,和编码丙酮酸羧化酶的异源多核苷酸。可与这些宿主细胞一同使用的苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的实例可见于,例如2010年4月23日提交的标题为“Methods for Improving Malic AcidProduction in Filamentous Fungi”的美国临时专利申请号61/327,224,其内容通过提述以其整体并入本文,特别是关于本文中所述的编码苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的多核苷酸。在任何这些方面,所述异源多核苷酸可以可操作地连接于外源启动子,如上文中所述。
在任何这些方面,宿主细胞与不具有编码所述C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的编码多核苷酸的宿主细胞当在相同条件下培养时相比分泌和/或能够分泌至少25%,例如至少50%,至少100%,至少150%,至少200%,至少300%,或至少500%的增加水平的C4二羧酸(例如苹果酸)。
可使用本领域公知方法在适于产生C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和/或丙酮酸羧化酶的营养培养基中培养重组丝状真菌宿主细胞。举例而言,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养和小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中),或可从商业上可获得的成分制备。
可以使用本领域已知的对于多肽具特异性的方法来检测C4二羧酸转运蛋白、苹果酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,如本文中所述,酶测定(enzyme assay)可用于确定苹果酸脱氢酶变体和丙酮酸羧化酶的活性。可使用任何本领域中已知的方法来回收苹果酸。参见,例如WO1998/022611和美国专利号7,601,865。
通过下述实施例进一步描述本发明,其不应视为对本发明范围的限制。
实施例
用作缓冲液和底物是至少试剂级的商品。
菌株
使用日本裂殖酵母作为C4二羧酸转运蛋白基因ssjMAT275(NCBIGeneID:7048154)的来源。使用米曲霉NRRL3488(或ATCC56747)产生C4二羧酸。
培养基
YEG培养基组成为:20g葡萄糖,5g酵母提取物,和去离子水加至1升。
COVE平板组成为:1M蔗糖,2%COVE盐溶液,10mM乙酰胺,15mMCsCl,和25g/l Agar Noble。
COVE盐溶液组成为:26g KCl,26g MgSO4·7H2O,76g KH2PO4,50mlCOVE痕量元素溶液,和去离子水加至1升。
COVE痕量元素溶液组成为:0.04g Na2B4O7·10H2O,0.04g CuSO4·5H2O,1.2g FeSO4·7H2O,0.7g MnSO4·H2O,0.8g Na2MoO2·2H2O,10g ZnSO4·7H2O和去离子水加至1升。
种子培养基B组成为:30g葡萄糖,3g细菌用蛋白胨(Bacto Peptone),560mgKH2PO4,560mg K2HPO4,925mg NaH2PO4·H2O,820mg Na2HPO4,75mgMgSO4·7H2O,75mg CaCl2·H2O,0.75ml的1000X微量营养物溶液(MicronutrientSolution),和去离子水加至1升。
酸产生培养基C组成为:100g葡萄糖,80g CaCO3,6g细菌用蛋白胨,150mg KH2PO4,150mg K2HPO4,100mg MgSO4·7H2O,100mg CaCl2·H2O,1ml1000X微量营养物溶液,和去离子水加至1升。
1000X微量营养物溶液组成为:5g NaCl,5g FeSO4·7H2O,1g柠檬酸,和去离子水加至1升。
PDA平板组成为:39g/l马铃薯右旋糖琼脂。
2XYT+amp平板组成为:16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5g NaCl,100mg氨苄青霉素,15g细菌用琼脂(Bacto agar),和去离子水加至1升。
实施例1:日本裂殖酵母C4二羧酸转运蛋白基因的克隆和表达载体pSaMF37的构建
对1353bp C4二羧酸转运蛋白基因ssjMAT275进行密码子优化以供在米曲霉中表达和合成构建入p41620ssjMAT275(图1;DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)。使用下示的引物069869和069870从p41620ssjMAT275扩增ssjMAT275基因。
引物069869:
5’-TGTGATAGAACATCGTCCATAATGTCGTCGGAGACA-3’(SEQ ID NO:4)
引物069870:
5’-GTGTCAGTCACCTCTAGTTATTAAATCTTTTCCTCGTCCG-3’(SEQ ID NO:5)
PCR反应包含10μL5X反应缓冲液(Finnzymes,Inc.Massachusetts,USA),1μL p41620ssjMAT275模板(20ng/μL),1μL引物069869(100ng/μL),1μL引物069870(100ng/μL),1μL dNTP混合物(10mM),35.5μL去离子水,和0.5μL PhusionTMHot Start High-Fidelity DNA Polymerase(Finnzymes,Inc.Massachusetts,USA)。扩增反应在EPPENDORFMASTERCYCLER(Eppendorf Scientific Inc.Westbury,New York,USA)中温育,其程序如下:1个循环在98℃进行30秒;30个循环,每循环在98℃进行10秒,60℃进行30秒,和72℃进行1分钟;和一个循环,在72℃进行10分钟。对PCR反应物用DpnI进行限制性消化1小时以降解任何质粒DNA模板,然后使用MinElutePCR Purification Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化。
将质粒pShTh60(图2;亦参见2010年4月23日提交的美国临时申请号61/327,224)用SexAI和PacI消化,然后通过TBE缓冲液(10.8g/L Tris碱,5.5g/L硼酸,2mM EDTA,pH8.0)中的0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)纯化。然后将上述纯化的PCR产物使用In-FusionTM Advantage反应试剂盒(Clontech,Mountain View,CA,USA)插入消化的pShTh60,反应包含2μL5X缓冲液(Clontech,Mountain View,CA,USA),0.5μL纯化的PCR产物(170ng/μL),1.5μL经消化和凝胶纯化的pShTh60(132ng/μL),1μL In-FusionTM酶和5μL去离子水。将反应在37℃温育15分钟然后在50℃温育15分钟,接着将其置于冰上5分钟,并用40μL TE缓冲液(10mM Tris碱,1mM EDTA,pH8.0)稀释,得到pSaMF37(图3)。
