CN105324488A - 芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 - Google Patents
芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105324488A CN105324488A CN201480034513.2A CN201480034513A CN105324488A CN 105324488 A CN105324488 A CN 105324488A CN 201480034513 A CN201480034513 A CN 201480034513A CN 105324488 A CN105324488 A CN 105324488A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- bacillus
- host cell
- enzyme
- polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 212
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 204
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 204
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 69
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 51
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 51
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 23
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 claims description 21
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 claims description 21
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 claims description 21
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 16
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 16
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 12
- -1 xylobiase Proteins 0.000 claims description 12
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 11
- 101710164759 Extracellular serine proteinase Proteins 0.000 claims description 10
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 9
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 8
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 claims description 8
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241001328122 Bacillus clausii Species 0.000 claims description 7
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 7
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 6
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 claims description 6
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims description 6
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 claims description 6
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 6
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 6
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 claims description 6
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 6
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 claims description 6
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 6
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 6
- 241000194109 Paenibacillus lautus Species 0.000 claims description 6
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 6
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 6
- 229940005348 bacillus firmus Drugs 0.000 claims description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 5
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 4
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010031396 Catechol oxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000030523 Catechol oxidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 4
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 4
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 4
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010054377 Mannosidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001696 Mannosidases Human genes 0.000 claims description 4
- 101710177586 Neutral protease B Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 4
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 claims description 4
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 claims description 4
- 241001291204 Thermobacillus Species 0.000 claims description 4
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 4
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 4
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 claims description 4
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 claims description 4
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 4
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940072417 peroxidase Drugs 0.000 claims description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 4
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 241001186014 Tormus Species 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 149
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 230000001254 nonsecretory effect Effects 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 7
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 6
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 5
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 5
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- YBMRDBCBODYGJE-UHFFFAOYSA-N germanium dioxide Chemical compound O=[Ge]=O YBMRDBCBODYGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 3
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 3
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 3
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 3
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000222518 Agaricus Species 0.000 description 2
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 description 2
- 241000228215 Aspergillus aculeatus Species 0.000 description 2
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- 241001480052 Aspergillus japonicus Species 0.000 description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223651 Aureobasidium Species 0.000 description 2
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 2
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 description 2
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 2
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 2
- 241000123346 Chrysosporium Species 0.000 description 2
- 241000985909 Chrysosporium keratinophilum Species 0.000 description 2
- 241001674001 Chrysosporium tropicum Species 0.000 description 2
- 241000221760 Claviceps Species 0.000 description 2
- 241000228437 Cochliobolus Species 0.000 description 2
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 241000935926 Diplodia Species 0.000 description 2
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000221433 Exidia Species 0.000 description 2
