CN105072919A - 用于生产烤制的咖啡豆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括用蒸汽处理原咖啡豆,随后与天冬酰胺酶进行接触。
Description
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括使原咖啡豆(rawcoffeebean)与天冬酰胺酶接触。
发明背景
熟知的是,加热的食物产品中丙烯酰胺的形成可以通过减少食物材料中的天冬酰胺的量的处理来减少,例如通过使食物材料经受天冬酰胺酶的作用(参见例如,WO2004/026042)。
在未煮的烤制咖啡研磨粉中,已测出丙烯酰胺在45和374ng/g之间的浓度(安杰耶夫斯基(Andrzejewski)D.等人,“通过LC-MS/MS针对丙烯酰胺的存在分析咖啡(AnalysisofCoffeeforthePresenceofAcrylamidebyLC-MS/MS)”,农业和食品化学杂志(JournalofAgriculturalandFoodChemistry),第52卷,第7期,2004,第1996-2002页)。
已经披露了咖啡豆的天冬酰胺酶处理以减少烤制咖啡中的丙烯酰胺含量(WO2004/037007;WO2008/151807;WO2013/005145)。
已经披露了通过用温度为135℃-140℃的蒸汽处理原咖啡豆来改进咖啡豆的品质(US5,019,413)。
发明概述
诸位发明人已发现在天冬酰胺酶处理过的烤制咖啡豆(特别是罗布斯塔咖啡豆(Robustacoffeebean))中的丙烯酰胺的形成可以通过在天冬酰胺酶处理之前使咖啡豆经受蒸汽处理来进一步减少。
因此,本发明提供了一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括:
(a)用蒸气处理原罗布斯塔咖啡豆;
(b)使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触;并且
(c)烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。
具体地而言,用温度为约100℃-115℃(例如约100℃或110℃)的蒸汽处理原咖啡豆,随后经天冬酰胺酶处理和烤制,产生了与未经如此处理的咖啡豆相比烤制的咖啡豆中低水平的丙烯酰胺。
在优选实施例中,将原罗布斯塔咖啡豆用温度为约100℃-120℃,优选约105℃-115℃的蒸气处理。
本发明还提供了一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括:
(a)用温度为约105℃-115℃的蒸汽处理原咖啡豆;
(b)使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触;并且
(c)烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。
在优选实施例中,这些咖啡豆是罗布斯塔咖啡豆。
发明的详细说明
一般认为,有两种主要的商业咖啡种类:阿拉比卡咖啡豆(来自植物小果咖啡(Coffeaarabica))和罗布斯塔咖啡豆(来自植物中粒咖啡(Coffeacanephora))。
本发明在第一方面中提供了一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括:
(a)用蒸气处理原罗布斯塔咖啡豆;
(b)使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触;并且
(c)烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。
优选地,在本发明的背景中,罗布斯塔咖啡豆是来自植物中粒咖啡的咖啡豆。
在第一方面的优选实施例中,将原罗布斯塔咖啡豆用温度为约100℃-120℃,优选约105℃-115℃的蒸气处理。
在第二方面中,本发明提供了一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括:
(a)用温度为约105℃-115℃的蒸汽处理原咖啡豆;
(b)使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触;并且
(c)烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。
在第二方面的优选实施例中,这些咖啡豆是罗布斯塔咖啡豆。
针对于本发明的两个方面,该方法将在下文中进一步详细描述。
在优选实施例中,该方法是用于生产与未经蒸汽处理随后未与天冬酰胺酶接触的烤制咖啡豆相比具有降低的丙烯酰胺水平的烤制咖啡豆。
优选地,相比于未经蒸汽处理随后未与天冬酰胺酶接触的烤制咖啡豆的丙烯酰胺含量,这些烤制咖啡豆的丙烯酰胺含量降低了至少25%,更优选至少40%,甚至更优选至少50%。
在另一个优选实施例中,该方法是用于生产与以相同方式(除了未将这些烤制咖啡豆与天冬酰胺酶接触)获得的烤制咖啡豆相比具有降低的丙烯酰胺水平的烤制咖啡豆。