将上述连接反应物的2.5μL等分试样根据生产商的指示转化入ONESHOTTOP10化感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen,San Diego,CA,USA)。将转化体铺板于2XYT+amp平板上,并在37℃温育过夜。挑取所得的转化体,并对其进行DNA测序以确认ssjMAT275基因整合入载体。
日本裂殖酵母ssjMAT275基因经密码子优化的核苷酸序列(CO),推导的氨基酸序列和野生型核苷酸序列(WT)示于图4A和4B(分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)。编码序列为1353bp,包括终止密码子。编码的预测的蛋白为450个氨基酸。使用SignalP程序(Nielsen等,1997,ProteinEngineering10:1-6),预测了57个残基的信号肽。基于该程序,预测的成熟蛋白包含393个氨基酸,具有44.1kDa的预测的分子量,和9.03的等电点pH。使用InterProScan程序(The European Bioinformatics Institute),预测了89个残基的信号肽。基于该程序,预测的成熟蛋白包含361个氨基酸,具有40.6kDa的预测的分子量,和8.87的等电点pH。
实施例2:将pSaMF37转化入米曲霉NRRL3488
进行米曲霉NRRL3488的原生质体制备和转化,即,将大约2x107个孢子接种入100mL YEG培养基,并将烧瓶在27℃以140rpm温育16-18小时。收集菌丝体,即将培养物倾倒透过衬有MIRACLOTH(Calbiochem,San Diego,CA,USA)的灭菌漏斗,并用50mL的0.7M KCl漂洗。将经洗涤的菌丝体重悬于含有20mL原生质体化溶液的125mL烧瓶,所述溶液包含每mL0.7M KCl(经过滤灭菌)5mg的GLUCANEXTM(Novozymes A/S,Denmark)和0.5mg的壳多糖酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,USA),并将该烧瓶在34℃以80rpm混合温育30分钟。将原生质体化溶液倾倒透过衬有MIRACLOTH的灭菌漏斗,并用50mL的STC缓冲液(1M山梨醇-10mM Tris-HCl pH6.5-10mMCaCl2)漂洗。将流过物在两个50mL聚丙烯管中收集。将管在室温在1300x g离心10分钟。弃去上清并将原生质体沉淀重悬于20mL的STC缓冲液。洗涤原生质体,即进行两轮的将沉淀重悬于20mL的STC缓冲液并在室温在1300xg离心10分钟。将最终沉淀重悬于2mL的STC缓冲液。对原生质体进行计数,即移出10μl样品并在血细胞计数器(VWR,West Chester,PA,USA)中对其进行计数。用STC缓冲液调整体积以获得2x107每mL的原生质体浓度。
通过用PmeI进行限制性消化制备pSaMF37以供转化。通过TBE缓冲液中的0.8%琼脂糖凝胶电泳从消化的载体分离5136bp表达盒,并使用QIAQUICKGel Extraction Kit进行纯化。准备了两个转化反应。对于每个反应,将原生质体制备物的100μL溶液转移至12mL聚丙烯管,对其添加5μg直链化的pSaMF37,250μl PEG溶液(60%w/v聚乙二醇(PEG),10mM Tris6.5,10mM CaCl)接着进行轻柔地混合,并在37℃温育30分钟。将每个转化物用9mL的STC缓冲液稀释,接着将三个不同的3mL等分试样铺板于COVE平板上。然后将每个平板在34℃温育7-10日。将二十个SaMF37转化体转移至单个COVE平板,并在34℃温育5日。通过将孢子收集于0.1%TWEEN80来制备孢子储液。储藏培养物,即,制备每个的甘油储液(800μl孢子储液,200μl0.1%TWEEN80)并冻结于-80℃。
实施例3:在摇瓶培养中产生苹果酸
将来自如上所述的转化体和作为对照的米曲霉NRRL3488的孢子铺板于单个COVE平板,并允许其在34℃进行5至7日的孢子形成。在0.1%TWEEN80中收集孢子,并使用血细胞计数器进行计数。在含有100ml的种子培养基B的250ml烧瓶中制备种子培养物,并用总共2x108个孢子接种。将种子培养物在30℃以200rpm振荡生长大约17个小时。在含有50ml的酸产生培养基C和3ml的17小时种子培养物的250ml不带挡板的烧瓶中制备酸产生培养物。将培养物在30℃以200rpm振荡温育2-10日。
实施例4:摇瓶培养物的苹果酸的HPLC定量
对于实施例3的摇瓶培养物的苹果酸的定量通过使用1200Series Binary LCSystem和1200Series Diode Array Detector(DAD)(Agilent Technologies,SantaClara,CA USA)的反向高压液相层析(RP-HPLC)进行。使用Aqua5μC18205x4.6mm ID柱和AQ C184x3.0mm安全保护柱(Security Guard Cartridge)(Phenomenex,Inc.,Torrance,CA,USA)进行反向分离。HPLC运行缓冲液由10%甲醇(HPLC级)和90%磷酸(盐)缓冲液(145mM pH1.5)组成。
移出全培养样品,并将其在HPLC运行缓冲液中以1:20稀释。将大约270μL的每个样品在HPLC分析之前通过0.45微米苯乙烯96孔过滤板(Millipore)进行过滤。
使用10μl的注入体积以0.7ml/分钟(等度的)流速以20℃的柱温度和14分钟的运行时间进行RP-HPLC。检测设定为210nm,4nm带宽,参照为360nm,40nm带宽。空白时间(void time)确定为3.8分钟。通过进行浓度范围为49.2至3.93mM的系列稀释的苹果酸标样的重复注入,对于苹果酸确定了反相方法的定量能力。对于重复注入的相对标准偏差(RSD)为≤5%。苹果酸显示R2≥0.9999。
上述18个测试的转化体的大约一半在3日的振荡摇瓶生长之后与作为对照的米曲霉NRRL3488的苹果酸产生相比显示苹果酸效价(titer)的增加。六个转化体相对于米曲霉NRRL3488显示至少40%的增加。
实施例5:转化的米曲霉菌株的发酵
将上述米曲霉转化体和米曲霉NRRL3488对照在32℃在PDA平板上生长大约7日。将5-6ml体积的含有0.1%TWEEN80的灭菌的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)添加至每个平板,并通过用接种环刮擦使孢子悬浮。通过移液将每个悬液转移至50ml锥形管。对于每个管,将25ml的灭菌的磷酸钠缓冲液添加至含有75ml的种子培养基的500ml不带挡板的烧瓶,然后对其用2ml的孢子悬液接种。种子培养基组成为:40g葡萄糖,4.0g(NH4)2SO4,0.75g KH2PO4,0.75g K2HPO4,0.1g MgSO4·7H2O,0.1g CaCl2·2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。然后将烧瓶在32℃和180rpm温育约24小时。合并种子烧瓶以供应每罐所需的144ml接种物。