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 2
- 241000567163 Fusarium cerealis Species 0.000 description 2
- 241000146406 Fusarium heterosporum Species 0.000 description 2
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 2
- 241000626621 Geobacillus Species 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223198 Humicola Species 0.000 description 2
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 2
- 241000222344 Irpex lacteus Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 241000226677 Myceliophthora Species 0.000 description 2
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241001236817 Paecilomyces <Clavicipitaceae> Species 0.000 description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 2
- 241000222393 Phanerochaete chrysosporium Species 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000222480 Schizophyllum Species 0.000 description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228341 Talaromyces Species 0.000 description 2
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 description 2
- 241001540751 Talaromyces ruber Species 0.000 description 2
- 241001313536 Thermothelomyces thermophila Species 0.000 description 2
- 241000183057 Thielavia microspora Species 0.000 description 2
- 241001149964 Tolypocladium Species 0.000 description 2
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 2
- 241000215642 Trichophaea Species 0.000 description 2
- 241000202898 Ureaplasma Species 0.000 description 2
- 241000082085 Verticillium <Phyllachorales> Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241001507667 Volvariella Species 0.000 description 2
- 241001523965 Xylaria Species 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-N isocaproic acid Chemical compound CC(C)CCC(O)=O FGKJLKRYENPLQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- 101150052264 xylA gene Proteins 0.000 description 2
- MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N (2E,4E)-2,4-hexadien-1-ol Chemical compound C\C=C\C=C\CO MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N 0.000 description 1
- NHUFMXNVSAWNTO-OJUPNBFJSA-N (3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O.OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O NHUFMXNVSAWNTO-OJUPNBFJSA-N 0.000 description 1
- RRUCHHPCCXAUEE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-n-[2-oxo-2-(2-oxoethylamino)ethyl]acetamide Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC=O RRUCHHPCCXAUEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 6-Phospho-D-gluconate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O BIRSGZKFKXLSJQ-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 108010041525 Alanine racemase Proteins 0.000 description 1
- 241000220433 Albizia Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000534414 Anotopterus nikparini Species 0.000 description 1
- 241000207208 Aquifex Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000892910 Aspergillus foetidus Species 0.000 description 1
- 101000775727 Bacillus amyloliquefaciens Alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 101000695691 Bacillus licheniformis Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 241000190146 Botryosphaeria Species 0.000 description 1
- ABIAEINXHHPIOF-UHFFFAOYSA-L C(C=CC=CC)(=O)[O-].[K+].[Cl-].[Na+] Chemical compound C(C=CC=CC)(=O)[O-].[K+].[Cl-].[Na+] ABIAEINXHHPIOF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000146399 Ceriporiopsis Species 0.000 description 1
- 241000259840 Chaetomidium Species 0.000 description 1
- 241001057137 Chaetomium fimeti Species 0.000 description 1
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 1
- 241001674013 Chrysosporium lucknowense Species 0.000 description 1
- 241001556045 Chrysosporium merdarium Species 0.000 description 1
- 241000080524 Chrysosporium queenslandicum Species 0.000 description 1
- 241000355696 Chrysosporium zonatum Species 0.000 description 1
- 241000235457 Chytridium Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241001478240 Coccus Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241001085790 Coprinopsis Species 0.000 description 1
- 241000222511 Coprinus Species 0.000 description 1
- 241001509964 Coptotermes Species 0.000 description 1
- 241001252397 Corynascus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241001362614 Crassa Species 0.000 description 1
- 241000221755 Cryphonectria Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 101100342470 Dictyostelium discoideum pkbA gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010013195 E coli gluconate permease Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 1
- 101100385973 Escherichia coli (strain K12) cycA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000145614 Fusarium bactridioides Species 0.000 description 1
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 description 1
- 241001314401 Fusarium globosum Species 0.000 description 1
- 241001112697 Fusarium reticulatum Species 0.000 description 1
- 241001014439 Fusarium sarcochroum Species 0.000 description 1
- 241000223192 Fusarium sporotrichioides Species 0.000 description 1
- 241001465753 Fusarium torulosum Species 0.000 description 1
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 101100001650 Geobacillus stearothermophilus amyM gene Proteins 0.000 description 1
- 101100080316 Geobacillus stearothermophilus nprT gene Proteins 0.000 description 1
- 241000427402 Geothermobacterium Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 241001497663 Holomastigotoides Species 0.000 description 1
- 101000882901 Homo sapiens Claudin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000223199 Humicola grisea Species 0.000 description 1
- 241000411968 Ilyobacter Species 0.000 description 1
- 241000222342 Irpex Species 0.000 description 1
- 241000006384 Jeotgalibacillus marinus Species 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 241000222435 Lentinula Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 241000183011 Melanocarpus Species 0.000 description 1
- 241001184659 Melanocarpus albomyces Species 0.000 description 1
