CN110938555A

CN110938555A - 一种地衣芽孢杆菌z-1及其l-天冬酰胺酶基因与应用

Info

Publication number: CN110938555A
Application number: CN201910515173.XA
Authority: CN
Inventors: 吕凤霞; 焦琳舒; 陆兆新; 张充; 别小妹; 赵海珍
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2020-03-31

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌Z‑1及其L‑天冬酰胺酶基因与应用。本发明公开的L‑天冬酰胺酶基因来源于从土壤中筛选得到的一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）Z‑1（菌种保藏号：CGMCC NO:17310），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该L‑天冬酰胺酶具有良好的催化活力及稳定性，可有效抑制油炸食品中丙烯酰胺的生成，可从根源上控制含淀粉类食品高温加工中潜在致癌物质丙烯酰胺的产生，在食品加工领域具有广阔的应用前景。

Description

一种地衣芽孢杆菌Z-1及其L-天冬酰胺酶基因与应用

技术领域

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌Z-1及其L-天冬酰胺酶基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1，L-asparaginase)属于氨基水解酶，可以专一性地催化L-天冬酰胺形成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶在食品加工和医疗领域都有重要应用。高淀粉含量的食品如薯条、面包和油条等在高温加工过程中，L-天冬酰胺和还原糖发生美拉德反应生成潜在致癌物丙烯酰胺，L-天冬酰胺酶可以水解L-天冬酰胺，从根源上控制高热加工食品中丙烯酰胺形成。与此同时，L-天冬酰胺酶也可以应用于治疗急性淋巴细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，淋巴肉瘤及黑色素瘤等，具有广阔的应用前景。

L-天冬酰胺酶来源广泛，动物、植物和微生物均可以生产L-天冬酰胺酶。动植物来源的 L-天冬酰胺酶提取工艺复杂，产量较低，因此微生物发酵法因其周期短和易于分离纯化的特点成为生产L-天冬酰胺酶的主要方法。微生物发酵法可用来生产L-天冬酰胺酶，经过复杂分离纯化后才能用于生产，因其对酶的纯度有较高要求。大部分微生物产的天然L-天冬酰胺酶都是胞内酶，经多次传统的分离纯化方法如硫酸铵沉淀结合凝胶色谱或离子交换层析等进行纯化，且通常产量较低。而通过基因工程手段构建的重组L-天冬酰胺酶可在工程菌中大量表达，通过一步纯化达到较高纯度。因此，分离新型的L-天冬酰胺酶产生菌，并且将其在工程菌种高效表达，以获得产量高、性质好、成本低的新型酶势在必行。

发明内容

本发明的目的在于运用基因工程技术手段，从地衣芽孢杆菌Z-1的基因组DNA中克隆得到可编码L-天冬酰胺酶的基因片段ansA，实现了其在原核细胞中的高效表达，并将其应用于油炸食品中，有效抑制了油炸食品中丙烯酰胺的生成。

本发明通过基因工程技术克隆L-天冬酰胺酶基因，构建基因工程菌，获得了一种新型的重组L-天冬酰胺酶，实现L-天冬酰胺酶基因的高效表达，有效控制含淀粉类食品高温加工中潜在致癌物质丙烯酰胺的产生，在食品加工领域具有巨大的应用前景。

技术方案

本发明从江苏省某天冬酰胺生产企业排放污水口土壤中分离得到一株地衣芽孢杆菌，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Z-1，已于2019年3月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO:17310。

以上所述的地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶基因ansA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示。

所述的L-天冬酰胺酶基因ansA编码的L-天冬酰胺酶BlansA，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

以上所述的L-天冬酰胺酶BlansA的制备方法，包括以下步骤：

(1)对权利要求1所述的L-天冬酰胺酶基因ansA进行PCR扩增；

(2)构建L-天冬酰胺酶基因ansA原核表达载体；

(3)重组L-天冬酰胺酶在原核细胞中进行表达。

所述的L-天冬酰胺酶的制备方法，步骤(2)中所用表达载体为pET-28a、pET-30a、pET-32a、PCBS221或PCBS345中的任意一种。

所述的L-天冬酰胺酶的制备方法，步骤(3)中所用原核表达宿主为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

所述的L-天冬酰胺酶BlansA，其具有至少4个，优选5个，更优选5.5个pH单位宽的活性范围宽度。

所述的L-天冬酰胺酶BlansA，其具有不低于40℃，优选45℃，更优选50℃的活性温度上限。

所述的L-天冬酰胺酶在食品抑制丙烯酰胺产生中的应用。

所述的应用，具体方法为将原料浸泡在浓度为5-30IU/mL的L-天冬酰胺酶BlansA溶液中，其物料比为1:2-1:3，浸泡温度40-50℃，时间20-30min。丙烯酰胺含量可降低50-65％。

