CN101278044A

CN101278044A - 适用于制备重组多肽的突变体细胞

Info

Publication number: CN101278044A
Application number: CNA2006800226073A
Authority: CN
Inventors: 乔恩·M·珀森; 艾伦·K·尼尔森; 尼尔斯·班克
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2005-06-24
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2008-10-01
Also published as: WO2006136164A1; EP1896573A1; US20100173286A1

Abstract

本发明涉及产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，其中所述细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，降低了YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平；产生所述细胞的方法，以及使用所述细胞产生目的多肽的方法。

Description

适用于制备重组多肽的突变体细胞

序列表

本发明包含序列表。

发明领域

本发明涉及：产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，其中所述细胞与其它的等基因(isogenic)但未突变的细胞相比，具有降低的YugJ(SEQ IDNO：2)或其同源物的表达水平；产生所述细胞的方法，以及使用所述细胞产生目的多肽的方法。

发明背景

目前经常可见在发酵期间多肽结晶/非结晶的形成，因为发酵产量由于发酵配方(fermentation recipe)的优化和/或由于更有效的产生生物的鉴定/开发或构建而变得越来越高。

在此情况下，以高于其溶解度极限的产量发酵多肽，意味着其可能以部分沉淀的形式存在于培养液中。该沉淀物可能是以结晶的形式或作为非结晶沉淀。

这导致回收中的问题，其中在从培养液中除去细胞及其它固体以前必须采用专门的方法溶解结晶/非结晶沉淀物。这些方法常常导致产量损失。

WO 2004/003187公开了一种发酵微生物来产生目的多肽的方法，其中在发酵期间存在少量(例如：5％w/w)的一种或多种选自由以下物质所组成的组的化合物：1，2-丙二醇(单丙二醇；MPG)、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇(dulcitol)、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚，由此可以避免、显著延迟或显著减少目的多肽的结晶或非结晶沉淀的形成。通过在发酵期间避免形成多肽结晶/非结晶沉淀，可使用更加简单的回收方法来获得较高的产量。

MPG对于大多数微生物而言仅仅是非常不良的碳源，或者被大多数微生物非常不良地代谢，或根本不代谢，所以可将其在开始发酵以前和/或在发酵期间加入而不明显影响细胞生长和目的肽的生产力。

但是，一些微生物在一定程度上降解这些加入的化合物，例如MPG，并且需要向这些微生物供给大量的该化合物来实现最佳效果。因为这些化合物有些昂贵，所以感兴趣的是将达到预期效果所需要的量最小化。

发明概述

在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)酶产生菌株中推定的yugJ开放阅读框的失活令人惊讶地导致发酵过程中单丙二醇(MPG)降解的降低。将MPG加入生长培养基来避免或显著减少酶结晶的形成。因此，需要将更少的MPG加入yugJ突变体菌株的发酵培养基中来达到预期效果，从而降低生产成本。

根据序列同源性，预测推定的yugJ开放阅读框编码醇脱氢酶，很可能编码丁醇脱氢酶。已发现文献中的很多微生物包含编码醇或丁醇脱氢酶的yugJ同源物，其具有与本发明预测的YugJ非常相似的氨基酸序列，所述微生物包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、Geobacillus kaustophilus、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、Oceanobacillus iheyensis、Bacillus halodurans等。

因此，在第一个方面中，本发明涉及产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，其中所述细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，具有降低的YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平。

本发明的另一个方面涉及产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，其中所述细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，具有降低的醇脱氢酶的表达水平，所述醇脱氢酶包含具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQID NO：2具有至少60％的同一性，或优选与SEQ ID NO：2具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％的同一性。

本发明的又一个方面涉及构建突变的细菌细胞的方法，所述方法包含如下步骤：

a)将细菌细胞突变；和

b)选择突变细胞，所述突变细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，具有降低的YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平。

本发明的又一个方面涉及产生目的多肽的方法，所述方法包含如下步骤：

a)在至少50升的培养基中培养产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，所述培养基包含一种或多种选自由以下物质所组成的组的化合物：1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚，其在发酵之前和/或在发酵期间加入培养基中，其中所述突变细胞具有降低的YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平，和

b)分离目的多肽。

本发明的优选实施方案涉及任何上述方面的突变体细胞，其中突变体细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，显示降低的降解一种或多种多元醇的能力，所述多元醇优选自由以下物质所组成的组：1，2-丙二醇(单丙二醇；MPG)、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚。

附图简述

图1显示质粒pAN212b的示意图，所述质粒pAN212b是质粒pSJ2739(在WO 99/41358中所述)的衍生物，而其又衍生自质粒pE194，即一种用于复制的天然温度敏感型质粒。质粒pAN212b包含pE194复制子，以及来源于质粒pUB 110的片段。

图2显示质粒pAN212b-yugJ的示意图，所述质粒pAN212b-yugJ由yugJSOEpcr片段组成，该片段克隆在如图1所示的温度敏感型质粒pAN212b的SacII-BsaHI位点，构建过程如以下实施例所述。

发明详述

微生物

根据本发明的微生物(微生物菌株或细胞)可从例如下列的那些细菌来源的任何属的微生物中获得。在优选实施方案中，本发明的第一个方面的细胞是原核细胞，优选革兰氏阳性细胞，更优选为芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，并且最优选嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。

突变细胞

在本发明的优选实施方案中，YugJ同源物包含与SEQ ID NO：2所示序列具有至少60％的同一性，优选与SEQ ID NO：2具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的突变细胞在yugJ(SEQ ID NO：1)或其同源物中突变；优选yugJ和/或yugJ同源物编码包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示序列具有至少60％的同一性，优选与SEQID NO：2具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％的同一性；更优选yugJ同源物包含具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示序列具有至少60％的同一性，优选与SEQID NO：1具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％的同一性。

优选地，本发明的细胞在至少一个多核苷酸中突变，其中具有至少100bp大小的所述至少一个多核苷酸的亚序列与具有SEQ ID NO：1所示序列或相应互补序列的多核苷酸在中等严紧杂交条件下杂交。

在本发明细胞的优选实施方案中，将yugJ或其同源物部分或全部从染色体中缺失；或者yugJ或其同源物包含至少一个移码突变或无义突变。

这些突变的优选结果是：与其它的等基因但未突变的细胞相比，本发明的细胞具有降低至少两倍的(two-fold reduced)YugJ或其同源物的表达水平；或者与其它的等基因但未突变的细胞相比，本发明的细胞检测不到(has nomeasureable)YugJ或其同源物的表达。

目的多肽

在优选实施方案中，目的多肽可获得自细菌或真菌来源。

例如，目的多肽可获得自革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌属菌株，如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；或链霉菌属(Streptomyces)菌株，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；或来自革兰氏阴性细菌，例如：大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp)。

目的多肽可获得自真菌来源，例如来自酵母菌株如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)菌株如卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)菌株。

目的多肽可获得自丝状真菌菌株，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)菌株，特别地，目的多肽可获得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够轻易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammiung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，应指目的多肽由该来源或由其中已插入来自该来源的基因的细胞产生。

目的多肽可为肽或蛋白。根据本发明的优选的肽包含2至100个氨基酸；优选10至80个氨基酸；更优选15至60个氨基酸；甚至更优选15至40个氨基酸。

在优选的实施方案中，该蛋白是酶，尤其是水解酶(根据酶命名法(EnzymeNomenclature)；国际生物化学联合会术语委员会的建议(NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry)为EC3类)。在具体的优选实施方案中，优选下列水解酶：