- 241000123315 Meripilus Species 0.000 description 1
- 241000204675 Methanopyrus Species 0.000 description 1
- 101100063932 Micromonospora echinospora gacH gene Proteins 0.000 description 1
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 241000233892 Neocallimastix Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 241001072230 Oceanobacillus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000123526 Peziza Species 0.000 description 1
- 241000222385 Phanerochaete Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000235379 Piromyces Species 0.000 description 1
- 241001451060 Poitrasia Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000222640 Polyporus Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000383860 Pseudoplectania Species 0.000 description 1
- 241001497658 Pseudotrichonympha Species 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000001006 Saccharomyces cerevisiae var diastaticus Nutrition 0.000 description 1
- 244000206963 Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus Species 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241001489223 Saccharomycodes Species 0.000 description 1
- 241000223255 Scytalidium Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000264435 Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis Species 0.000 description 1
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 description 1
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 241001215623 Talaromyces cellulolyticus Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000228178 Thermoascus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241001494489 Thielavia Species 0.000 description 1
- 241000182980 Thielavia ovispora Species 0.000 description 1
- 241000183053 Thielavia subthermophila Species 0.000 description 1
- 241001495429 Thielavia terrestris Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 241000378866 Trichoderma koningii Species 0.000 description 1
- 241000223262 Trichoderma longibrachiatum Species 0.000 description 1
- 241000223261 Trichoderma viride Species 0.000 description 1
- 241000894525 Trichonympha Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 241000409279 Xerochrysium dermatitidis Species 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- 238000007233 catalytic pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 101150005799 dagA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000002003 electron diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 1
- 108010061330 glucan 1,4-alpha-maltohydrolase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150092851 gntP gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 229940049547 paraxin Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 101150091813 shfl gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 229940115922 streptococcus uberis Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003544 thiamines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 101150110790 xylB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/82—Asparaginase (3.5.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
- C12Y305/01001—Asparaginase (3.5.1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种在芽孢杆菌属宿主细胞中生产不具有分泌信号的天然非分泌多肽并且无需进行裂解步骤来回收该多肽的方法;并且涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌多肽。
Description
发明领域
本发明涉及一种在芽孢杆菌属宿主细胞中生产不具有分泌信号的天然非分泌多肽并且无需进行裂解步骤来回收该天然非分泌多肽的方法;并且涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌感兴趣多肽。
发明背景
芽孢杆菌属宿主细胞已经被表征为工业制造各种感兴趣多肽的主力,主要是因为它们主动分泌具有所谓信号肽的多肽。该信号肽是一种小多肽,典型的是约20-30个氨基酸,该小多肽在与待分泌多肽的N-末端的转录和翻译融合体中表达。它引导该融合的多肽进入适当配备的宿主细胞的分泌机构中,于是该融合的多肽裂解,这时不具有其信号肽的现已成熟的感兴趣多肽被分泌进入周围培养液中,该信号肽保留在细胞中并且被降解。
芽孢杆菌属中重组生产的感兴趣多肽的分泌能够使得不用必须进行细胞裂解步骤而直接从培养液中比较容易地回收多肽。在芽孢杆菌属中,只有肯定会从细胞输出至生长培养基中的多肽是天然具有信号肽的。
然而,细胞中大多数的多肽不是肯定会输出的,而是相反原本在细胞内、周质、膜结合的等等。生产此类天然非分泌多肽通常被认为是繁重的,因为它们需要从宿主细胞内进行回收,这些宿主细胞通常需要凌杂的细胞溶解步骤,这导致了挑战性的回收过程,或者它们需要被表达为与异源性分泌信号一起的人工融合多肽,希望这将使得来自像芽孢杆菌属的宿主细胞能主动分泌,但这不是绝对能保证成功的。因此,在本领域存在着对以经济有效的途径生产天然非分泌多肽的方法的需要。
发明概述
与我们的预期相反,当天然细胞内的或非分泌的酶在不具有信号肽的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌宿主中表达时,我们在上清液中发现了非常高水平的酶活性。这是一个非常出人意料的结果并且是一个具有经济重要性的结果,因为这证实了天然非分泌多肽可以在芽孢杆菌属中产生并且可以无需昂贵的细胞裂解步骤直接从培养液中回收。
在以下实例1中,将过表达不具有信号肽的天然非分泌天冬酰胺酶(ASP)的枯草芽孢杆菌菌株和过表达不具有信号肽的天然非分泌葡聚糖转移酶(GT)的地衣芽孢杆菌菌株或不具有信号肽的GFP变体,分别与不具有ASP/GT/GFP-变体编码基因的对照菌株进行比较。这些ASP、GT和GFP-变体编码基因在没有分泌信号的情况下进行表达,该分泌信号另外被认为是芽孢杆菌属细胞主动分泌所需要的。非常出人意料的是在芽孢杆菌属宿主的上清液中发现了高水平的酶活性。但是这是一个非常受欢迎的惊喜,我们可以在芽孢杆菌属宿主细胞中不必进行昂贵的裂解步骤,重组地生产在天然细胞内的或非分泌的没有信号肽的多肽,因为这允许更加具有成本效益的生产。
因此,在第一方面,本发明提供了在芽孢杆菌属宿主细胞中生产感兴趣多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
i)在生长培养基中,在有助于表达该多肽的条件下,培养包括一种或多种外源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴趣多肽;并且
ii)无需进行裂解步骤回收该多肽。
在第二方面,本发明涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴趣多肽。
定义
等位基因变体:术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生,并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
细胞裂解步骤:术语“细胞裂解步骤”意指一种在回收期间引入的加工步骤,以导致芽孢杆菌属细胞的裂解。实例包括向耗尽的发酵培养基添加酶,例如,溶菌酶;超声处理;均质化、冻结并研磨,和珠磨裂解。
编码序列:术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定,该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列:术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即,来自相同基因)或外源的(即,来自不同基因),或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少,控制序列包括启动子,以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的,这些控制序列可以提供有多个接头。
表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,包括但不限于,转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体:术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子,该分子包括编码一种多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的:术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括:(1)任何非天然存在的物质;(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质,包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子;(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质;或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如,宿主细胞中的重组体产量;编码该物质的基因的多个拷贝;以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短等之后处于其最终形式的多肽。本领域中已知的是,一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即,具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知,不同的宿主细胞不同地加工多肽,并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如,具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