有益效果

1.本发明挖掘了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Z-1来源的L-天冬酰胺酶基因，并实现了其在原核细胞中的表达，构建了新型高产L-天冬酰胺酶的基因工程菌株。

2.将重组L-天冬酰胺酶BlansA应用于油炸食品中，经L-天冬酰胺酶处理后，有效抑制了油炸食品中丙烯酰胺的生成。

附图说明

图1为地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶基因ansA片段琼脂糖凝胶电泳图谱，其中M:DNA Marker：DS2000；1：地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶基因片段ansA；

图2为重组L-天冬酰胺酶表达纯化蛋白电泳示意图，其中M：蛋白marker；1：地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶BlansA纯化前蛋白；2：地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶BlansA纯化后蛋白

图3为重组L-天冬酰胺酶BlansA在油炸食品中的应用效果示意图。

具体实施方式：

实施例1

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Z-1L-天冬酰胺酶基因的克隆

(1)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Z-1全基因组提取：离心收集地衣芽孢杆菌 Z-1菌体，采用OMGA公司的Bacterial DNA kit试剂盒提取细菌全基因组。

(2)L-天冬酰胺酶引物设计：根据NCBI数据库中Bacillus licheniformis全基因组核酸序列中ansA基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR上下游引物F1、R1、F2、R2：

F1：5’CTTCCAGAGATGAGCTCATGAAAAAGAAAGTAGCTCTTATTACAA 3’(SacI) (SEQ IDNO.3)

R1：5’CTGCCGTTCGACGATCTCGAGGTAGCAGAATTTGTCTTTTATGCCTT 3’(XhoI) (SEQ IDNO.4)

F2：5’CTTCCAGAGATGCCNNNNNGGCATGAAAAAGAAAGTAGCTCTTAT 3’(BglII) (SEQ IDNO.5)

R2：5’CTGCCGTTCGACGATGGTACCGTAGCAGAATTTGTCTTTTATGCCTT 3’(KpnI) (SEQ IDNO.6)

(3)L-天冬酰胺酶基因的克隆：以地衣芽孢杆菌Z-1全基因组为模板，采用以上设计的引物做PCR扩增，PCR扩增体系：2×Taq Master Mix 25μL，DNA模板2μL，dd H₂O 19 μL，上下游引物各2μL；PCR扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min。采用凝胶回收试剂盒进行胶回收纯化，纯化产物与pMD19-T载体16℃连接过夜，热激法转化入感受态细胞E.coli DH5α，涂布于氨苄青霉素(Amp)抗性平板，挑取阳性转化子增菌验证(如图1所示)，送至金斯瑞南京公司测序。

用计算机软件分析测序结果,得到一个966bp的片段(如SEQ ID NO.1所示)，即不动杆菌L-天冬酰胺酶基因ansA，编码一个由321个氨基酸组成的蛋白质(如SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：重组L-天冬酰胺酶的在大肠杆菌中的表达及纯化

(1)表达载体构建：将pMD19-T-ansA和空载体酶切。用凝胶回收试剂盒回收目的片段，T₄酶16℃连接过夜，转化入感受态细胞E.coli DH5α，涂布于卡那霉素(Kana)抗性平板，挑取阳性转化子增菌，提取质粒。将质粒转化入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于Kana抗性平板，挑取阳性转化子测序。

(2)重组L-天冬酰胺酶的表达：重组菌接种于含有100μg/mL Kana的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养过夜，制成种子液。然后以1％的接种量转接到相应含抗生素的100 mLLB液体培养基中，37℃至OD值0.6-0.8之间，加入100μL的IPTG(100mg/mL)， 20℃过夜诱导表达。

(3)重组L-天冬酰胺酶的纯化：低温离心收集菌体，缓冲液悬浮菌体超声破碎，再次离心取上清得粗酶液。由于在质粒构建时目标蛋白的融合了组氨酸标签，可以采用Ni²⁺-NTA亲和柱纯化重组L-天冬酰胺酶。方法如下：

上样：样品终浓度调节至5mM咪唑以增强吸附性，过膜处理；上样之前Ni²⁺-NTA亲和柱用10个柱体积5mM咪唑缓冲液平衡；样品循环上样吸附3次；上样后先用5mM咪唑缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白，再用20mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白；

洗脱：杂蛋白洗脱后，用10倍介质体积50mM咪唑缓冲液洗脱，收集流出液即得到纯化样品，透析除去咪唑，即得到纯化后蛋白。将纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳验证，如图2所示，在35kDa有单一蛋白条带，与理论值36.6kDa相符合。