优选地,与以相同方式(除了未将这些烤制咖啡豆与天冬酰胺酶接触)获得的烤制咖啡豆的丙烯酰胺含量相比,这些烤制咖啡豆的丙烯酰胺含量降低了至少10%,更优选至少25%,例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%或至少50%。
在另一个优选实施例中,该方法是用于生产与以相同方式(除了未使这些烤制的咖啡豆经受蒸汽处理)获得的烤制咖啡豆相比具有降低的丙烯酰胺水平的烤制咖啡豆。
优选地,与以相同方式(除了未使这些烤制咖啡豆经受蒸汽处理)获得的烤制咖啡豆的丙烯酰胺含量相比,这些烤制咖啡豆的丙烯酰胺含量降低了至少10%,更优选至少25%,例如至少30%、至少35%、至少40%、至少45%或至少50%。
有待用于本发明方法中的咖啡豆是原咖啡豆。原咖啡豆还可称为生咖啡豆(greencoffeebean)或未经烤制的咖啡豆。
在本发明的方法中,使原咖啡豆经受蒸汽处理。优选地,将原咖啡豆用饱和蒸汽处理。
在优选实施例中,在步骤(a)之前或期间,咖啡豆的含水量增加至从约30%w/w至约45%w/w范围的水平,例如约35%w/w。
优选地,通过蒸汽处理即在步骤(a)期间增加咖啡豆的含水量。
可替代地,咖啡豆的含水量可以通过将咖啡豆预浸泡于水中来增加,例如在约30℃-80℃的温度下,例如约60℃。
在优选实施例中,进行蒸汽处理持续约5-60分钟,优选地持续约10-30分钟,例如持续约15分钟。优选地,在已获得所希望的温度后,进行蒸汽处理持续约5-60分钟,更优选地在已获得所希望的温度后进行蒸汽处理持续约10-30分钟,例如持续约15分钟。
将经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触适当的时间间隔,允许天冬酰胺酶来发挥其作用。
该用于与天冬酰胺酶接触的时间间隔取决于各种因素。酶与天冬酰胺反应所需要的时间量将取决于如下因素,包括但不限于:天冬酰胺(并且因此丙烯酰胺)降低的希望水平、具体咖啡豆的特征(例如,豆的类型、组成、粒径)、残渣或剩余果肉的水平、生产工艺、天冬酰胺浓度、和所添加的具体的天冬酰胺酶。技术人员将能够容易地确定接触时间。优选地,允许酶反应足够的时间量以产生咖啡豆,其中该天冬酰胺的水平降低了至少约10%,优选至少约20%,更优选至少约30%,还更优选至少约40%,并且甚至更优选至少约50%。一般而言,允许酶反应的时间越长,烤制的咖啡豆中天冬酰胺降低的水平越高,并且因此丙烯酰胺降低的水平越高。
在优选实施例中,步骤中(b)中的接触持续约10-240分钟,优选持续约30-180分钟,更优选持续约45-180分钟。
允许酶反应足够的时间的步骤可以按任何适合的方式进行;例如,在一个温度下可以添加天冬酰胺酶随后逐渐升高或降低温度。
与天冬酰胺酶接触构成了天冬酰胺酶处理。
如本领域已知的,pH和温度是影响酶活性的因素。本领域技术人员应当能够容易地确定这些和其他参数(例如,含水量)的最优条件。此外,针对具体酶的最优pH和温度条件典型地可以在文献和/或从酶供应商获得。
当所使用的天冬酰胺酶是活跃的情况下,在一定温度下进行与天冬酰胺酶的接触。技术人员将能够容易地确定与天冬酰胺酶接触的温度。
在优选实施例中,步骤(b)中的接触是在约25℃-75℃,优选约50℃-70℃,例如约60℃的温度下进行。
在另一个实施例中,使用的是热稳定天冬酰胺酶,并且在步骤(b)中的接触是在较高温度下进行,例如,在约75℃-100℃的温度下。
可以将本发明背景中的热稳定酶定义为一种天冬酰胺酶,该天冬酰胺酶在70℃下孵育10分钟后具有至少75%的残余活性。
可以通过本领域中已知的任何方法,将咖啡豆与天冬酰胺酶接触,例如通过喷雾、浸泡、喷淋、或主浴。
在一个实施例中,通过将天冬酰胺酶的溶液喷雾到豆上,使咖啡豆与天冬酰胺酶接触,同时轻微的搅动豆,以便均匀地施用到所有的豆表面。
在另一个实施例中,通过将豆浸泡在天冬酰胺酶的溶液中,使咖啡豆与天冬酰胺酶接触。在接触期间可以施加轻微的搅动。
技术人员将能够确定添加至咖啡豆的天冬酰胺酶的浓度。可以将咖啡豆与浓度为约100-30,000ASNU/kg咖啡豆,优选是约500-20,000ASNU/kg咖啡豆例如约3,000ASNU/kg咖啡豆的天冬酰胺酶进行接触。
在接触后,可以通过本领域中已知的任何方法来使天冬酰胺酶失活。可以通过加热来使酶失活,因此可以同时进行可任选的失活步骤和烤制咖啡豆。热处理可以使酶变性并且失活,这样使得烤制的咖啡豆不经受持续的酶活性。
在步骤(b)后并且在步骤(c)前,可以干燥原咖啡豆。可以将原咖啡豆干燥至约5%-15%w/w的含水量,优选7%-12%w/w。干燥的适合的方法可以包括冷冻干燥、带状干燥、真空干燥、烘干、流化床干燥、及其组合。
在天冬酰胺酶处理和可任择的干燥之后,将咖啡豆进行烤制以形成烤制的咖啡豆。可以使用包括烤制的任何合适的过程。如在此使用的,术语“烤制”包括咖啡豆的任何合适的热处理以产生咖啡指示性的风味。适合的烤制技术可以包括但不限于,烤箱烤制、挤压烤制、蒸气烤制(例如,没有后烤制)、红外烤制、微波烤制、介电/感应加热烤制、及其组合。
可以将咖啡豆烤制成任何希望的烤色。该烤色可以通过不同的设备、亨特立测色仪或颜色测试来监测