天然非分泌多肽:术语“天然非分泌多肽”意指通过其天然的、野生型来源胞内产生(即,非分泌)的多肽。在变体的情况下,术语“天然非分泌多肽”意指通过其天然的、野生型来源胞内产生(即,非分泌)的野生型多肽(该变体衍生自该野生型多肽)。
核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单-链或双链核酸分子,其分离自天然存在的基因,或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段,或其为合成的,其包括一个或多个控制序列。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指一种配置,其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处,以使得控制序列指引编码序列的表达。
序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),赖斯(Rice)等人,2000,遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施),1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5,以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且如下计算:
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件,赖斯(Rice)等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch),1970,见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位拓展罚分0.5,和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且如下计算:
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体:术语“变体”意指具有酶活性的且相比于其亲本野生型或参照的氨基酸序列在一个或多个(例如,若干个)位置处包含改变(即取代、插入、和/或缺失)的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸;缺失意指去除占据一个位置的氨基酸;并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
成熟多肽的变体可以在一个或多个(例如,若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。引入成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目可以多达10个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质,即,不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地1-30个氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸,如氨基末端的甲硫氨酸残基;多达20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸,如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill),1979,在蛋白质(TheProteins),学术出版社,纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地,氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如,氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH,等等。
可以根据本领域中已知的程序,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells),1989,科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中,在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变,并且对所得突变体分子的酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见,希尔顿(Hilton)等人,1996,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变,如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析,从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如,德弗斯(deVos)等人,1992,科学(Science)255:306-312;史密斯(Smith)等人,1992,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904;乌乐达维尔(Wlodaver)等人,1992,欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试,随后进行相关筛选程序,如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer),1988,科学(Science)241:53-57;博维(Bowie)和萨奥尔,1989,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,洛曼(Lowman)等人,1991,生物化学(Biochemistry)30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人,1986,基因(Gene)46:145;内尔(Ner)等人,1988,DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人,1999,自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞,并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
融合多肽:感兴趣多肽可以是一种杂合多肽,其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽,其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的,并包括连接编码多肽的编码序列,这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建,其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人,1993,欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583;道森(Dawson)等人,1994,科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个裂解位点。在融合蛋白分泌之时,该位点被裂解,从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点:马丁(Martin)等人,2003,工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576;斯维特娜(Svetina)等人,2000,生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251;拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人,1997,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493;沃德(Ward)等人,1995,生物技术(Biotechnology)13:498-503;以及孔特雷拉斯(Contreras)等人,1991,生物技术9:378-381;伊顿(Eaton)等人,1986,生物化学(Biochemistry)25:505-512;柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人,1995,生物技术13:982-987;卡特(Carter)等人,1989,蛋白质:结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,andGenetics)6:240-248;以及史蒂文斯(Stevens),2003,药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。
发明的详细说明
生产方法
在第一方面,本发明涉及在芽孢杆菌属宿主细胞中生产天然非分泌的感兴趣多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
i)在生长培养基中,在有助于表达该多肽的条件下,培养包括一种或多种外源或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴趣多肽;并且
ii)无需进行细胞裂解步骤来回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如,可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下,进行摇瓶培养,或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续,分批,分批补料,或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序,在一种适合营养培养基中发生,该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。该温度典型地是在30℃-40℃的范围内,并且该pH典型地是在5-8的范围内。本发明的方法实现了感兴趣多肽的较高产量,即,至少1g/l的发酵液,优选至少10g/l并且更优选至少20g/l。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于,特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如,该多肽可以通过常规程序,包括但不限于,收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀,从该营养培养基回收。在一个方面中,回收包括该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽,这些程序包括但不限于:色谱法(例如,离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如,制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如,蛋白质纯化(ProteinPurification),詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑,VCH出版社(VCHPublishers),纽约,1989)。
在一个替代性方面中,没有回收该多肽,而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
天然非分泌多肽
一种本发明的天然非分泌的且没有信号肽的感兴趣多肽可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的,如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。
该多肽可以是细菌多肽。例如,该多肽可以是一种革兰氏阳性细菌多肽,如具有酶活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳酸杆菌属属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽;或一种革兰氏阴性细菌多肽,如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一方面,该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)多肽。
在另一个方面中,该多肽是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种多肽。
在另一个方面,该多肽是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链丝菌、或浅青紫链霉菌多肽。