实施例3：L-天冬酰胺酶在油炸薯条中的应用

(1)薯条制作：将土豆洗净并去皮，切成长条形(5mm×5mm×70mm)，用水漂洗1 min去除表面的淀粉。将土豆条浸泡于浓度为5-30IU/mL的L-天冬酰胺酶溶液中，浸泡温度40-50℃，时间20-30min。将浸泡后的土豆条沥干后置于鼓风干燥箱内干燥，175℃预炸 1min后置于-20℃冷冻48h，175℃油炸5min后沥油冷却干燥，得到薯条。

(2)样品中游离L-天冬酰胺(L-Asn)和L-天冬氨酸(L-Asp)的提取及检测：将油炸前干燥后的土豆条粉碎，称取5g，加入浓度为50％的乙醇溶液50mL，超声30min，抽滤，将滤液在50℃下旋转蒸干有机溶剂，用0.1M HCl定容为5mL，过0.45μm滤膜，上样检测。如图3所示，随着酶处理量的增加，土豆样品中L-天冬酰胺逐渐降低，与之相应的，L-天冬氨酸含量逐渐升高。

(3)样品中丙烯酰胺的分离纯化：10g均质后的薯条(粉碎，烘干)，加入40ml正己烷脱脂，重复三次。加入50mL去离子水、50mL乙腈、20g MgSO₄和5g NaCl，振荡2 min，超声水浴30min，10000g离心10min，取乙腈层(上层)于旋转蒸发仪中将乙腈旋干，加1mL超纯水复溶，过0.22μm滤膜，上样检测。

如图3所示，其中CK表示上述(2)中油炸前干燥后的土豆(即未使用L-天冬酰胺酶处理的样品)中游离L-天冬酰胺(L-Asn)和L-天冬氨酸(L-Asp)以及丙烯酰胺的含量，可以看出，随着酶处理量的增加，薯条中的丙烯酰胺含量逐渐降低，酶浓度越高，降低丙烯酰胺的效果越显著。

实施例4：L-天冬酰胺酶抑制油炸薯条中丙烯酰胺产生的效果

经L-天冬酰胺酶处理后，油炸薯条中提取的丙烯酰胺的浓度，相较于处理前可降低50- 65％，L-天冬酰胺及L-天冬氨酸含量也相应地下降或上升，证明该酶有效抑制了油炸食品中丙烯酰胺的产生。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种地衣芽孢杆菌Z-1及其L-天冬酰胺酶基因与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶核苷酸序列(Bacillus licheniformis)

<400> 1

atgaaaaaga aagtagctct tattacaaca ggaggaacga tcgccagccg gaaaaccgaa 60

agcggcaggc ttgcggcagg ggcgatcagc ggtcctgaat tagccgaaat gtgcagcctg 120

ccggaagatg tccagatcga tgtctatccg gcgtttcagc ttccgagtat gcatattaca 180

tttcagcatt tactagaact caaacaaacc gtcgaacgcg tttttcagga cggcagctat 240

gacggcgtgg ttgtgacgca tgggacggac acgcttgaag aaaccgctta ttttttagat 300

ttaaccttgc aggatgagag gccggtcgtt gtcacaggct cacaacgagc ccccgagcag 360

caaggaacag atgcatatac aaatatcaga cacgccgttt atacagcgtg cagcccagat 420

ataaaaggag ccggcacggt cgttgttttt aacgagagga tctttaacgc gcgctacgtt 480

aaaaaagtgc acgcttcgaa tctgcagggt tttgacgtat tcggcttcgg ttacttaggg 540

attattgaca atgataaagt atatgtttat caaaagccct taaagcggga tgttcatcag 600

ctgcaaagac cgcttcctga agtggatatc gtcaaatgct atctggatgg agacggcaag 660

tttatcagag ccgctgtccg cgagggtgca gcagggatcg tccttgaagg agtcggaagg 720

ggacaggtac cgccgaatat ggtgggcgat attgagcaag ctttacatca gggcgtttat 780

atcgtcatca cgacgagcgc agaggaaggc gaagtgtata cgacctatga ctatgcgggc 840

agcagctatg acctcgcaaa aaaaggtgtc atcttaggca aggattatga cagcaaaaaa 900

gcgagaatga aactggccgt ccttcttgca agctatgaag aaggcataaa agacaaattc 960

tgctac 966

<210> 2

<211> 322

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶氨基酸序列(Bacillus licheniformis)