通过导入米曲霉转化体或米曲霉NRRL3488的合并的种子烧瓶的144ml(8%)的种子培养液来分别接种含有1.8升的培养基的三升发酵罐。培养基组成为:120g葡萄糖,90g CaCO3,6g Bacto蛋白胨,0.150g KH2PO4,0.150g K2HPO4,0.10g MgSO4·7H2O,0.10g CaCl2-2H2O,0.005g FeSO4·7H2O,0.005g NaCl,和去离子水加至1升。
将发酵罐平衡于32±0.1℃并以500rpm搅拌。输入气流维持在1v/v/m。未使用酸或碱添加以供pH控制。
每日取出样品,并就苹果酸产生进行分析。发酵在7日之后完成。
实施例6:发酵的苹果酸的HPLC定量
对于实施例5的发酵的苹果酸的定量如实施例4中所述进行。对于上述转化体说明了在发酵过程中苹果酸效价相对于米曲霉NRRL3488的苹果酸产生的相对改变。
可进一步通过下述编号段落描述本发明:
[1]一种产生C4二羧酸的方法,其包括:
(a)培养宿主细胞,所述宿主细胞包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,其中所述转运蛋白选自:
(i)C4二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(ii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列;
(iii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(iv)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;和
(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;和
(b)回收所述C4二羧酸。
[2]段[1]的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
[3]段[1]或[2]的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,低-中等严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3,或它们的全长互补链的成熟多肽编码序列。
[4]段[1]-[3]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
[5]段[1]-[4]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含如下或由如下组成:SEQ ID NO:2。
[6]段[1]-[4]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含如下或由如下组成:SEQ ID NO:2的成熟多肽。
[7]段的方法[6],其中SEQ ID NO:2的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸58至450或SEQ ID NO:2的氨基酸90至450。
[8]段[1]-[4]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:2的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。
[9]段[1]-[4]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白是变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。
[10]段[1]-[9]任一项的方法,其中所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[11]段[1]-[10]任一项的方法,其中所述宿主细胞进一步包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
[12]段[11]的方法,其中所述编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[13]段[1]-[12]任一项的方法,其中所述宿主细胞进一步包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
[14]段[13]的方法,其中所述编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[15]段[1]-[14]任一项的方法,其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
[16]段[15]的方法,其中所述宿主细胞选自:枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)细胞。
[17]段[16]的方法,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
[18]段[17]的方法,其中所述曲霉属宿主细胞是米曲霉宿主细胞。
[19]段[1]-[18]任一项的方法,其中C4二羧酸的水平与不具有所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞相比当在相同条件下培养时增加至少25%,例如至少50%,至少100%,至少150%,至少200%,至少300%,或至少500%。
[20]段[1]-[19]任一项的方法,其中所述C4二羧酸选自苹果酸,琥珀酸,草酰乙酸,丙二酸,和延胡索酸。
[21]段[20]的方法,其中所述C4二羧酸是苹果酸。
[22]一种增加C4二羧酸产生的方法,其包括:
(a)将编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸转化入宿主细胞,其中所述转运蛋白选自:
(i)C4二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(ii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列;
(iii)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(iv)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;和
(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;和
(b)在培养基中培养转化的生物;和
(c)回收所述C4二羧酸。
[23]段[22]的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
[24]段[22]或[23]的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,低-中等严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
[25]段[22]-[24]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