在另一个方面中,该多肽衍生自嗜热细菌或低嗜热细菌(thermophilicorhypothermophilicbacterium),所述细菌来自Aeropylum、产液菌属(Aquifex)、古生球菌属(Archaeoglubus)、网团菌属、地热菌属(Geothermobacterium)、甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)、火球菌属、火叶菌属、硫化叶菌属、热袍菌属、和栖热菌属的属类。一种嗜热生物具有至少50℃的最适温度,并且可以在高达70℃-80℃的温度下存活。低嗜热生物(hypothermophilicorganism)具有至少80℃的最适温度,并且需要80℃-105℃的生长温度。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如,该多肽可以是酵母多肽,例如假丝酵母属(Candida)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽;或丝状真菌多肽,例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、某真菌属(Poitrasia)、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
在另一个方面,该多肽是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
在另一个方面,该多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢菌(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、成层梭孢壳菌(Thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、或绿色木霉(Trichodermaviride)多肽。
将理解的是,对于以上提到的物种而言,本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物,例如无性型,而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得,如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures,CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以从其他来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦检测到编码多肽的多核苷酸,就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如,萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,见上文)。
在本发明的一个优选实施例中,该感兴趣多肽是酶;优选地该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶;更优选地该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
在一个优选实施例中,该酶对抗由在发酵液中由该芽孢杆菌属宿主细胞生产的一种或多种内源蛋白酶引起的降解。对抗降解被定义为在实例1中所描述的限定的培养基中,在发酵期间随着时间在上清液中的酶的积聚。
在一个优选的实施例中,该酶是衍生自嗜热生物或低嗜热生物。来自这些生物的酶通常在高温(50℃-110℃)下更稳定,并且由于它们的受约束结构还显示出了在较低温度下的对蛋白酶的较高抗性(帕斯尔(Parcell)和萨奥尔(Sauer),1989;丹尼尔(Daniel)等人,1982帕斯尔(Pacell)和萨奥尔(Sauer),1989,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264:7590-7595;丹尼尔(Danel)等人,1982,生物化学杂志(Biochem.J.)207:641-644)。
在本发明的一个更优选的实施例中,该感兴趣多肽是酶;更优选地它是包括一种以下氨基酸序列或由其组成的葡聚糖转移酶,该氨基酸序列与SEQIDNO:1具有至少70%的一致性,优选地与SEQIDNO:1具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的一致性;来自海洋水母维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白的变体,该变体包括一种以下氨基酸序列或由其组成,该氨基酸序列与SEQIDNO:2具有至少70%的一致性,优选地与SEQIDNO:2具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的一致性;或者是包括一种以下氨基酸序列或由其组成的天冬酰胺酶,该该氨基酸序列与SEQIDNO:3具有至少70%的一致性,优选地与SEQIDNO:3具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的一致性。
多核苷酸
本发明还涉及编码在此已经描述的不具有信号肽的天然非分泌的感兴趣多肽的外源或异源多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA,或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段,实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如,伊尼斯(Innis)等人,1990,PCR:方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication),学术出版社(AcademicPress),纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似于”该多肽是指该多肽的非天然存在形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽,例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于编码多肽(该多肽包括以SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列或由其组成)的多核苷酸(例如其子序列),和/或通过引入不会产生该多肽的氨基酸序列的改变的、但对应于旨在用于产生该多肽的宿主生物的密码子用法的核苷酸取代,或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述,参见例如福德(Ford)等人,1991,蛋白表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体,这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸,在与控制序列相容的条件下,这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体,在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子,即,被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列,这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸,包括突变型、截短型及杂合型启动子,并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。优选地,本发明的一种或多种外源或异源多核苷酸中的每一个可操作地与至少一个启动子连接以使其能够表达;优选地该启动子是内源的或外源的;更优选地该启动子是串联启动子。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子:解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus),1994,分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人,1988,基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人,1978,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人,1983,美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人,1980,科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”;以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,见上文。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区,其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的:苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人,1995,细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是编码位于例如多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化裂解或自动催化裂解前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
还可能希望地是添加调节序列,这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体,这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地,该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时,该编码序列是位于该载体中,这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA程序,并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可包括任何用以保证自我复制的要素。可替代地,该载体可以是这样一种载体,该载体当被引入宿主细胞中时,被整合到基因组中并且与整合有它的一个或多个染色体一起被复制;优选地本发明的一种或多种外源多核苷酸被整合到宿主细胞的至少一个染色体位点中;优选地整合到若干位点中。一个多核苷酸或一个载体可以经染色体整合到如WO2006/042548中所示的两个或更多个拷贝中。此外,可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的可选择性标记。选择性标记是一种基因,该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因,或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中,该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地,该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性,这些整合的元件应包含足够数量的核酸,例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对,这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外,这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面,该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制,载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点,以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目,其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见,例如,萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及包括一种或多种外源或异源多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌的感兴趣多肽。本发明的多核苷酸可操作地连接至指导感兴趣多肽的产生的一个或多个控制序列。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中,这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体,如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞,包括但不限于:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现:原生质体转化(参见例如,张(Chang)和科恩(Cohen),1979,分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见,例如,杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen),1961,细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829;或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson),1971,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见,例如,茂川(Shigekawa)和道尔(Dower),1988,生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见,例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne),1987,细菌学杂志169:5271-5278)。