<400> 2

Met Lys Lys Lys Val Ala Leu Ile Thr Thr Gly Gly Thr Ile Ala Ser

1 5 10 15

Arg Lys Thr Glu Ser Gly Arg Leu Ala Ala Gly Ala Ile Ser Gly Pro

20 25 30

Glu Leu Ala Glu Met Cys Ser Leu Pro Glu Asp Val Gln Ile Asp Val

35 40 45

Tyr Pro Ala Phe Gln Leu Pro Ser Met His Ile Thr Phe Gln His Leu

50 55 60

Leu Glu Leu Lys Gln Thr Val Glu Arg Val Phe Gln Asp Gly Ser Tyr

65 70 75 80

Asp Gly Val Val Val Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu Thr Ala

85 90 95

Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Leu Gln Asp Glu Arg Pro Val Val Val Thr

100 105 110

Gly Ser Gln Arg Ala Pro Glu Gln Gln Gly Thr Asp Ala Tyr Thr Asn

115 120 125

Ile Arg His Ala Val Tyr Thr Ala Cys Ser Pro Asp Ile Lys Gly Ala

130 135 140

Gly Thr Val Val Val Phe Asn Glu Arg Ile Phe Asn Ala Arg Tyr Val

145 150 155 160

Lys Lys Val His Ala Ser Asn Leu Gln Gly Phe Asp Val Phe Gly Phe

165 170 175

Gly Tyr Leu Gly Ile Ile Asp Asn Asp Lys Val Tyr Val Tyr Gln Lys

180 185 190

Pro Leu Lys Arg Asp Val His Gln Leu Gln Arg Pro Leu Pro Glu Val

195 200 205

Asp Ile Val Lys Cys Tyr Leu Asp Gly Asp Gly Lys Phe Ile Arg Ala

210 215 220

Ala Val Arg Glu Gly Ala Ala Gly Ile Val Leu Glu Gly Val Gly Arg

225 230 235 240

Gly Gln Val Pro Pro Asn Met Val Gly Asp Ile Glu Gln Ala Leu His

245 250 255

Gln Gly Val Tyr Ile Val Ile Thr Thr Ser Ala Glu Glu Gly Glu Val

260 265 270

Tyr Thr Thr Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Ser Tyr Asp Leu Ala Lys Lys

275 280 285

Gly Val Ile Leu Gly Lys Asp Tyr Asp Ser Lys Lys Ala Arg Met Lys

290 295 300

Leu Ala Val Leu Leu Ala Ser Tyr Glu Glu Gly Ile Lys Asp Lys Phe

305 310 315 320

Cys Tyr

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr

1 5 10 15

Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala

20 25 30

Gly Cys Thr Cys Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Ala Ala

35 40 45

<210> 4

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Thr Cys

1 5 10 15

Thr Cys Gly Ala Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr

20 25 30

Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Cys Thr Thr

35 40 45

<210> 5

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Cys Cys Asn Asn

1 5 10 15

Asn Asn Asn Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Thr Ala Gly Cys Thr Cys Thr Thr Ala Thr

35 40 45

<210> 6

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ala Cys Cys Gly Thr Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr Thr

20 25 30

Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys Cys Thr Thr

35 40 45

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌Z-1，菌种保藏号为CGMCC NO:17310。

2.一种地衣芽孢杆菌Z-1L-天冬酰胺酶基因ansA，其特征在于，其来源于权利要求所述的地衣芽孢杆菌Z-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种L-天冬酰胺酶BlansA，其特征在于，其由权利要求2所述的L-天冬酰胺酶基因ansA编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求3所述的L-天冬酰胺酶BlansA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对权利要求2所述的L-天冬酰胺酶基因ansA进行PCR扩增；

（2）构建L-天冬酰胺酶基因ansA原核表达载体；

（3）重组L-天冬酰胺酶在原核细胞中进行表达。

5.根据权利要求4所述的L-天冬酰胺酶BlansA的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所用表达载体为pET-28a、pET-30a、pET-32a、PCBS221或PCBS345中的任意一种。

6.根据权利要求4所述的L-天冬酰胺酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所用原核表达宿主为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

7.根据权利要求3所述的L-天冬酰胺酶BlansA，其特征在于，其具有至少4个，优选5个，更优选5.5个pH单位宽的活性范围宽度。

8.根据权利要求3所述的L-天冬酰胺酶BlansA，其特征在于，其具有不低于40℃，优选45℃，更优选50℃的活性温度上限。

9.权利要求3所述的L-天冬酰胺酶BlansA在食品抑制丙烯酰胺产生中的应用。

10.根据权利要求9的应用，其特征在于，应用方法为将原料浸泡在浓度为20-30 IU/mL的L-天冬酰胺酶BlansA溶液中，其物料比为1:2-1:3，浸泡温度45-60℃，时间20-30 min。