可任选地研磨咖啡豆。研磨可以在任何阶段进行,例如在汽蒸之前或在烤制之前或之后。优选地,碾磨在烤制之后进行。
该烤制的咖啡豆可以照原样使用或可以用来制成多种烤制的咖啡产品,例如烤制的和磨碎的咖啡,液体浓缩物,速溶或粉末状的咖啡,咖啡饮料类(例如,热的和冷的准备饮用的咖啡、贩卖的咖啡、商业和家庭煮制的咖啡、卡鲁瓦咖啡酒(Kahlua)TM、拿铁、卡布其諾),混合咖啡(例如,拿铁混合咖啡),糖膏(例如,糖果),甜品(例如,蛋糕、冰淇淋、慕斯(mouss)、蛋奶糕),糕点(例如,丹麦酥、甜甜圈),调味汁,和汤(例如,辣酱汤(chili))。在一个实施例中,将咖啡豆进行干燥、烤制、然后研磨以形成经烤制和研磨的咖啡。
可以将根据本发明的方法生产的咖啡豆与其他咖啡豆共混。例如,可以将根据本发明生产的罗布斯塔咖啡豆与阿拉比卡咖啡豆共混,该阿拉比卡咖啡豆可以用天冬酰胺酶处理或可以不用天冬酰胺酶处理。此类共混可以在任何阶段进行,例如,在可任选的干燥之前或之后,在烤制之前或之后,和/或在可任选的研磨之前或之后。
在另一方面,本发明提供了可通过如以上所描述的本发明方法所获得的烤制的咖啡豆。
天冬酰胺酶
天冬酰胺酶在本发明的背景中意为一种具有天冬酰胺酶活性的酶,即一种催化天冬酰胺水解为天冬氨酸的酶(EC3.5.1.1)。
例如,可以根据实例中所描述的天冬酰胺酶活性(ASNU)测定来确定天冬酰胺酶活性。在一个实施例中,当在pH7并且37℃下测量时,有待用于本发明方法中的天冬酰胺酶具有SEQIDNO:1的成熟多肽的天冬酰胺酶活性的至少20%,例如,至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%。可以确定,每微克的天冬酰胺酶的天冬酰胺酶活性。
天冬酰胺酶可以从任何来源获得,例如,从微生物,从植物或从动物。
天冬酰胺酶可以从任何属的微生物获得,例如从细菌、古细菌或真菌。出于本发明的目的,如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的天冬酰胺酶是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。
它可以是一种野生型的天冬酰胺酶,即在自然界中发现的一种天冬酰胺酶;或者它可以是一种天冬酰胺酶变体,即相比衍生出它的一种亲本天冬酰胺酶,该天冬酰胺酶包含了一种改变,即在一个或多个(例如若干个)位置上的取代、插入、和/或缺失。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸;缺失意指去除占据一个位置的氨基酸;并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
该天冬酰胺酶或者它的亲本(优选该天冬酰胺酶)可以是一种细菌的天冬酰胺酶。例如,该天冬酰胺酶可以是一种革兰氏阳性细菌天冬酰胺酶,如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)天冬酰胺酶;或一种革兰氏阴性细菌天冬酰胺酶,如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)天冬酰胺酶。
在一个实施例中,该天冬酰胺酶是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)天冬酰胺酶。
在另一个实施例中,该天冬酰胺酶是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种天冬酰胺酶。
在另一个实施例中,该天冬酰胺酶是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)天冬酰胺酶。
在一个优选实施例中,该天冬酰胺酶或其亲本(优选该天冬酰胺酶)是一种真菌天冬酰胺酶。例如,该天冬酰胺酶可以是酵母天冬酰胺酶,例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)天冬酰胺酶;或丝状真菌天冬酰胺酶,例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、某真菌属(Poitrasia)、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)天冬酰胺酶。
在一个实施例中,该天冬酰胺酶是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)天冬酰胺酶。
在另一个实施例中,该天冬酰胺酶是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢菌(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、成层梭孢壳菌(Thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、或绿色木霉(Trichodermaviride)天冬酰胺酶。