然而,可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包括本发明的宿主细胞的一种发酵培养液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分,例如像,细胞(包括含有编码本发明的多肽的一个或多个外源或异源多核苷酸的宿主细胞,这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中,该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如,当微生物培养物生长至饱和,在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如,由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时,产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地,发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如,丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中,发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中,该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中,该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐,或前述酸中的两种或更多种的混合物;并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐,或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一个方面中,该组合物包含一种或多种有机酸,并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中,从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片,以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂,包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地,该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如,丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中,细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中,可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体,但是可以含有不溶组分,例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中,可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO90/15861或WO2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
实例
实例1:不具有信号肽的葡聚糖转移酶(GT)、绿色荧光蛋白(GFP)和天冬酰胺酶(ASP)的生产
菌株:
PP2577-1:亲本地衣芽孢杆菌Si3菌株的衍生物,其进而是地衣芽孢杆菌Ca63的天然分离物的孢子形成缺陷衍生物。地衣芽孢杆菌菌株Ca63的分类学特征如下:名称=地衣芽孢杆菌,目=芽孢杆菌科,属=芽孢杆菌属,种=地衣杆菌。(参考:伯杰氏系统细菌学手册(Bergey'sManualofSystematicBacteriology))。宿主细胞的分类是基于分类学特征,该分类学特征给出于普里斯特(Priest)和亚历山大(Alexander),1988,普通微生物学杂志(JournalofGeneralMicrobiology)134:3011-3018。该PP2577-1衍生物具有破坏性基因缺失,该破坏性基因缺失是通过双同源重组进入编码如下基因产物的基因中来获得的:Mpr(金属蛋白酶)、AprE(碱性蛋白酶)、BglC(内切-1,4-β-葡聚糖酶)、和AmyE(α-淀粉酶)(名称是指枯草芽孢杆菌中相应的同系物)。衍生自嗜热栖热菌的葡聚糖转移酶GT的生产是从在染色体上三个整合的表达盒来获得的(如在美国专利号6,255,076中所进行的)。这些表达盒被插入到amyE(α-淀粉酶)、gntP(葡萄糖酸盐透性酶)和xylA(木糖异构酶)位点中或附近(如在EP1805296中所进行的)。
PP2913-1:孢子形成缺陷地衣芽孢杆菌菌株Si3衍生物,具有破坏性基因缺失,该破坏性基因缺失是通过双同源重组进入编码如下基因产物的基因中来获得的:Mpr(金属蛋白酶)、AprE(碱性蛋白酶)、Vpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、Bpr(杆菌肽酶(bacillopeptidase)F)、Epr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、BglC(内切-1,4-β-葡聚糖酶)、和AmyE(α-淀粉酶)(名称是指枯草芽孢杆菌中相应的同系物)。绿色荧光蛋白BioST的生产是从染色体整合的在glpD(甘油-3-磷酸-脱氢酶)位点附近插入的表达盒获得的。
MOL2940:孢子形成缺陷枯草芽孢杆菌A164菌株ATCC6051a,具有破坏性基因缺失,该破坏性基因缺失是通过双同源重组进入编码如下基因产物的基因中来获得的:AmyE(α-淀粉酶)、BglC(内切-1,4-β-葡聚糖酶)、Pel(果胶酸裂解酶)、AprE(碱性蛋白酶)、NprE(胞外中性蛋白酶B)、Bpr(杆菌肽酶F)、Vpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、Mpr(金属蛋白酶)、Epr(小胞外丝氨酸蛋白酶)和WprA(分泌的质控蛋白酶)(名称是指枯草芽孢杆菌中相应的同系物)。来自强烈火球菌ATCC43587的天冬酰胺酶AsnPfu的生产,是从在染色体上三种整合的表达盒获取的。将该表达盒插入到alr(丙氨酸消旋酶)、pel(果胶酸裂解酶)、和amyE(α-淀粉酶)位点中或附近。
如下所述,用地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌进行多个分批补料发酵过程。所有培养基通过本领域中已知的方法进行灭菌。除非另外描述,使用自来水。在下面的配方中提及的成分浓度是任何接种之前的浓度。
第一接种物培养基:
LB琼脂:来自酪蛋白的10g/l的蛋白胨;5g/l酵母提取物;10g/l氯化钠;调整到pH6.8至7.2的12g/l细菌培养用琼脂。使用来自默克(Merck)的预混料。
转移缓冲液:
M-9缓冲液(使用去离子水制备):磷酸氢二钠·2H2O8.8g/l;磷酸二氢钾3g/l;氯化钠4g/l;硫酸镁·7H2O0.2g/l。
接种物摇瓶培养基(浓度是接种之前的浓度):
PRK-50:110g/l大豆粒;磷酸氢二钠·2H2O5g/l;在灭菌前用NaOH/H3PO4将pH调节至8.0。
组成培养基(浓度是接种之前的浓度):
胰蛋白胨(来自蒂福科(Difco)的酪蛋白水解物)30g/l;硫酸镁·7H2O4g/l;磷酸氢二钾7g/l;磷酸氢二钠·2H2O7g/l;硫酸二铵4g/l;柠檬酸0.78g/l;维生素(二氯化硫胺34.2mg/l;核黄素2.9mg/l;烟酸23mg/l;D-泛酸钙28.5mg/l;盐酸吡哆醛5.7mg/l;D-生物素1.1mg/l;叶酸2.9mg/l);痕量金属(MnSO4·H2O39.2mg/l;FeSO4·7H2O157mg/l;CuSO4·5H2O15.6mg/l;ZnCl215.6mg/l);消泡剂(SB2121)1.25ml/l;在灭菌之前用NaOH/H3PO4将pH调节至6.0。
补料培养基:
蔗糖708g/l
用于接种物步骤的程序:
首先,在37℃下,使菌株在LB琼脂斜面上生长1天。
然后,使用M-9缓冲液洗涤琼脂,并且在650nm处测量所得细胞悬浮液的光密度(OD)。
使用OD(650nm)xml细胞悬浮液=0.1的接种物来接种接种物摇瓶(PRK-50)。
将摇瓶在37℃下、在300rpm处孵育20小时。
通过用来自该摇瓶的生长培养物接种主发酵罐来开始主发酵罐(发酵器)中的发酵。接种体积是组成培养基的11%(对于720ml组成培养基而言,是80ml)。
发酵罐设备:
使用配备以下项的标准实验室发酵罐:温度控制系统,使用氨水和磷酸的pH控制,用于贯穿整个发酵过程测量>20%氧饱和度的溶氧电极。
发酵参数:
温度:41℃(GFP,GT);43℃(ASP)。
使用氨水和磷酸将pH保持在6.8与7.2之间
控制:6.8(氨水);7.2磷酸
通气:接种之后针对800ml起始体积为1.5升/min。
搅拌:1500rpm
补料策略:
0小时。接种之后,0.05g/min/kg初始培养液
8小时。接种之后,0.156g/min/kg初始培养液
结束:接种之后,0.156g/min/kg初始培养液
天冬酰胺酶测定:
天冬酰胺酶的活性能以ASNU测量。将一个天冬酰胺酶单位(ASNU)定义为在37℃和pH7.0下于具有9.2mg/ml天冬酰胺的0.1MMOPS缓冲液中在1分钟内产生1.0微摩尔的氨所需的酶量。
天冬酰胺酶将天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨。在一个偶联测定中确定该天冬酰胺酶活性,其中将所生产的氨与α-酮戊二酸盐和NADH反应,以形成谷氨酸和NAD+。通过过量添加的谷氨酸脱氢酶催化后一反应。所产生的一摩尔的氨将导致一摩尔NADH的消耗。在340nm下以分光光度法测量NADH的消耗。NADH在340nm下具有吸光度(摩尔消光系数6300(M*cm)-1),而NAD+在这一波长下没有明显的吸光度。因此测量颜色的下降,并且可以与天冬酰胺酶活性相互关联。
测定条件:
测定程序:
1)样品的稀释:称出约1g的样品。用包含0.1M乙酸钠和0.225g/LBrij35的缓冲液(pH5.0)在100mL容量瓶中溶解并且补足到刻度。在稀释以进一步到达约0.57ASNU/mL之前,用磁力搅拌器搅拌溶液持续15-30分钟。
2)底物试剂溶液的制备:制作在0.1MMOPS中包含66.6mML-天冬酰胺、0.66mMNADH、13.3mMα-酮戊二酸盐和67.2U/mL谷氨酸脱氢酶的溶液,pH7.0。该溶液应当避光保存,例如,通过将该含有底物试剂的烧瓶包覆在箔内。如果该初始吸光度在340nm下是高于2.3个吸光度单位,则该试剂在室温下持续约6小时是稳定的。
3)该测量是以移液230μL底物试剂溶液到UV-透明微量滴定板中开始,并且在37℃预孵育该板8分钟,在此之后添加20μL样品并且将该混合物进一步在37℃下平衡90秒。然后在340nm下读取吸光度持续120秒,例如,每18秒读取一次。
4)从吸光度对时间的点的斜率确定活性,并且该活性与标准曲线相关。
化学品:
样品制备:
1.称出约1g的样品。
2.用具有Brij的、pH5.0的0.1M乙酸盐缓冲液在100-ml的量瓶中溶解并填充至刻度。
3.以磁力搅拌器搅拌15-30分钟。
4.进一步用具有Brij的、pH5.0的0.1M乙酸钠缓冲液稀释样品至约0.57ASNU/ml。
计算是基于对NADH的摩尔延伸以及以下事实:相比于所转化的天冬氨酸的量产生了等摩尔量的NAD+。
那么在此情况下,该酶活性是相对于最终样品相关的。
当测量样品中的总酶活性时,在稀释和酶法分析之前不进行样品的分离。在测量上清液中酶活性的情况下,在8500g下离心10ml的培养液样品30分钟,将上清液从沉淀物中轻轻倒出,并且通过0.22或0.45μm的滤器进行无菌过滤以确保它不包含任何细胞,之后进行稀释并确定酶活性。如果该酶大部分存在于上清液中,那么相比于总样品,在这一部分中将会测定出较高的活性,因为在那种情况下,生物质将稀释该酶活性。
葡聚糖转移酶测定
一个GTNU(葡聚糖转移酶单位)是在上述条件下(但是在60℃下)每分钟产生1μmol葡萄糖的酶的量。这对应于乘以因子约7.7的在37℃下每分钟产生1μmol葡萄糖的酶的量。
葡聚糖转移酶(EC2.4.1.25)是将1,4-α-D-葡聚糖转移至新的4位的酶,该位置一定是葡萄糖或另一个1,4-α-D-葡聚糖。麦芽三糖被用作测定中的底物,并且葡聚糖转移酶的活性被测量为在以下反应中葡萄糖的生产:
G-G-G+G-G-G->G-G-G-G-G+G
停止葡聚糖转移酶反应,并且通过添加氢氧化钠来灭活该酶。
使用来自热电公司(ThermoElectronCorporation)的商业试剂盒测量葡萄糖的形成。将葡萄糖通过己糖激酶磷酸化成葡萄糖-6-磷酸,并且进一步通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸,从而将NAD+还原成NADH。在340nm下测量NADH的形成。还可以使用测量所生成的葡萄糖的替代方式。
测定条件:
测定程序:
1)样品的稀释:称出约1g的样品。用包含50mM磷酸盐缓冲液和0.1%W/VTritonX-100,pH6.0的缓冲液在100mL容量瓶中溶解并且补足到刻度。以磁力搅拌器搅拌该溶液15-30分钟。
2)在62℃+/-2℃下孵育已稀释的样品15分钟,以便使任何α-葡糖苷酶失活。
3)进一步将该样品稀释至约1.1GTNU/mL的酶活性。
4)底物试剂溶液的制备:制作在缓冲液中包含1%W/V麦芽糖糊精和0.06%W/V糊精的溶液,该缓冲液包含50mM磷酸盐缓冲液和0.1%W/VTritonX-100,pH6.0。