蛋白酶

合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。其中包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。所述蛋白酶可为酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶，在WO 89/06270和WO 94/25583中描述。

有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。

优选的商业上能够获得的蛋白酶包括ALCALASE^TM、SAVINASE^TM、PRIMASE^TM、DURALASE^TM、ESPERASE^TM、RELASE^TM和KANNASE^TM(Novozymes A/S)、MAXATASE^TM、MAXACAL^TM、MAXAPEM^TM、PROPERASE^TM、PURAFECT^TM、PURAFECT OXP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶

合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自如下的脂肪酶：腐质霉属(同物异名嗜热霉属(Thermomyces))，例如，来自疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))如EP 258 068和EP 305 216中所述，或来自特异腐质霉如WO96/13580中所述，假单胞菌属脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)菌株SD 705(WO95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois et al.，1993，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它实例是脂肪酶变体，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中描述的那些脂肪酶变体。

优选的商业上能够获得的脂肪酶包括LIPOLASE^TM、LIPOLASEULTRA^TM和LIPEX^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶

合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌和真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的特殊菌株，在GB 1,296,839中有更详细的描述。

有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO 97/43424和WO 01/66712中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

商业上能够获得的淀粉酶是DURAMYL^TM、TERMAMYL^TM、FUNGAMYL^TM、NATALASE^TM、TERMAMYL LC^TM、TERMAMYL SC^TM、LIQUIZYME-X^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、RAPIDASE^TM和PURASTAR^TM(来自Genencor International Inc.)。

纤维素酶

合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶，其公开于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中。

特别合适的纤维素酶是碱性或中性纤维素酶，其具有保护颜色的益处(colour care benefits)。这种纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些纤维素酶变体。

商业上能够获得的纤维素酶包括CELLUZYME^TM、CAREZYME^TM和CAREZYME CORE^TM(Novozymes A/S)、CLAZINASE^TM和PURADAX HA^TM(Genencor International Inc.)以及KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

氧化还原酶

可根据本发明处理的氧化还原酶包括过氧化物酶，以及氧化酶例如漆酶和过氧化氢酶。

其它优选的水解酶是碳水解酶(carbohydrolase)，包括MANNAWAY^TM。其它优选的酶是转移酶、裂合酶、异构酶和连接酶。

目的多肽的表达构建体

在优选的实施方案中，本发明的细胞包含一个或多个在染色体上整合的、编码至少一种异源多肽的多核苷酸的拷贝。

优选本发明的至少一种异源多肽由从至少一种异源启动子转录的多核苷酸编码；优选地，至少一个启动子包括人工启动子。合适的启动子构建体在WO 93/10249中公开，该文献以其整体并入本文作为参考。

另外，优选的人工启动子包含一个或多个mRNA稳定序列，优选源自cryIIIa启动子。合适的构建体在WO 99/43835中描述，该文献以其整体并入本文作为参考。

发酵

本发明可用于工业规模的任何发酵，例如用于具有至少50升、优选至少100升、更优选至少500升、更优选1000升、尤其是至少5000升的培养基的任何发酵。

可通过本领域已知的任何方法来发酵菌株或细胞。发酵培养基可为复合培养基，其包含复合的氮源和/或碳源，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解物、糖蜜(molasses)等。发酵培养基可为化学上确定成分培养基，例如在WO 98/37179中所定义的。

可通过分批、补料分批、重复补料分批(repeated fed-batch)或连续发酵方法来进行发酵。

在补料分批方法中，在发酵开始之前培养基中不添加包含一个或多个结构性和/或催化元件(element)的化合物(compound)或添加部分化合物，并在发酵过程中分别补料包含一个或多个结构性和/或催化元件的化合物的全部或剩余部分。选择用于补料的化合物可一起或彼此分离地补料到发酵过程。

在重复补料分批或连续发酵的方法中，在发酵期间将完全的起始培养基另外补料。可将起始培养基与结构元件进料一起或分开补料。在重复补料分批的方法中，在一定的时间间隔内将包含生物质的部分发酵液去除，而在连续方法中，部分发酵液的去除连续发生。因此用相当于回收发酵液的量的一部分新鲜培养基补足(replenish)发酵过程。

在本发明的优选实施方案中，优选补料分批、重复补料分批方法或连续发酵方法。

多元醇

可将非常有用的碳水化合物的亚类多元醇添加到根据本发明的发酵中。可使用任何多元醇。但是，优选的是选自由以下物质组成的组的多元醇：1，2-丙二醇(单丙二醇；MPG)、1，3-丙二醇、甘油、乙二醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖和山梨糖醇。特别地，优选可缓慢代谢的多元醇。

应当注意的是，一些多元醇(例如甘油)被大多数细胞相当容易地代谢，但是例如甘油的吸收则可以被阻断，这意味着可根据本发明使用甘油。

在本发明的具体实施方案中，将多元醇在接种之前或在接种之后以至少0.1％(w/w)的量；尤其是以至少0.5％(w/w)的量加入培养基中。将多元醇在接种之前或在接种之后以多至10％w/w的量；优选以多至8％w/w的量；更优选以多至6％w/w的量；更优选以多至5％w/w的量；更优选以多至4％w/w的量；更优选以多至3％w/w的量；更优选以多至2％w/w的量；甚至更优选以多至1％w/w的量加入培养基中。

在一些情况下，使用两种或两种以上多元醇(例如甘油和单丙二醇)的混合物或者可缓慢代谢的多元醇和可缓慢代谢的碳水化合物的混合物可能是有利的。

代谢的程度

下列测试可用来检验产生目的多肽的微生物是否不能或只能低程度地代谢给定的化合物：

选择用于培养目的微生物的合适的培养基。该培养基的特点在于下列参数：

a.该培养基包含葡萄糖作为唯一的碳水化合物来源。

b.将葡萄糖除去时，该培养基只能维持显著较低的生物量(小于50％)的生长。

然后在以下3种培养基中比较目的微生物的生长：

I：正常培养基(以葡萄糖作为唯一的碳水化合物来源)

II：无葡萄糖的培养基I

III：无葡萄糖但具有相同C-mol的测试化合物的培养基I

然后在上述的3种培养基中跟踪8小时的时间的生长。用确保正常培养基在75％的时间范围内长出的生物质浓度来进行接种。将生物质的量测定为在650nm的光密度(OD)。测定在不同培养基中获得的OD。

将待测的化合物定义为可低代谢的，如果：

(OD_III-OD_II)/(OD_I-OD_II)＜25％；优选地

(OD_III-OD_II)/(OD_I-OD_II)＜20％；更优选地

(OD_III-OD_II)/(OD_I-OD_II)＜15％；更优选地

(OD_III-OD_II)/(OD_I-OD_II)＜10％；更优选地

(OD_III-OD_II)/(OD_I-OD_II)＜5％；更优选地

(OD_III-OD_II)/(OD_I-OD_II)＝0％

在实施例2中，依据这种方法测试了发酵物。

目的多肽的回收

本发明的又一个方面涉及发酵液的下游加工。在发酵过程结束之后，可使用为目的多肽开发的标准技术从发酵液中回收目的多肽。应用的有关下游加工技术取决于目的多肽的性质。

从发酵液中回收目的多肽的方法通常涉及(但不限于)下列步骤的一些或全部：

1)培养液的预处理(例如：絮凝)