将理解的是,对于以上提到的物种而言,本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物,例如无性型,而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得,如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures,CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以从其他来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该天冬酰胺酶。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该天冬酰胺酶的多核苷酸。一旦已检测出编码天冬酰胺酶的多核苷酸,可以通过利用本领域的普通技术人员已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(例如,参见,萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,分子克隆(MolecularCloning),实验手册(ALaboratoryManual),第2版,冷泉港(ColdSpringHarbor),纽约)。
在一个优选实施例中,该天冬酰胺酶或其亲本(优选该天冬酰胺酶)可从曲霉属获得,例如,从棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)或土曲霉(Aspergillusterreus)。
在另一个优选实施例中,该天冬酰胺酶或其亲本(优选该天冬酰胺酶)可从米曲霉(Aspergillusoryzae)获得,例如,SEQIDNO:1的天冬酰胺酶或其成熟多肽。在另一个优选实施例中,该天冬酰胺酶或其亲本(优选该天冬酰胺酶)可从黑曲霉(Aspergillusniger)获得,例如,SEQIDNO:2的天冬酰胺酶或其成熟多肽。
在另一个优选实施例中,该天冬酰胺酶与SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少50%的序列一致性,例如与SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。
SEQIDNO:1是来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的天冬酰胺酶的氨基酸序列。
在本发明的背景中,术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰之后处于其最终形式的多肽,这些翻译后修饰为例如N-末端加工、C-末端平截、糖基化、磷酸化、等等。本领域已知宿主细胞可以产生由相同的多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即,具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
基于N-末端测序和质谱(MS)分析,显现SEQIDNO:1的天冬酰胺酶的N-末端加工是相当多样的。在一个实施例中,基于预测SEQIDNO:1的氨基酸1至19是信号肽的SignalP(尼耳森(Nielsen)等人,1997,蛋白质工程(ProteinEngineering)10:1-6),该成熟多肽是SEQIDNO:1的氨基酸20至378。
SEQIDNO:2是来自黑曲霉(Aspergillusniger)的天冬酰胺酶的氨基酸序列。在一个实施例中,基于预测信号肽是氨基酸1-17,SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至378。
出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),赖斯(Rice)等人,2000,遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施),1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5,以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且如下计算:
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
在另一个优选实施例中,该天冬酰胺酶是一种亲本天冬酰胺酶的变体,该变体与SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少50%的序列一致性,例如与SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。
在更优选实施例中,该天冬酰胺酶是一种亲本天冬酰胺酶的变体,该变体与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少50%的序列一致性,例如与SEQIDNO:1的成熟多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。
在另一个优选实施例中,相比于SEQIDNO:1或2中的任一种的成熟多肽,该天冬酰胺酶包括至多100,优选至多80或至多50,更优选至多25、至多20、至多15、至多10或至多5个氨基酸差异。
在另一个实施例中,该天冬酰胺酶是一种热稳定天冬酰胺酶,例如,来自披露于WO2008/151807中披露的强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的天冬酰胺酶。
实例
材料与方法
天冬酰胺酶活性(ASNU)测定
天冬酰胺酶的活性能以ASNU测量。将一个天冬酰胺酶单位(ASNU)定义为在37℃和pH7.0下于具有9.2mg/ml天冬酰胺的0.1MMOPS缓冲液中在1分钟内产生1.0微摩尔的氨所需的酶量。
天冬酰胺酶将天冬酰胺水解为天冬氨酸和铵。产生的铵与α-酮戊二酸组合,以形成谷氨酸,由此NADH被氧化为NAD+。由剩余的谷氨酸脱氢酶催化该反应。通过340nm下的光度测定法测量NADH的消耗。NADH在340nm处具有吸光度,然而NAD+没有吸光度。因此对颜色的下降进行测量,并且可以将其与天冬酰胺酶活性相互关联。
相对于具有已知活性的天冬酰胺酶标准品确定活性。可以将一种具有公告活性的商用产品(像)用作标准品。
使用HPLC量化天冬酰胺和天冬氨酸
样品的天冬酰胺和天冬氨酸含量可以在赛默飞世尔(ThermoFisher)WPS3000高压液相层析系统上进行分析,该系统包括四元泵、具有温度控制的自动进样器、柱温箱和可调荧光检测器。
在自动柱前衍生化之后,分析样品。将30μL的milli-Q水、10μL的0.4M硼酸盐缓冲液pH10.2、2μL的样品、和在0.4M硼酸盐缓冲液(pH10.2)中的2μL邻苯二甲醛10g/L进行收集,并且在混合瓶中通过上下吸移来混合;添加100μL的milli-Q水,并且最后在具有相应保护柱的安捷伦zorbaxeclipseAAA柱(4.6mm乘150mm,3.5μm粒径)上注射2μL用于层析分析。
将泵设定为2ml/分钟的恒定流速,初始用20mM磷酸盐缓冲液pH7.5平衡柱,并且将天冬酰胺用从4分钟至12分钟、45%甲醇45%乙腈10%水的混合物从0%至100%的线性梯度进行洗脱。天冬酰胺衍生物的荧光在340nm的光下激发,并且在450nm处对发射值量化。通过与在从0.05g/l至0.75g/L的浓度范围内的标准天冬氨酸和天冬酰胺比较来分析样品。
实例1
采用或不采用汽蒸时对罗布斯塔咖啡豆的天冬酰胺酶处理
针对处理越南罗布斯塔豆(VietnamRobustabean)的天冬酰胺酶试验
设置
汽蒸程序
在所使用的高压釜中,只能获得20%w/w的在豆中的最终含水量,因为水/蒸汽入口不能被调整高于此水平。因此,在高压釜中进行汽蒸程序之前,引入预浸泡步骤。然而,出于既定的目的,更灵活的汽蒸设备是可商购的,在这种情况下,因为咖啡豆的含水量可以通过蒸汽处理增加至所希望的水平,所以预浸泡可以是不必要的。
预浸泡:轻轻混合5.0kg越南罗布斯塔豆+高达2.25L的自来水。进行混合,直至所有的水被豆吸收,约20-30min。
汽蒸:通过赛斯太克(Systec)XV65高压釜进行汽蒸,3号程序,汽蒸在110℃-120℃下发生持续15min。
酶处理和干燥
向5.0kg豆(初始量)添加4.5L自来水和0或3000ASNU/kg的CB,L豆,伴随在60℃下轻轻混合持续60-120分钟。缓慢添加水和酶。
在酶处理之后,在流化床中将生咖啡豆干燥至约10%w/w水,该流化床其入口温度60℃以及300m3/h的空气流量持续第一个1.5h,并且其入口温度50℃以及250m3/h的空气流量持续另一个2.5h。
烤制和丙烯酰胺分析
将来自酶影响试验的125g的干燥咖啡豆烤制至80的LRU色值。之后使用LC-MS/MS针对丙烯酰胺来分析豆。
结果
起初,在35%w/w的总含水量下(在如以上所描述的预浸泡和汽蒸期间所获得的),在110℃下对5kg的生的越南罗布斯塔豆进行汽蒸。添加0或3000ASNU/kgCB,L咖啡豆,并且允许在轻轻混合下反应120min。在干燥和烤制之后,当对照产生了3%的丙烯酰胺减少,针对于酶处理过的测量到丙烯酰胺减少达38%。在两种情况下,该减少已与相对应的没有酶的过程对照进行了比较。
然后将酶处理的时间从120min减少至60min;其他参数保持恒定。后者产生了33%的丙烯酰胺含量减少。随后,测试了将汽蒸温度从110℃增加至120℃的测验。出人意料地,目前所获得的丙烯酰胺减少只有4%。
3号和4号显示出了没有前面的汽蒸步骤时天冬酰胺酶处理几乎不能导致任何丙烯酰胺的减少。将5号和6号与7号和8号相比显示出了汽蒸温度对于丙烯酰胺减少很重要。将针对具有35%含水量的5号和6号的生的(未经烤制的)豆的丙烯酰胺水平与10号(其中在照原样具有8%含水量的生豆上进行汽蒸)相比显示出了含水量是重要的。当将具有低含水量的生豆进行蒸汽处理时,在烤制之前测量到了140ppb的丙烯酰胺。在蒸汽处理期间所获得的丙烯酰胺将不能通过后续天冬酰胺酶处理来减少。
实例2
采用或不采用汽蒸时对阿拉比卡咖啡豆的天冬酰胺酶处理
在酶处理之前在采用或不采用汽蒸时,对5g规模的、经天冬酰胺酶处理的阿拉比卡豆进行测试。在这种情况下,只有天冬酰胺减少被监测到;然而众所周知用于丙烯酰胺减少的主要前体是天冬酰胺。
在2010年,从CR3(CR3-KaffeeveredelungM.HermsenGmbH,不莱梅(Bremen),德国)获得了未洗的生的阿拉比卡咖啡豆。以实验室规模在采用或不采用天冬酰胺酶CB,L以及采用或不采用汽蒸时,对它们进行测试。
在被嵌入蒸汽锅炉(该蒸汽锅炉含有1L的沸腾的去离子水)中的小线篓中,在100℃下,将具有6.5%含水量的5.0g未洗的生的阿拉比卡咖啡豆的部分汽蒸45分钟。在汽蒸之后,对被吸收的水的量进行定量确定。然后将豆添加至4.2ml的加热的去离子水(60℃),该去离子水包含0ASNU的CB,L/kg或3000ASNU/kg的CB,L。仅将豆的其他5g部分添加至4.2ml的加热的去离子水(60℃),该去离子水包含0ASNU的CB,L/kg或3000ASNU/kg的CB,L。以四个重复对所有的剂量进行测试。将这些样品在60℃下孵育45分钟,伴随20rpm的搅拌速度。在45-60分钟之后,水完全由豆吸收。
研磨相应于5g的初始干的生豆的量;添加盐酸以使酶失活并且用于萃取天冬酰胺。在萃取之后,过滤这些豆,并且保持在-18℃直至进一步分析。
使用高压液相层析系统分析天冬酰胺含量,通过柱前衍生化分析氨基酸,并且将荧光量化。
当使用阿拉比卡咖啡豆时,在不采用前面的汽蒸步骤时,观察到了显著的酶诱导的天冬酰胺减少。
Claims (15)
1.一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括:
(a)用蒸气处理原罗布斯塔咖啡豆;
(b)使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触;并且
(c)烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。
2.如权利要求1所述的方法,其中将这些原罗布斯塔咖啡豆用温度为约100℃-120℃,优选约105℃-115℃的蒸汽处理。
3.一种用于生产烤制的咖啡豆的方法,该方法包括:
(a)用温度为约105℃-115℃的蒸汽处理原咖啡豆;
(b)使这些经蒸汽处理的原咖啡豆与天冬酰胺酶接触;并且
(c)烤制这些经天冬酰胺酶处理的原咖啡豆。
4.如权利要求3所述的方法,其中这些咖啡豆是罗布斯塔咖啡豆。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(a)之前或期间,将这些咖啡豆的含水量增加至从约30%w/w至约45%w/w范围的水平,例如约35%w/w。
6.如权利要求5所述的方法,其中这些咖啡豆的含水量是通过蒸汽处理来增加的。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(a)进行约5-60分钟,优选约10-30分钟,例如约15分钟。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(b)中的接触是持续约10-240分钟,优选地持续约30-180分钟,更优选地持续约45-180分钟。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(b)是通过与浓度为约100-30,000ASNU/kg咖啡豆,优选约500-20,000ASNU/kg咖啡豆例如约3,000ASNU/kg咖啡豆的天冬酰胺酶接触来进行的。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(b)之后且在步骤(c)之前,将这些原咖啡豆干燥至含水量为约5%-15%w/w,优选7%-12%w/w。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤(c)之后,研磨这些咖啡豆。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该天冬酰胺酶是获得自曲霉属,优选米曲霉或黑曲霉,或是从曲霉属优选米曲霉或黑曲霉中获得的亲本天冬酰胺酶的变体。
13.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中相比于SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽,该天冬酰胺酶包括至多100,优选至多80或至多50,更优选至多25、至多20、至多15、至多10或至多5个氨基酸差异。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该天冬酰胺酶与SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少50%的序列一致性,例如与SEQIDNO:1或2中的任一个的成熟多肽具有至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列一致性。
15.如以上权利要求中任一项所述的方法,其中该天冬酰胺酶是一种热稳定天冬酰胺酶。
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