5)该测量是以移液77μL底物试剂溶液到UV-透明微量滴定板中开始,并且在37℃预孵育该板8分钟,在此之后添加13μL样品并且将该混合物在37℃下孵育5分钟。通过添加13μL0.5MNaOH停止反应。所产生的葡萄糖的量例如是通过添加来自热电公司(ThermoElectronCorporation)的商业试剂盒的147μL反应混合物来进行测量。允许该反应进行280秒,并且然后在340nm下读取吸光度。
6)从相对于标准曲线的所测量的吸光度来确定活性。
化学品:
样品制备:
1.称出约1g的样品。
2.用包含50mM磷酸盐缓冲液和0.1%W/VTritonX-100,pH6.0的缓冲液在100-ml容量瓶中溶解并且填充到达刻度。
3.以磁力搅拌器搅拌15-30分钟。
4.在62℃+/-2℃下孵育已稀释的样品15分钟,以便使任何α-葡糖苷酶失活。
5.将这些样品进一步用包含50mM磷酸盐缓冲液和0.1%W/VTritonX-100,pH6.0的缓冲液进行稀释。
首先,将该样品用麦芽三糖孵育300秒,然后通过添加NaOH停止该反应,并且然后由来自热电公司(ThermoElectronCorporation)的商业试剂盒检测葡萄糖的量。第二反应的反应时间为280秒,并且然后在340nm下测量吸光度。那么在此情况下,该酶活性是相对于最终样品相关的。
当测量样品中的总酶活性时,在稀释和酶法分析之前不进行样品的分离。在测量上清液中的酶活性的情况下,在8500g下离心样品30分钟,将该上清液从沉淀物中轻轻倒出,并且通过0.22μm的滤器进行无菌过滤,之后进行稀释和确定酶活性。如果该酶大部分存在于上清液中,那么相比于总样品,在这一部分中将会测定出较高的活性,因为在那种情况下,细胞将稀释该酶活性。
结果:
该发酵进行了三至五天,并且结果示于表1-3中。
表1:葡聚糖转移酶2*)
*):如本文中其他处所显示的确定活性量(GTNU),并且将在第5天培养液中的总活性归一化到100%。
表2:GFP*)
*):针对GFP的确定,使用荧光光谱测量法确定蛋白的量。GFP对许多致力于研究蛋白质表达的人员来说是熟知的,并且已知的是甚至当它存在于细胞中时,可以直接被测量。因此,通过总培养液的荧光光谱所确定的量对应于细胞和上清液两者的蛋白含量。将针对在第3天培养液中的总活性的量归一化至100%。
表3:天冬酰胺酶*)
*)如本文中其他处所显示的确定活性量(ASNU),并且将在第5天培养液中的总活性归一化到100%。
与我们的预期相反,当天然细胞内的或非分泌的酶在地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中表达时,我们在上清液中发现了非常高水平的酶活性。这是一个非常出人意料的结果并且是一个具有经济重要性的结果,因为这意味着天然非分泌多肽现在可以在芽孢杆菌属中产生并且可以无需另外需要的且昂贵的细胞裂解步骤直接从培养液中回收。
本发明在下面各段中进行了进一步的定义:
1.一种在芽孢杆菌属宿主细胞中生产天然非分泌多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在生长培养基中,在有助于表达该天然非分泌多肽的条件下,培养包括一种或多种外源或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的该天然非分泌多肽;并且
(b)无需进行细胞裂解步骤来回收该天然非分泌多肽。
2.一种生产多肽的方法,该方法包括以下步骤:
(a)在有助于生产该多肽的条件下,培养包括一种或多种编码该多肽的多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,其中该多肽是由其天然的、野生型来源胞内产生的,并且其中该一种或多种多核苷酸并非可操作地连接至信号肽编码序列;并且
(b)无需进行细胞裂解步骤来回收该多肽。
3.如段落1或2所述的方法,其中该芽孢杆菌属宿主细胞是选自下组,该组由以下各项组成:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
4.如段落1-3中任一项所述的方法,其中该多肽对于该芽孢杆菌属宿主细胞为原生的。
5.如段落1-3中任一项所述的方法,其中该多肽对于该芽孢杆菌属宿主细胞为异源的。
6.如段落1-3和5中任一项所述的方法,其中该多肽衍生自嗜热生物。
7.如段落1-3和5中任一项所述的方法,其中该多肽衍生自低嗜热生物。
8.如段落6或7所述的方法,其中该嗜热生物或低嗜热生物是选自下组,该组由以下各项组成:Aeropylum、产液菌属、古生球菌属、网团菌属、地热菌属、甲烷嗜热菌属、火球菌属、火叶菌属、硫化叶菌属、热袍菌属、和栖热菌属。
9.如段落1-8中任一项所述的方法,其中该多肽对抗由在发酵液中由该芽孢杆菌属宿主细胞生产的一种或多种内源蛋白酶引起的降解。
10.如段落1-9中任一项所述的方法,其中该感兴趣多肽是酶;优选地该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶;更优选地该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
11.如段落10所述的方法,其中该酶是包括与SEQIDNO:1具有至少70%一致性的氨基酸序列的葡聚糖转移酶,或者是来自海洋水母维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白的变体,该变体包括与SEQIDNO:2具有至少70%一致性的氨基酸序列,或者是包括与SEQIDNO:3具有至少70%一致性的氨基酸序列的天冬酰胺酶。
12.如段落1-11中任一项所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的每一个可操作地与至少一个启动子连接以使其能够表达;优选地该启动子是内源的或外源的;更优选地该启动子是串联启动子。
13.如段落1-12中任一项所述的方法,其中将该一种或多种多核苷酸整合到该芽孢杆菌属宿主细胞的至少一个染色体位点中;优选地整合到若干位点中。
14.如段落1-13中任一项所述的方法,其中通过收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀回收该多肽。
15.如段落1-13中任一项所述的方法,其中在该发酵液中回收该多肽。
16.如段落1-15中任一项所述的方法,其中该芽孢杆菌属宿主细胞包括编码一种或多种蛋白酶例如四种、五种或六种蛋白酶的一种或多种核酸序列的破坏,例如缺失,这导致了较少的蛋白酶的产生。
17.如段落16所述的方法,其中该一种或多种蛋白酶是选自下组,该组由以下各项组成:AprE(碱性蛋白酶)、Bpr(杆菌肽酶F)、Epr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、Mpr(金属蛋白酶)、NprE(胞外中性蛋白酶B)、Vpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、和WprA(分泌的质控蛋白酶)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所产生的多肽的量是至少1g/l的发酵液,优选至少10g/l并且更优选至少20g/l。
19.一种包括一种或多种外源或异源多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的感兴趣的天然非分泌多肽。
20.一种包括一种或多种编码多肽的多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞,其中该多肽是通过其天然的、野生型来源胞内产生的,并且其中该一种或多种多核苷酸并非可操作地连接至信号肽编码序列。
21.如段落19或20所述的宿主细胞,其中该芽孢杆菌属宿主细胞是选自下组,该组由以下各项组成:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
22.如段落19-21中任一项所述的宿主细胞,其中该多肽对于该芽孢杆菌属宿主细胞为原生的。
23.如段落19-21中任一项所述的宿主细胞,其中该多肽对于该芽孢杆菌属宿主细胞为异源的。
24.如段落19-21和23中任一项所述的宿主细胞,其中该多肽衍生自嗜热生物。
25.如段落19-21和23中任一项所述的宿主细胞,其中该多肽衍生自低嗜热生物。
26.如段落24或25所述的宿主,其中该嗜热生物或低嗜热生物是选自下组,该组由以下各项组成:Aeropylum、产液菌属、古生球菌属、网团菌属、地热菌属、甲烷嗜热菌属、火球菌属、火叶菌属、硫化叶菌属、热袍菌属、和栖热菌属。
27.如段落19-26中任一项所述的宿主细胞,其中该多肽对抗由在发酵液中由该芽孢杆菌属宿主细胞生产的一种或多种内源蛋白酶引起的降解。
28.如段落19-27中任一项所述的宿主细胞,其中该感兴趣多肽是酶;优选地该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶;更优选地该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
29.如段落28所述的宿主细胞,其中该酶是包括与SEQIDNO:1具有至少70%一致性的氨基酸序列的葡聚糖转移酶,或者是来自海洋水母维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白的变体,该变体包括与SEQIDNO:2具有至少70%一致性的氨基酸序列,或者是包括与SEQIDNO:3具有至少70%一致性的氨基酸序列的天冬酰胺酶。
30.如段落19-29中任一项所述的宿主细胞,其中该一种或多种多核苷酸中的每一个可操作地与至少一个启动子连接以使其能够表达;优选地该启动子是内源的或外源的;更优选地该启动子是串联启动子。
31.如段落19-30中任一项所述的宿主细胞,其中将该一种或多种多核苷酸整合到该芽孢杆菌属宿主细胞的至少一个染色体位点中;优选地整合到若干位点中。
32.如段落19-31中任一项所述的宿主细胞,该宿主细胞进一步包括编码一种或多种蛋白酶例如四种、五种或六种蛋白酶的一种或多种核酸序列的破坏,例如缺失,这导致了较少的蛋白酶的产生。
33.如段落32所述的宿主细胞,其中该一种或多种蛋白酶是选自下组,该组由以下各项组成:AprE(碱性蛋白酶)、Bpr(杆菌肽酶F)、Epr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、Mpr(金属蛋白酶)、NprE(胞外中性蛋白酶B)、Vpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、和WprA(分泌的质控蛋白酶)。
Claims (20)
1.一种在芽孢杆菌属宿主细胞中生产天然非分泌多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)在生长培养基中,在有助于表达该天然非分泌多肽的条件下,培养包括一种或多种外源或异源多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的该天然非分泌多肽;并且
(b)无需进行细胞裂解步骤来回收该天然非分泌多肽。
2.一种生产多肽的方法,该方法包括以下步骤:
(a)在有助于生产该多肽的条件下,培养包括一种或多种编码该多肽的多核苷酸的芽孢杆菌属宿主细胞,其中该多肽是由其天然的、野生型来源胞内产生的,并且其中该一种或多种多核苷酸并非可操作地连接至信号肽编码序列;并且
(b)无需进行细胞裂解步骤来回收该多肽。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中该芽孢杆菌属宿主细胞是选自下组,该组由以下各项组成:嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌,优选是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中该多肽对于该芽孢杆菌属宿主细胞为原生的。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中该多肽对于该芽孢杆菌属宿主细胞为异源的。
6.如权利要求1-3和5中任一项所述的方法,其中该多肽衍生自嗜热生物。
7.如权利要求1-3和5中任一项所述的方法,其中该多肽衍生自低嗜热生物。
8.如权利要求6或7所述的方法,其中该嗜热生物或低嗜热生物是选自下组,该组由以下各项组成:Aeropylum、产液菌属、古生球菌属、网团菌属、地热菌属、甲烷嗜热菌属、火球菌属、火叶菌属、硫化叶菌属、热袍菌属、和栖热菌属。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其中该多肽对抗由在发酵液中由该芽孢杆菌属宿主细胞生产的一种或多种内源蛋白酶引起的降解。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其中该多肽是酶;优选地该酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶;更优选地该酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