2)从培养液中除去细胞及其它固体物质(初次分离)

3)过滤

4)浓缩

5)过滤

6)稳定和标准化。

除了上面列出的单元操作之外，可应用一些其它的回收方法和步骤，例如：pH-调节、温度变化、结晶、用活性炭处理包含目的多肽的溶液以及使用各种吸附剂。

通过使用本发明的方法，当通过在发酵期间加入例如MPG来减少或消除结晶形成时，回收中的目的多肽的产率(yield)高得多。

在下面实施例中进一步说明本发明，所述实施例不意欲以任何方式限制本发明所要求的范围。

实施例

实施例1：地衣芽孢杆菌菌株中yugJ基因的缺失

除非另有说明，应用分子生物学的标准方法来进行DNA操作和转化(Sambrook et al.(1989)Molecular cloning：A laboratory manual，Cold SpringHarbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.et al.(eds.)“Currentprotocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.andCutting，S.M.(eds.)“Molecular Biological Methods for Bacillus”，John Wileyand Sons，1990)。根据供应商的说明书来使用DNA操作的酶(例如：限制性核酸内切酶、连接酶等可获得自New England Biolabs，Inc.)。如Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F.E.(1975)Transformation and transfection in lysogenicstrains of Bacillus subtilis：evidence for selective induction of prophage incompetent cells.J.Bacteriol，121：296-304。

菌株

地衣芽孢杆菌SJ1707：在WO 93/10249中公开。

地衣芽孢杆菌SJ1707b：在WO 01/66712中公开的表达重组变体α-淀粉酶的SJ1707。

地衣芽孢杆菌AN232：SJ1707b(ΔyugJ)；本研究。

枯草芽孢杆菌PP289-5：用于接合转移质粒的供体菌株，所述质粒具有来源于pUB110(在WO 96/23073中描述)的转移起点oriT。

质粒

质粒pAN212b是质粒pSJ2739(在WO 99/41358中描述)的衍生物，所述质粒pSJ2739又衍生自公知的质粒pE194，其为用于复制的天然温度敏感型质粒。质粒pAN212b包含pE194复制子(replicon)，和源自质粒pUB110的片段，如图1中所示。pAN212b的全部核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

引物

yugJ1F(SEQ ID NO.4)：ataaaagtccgcggttgatcagacctgcgattccg

yugJ2R(SEQ ID NO.5)：cagcgttttaaagcggccgatcgcttaatgctgcctccgc

yugJ3F(SEQ ID NO.6)：gcggaggcagcattaagcgatcggccgctttaaaacgctg

yugJ4R(SEQ ID NO.7)：tgcccggacgtcttttttcgtgaatggtatggtgg

可根据核苷酸序列(SEQ ID NO.1)通过本领域已知的任何标准方法来进行地衣芽孢杆菌菌株中yugJ基因的缺失，所述标准方法例如下述：

通过使用由重叠延伸的剪接技术来产生PCR产物。在以SJ1707染色体DNA作为模板的PCR反应中，通过使用引物yugJ1F和yugJ2R来产生包含yugJ上游序列的PCR1。在另一个以SJ1707染色体DNA作为模板的PCR反应中，通过使用引物yugJ3F和yugJ4R来产生包含yugJ下游序列的PCR2。在使用PCR1和PCR2作为模板，以及yugJ1F和yugJ4R作为引物的第二阶段PCR中产生剪接产物(930bp，表示为yugJSOEpcr；如SEQ ID NO.8所示)，其中yugJ基因从387aa减少到51aa。

然后通过将yugJSOEpcr克隆入温度敏感型质粒pAN212b的Sac II-BsaHI位点来构建表示为“缺失质粒(deletion plasmid)”的质粒-产生缺失质粒pAN212b-yugJ，如在图2中示意性显示。pAN212b-yugJ的全部序列如SEQ IDNO.9所示。

将该缺失质粒转化入枯草芽孢杆菌接合供体菌株PP289-5(其包含染色体dal-缺失、质粒pBC16(可从DSMZ ref.4424获得；Kreft J，et al.1978.Mol GenGenet.Jun 1；162(1)：59-67)和质粒pLS20(也可从DSMZ ref.4449获得；

，T.M.和Thome，C.B.1987.J.Bacteriol.169：5271-5278))的感受态细胞，并且通过使用标准方法(如WO 02/00907所述)接合于地衣芽孢杆菌SJ1707b菌株。

然后通过由整合和切除温度敏感型缺失质粒介导的借助于PCR1和PCR2的双同源重组，将yugJ缺失从缺失质粒转移到靶地衣芽孢杆菌SJ1707b菌株的染色体(如WO 02/00907所述)。

通过以引物yugJ1F和yugJ4R从染色体DNA中产生PCR片段来确认yugJ-缺失的菌株，其中通过标准核苷酸序列分析来验证该缺失。将yugJ-缺失的菌株表示为地衣芽孢杆菌AN232。

实施例2.yugJ缺失菌株中降低的MPG降解

将两种等基因的地衣芽孢杆菌菌株SJ1707b和AN232(SJ1707b(ΔyugJ))如下进行发酵：

培养基

除非另有所述，在所有情况下使用自来水。通过本领域已知的方法对所有培养基进行灭菌来确保发酵作为单种培养(monoculture)进行。

第一接种培养基：将LB琼脂用作固体生长培养基(如Ausubel，F.M.et al.(eds.)“Current protocols in Molecular Biology”.John Wiley and Sons，1995所述)。LB琼脂：10g/l来自酪蛋白的蛋白胨；5g/l酵母提取物；10g/l氯化钠；12g/l细菌用琼脂(Bacto-agar)，调节到pH6.8至7.2。使用来自Merck的预混物(premix)。

转移缓冲液：M-9缓冲液(使用去离子水)：磷酸氢二钠·2H₂O 8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁·7H₂O 0.2g/l。

接种摇瓶培养基(在接种之前浓缩)：PRK-50：110g/l豆渣(soy grit)；磷酸氢二钠·2H₂O 5g/l；在灭菌之前用NaOH/H₃PO₄将pH调节到8.0。

补充培养基(在接种之前浓缩)：胰蛋白胨(来自Difco的酪蛋白水解物)30g/l；硫酸镁·7H₂O 4g/l；磷酸氢二钾7g/l；磷酸氢二钠·2H₂O 7g/l；硫酸铵4g/l；柠檬酸0.78g/l；维生素(硫胺素-二氯化物34.2mg/l；核黄素2.9mg/l；烟酸23mg/l；D-泛酸钙28.5mg/l；吡哆醛-HCl 5.7mg/l；D-生物素1.1mg/l；叶酸2.9mg/l)；痕量金属(MnSO₄·H₂O 39.2mg/l；FeSO₄·7H₂O 157mg/l；CuSO₄·5H₂O 15.6mg/l；ZnCl₂ 15.6mg/l)；消泡剂(SB2121)1.25ml/l；在灭菌之前用NaOH/H₃PO₄将pH调节到6.0。

补料培养基(Feed medium)：Glucose.1H₂O 820g/l。

步骤

首先将菌株在37℃在LB琼脂斜面上培养1天。然后用M-9缓冲液洗涤琼脂，并且测定产生的细胞悬浮液在650nm处的光密度(OD)。

将接种物摇瓶(PRK-50)用OD(650nm)x ml细胞悬液＝0.1的接种物接种。然后在37℃300rpm将摇瓶温育20小时。

通过将生长培养物从摇瓶中接种到主发酵罐中开始在主发酵罐(发酵槽(fermentation tank))中的发酵。接种体积是10％的补充培养基(800ml补充培养基的80ml)。

使用装备有温度控制系统、用氨水和磷酸的pH控制、在整个发酵过程中测量＞20％氧饱和度的溶氧电极的标准实验发酵罐。发酵参数是：

温度：41℃。

使用氨水和磷酸将pH保持在6.8-7.2。

控制：6.8(氨水)；7.2磷酸

通气：1.5升/min/kg培养液重量

搅拌：1500rpm

补料策略：

0小时。在接种之后0.05g/min/kg初始培养液

8小时。在接种之后0.156g/min/kg初始培养液

终止。在接种之后0.156g/min/kg初始培养液

结果：

分别平行进行SJ1707b(yugJ野生型)和AN 232(yugJ缺失突变体)的两个发酵。在24小时和50小时20分时将2％MPG加入两个发酵中。结果(如表1所示)显示在yugJ缺失菌株AN232中(在时间段30小时-93小时内)与其它等基因的菌株SJ1707b相比降低的MPG代谢。确实，通过使用yugJ在失菌株可以降低发酵成本，因为需要加入更少的MPG来减少晶体形成。

表1.发酵A(SJ1707b)和B(AN232；yugJ突变体)的发酵液中的MPG浓度(％)。在24小时和50小时20分加入2％MPG。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>适用于制备重组多肽的突变体细胞

<130>NZ 10800.204-WO

<150>DK PA 2005 00936

<151>2005-06-24

<150>US 60/694,540

<151>2005-06-28

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1164

<212>DNA

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1161)

<223>YugJ-推定的醇脱氢酶

<400>1

atg gat aac ttt aca tat tgg aat ccc aca aag ctg ata ttc ggc cgg 48

Met Asp Asn Phe Thr Tyr Trp Asn Pro Thr Lys Leu Ile Phe Gly Arg

1 5 10 15

gga gaa gtt gaa aag ctg gca gaa gag gtg aaa caa tac ggc cgc aat 96

Gly Glu Val Glu Lys Leu Ala Glu Glu Val Lys Gln Tyr Gly Arg Asn

20 25 30

gtc ctg ctc gta tac ggc gga ggc agc att aag cga aac ggt tta tac 144

Val Leu Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser lle Lys Arg Asn Gly Leu Tyr

35 40 45

gat caa gtc att tca atc ctt gaa aag gcg ggc gcg acc gtc cat gaa 192

Asp Gln Val Ile Ser Ile Leu Glu Lys Ala Gly Ala Thr Val His Glu

50 55 60

ctg ccc ggc gtc gaa ccg aat ccg cgt gtt gcc act gtg aat aaa gga 240

Leu Pro Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Ala Thr Val Asn Lys Gly

65 70 75 80

gtt gcg atc tgc aaa gag aac gat att gac ttt ctt ttg gca gtc ggc 288

Val Ala Ile Cys Lys Glu Asn Asp Ile Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly

85 90 95

ggc gga agc gtc att gat tgt acg aaa gca att gct gcc gga gcg aaa 336

Gly Gly Ser Val Ile Asp Cys Thr Lys Ala Ile Ala Ala Gly Ala Lys

100 105 110

tac gac ggc gat gcg tgg gat att gtg acg aaa aaa cat att ccg gct 384

Tyr Asp Gly Asp Ala Trp Asp Ile Val Thr Lys Lys His Ile Pro Ala

115 120 125

gat gcg ctg ccg ttt gga aca gtt tta acg tta gca gca aca ggc tct 432

Asp Ala Leu Pro Phe Gly Thr Val Leu Thr Leu Ala Ala Thr Gly Ser

130 135 140

gaa atg aac tcg gga tct gtg atc aca aat tgg gaa acc aat gaa aaa 480

Glu Met Asn Ser Gly Ser Val lle Thr Asn Trp Glu Thr Asn Glu Lys

145 150 155 160

tac ggc tgg gga agc ccg ctc gta ttc cct aaa ttt tca att ctt gat 528

Tyr Gly Trp Gly Ser Pro Leu Val Phe Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp

165 170 175

ccg gtc aac acg ttt acc gtc ccg aaa gac cac acg att tac ggc att 576

Pro Val Asn Thr Phe Thr Val Pro Lys Asp His Thr Ile Tyr Gly Ile

180 185 190

gtc gac atg atg tcc cac gtg ttt gag caa tat ttt cac cat acc gaa 624

Val Asp Met Met Ser His Val Phe Glu Gln Tyr Phe His His Thr Glu

195 200 205

aat acc cct tat cag gac cgg atg tgc gaa tcc ctg ctt aaa acg gta 672

Asn Thr Pro Tyr Gln Asp Arg Met Cys Glu Ser Leu Leu Lys Thr Val

210 215 220

att gaa aca gct cct aag ctc att gaa gac cta gaa aac tat gag ctg 720

Ile Glu Thr Ala Pro Lys Leu Ile Glu Asp Leu Glu Asn Tyr Glu Leu

225 230 235 240

cgt gaa acg att ctg tat aca ggc acc att gcg ctg aac ggc atg cta 768

Arg Glu Thr Ile Leu Tyr Thr Gly Thr Ile Ala Leu Asn Gly Met Leu

245 250 255

tca atg ggc gca cgc gga gac tgg gca acg cac aat atc gag cac gct 816

Ser Met Gly Ala Arg Gly Asp Trp Ala Thr His Asn Ile Glu His Ala

260 265 270

gtt tca gcc gta tac gat att ccg cat gcg gga ggg ctt gcg att ctg 864

Val Ser Ala Val Tyr Asp Ile Pro His Ala Gly Gly Leu Ala Ile Leu

275 280 285

ttc ccg aat tgg atg aag cac acg ctt tcc gag aac gtc ggc cgc ttt 912

Phe Pro Asn Trp Met Lys His Thr Leu Ser Glu Asn Val Gly Arg Phe

290 295 300

aaa cag ctt gcc gtc cgt gtt ttt gac gta gat gaa aca gga aaa acc 960

Lys Gln Leu Ala Val Arg Val Phe Asp Val Asp Glu Thr Gly Lys Thr

305 310 315 320

gat cgc gaa gtg gcg ctt gtt gga atc gag aaa ctg tct gaa ttc tgg 1008

Asp Arg Glu Val Ala Leu Val Gly Ile Glu Lys Leu Ser Glu Phe Trp

325 330 335

acc agc ctt ggc gcg cca aat cgt ctt gcc gat tat gac att aca gat 1056

Thr Ser Leu Gly Ala Pro Ash Arg Leu Ala Asp Tyr Asp Ile Thr Asp

340 345 350

gag aag ctt gat ctc att gcc gac aaa gcg atg gca aac ggc gaa ttc 1104

Glu Lys Leu Asp Leu Ile Ala Asp Lys Ala Met Ala Asn Gly Glu Phe

355 360 365

ggc cgc ttt aaa acg ctg aat aaa gac gat gtt ctg tct att ttg aag 1152

Gly Arg Phe Lys Thr Leu Asn Lys Asp Asp Val Leu Ser Ile Leu Lys

370 375 380

gct tct tta taa 1164

Ala Ser Leu

385

<210>2

<211>387

<212>PRT

<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400>2

Met Asp Asn Phe Thr Tyr Trp Asn Pro Thr Lys Leu Ile Phe Gly Arg

1 5 10 15

Gly Glu Val Glu Lys Leu Ala Glu Glu Val Lys Gln Tyr Gly Arg Asn

20 25 30

Val Leu Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Leu Tyr

35 40 45

Asp Gln Val Ile Ser Ile Leu Glu Lys Ala Gly Ala Thr Val His Glu

50 55 60

Leu Pro Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Ala Thr Val Asn Lys Gly

65 70 75 80

Val Ala Ile Cys Lys Glu Asn Asp Ile Asp Phe Leu Leu Ala Val Gly

85 90 95

Gly Gly Ser Val Ile Asp Cys Thr Lys Ala Ile Ala Ala Gly Ala Lys

100 105 110

Tyr Asp Gly Asp Ala Trp Asp Ile Val Thr Lys Lys His Ile Pro Ala

115 120 125

Asp Ala Leu Pro Phe Gly Thr Val Leu Thr Leu Ala Ala Thr Gly Ser

130 135 140

Glu Met Asn Ser Gly Ser Val Ile Thr Asn Trp Glu Thr Asn Glu Lys

145 150 155 160

Tyr Gly Trp Gly Ser Pro Leu Val Phe Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp

165 170 175

Pro Val Asn Thr Phe Thr Val Pro Lys Asp His Thr Ile Tyr Gly Ile

180 185 190

Val Asp Met Met Ser His Val Phe Glu Gln Tyr Phe His His Thr Glu

195 200 205

Asn Thr Pro Tyr Gln Asp Arg Met Cys Glu Ser Leu Leu Lys Thr Val

210 215 220

Ile Glu Thr Ala Pro Lys Leu Ile Glu Asp Leu Glu Asn Tyr Glu Leu

225 230 235 240

Arg Glu Thr Ile Leu Tyr Thr Gly Thr Ile Ala Leu Asn Gly Met Leu

245 250 255

Ser Met Gly Ala Arg Gly Asp Trp Ala Thr His Asn Ile Glu His Ala

260 265 270

Val Ser Ala Val Tyr Asp Ile Pro His Ala Gly Gly Leu Ala Ile Leu

275 280 285

Phe Pro Asn Trp Met Lys His Thr Leu Ser Glu Asn Val Gly Arg Phe

290 295 300

Lys Gln Leu Ala Val Arg Val Phe Asp Val Asp Glu Thr Gly Lys Thr

305 310 315 320

Asp Arg Glu Val Ala Leu Val Gly Ile Glu Lys Leu Ser Glu Phe Trp

325 330 335

Thr Ser Leu Gly Ala Pro Asn Arg Leu Ala Asp Tyr Asp Ile Thr Asp

340 345 350

Glu Lys Leu Asp Leu Ile Ala Asp Lys Ala Met Ala Asn Gly Glu Phe

355 360 365

Gly Arg Phe Lys Thr Leu Asn Lys Asp Asp Val Leu Ser Ile Leu Lys

370 375 380

Ala Ser Leu

385

<210>3

<211>4350

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pAN212b

<400>3

aattcagatc cttattgttc ccgcgggacg tcgattcaca aaaataggca cacgaaaaac 60

aagtaaggga tgcagtttat gcatccctta acttacttat taaataattt atagctattg 120

aaaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat cgtcaattcc tgcatgtttt 180

aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt attctttgtt aacccatttc 240

ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata ttcttgattt ttttctactt 300

aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa aatattctct tggaaccata 360

cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg ccaatgagcg ttttgtattt 420

aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa tctcattagc tatactatca 480

aaaacaattt tgcgtattat atccgtactt atgttataag gtatattacc atatatttta 540

taggattggt ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct tgtttaaaac ttggaaatta 600

tcgtgatcaa caagtttatt ttctgtagtt ttgcataatt tatggtctat ttcaatggca 660

gttacgaaat tacacctctt tactaattca agggtaaaat ggccttttcc tgagccgatt 720

tcaaagatat tatcatgttc atttaatctt atatttgtca ttattttatc tatattatgt 780

tttgaagtaa taaagttttg actgtgtttt atatttttct cgttcattat aaccctcttt 840

aatttggtta tatgaatttt gcttattaac gattcattat aaccacttat tttttgtttg 900

gttgataatg aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat gcccatattt tttcctcctt 960

ataaaattag tataattata gcacgagctc tgataaatat gaacatgatg agtgatcgtt 1020

aaatttatac tgcaatcgga tgcgattatt gaataaaaga tatgagagat ttatctaatt 1080

tcttttttct tgtaaaaaaa gaaagttctt aaaggtttta tagttttggt cgtagagcac 1140

acggtttaac gacttaatta cgaagtaaat aagtctagtg tgttagactt tatgaaatct 1200

atatacgttt atatatattt attatccgga ggtgtagcat gtctcattca attttgaggg 1260

ttgccagagt taaaggatca agtaatacaa acgggataca aagacataat caaagagaga 1320

ataaaaacta taataataaa gacataaatc atgaggaaac atataaaaat tatgatttga 1380

ttaacgcaca aaatataaag tataaagata aaattgatga aacgattgat gagaattatt 1440

cagggaaacg taaaattcgg tcagatgcaa ttcgacatgt ggacggactg gttacaagtg 1500

ataaagattt ctttgatgat ttaagcggag aagaaataga acgatttttt aaagatagct 1560

tggagtttct agaaaatgaa tacggtaagg aaaatatgct gtatgcgact gtccatctgg 1620

atgaaagagt cccacatatg cactttggtt ttgtcccttt aacagaggac gggagattgt 1680

ctgcaaaaga acagttaggc aacaagaaag actttactca attacaagat agatttaatg 1740

agtatgtgaa tgagaaaggt tatgaacttg aaagaggcac gtccaaagag gttacagaac 1800

gagaacataa agcgatggat cagtacaaga aagatactgt atttcataaa caggaactgc 1860

aagaagttaa ggatgagtta cagaaggcaa ataagcagtt acagagtgga atagagcata 1920

tgaggtctac gaaacccttt gattatgaaa atgagcgtac aggtttgttc tctggacgtg 1980

aagagactgg tagaaagata ttaactgctg atgaatttga acgcctgcaa gaaacaatct 2040

cttctgcaga acggattgtt gatgattacg aaaatattaa gagcacagac tattacacag 2100

aaaatcaaga attaaaaaaa cgtagagaga gtttgaaaga agtagtgaat acatggaaag 2160

aggggtatca cgaaaaaagt aaagaggtta ataaattaaa gcgagagaat gatagtttga 2220

atgagcagtt gaatgtatca gagaaatttc aagctagtac agtgacttta tatcgtgctg 2280

cgagggcgaa tttccctggg tttgagaaag ggtttaatag gcttaaagag aaattcttta 2340

atgattccaa atttgagcgt gtgggacagt ttatggatgt tgtacaggat aatgtccaga 2400

aggtcgatag aaagcgtgag aaacagcgta cagacgattt agagatgtag aggtactttt 2460

atgccgagaa aactttttgc gtgtgacagt ccttaaaata tacttagagc gtaagcgaaa 2520

gtagtagcga cagctattaa ctttcggttt caaagctcta ggatttttaa tggacgcagc 2580

gcatcacacg caaaaaggaa attggaataa atgcgaaatt tgagatgtta attaaagacc 2640

tttttgaggt ctttttttct tagatttttg gggttattta ggggagaaaa catagggggg 2700

tactacgacc tcccccctag gtgtccattg tccattgtcc aaacaaataa ataaatattg 2760

ggtttttaat gttaaaaggt tgttttttat gttaaagtga aaaaaacaga tgttgggagg 2820

tacagtgatg gttgtagata gaaaagaaga gaaaaaagtt gctgttactt taagacttac 2880

aacagaagaa aatgagatat taaatagaat caaagaaaaa tataatatta gcaaatcaga 2940

tgcaaccggt attctaataa aaaaatatgc aaaggaggaa tacggtgcat tttaaacaaa 3000

aaaagataga cagcactggc atgctgccta tctatgacta aattttgtta agtgtattag 3060

caccgttatt atatcatgag cgaaaatgta ataaaagaaa ctgaaaacaa gaaaaattca 3120

agaggacgta attggacatt tgttttatat ccagaatcag caaaagccga gtggttagag 3180

tatttaaaag agttacacat tcaatttgta gtgtctccat tacatgatag ggatactgat 3240

acagaaggta ggatgaaaaa agagcattat catattctag tgatgtatga gggtaataaa 3300

tcttatgaac agataaaaat aattacagaa gaattgaatg cgactattcc gcagattgca 3360

ggaagtgtga aaggtcttgt gagatatatg cttcacatgg acgatcctaa taaatttaaa 3420

tatcaaaaag aagatatgat agtttatggc ggtgtagatg ttgatgaatt attaaagaaa 3480

acaacaacag atagatataa attaattaaa gaaatgattg agtttattga tgaacaagga 3540

atcgtagaat ttaagagttt aatggattat gcaatgaagt ttaaatttga tgattggttc 3600

ccgcttttat gtgataactc ggcgtatgtt attcaagaat atataaaatc aaatcggtat 3660

aaatctgacc gatagatttt gaatttaggt gtcacaagac actctttttt cgcaccagcg 3720

aaaactggtt taagccgact gcgcaaaaga cataatcgac tctagaggat ccccgggtac 3780

cgagctctgc cttttagtcc agctgatttc actttttgca ttctacaaac tgcataactc 3840

atatgtaaat cgctcctttt taggtggcac aaatgtgagg cattttcgct ctttccggca 3900

accacttcca agtaaagtat aacacactat actttatatt cataaagtgt gtgctctgcg 3960

aggctgtcgg cagtgccgac caaaaccata aaacctttaa gacctttctt ttttttacga 4020

gaaaaaagaa acaaaaaaac ctgccctctg ccacctcagc aaaggggggt tttgctctcg 4080

tgctcgttta aaaatcagca agggacaggt agtatttttt gagaagatca ctcaaaaaat 4140

ctccaccttt aaacccttgc caatttttat tttgtccgtt ttgtctagct taccgaaagc 4200

cagactcagc aagaataaaa tttttattgt ctttcggttt tctagtgtaa cggacaaaac 4260

cactcaaaat aaaaaagata caagagaggt ctctcgtatc ttttattcag caatcgcgcc 4320

cgattgctga acagattaat aatgagctcg 4350

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物yugJ1F

<400>4

ataaaagtcc gcggttgatc agacctgcga ttccg 35

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物yugJ2R

<400>5

cagcgtttta aagcggccga tcgcttaatg ctgcctccgc 40

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物yugJ3F

<400>6

gcggaggcag cattaagcga tcggccgctt taaaacgctg 40

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物yugJ4R

<400>7

tgcccggacg tcttttttcg tgaatggtat ggtgg 35

<210>8

<211>930

<212>DNA

<213>人工序列

<223>PCR片段yugJSOEpcr

<400>8

ataaaagtcc gcggttgatc agacctgcga ttccgacaag cgcgtaaacg gtccgtgcta 60

aagcagaccc ttggccgcca aaaatggctg caaccaagtc aaattgaaaa aatcctatca 120

gtccccaatt gattgctccg atgatcgtta aaaccaatgc aatacgttga agtgcattca 180

tttgttattc ctcctatttt gaaatcatat atttcacatt tatagattgc gaccgatttg 240

gaaacattat acgcctgagg agcagatcgc tttacagagc gttcggcgat ttcccataat 300

agtaaataaa ggaggagatg tagatggata actttacata ttggaatccc acaaagctga 360

tattcggccg gggagaagtt gaaaagctgg cagaagaggt gaaacaatac ggccgcaatg 420

tcctgctcgt atacggcgga ggcagcatta agcgatcggc cgctttaaaa cgctgaataa 480

agacgatgtt ctgtctattt tgaaggcttc tttataagat ttcttgacgg ctcaaggaga 540

accgccattc cttgagccgt tgtttattgt tatgtttttg acaaaaatgc aagtggaggc 600

tgaaaaaaca tgcatttttg gcgggcatcc tccatcctcc tttttttcgt cacttgattt 660

aacgaaggag ttcatataaa gtgaaaaggg aagaggctgt cgccgaaaat cgacatgttt 720

taaaaccctt tggcccgcac tctcatgcaa atgaaagcgc tggcgggtat ttgaaagaaa 780

acagctagta ctggaggttt aataatatga cgcatgtccg ttttgactac tcaagagcat 840

tgccattctt taaagaacag gagcttacat atctgcgtga cttcgttaaa gtcgcccacc 900

ataccattca cgaaaaaaga cgtccgggca 930

<210>9

<211>5254

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pAN212b-yugJ

<400>9

aattcagatc cttattgttc ccgcggttga tcagacctgc gattccgaca agcgcgtaaa 60

cggtccgtgc taaagcagac ccttggccgc caaaaatggc tgcaaccaag tcaaattgaa 120

aaaatcctat cagtccccaa ttgattgctc cgatgatcgt taaaaccaat gcaatacgtt 180

gaagtgcatt catttgttat tcctcctatt ttgaaatcat atatttcaca tttatagatt 240

gcgaccgatt tggaaacatt atacgcctga ggagcagatc gctttacaga gcgttcggcg 300

atttcccata atagtaaata aaggaggaga tgtagatgga taactttaca tattggaatc 360

ccacaaagct gatattcggc cggggagaag ttgaaaagct ggcagaagag gtgaaacaat 420

acggccgcaa tgtcctgctc gtatacggcg gaggcagcat taagcgatcg gccgctttaa 480

aacgctgaat aaagacgatg ttctgtctat tttgaaggct tctttataag atttcttgac 540

ggctcaagga gaaccgccat tccttgagcc gttgtttatt gttatgtttt tgacaaaaat 600

gcaagtggag gctgaaaaaa catgcatttt tggcgggcat cctccatcct cctttttttc 660

gtcacttgat ttaacgaagg agttcatata aagtgaaaag ggaagaggct gtcgccgaaa 720

atcgacatgt tttaaaaccc tttggcccgc actctcatgc aaatgaaagc gctggcgggt 780

atttgaaaga aaacagctag tactggaggt ttaataatat gacgcatgtc cgttttgact 840

actcaagagc attgccattc tttaaagaac aggagcttac atatctgcgt gacttcgtta 900

aagtcgccca ccataccatt cacgaaaaaa gacgtcgatt cacaaaaata ggcacacgaa 960

aaacaagtaa gggatgcagt ttatgcatcc cttaacttac ttattaaata atttatagct 1020

attgaaaaga gataagaatt gttcaaagct aatattgttt aaatcgtcaa ttcctgcatg 1080

ttttaaggaa ttgttaaatt gattttttgt aaatattttc ttgtattctt tgttaaccca 1140

tttcataacg aaataattat acttttgttt atctttgtgt gatattcttg atttttttct 1200

acttaatctg ataagtgagc tattcacttt aggtttagga tgaaaatatt ctcttggaac 1260

catacttaat atagaaatat caacttctgc cattaaaagt aatgccaatg agcgttttgt 1320

atttaataat cttttagcaa acccgtattc cacgattaaa taaatctcat tagctatact 1380

atcaaaaaca attttgcgta ttatatccgt acttatgtta taaggtatat taccatatat 1440

tttataggat tggtttttag gaaatttaaa ctgcaatata tccttgttta aaacttggaa 1500

attatcgtga tcaacaagtt tattttctgt agttttgcat aatttatggt ctatttcaat 1560

ggcagttacg aaattacacc tctttactaa ttcaagggta aaatggcctt ttcctgagcc 1620

gatttcaaag atattatcat gttcatttaa tcttatattt gtcattattt tatctatatt 1680

atgttttgaa gtaataaagt tttgactgtg ttttatattt ttctcgttca ttataaccct 1740

ctttaatttg gttatatgaa ttttgcttat taacgattca ttataaccac ttattttttg 1800

tttggttgat aatgaactgt gctgattaca aaaatactaa aaatgcccat attttttcct 1860

ccttataaaa ttagtataat tatagcacga gctctgataa atatgaacat gatgagtgat 1920

cgttaaattt atactgcaat cggatgcgat tattgaataa aagatatgag agatttatct 1980

aatttctttt ttcttgtaaa aaaagaaagt tcttaaaggt tttatagttt tggtcgtaga 2040

gcacacggtt taacgactta attacgaagt aaataagtct agtgtgttag actttatgaa 2100

atctatatac gtttatatat atttattatc cggaggtgta gcatgtctca ttcaattttg 2160

agggttgcca gagttaaagg atcaagtaat acaaacggga tacaaagaca taatcaaaga 2220

gagaataaaa actataataa taaagacata aatcatgagg aaacatataa aaattatgat 2280

ttgattaacg cacaaaatat aaagtataaa gataaaattg atgaaacgat tgatgagaat 2340

tattcaggga aacgtaaaat tcggtcagat gcaattcgac atgtggacgg actggttaca 2400

agtgataaag atttctttga tgatttaagc ggagaagaaa tagaacgatt ttttaaagat 2460

agcttggagt ttctagaaaa tgaatacggt aaggaaaata tgctgtatgc gactgtccat 2520

ctggatgaaa gagtcccaca tatgcacttt ggttttgtcc ctttaacaga ggacgggaga 2580

ttgtctgcaa aagaacagtt aggcaacaag aaagacttta ctcaattaca agatagattt 2640

aatgagtatg tgaatgagaa aggttatgaa cttgaaagag gcacgtccaa agaggttaca 2700

gaacgagaac ataaagcgat ggatcagtac aagaaagata ctgtatttca taaacaggaa 2760

ctgcaagaag ttaaggatga gttacagaag gcaaataagc agttacagag tggaatagag 2820

catatgaggt ctacgaaacc ctttgattat gaaaatgagc gtacaggttt gttctctgga 2880

cgtgaagaga ctggtagaaa gatattaact gctgatgaat ttgaacgcct gcaagaaaca 2940

atctcttctg cagaacggat tgttgatgat tacgaaaata ttaagagcac agactattac 3000

acagaaaatc aagaattaaa aaaacgtaga gagagtttga aagaagtagt gaatacatgg 3060

aaagaggggt atcacgaaaa aagtaaagag gttaataaat taaagcgaga gaatgatagt 3120

ttgaatgagc agttgaatgt atcagagaaa tttcaagcta gtacagtgac tttatatcgt 3180

gctgcgaggg cgaatttccc tgggtttgag aaagggttta ataggcttaa agagaaattc 3240

tttaatgatt ccaaatttga gcgtgtggga cagtttatgg atgttgtaca ggataatgtc 3300

cagaaggtcg atagaaagcg tgagaaacag cgtacagacg atttagagat gtagaggtac 3360

ttttatgccg agaaaacttt ttgcgtgtga cagtccttaa aatatactta gagcgtaagc 3420

gaaagtagta gcgacagcta ttaactttcg gtttcaaagc tctaggattt ttaatggacg 3480

cagcgcatca cacgcaaaaa ggaaattgga ataaatgcga aatttgagat gttaattaaa 3540

gacctttttg aggtcttttt ttcttagatt tttggggtta tttaggggag aaaacatagg 3600

ggggtactac gacctccccc ctaggtgtcc attgtccatt gtccaaacaa ataaataaat 3660

attgggtttt taatgttaaa aggttgtttt ttatgttaaa gtgaaaaaaa cagatgttgg 3720

gaggtacagt gatggttgta gatagaaaag aagagaaaaa agttgctgtt actttaagac 3780

ttacaacaga agaaaatgag atattaaata gaatcaaaga aaaatataat attagcaaat 3840

cagatgcaac cggtattcta ataaaaaaat atgcaaagga ggaatacggt gcattttaaa 3900

caaaaaaaga tagacagcac tggcatgctg cctatctatg actaaatttt gttaagtgta 3960

ttagcaccgt tattatatca tgagcgaaaa tgtaataaaa gaaactgaaa acaagaaaaa 4020

ttcaagagga cgtaattgga catttgtttt atatccagaa tcagcaaaag ccgagtggtt 4080

agagtattta aaagagttac acattcaatt tgtagtgtct ccattacatg atagggatac 4140

tgatacagaa ggtaggatga aaaaagagca ttatcatatt ctagtgatgt atgagggtaa 4200

taaatcttat gaacagataa aaataattac agaagaattg aatgcgacta ttccgcagat 4260

tgcaggaagt gtgaaaggtc ttgtgagata tatgcttcac atggacgatc ctaataaatt 4320

taaatatcaa aaagaagata tgatagttta tggcggtgta gatgttgatg aattattaaa 4380

gaaaacaaca acagatagat ataaattaat taaagaaatg attgagttta ttgatgaaca 4440

aggaatcgta gaatttaaga gtttaatgga ttatgcaatg aagtttaaat ttgatgattg 4500

gttcccgctt ttatgtgata actcggcgta tgttattcaa gaatatataa aatcaaatcg 4560

gtataaatct gaccgataga ttttgaattt aggtgtcaca agacactctt ttttcgcacc 4620

agcgaaaact ggtttaagcc gactgcgcaa aagacataat cgactctaga ggatccccgg 4680

gtaccgagct ctgcctttta gtccagctga tttcactttt tgcattctac aaactgcata 4740

actcatatgt aaatcgctcc tttttaggtg gcacaaatgt gaggcatttt cgctctttcc 4800

ggcaaccact tccaagtaaa gtataacaca ctatacttta tattcataaa gtgtgtgctc 4860

tgcgaggctg tcggcagtgc cgaccaaaac cataaaacct ttaagacctt tctttttttt 4920

acgagaaaaa agaaacaaaa aaacctgccc tctgccacct cagcaaaggg gggttttgct 4980

ctcgtgctcg tttaaaaatc agcaagggac aggtagtatt ttttgagaag atcactcaaa 5040

aaatctccac ctttaaaccc ttgccaattt ttattttgtc cgttttgtct agcttaccga 5100

aagccagact cagcaagaat aaaattttta ttgtctttcg gttttctagt gtaacggaca 5160

aaaccactca aaataaaaaa gatacaagag aggtctctcg tatcttttat tcagcaatcg 5220

cgcccgattg ctgaacagat taataatgag ctcg 5254

Claims

1. 产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，其中所述细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，降低了YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平。

2. 根据权利要求1所述的细胞，其是原核细胞，优选革兰氏阳性细胞。

3. 根据权利要求2所述的细胞，其是芽孢杆菌属细胞。

4. 根据权利要求3所述的细胞，其是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。

5. 根据权利要求1-4任一项所述的细胞，其中所述YugJ同源物包含与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

6. 根据权利要求1-5任一项所述的细胞，其在yugJ(SEQ ID NO：1)或其同源物中突变。

7. 根据权利要求6所述的细胞，其中yugJ和/或yugJ同源物编码包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％的同一性。

8. 根据权利要求6所述的细胞，其中yugJ同源物包含具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示序列具有至少70％的同一性。

9. 根据权利要求1-8任一项所述的细胞，其在至少一个多核苷酸中突变，其中具有至少100bp大小的所述至少一个多核苷酸的亚序列与具有SEQ IDNO：1所示序列或相应互补序列的多核苷酸在中等严紧杂交条件下杂交。

10. 根据权利要求6-9任一项所述的细胞，其中将yugJ或其同源物从染色体中部分或全部缺失。

11. 根据权利要求6-9任一项所述的细胞，其中yugJ或其同源物包含至少一个移码突变或无义突变。

12. 根据权利要求1-11任一项所述的细胞，其与其它的等基因但未突变的细胞相比，YugJ或其同源物的表达水平降低至少两倍。

13. 根据权利要求1-12任一项所述的细胞，其与其它的等基因但未突变的细胞相比，检测不到YugJ或其同源物的表达。

14. 根据权利要求1-13任一项所述的细胞，其中至少一种异源多肽包括酶。

15. 根据权利要求14所述的细胞，其中所述的酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。

16. 根据权利要求1-15任一项所述的细胞，其包含一个或多个在染色体上整合的、编码至少一种异源多肽的多核苷酸的拷贝。

17. 根据权利要求1-16任一项所述的细胞，其中所述至少一种异源多肽由从至少一种异源启动子转录的多核苷酸编码。

18. 根据权利要求17所述的细胞，其中所述至少一种启动子包括人工启动子。

19. 根据权利要求18所述的细胞，其中所述人工启动子包含一种或多种mRNA稳定序列，优选衍生自cryIIIa启动子。

20. 一种构建突变细菌细胞的方法，所述方法包含如下步骤：

a)将细菌细胞突变；以及

b)选择与其它的等基因但未突变的细胞相比，降低了YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平的突变细胞。

21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原核细胞，优选革兰氏阳性细胞。

22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞是芽孢杆菌属细胞。

23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。

24. 根据权利要求20-23任一项所述的方法，其中YugJ同源物包含与SEQID NO：2所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

25. 根据权利要求20-24任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞在yugJ(SEQ ID NO：1)或其同源物中突变。

26. 根据权利要求25所述的方法，其中yugJ同源物编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％的同一性。

27. 根据权利要求25所述的方法，其中yugJ同源物具有与SEQ ID NO：1所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。

28. 根据权利要求20-27任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞在至少一个多核苷酸中突变，其中具有至少100bp大小的所述至少一种多核苷酸的亚序列与具有SEQ ID NO：1所示序列或相应互补序列的多核苷酸在中等严紧杂交条件下杂交。

29. 根据权利要求25-28任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞通过从细胞的染色体中部分或全部缺失yugJ或其同源物来进行突变。

30. 根据权利要求25-28任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞通过在yugJ或其同源物中引入至少一个移码突变或无义突变来进行突变。

31. 根据权利要求20-30任一项所述的方法，其中步骤(b)中所选择的细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，YugJ或其同源物的表达水平降低了至少两倍。

32. 根据权利要求20-31任一项所述的方法，其中步骤(b)中所选择的细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，检测不到YugJ或其同源物的表达。

33. 根据权利要求20-32任一项所述的方法，其中所述至少一种目的异源多肽包括酶。

34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。

35. 根据权利要求20-34任一项所述的方法，其中所述细胞包含一个或多个在染色体上整合的、编码所述至少一种目的异源多肽的多核苷酸的拷贝。

36. 根据权利要求20-35任一项所述的方法，其中所述至少一种目的异源多肽由从至少一种异源启动子转录的多核苷酸编码。

37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一种启动子包括人工启动子。

38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述人工启动子包含一种或多种mRNA稳定序列，优选衍生自cryIIIa启动子。

39. 一种产生目的多肽的方法，所述方法包含如下步骤：

a)在至少50升的培养基中培养产生至少一种目的异源多肽的突变细菌细胞，所述培养基包含一种或多种选自由以下物质所组成的组的化合物：1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、乙二醇、海藻糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖、山梨糖醇和平均分子量小于1000的聚醚，其在发酵之前和/或在发酵期间加入培养基中，其中所述突变细胞具有降低的YugJ(SEQ ID NO：2)或其同源物的表达水平，以及

b)分离目的多肽。

40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞是原核细胞，优选革兰氏阳性细胞。

41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞是芽孢杆菌属细胞。

42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。

43. 根据权利要求39-42任一项所述的方法，其中所述YugJ同源物包含与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。

44. 根据权利要求39-43任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞在yugJ(SEQ ID NO：1)或其同源物中突变。

45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述YugJ同源物编码具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示序列具有至少70％的同一性。

46. 根据权利要求44所述的方法，其中yugJ同源物具有与SEQ ID NO：1所示序列有至少70％同一性的核苷酸序列。

47. 根据权利要求39-46任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞在至少一个多核苷酸中突变，其中具有至少100bp大小的所述至少一个多核苷酸的亚序列与具有SEQ ID NO：1所示序列或相应互补序列的多核苷酸在中等严紧杂交条件下杂交。

48. 根据权利要求39-47任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞通过从细胞的染色体中部分或全部缺失yugJ或其同源物来进行突变。

49. 根据权利要求39-47任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞通过向yugJ或其同源物中引入至少一个移码突变或无义突变来进行突变。

50. 根据权利要求39-49任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，YugJ或其同源物的表达水平降低了至少两倍。

51. 根据权利要求39-50任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述细胞与其它的等基因但未突变的细胞相比，检测不到YugJ或其同源物的表达。

52. 根据权利要求39-51任一项所述的方法，其中所述至少一种目的多肽包括酶。

53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。

54. 根据权利要求39-53任一项所述的方法，其中所述细胞包含一个或多个在染色体上整合的、编码所述至少一种目的多肽的多核苷酸的拷贝。

55. 根据权利要求39-54任一项所述的方法，其中所述至少一种目的多肽由从至少一种异源启动子转录的多核苷酸编码。

56. 根据权利要求55所述的方法，其中所述至少一种启动子包括人工启动子。

57. 根据权利要求56所述的方法，其中所述人工启动子包含一个或多个mRNA稳定序列，优选衍生自cryIIIa启动子。