[26]段[22]-[25]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含如下或由如下组成:SEQ ID NO:2。
[27]段[22]-[25]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含如下或由如下组成:SEQ ID NO:2的成熟多肽。
[28]段[27]的方法,其中SEQ ID NO:2的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸58至450或SEQ ID NO:2的氨基酸90至450。
[29]段[22]-[25]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ ID NO:2的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。
[30]段[22]-[25]任一项的方法,其中所述C4二羧酸转运蛋白是变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和或插入。
[31]段[22]-[30]任一项的方法,其中所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[32]段[22]-[31]任一项的方法,其中所述宿主细胞进一步包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
[33]段[32]的方法,其中所述编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[34]段[22]-[33]任一项的方法,其中所述宿主细胞进一步包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
[35]段[34]的方法,其中所述编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[36]段[22]-[35]任一项的方法,其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
[37]段[36]的方法,其中所述宿主细胞选自:枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞。
[38]段[37]的方法,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
[39]段[38]的方法,其中所述曲霉属宿主细胞是米曲霉宿主细胞。
[40]段[22]-[39]任一项的方法,其中C4二羧酸的水平与不具有所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞当在相同条件下培养时相比增加至少25%,例如至少50%,至少100%,至少150%,至少200%,至少300%,或至少500%。
[41]段[22]-[40]任一项的方法,其中所述C4二羧酸选自苹果酸,琥珀酸,草酰乙酸,丙二酸,和延胡索酸。
[42]段[41]的方法,其中所述C4二羧酸是苹果酸。
[43]一种宿主细胞,其包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,其中所述转运蛋白选自:
(a)C4二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列;
(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,或100%序列同一性;
(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和或插入;和
(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;
其中所述宿主细胞与不具有所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞当在相同条件下培养时相比分泌增加水平的C4二羧酸。
[44]段[43]的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
[45]段[43]或[44]的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在低严格条件,低-中等严格条件,中等严格条件,中等-高严格条件,高严格条件,或非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
[46]段[43]-[45]任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%,例如至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%或100%序列同一性。
[47]段[43]-[46]任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含如下或由如下组成:SEQ ID NO:2。
[48]段[43]-[46]任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含如下或由如下组成:SEQ ID NO:2的成熟多肽。
[49]段[48]的宿主细胞,其中SEQ ID NO:2的成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸58至450或SEQ ID NO:2的氨基酸90至450。
[50]段[43]-[46]任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白是SEQ IDNO:2的片段,其中所述片段具有C4二羧酸转运蛋白活性。
[51]段[43]-[46]任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白是变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和或插入。
[52]段[43]-[51]任一项的宿主细胞,其中所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[53]段[43]-[52]任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞进一步包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
[54]段[53]的宿主细胞,其中所述编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[55]段[43]-[54]任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞进一步包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
[56]段[55]的宿主细胞,其中所述编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
[57]段[43]-[56]任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
[58]段[57]的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自:枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、根霉属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞。
[59]段[58]的宿主细胞,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
[60]段[59]任一项的宿主细胞,其中所述曲霉属宿主细胞是米曲霉宿主细胞。
[61]段[43]-[60]任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞与不具有所述编码异源多核苷酸的多核苷酸的宿主细胞当在相同条件下培养时相比能够分泌至少25%,例如至少50%,至少100%,至少150%,至少200%,至少300%,或至少500%的增加水平的C4二羧酸。
[62]段[43]-[61]任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸选自苹果酸,琥珀酸,草酰乙酸,丙二酸,和延胡索酸。
[63]段[62]的宿主细胞,其中所述C4二羧酸是苹果酸。
Claims (21)
1.一种宿主细胞,其包含编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸,其中所述转运蛋白选自:
(a)C4二羧酸转运蛋白,其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80%序列同一性;
(b)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸在中等严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列;
(c)C4二羧酸转运蛋白,其由多核苷酸编码,所述多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性;
(d)C4二羧酸转运蛋白变体,其包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个或多个(例如两个、几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入;和
(e)(a),(b),(c)或(d)的C4二羧酸转运蛋白的具有C4二羧酸转运蛋白活性的片段;
其中所述宿主细胞与不具有所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸的宿主细胞当在相同条件下培养时相比分泌增加水平的C4二羧酸。
2.权利要求1的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少90%序列同一性。
3.权利要求1的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少95%序列同一性。
4.权利要求1-3任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
5.权利要求1-3任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白由多核苷酸编码,所述多核苷酸在非常高严格条件下与以下杂交:SEQ ID NO:1或SEQID NO:3,或其全长互补链的成熟多肽编码序列。
6.权利要求1-5任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQID NO:2的成熟多肽或由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成。
7.权利要求1-6任一项的宿主细胞,其中SEQ ID NO:2的成熟多肽是氨基酸58至450多肽或SEQ ID NO:2的氨基酸90至450。
8.权利要求1-5任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸转运蛋白包含SEQID NO:2或由SEQ ID NO:2组成。
9.权利要求1-8任一项的宿主细胞,其中所述编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
10.权利要求1-9任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞进一步包含编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸。
11.权利要求10的宿主细胞,其中所述编码苹果酸脱氢酶的异源第二多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
12.权利要求1-11任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞进一步包含编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸。
13.权利要求12的宿主细胞,其中所述编码丙酮酸羧化酶的异源第三多核苷酸可操作地连接于对所述多核苷酸外源的启动子。
14.权利要求1-13任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。
15.权利要求14的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自:枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)细胞。
16.权利要求15的宿主细胞,其中所述宿主细胞是曲霉属宿主细胞。
17.权利要求16的宿主细胞,其中所述曲霉属宿主细胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)宿主细胞。
18.权利要求1-17任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞与不具有所述编码所述C4二羧酸转运蛋白的多核苷酸的宿主细胞当在相同条件下培养时相比能够分泌至少25%的增加水平的C4二羧酸。
19.权利要求1-18任一项的宿主细胞,其中所述C4二羧酸是苹果酸。
20.一种产生C4二羧酸的方法,其包括:
(a)在培养基中培养权利要求1-19任一项的宿主细胞;和
(b)回收所述C4二羧酸。
20.一种增加C4二羧酸产生的方法,其包括:
(a)将编码C4二羧酸转运蛋白的异源多核苷酸转化入宿主细胞,得到权利要求1-19任一项的宿主细胞;
(b)在培养基中培养转化的宿主细胞;和
(c)回收所述C4二羧酸。
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