11.如权利要求10所述的方法,其中该酶是包括与SEQIDNO:1具有至少70%一致性的氨基酸序列的葡聚糖转移酶,或者是来自海洋水母维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白的变体,该变体包括与SEQIDNO:2具有至少70%一致性的氨基酸序列,或者是包括与SEQIDNO:3具有至少70%一致性的氨基酸序列的天冬酰胺酶。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述一种或多种多核苷酸中的每一个可操作地与至少一个启动子连接以使其能够表达;优选地该启动子是内源的或外源的;更优选地该启动子是串联启动子。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法,其中将该一种或多种多核苷酸整合到该芽孢杆菌属宿主细胞的至少一个染色体位点中;优选地整合到若干位点中。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中通过收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀回收该多肽。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中在该发酵液中回收该多肽。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中该芽孢杆菌属宿主细胞包括编码一种或多种蛋白酶例如四种、五种或六种蛋白酶的一种或多种核酸序列的破坏,例如缺失,这导致了较少的蛋白酶的产生。
17.如权利要求16所述的方法,其中该一种或多种蛋白酶是选自下组,该组由以下各项组成:AprE(碱性蛋白酶)、Bpr(杆菌肽酶F)、Epr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、Mpr(金属蛋白酶)、NprE(胞外中性蛋白酶B)、Vpr(小胞外丝氨酸蛋白酶)、和WprA(分泌的质控蛋白酶)。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所产生的多肽的量是至少1g/l的发酵液,优选至少10g/l并且更优选至少20g/l。
19.一种包括一种或多种外源或异源多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞,该一种或多种外源或异源多核苷酸编码不具有分泌信号的天然非分泌多肽。
20.一种包括一种或多种编码多肽的多核苷酸的重组体芽孢杆菌属宿主细胞,其中该多肽是通过其天然的、野生型来源胞内产生的,并且其中该一种或多种多核苷酸并非可操作地连接至信号肽编码序列。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361837995P | 2013-06-21 | 2013-06-21 | |
US61/837,995 | 2013-06-21 | ||
PCT/EP2014/063184 WO2014202793A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-06-23 | Production of polypeptides without secretion signal in bacillus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105324488A true CN105324488A (zh) | 2016-02-10 |
Family
ID=51022850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480034513.2A Pending CN105324488A (zh) | 2013-06-21 | 2014-06-23 | 芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160122772A1 (zh) |
EP (1) | EP3011044A1 (zh) |
JP (1) | JP2016521579A (zh) |
CN (1) | CN105324488A (zh) |
WO (1) | WO2014202793A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110938555A (zh) * | 2019-06-14 | 2020-03-31 | 南京农业大学 | 一种地衣芽孢杆菌z-1及其l-天冬酰胺酶基因与应用 |
CN114958701A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 江南大学 | 一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104611284A (zh) * | 2015-02-03 | 2015-05-13 | 江南大学 | 一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用 |
CN107624134A (zh) | 2015-05-12 | 2018-01-23 | 诺维信公司 | 缺失羊毛硫抗生素基因的地衣芽孢杆菌宿主细胞 |
BR112017024855A2 (pt) * | 2015-05-22 | 2018-08-07 | Dupont Nutrition Biosci Aps | métodos de produção de aldc |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
NZ234059A (en) | 1989-06-13 | 1992-05-26 | Genencor Int | Method of killing cells by acid treatment; composition therefor |
IL99552A0 (en) | 1990-09-28 | 1992-08-18 | Ixsys Inc | Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof |
FR2704860B1 (fr) | 1993-05-05 | 1995-07-13 | Pasteur Institut | Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire. |
DE4343591A1 (de) | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
ATE206460T1 (de) | 1994-06-03 | 2001-10-15 | Novo Nordisk Biotech Inc | Gereinigte myceliophthora laccasen und nukleinsäuren dafür kodierend |
US5955310A (en) | 1998-02-26 | 1999-09-21 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell |
DE602005016707D1 (de) | 2004-10-22 | 2009-10-29 | Novozymes As | Stabile genomische integration mehrerer polynukleotidkopien |
WO2010096673A1 (en) | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Danisco Us Inc. | Fermentation broth formulations |
-
2014
- 2014-06-23 WO PCT/EP2014/063184 patent/WO2014202793A1/en active Application Filing
- 2014-06-23 US US14/896,423 patent/US20160122772A1/en not_active Abandoned
- 2014-06-23 JP JP2016520532A patent/JP2016521579A/ja active Pending
- 2014-06-23 CN CN201480034513.2A patent/CN105324488A/zh active Pending
- 2014-06-23 EP EP14733598.8A patent/EP3011044A1/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CHUN-KAI YANG等: "Nonclassical Protein Secretion by Bacillus subtilis in the Stationary Phase Is Not Due to Cell Lysis", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
RITVALEENA PUOHINIEMI等: "Secretion of the Escherichia coli outer membraneproteins OmpA and OmpF in Bacillus subtilis is blocked at an early intracellular step", 《MOLECULAR MICROBIOLOGY》 * |
YASUSHI INOUE等: "Cloning of the Maltose Phosphorylase Gene from Bacillus sp. Strain RK-1 and E‹cient Production of the Cloned Gene and the Trehalose Phosphorylase Gene from Bacillus stearothermophilus SK-1 in Bacillus subtilis", 《BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110938555A (zh) * | 2019-06-14 | 2020-03-31 | 南京农业大学 | 一种地衣芽孢杆菌z-1及其l-天冬酰胺酶基因与应用 |
CN114958701A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-08-30 | 江南大学 | 一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20160122772A1 (en) | 2016-05-05 |
EP3011044A1 (en) | 2016-04-27 |
WO2014202793A1 (en) | 2014-12-24 |
JP2016521579A (ja) | 2016-07-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109385415B (zh) | 天冬氨酸酶变体及其制备方法与应用 | |
CN103443278B (zh) | 生产分泌型多肽的方法 | |
CN105339499A (zh) | 不具有信号肽的天然分泌多肽的表达 | |
CN105324488A (zh) | 芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 | |
US20200181595A1 (en) | Bacillus Licheniformis Host Cell | |
CN105899660A (zh) | 通过酶的ph-稳定化来提高产率 | |
CN105492604A (zh) | 受调节的pepc表达 | |
CN101918551B (zh) | 草酸脱羧酶的生产中利用的重组表达质粒载体及重组菌、以及重组草酸脱羧酶的生产方法 | |
CN108884478A (zh) | 在ssf方法中组合使用至少一种内切蛋白酶和至少一种外切蛋白酶以改善乙醇产量 | |
CN105378079A (zh) | 在基因组之间多核苷酸的直接转移 | |
WO2012127002A1 (en) | Sweet-tasting polypeptide from gram-positive bacteria | |
CN109022396A (zh) | 一种酶活提高的α-淀粉酶突变体及其应用 | |
CN105339493A (zh) | 来自秋叶氏芽孢杆菌的密码子改性淀粉酶 | |
US20150307871A1 (en) | Method for generating site-specific mutations in filamentous fungi | |
CN110072997A (zh) | 具有蛋白酶活性的多肽和编码其的多核苷酸 | |
WO2020002575A1 (en) | Polypeptides having pectin lyase activity and polynucleotides encoding same | |
US11268081B2 (en) | Improving expression of a protease by co-expression with propeptide | |
US20110306139A1 (en) | Mutant Cells Suitable For Recombinant Polypeptide Production | |
WO2023104846A1 (en) | Improved protein production in recombinant bacteria | |
WO2013068309A1 (en) | Methods for production of archeae protease in yeast | |
US20140315274A1 (en) | Methods For Production of Archeae Protease in Yeast | |
CN101278044A (zh) | 适用于制备重组多肽的突变体细胞 | |
WO2017211803A1 (en) | Co-expression of heterologous polypeptides to increase yield |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160210 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |