BR112015024158B1

BR112015024158B1 - método para produção de grãos de café torrados

Info

Publication number: BR112015024158B1
Application number: BR112015024158-1A
Authority: BR
Inventors: Gitte Budolfsen Lynglev; Susanne Schoesler
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2014-03-20
Publication date: 2021-01-12
Also published as: NZ711527A; EP2975948A1; DK2975948T3; BR112015024158A2; CA2903352C; WO2014147189A1; US20160295877A1; EP2975948B1; AU2014234286B2; CN105072919A; CA2903352A1; AU2014234286A1

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE GRÃOS DE CAFÉ TORRADOS A presente invenção se relaciona com um método para produção de grãos de café torrados que compreende tratamento de grãos de café crus com vapor seguido por contato com asparaginase

Description

[001] Este pedido contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.

ÁREA DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se relaciona com um método para produção de grãos de café torrados que compreende contato de grãos de café crus com asparaginase.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] É bem conhecido que a formação de acrilamida em produtos alimentares aquecidos pode ser reduzida por um tratamento reduzindo a quantidade de asparagina nos materiais alimentares, tal como por sujeição dos materiais alimentares à ação da enzima asparaginase (ver, p.ex., WO2004/026042).

[004] Em borras de café torradas puras foram medidas concentrações de acrilamida entre 45 e 374 ng/g (Andrzejewski D. et al. "Analysis of Coffee for the Presence of Acrylamide by LC- MS/MS", Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 52, No. 7, 2004, pp. 1996-2002).

[005] O tratamento com asparaginase de grãos de café para reduzir o conteúdo de acrilamida em café torrado foi divulgado (WO2004/037007; WO2008/151807; WO2013/005145).

[006] A melhoria da qualidade de grãos de café por tratamento dos grãos de café crus com vapor a uma temperatura de 135-140 °C foi divulgada (US5,019,413).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] Os presentes inventores descobriram que a formação de acri- lamida em grãos de café torrados tratados com asparaginase, em particular grãos de café Robusta, pode ser adicionalmente reduzida por sujeição dos grãos de café a um tratamento com vapor antes do tratamento com asparaginase.

[008] A invenção proporciona portanto um método para produção de grãos de café torrados compreendendo: (a) tratamento de grãos de café Robusta crus com vapor; (b) contato dos grãos de café crus tratados com vapor com uma aspara-ginase; e (c) torrefação dos grãos de café crus tratados com asparaginase.

[009] Em particular, o tratamento dos grãos de café crus com vapor a uma temperatura de cerca de 100-115 °C, tal como cerca de 100 °C ou 110 °C, seguido por tratamento com asparaginase e torrefação resulta em um baixo nível de acrilamida nos grãos de café torrados em comparação com grãos de café que não foram sujeitos a tal tratamento.

[010] Em uma forma de realização preferencial, os grãos de café Robusta crus são tratados com vapor a uma temperatura de cerca de 100120 °C, preferencialmente cerca de 105-115 °C.

[011] A invenção proporciona também um método para produção de grãos de café torrados compreendendo: (a) tratamento de grãos de café crus com vapor a uma temperatura de cerca de 105-115 °C; (b) contato dos grãos de café crus tratados com vapor com uma aspara-ginase; e (c) torrefação dos grãos de café crus tratados com asparaginase. Em uma forma de realização preferencial, os grãos de café são grãos de café Robusta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[012] É geralmente reconhecido que existem duas espécies de café comerciais principais: Grãos de café Arabica (da planta Coffea arabica) e grãos de café Robusta (da planta Coffea canephora).

[013] A invenção proporciona em um primeiro aspeto um método para produção de grãos de café torrados compreendendo: (a) tratamento de grãos de café Robusta crus com vapor; (b) contato dos grãos de café crus tratados com vapor com uma aspara-ginase; e (c) torrefação dos grãos de café crus tratados com asparaginase.

[014] Preferencialmente, no contexto da presente invenção, os grãos de café Robusta são grãos de café da planta Coffea canephora.

[015] Em uma forma de realização preferencial do primeiro aspeto, os grãos de café Robusta crus são tratados com vapor a uma temperatura de cerca de 100-120 °C, preferencialmente cerca de 105-115 °C.

[016] Em um segundo aspeto, a presente invenção proporciona um método para produção de grãos de café torrados compreendendo: (a) tratamento de grãos de café crus com vapor a uma temperatura de cerca de 105-115 °C; (b) contato dos grãos de café crus tratados com vapor com uma aspara-ginase; e (c) torrefação dos grãos de café crus tratados com asparaginase.

[017] Em uma forma de realização preferencial do segundo aspeto, os grãos de café são grãos de café Robusta.

[018] Para ambos os aspetos da invenção, o método é descrito em detalhe adicional no que se segue.

[019] Em uma forma de realização preferencial, o método é para produção de grãos de café torrados tendo um nível de acrilamida reduzido em comparação com grãos de café torrados que não foram sujeitos a tratamento com vapor seguido por contato com uma asparaginase.

[020] Preferencialmente, o conteúdo de acrilamida dos grãos de café torrados é reduzido em pelo menos 25 %, mais preferencialmente em pelo menos 40 %, ainda mais preferencialmente em pelo menos 50 %, em comparação com o conteúdo de acrilamida de grãos de café torrados que não foram sujeitos a tratamento com vapor seguido por contato com uma asparaginase.

[021] Em outra forma de realização preferencial, o método é para produção de grãos de café torrados tendo um nível de acrilamida reduzido em comparação com grãos de café torrados obtidos do mesmo modo exceto que não foram contatados com uma asparaginase.

[022] Preferencialmente, o conteúdo de acrilamida dos grãos de café torrados é reduzido em pelo menos 10 %, mais preferencialmente em pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 % ou pelo menos 50 %, em comparação com o conteúdo de acrilamida de grãos de café torrados obtidos do mesmo modo exceto que não foram contatados com uma asparaginase.

[023] Em outra forma de realização preferencial, o método é para produção de grãos de café torrados tendo um nível de acrilamida reduzido em comparação com grãos de café torrados obtidos do mesmo modo exceto que não foram sujeitos a tratamento com vapor.

[024] Preferencialmente, o conteúdo de acrilamida dos grãos de café torrados é reduzido em pelo menos 10 %, mais preferencialmente em pelo menos 25 %, tal como pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 % ou pelo menos 50 %, em comparação com o conteúdo de acrilamida de grãos de café torrados obtidos do mesmo modo exceto que não foram sujeitos a tratamento com vapor.

[025] Os grãos de café a serem usados no método da invenção são grãos de café crus. Os grãos de café crus podem ser também referidos como grãos de café imaturos ou grãos de café não torrados.

[026] No método da invenção, os grãos de café crus são sujeitos a um tratamento com vapor. Preferencialmente, os grãos de café crus são tratados com vapor saturado.

[027] Em uma forma de realização preferencial, antes do ou durante o passo (a), o conteúdo de água dos grãos de café é aumentado até um nível de cerca de 30 % p/p a cerca de 45 % p/p tal como cerca de 35 % p/p.

[028] Preferencialmente, o conteúdo de água dos grãos de café é aumentado pelo tratamento com vapor, /.e., durante o passo (a).

[029] Alternativamente, o conteúdo de água dos grãos de café pode ser aumentado por pré-embebição dos grãos de café em água, p.ex., a uma temperatura de cerca de 30-80 °C tal como cerca de 60 °C.

[030] Em uma forma de realização preferencial, o tratamento com vapor é realizado durante cerca de 5-60 minutos, preferencialmente durante cerca de 10-30 minutos tal como durante cerca de 15 minutos. Preferencialmente, o tratamento com vapor é realizado durante cerca de 5-60 minutos após a temperatura desejada ter sido obtida, mais preferencialmente durante cerca de 10-30 minutos tal como durante cerca de 15 minutos após a temperatura desejada ter sido obtida.

[031] Os grãos de café crus tratados com vapor são para ser contatados com uma asparaginase durante um intervalo de tempo apropriado permitindo que a asparaginase exerça a sua ação.

[032] O intervalo de tempo para o contato com a asparaginase depende de vários fatores. A quantidade de tempo necessária para que a enzima reaja com a asparaginase dependerá de fatores incluindo o, mas não se limitando ao, nível desejado de redução de asparagina (e logo acrilami- da), as características dos grãos de café particulares (p.ex., tipos de grãos, composição, tamanho das partículas), nível de detritos ou polpa remanescente, o processo de produção, a concentração de asparagina, e a asparaginase particular adicionada. A pessoa perita será prontamente capaz de determinar o tempo de contato. Preferencialmente se permite que a enzima reaja durante uma quantidade de tempo suficiente para resultar em grãos de café em que o nível de asparagina é reduzido em pelo menos cerca de 10 %, preferencialmente pelo menos cerca de 20 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 30 %, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 40 %, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 50 %. Em geral, quanto mais se permite que a enzima reaja, maior o nível de redução da asparagina e logo maior o nível de redução da acrilamida nos grãos de café torrados.

[033] Em uma forma de realização preferencial, o contato no passo (b) é durante cerca de 10-240 minutos, preferencialmente durante cerca de 30-180 minutos, mais preferencialmente durante cerca de 45-180 minutos.

[034] O passo de permitir um tempo suficiente para que a enzima reaja pode ser levado a cabo de qualquer modo adequado; por exemplo, a asparaginase pode ser adicionada a uma temperatura seguido por um aumento ou diminuição gradual na temperatura.

[035] O contato com a asparaginase constitui o tratamento com asparaginase.

[036] Como é conhecido na técnica, o pH e a temperatura são fatores que afetam a atividade enzimática. Um perito na técnica deve ser prontamente capaz de determinar condições ótimas destes e outros parâmetros (p.ex., conteúdo de água). Adicionalmente, condições de pH e temperatura ótimas para enzimas específicas estão tipicamente disponíveis na literatura e/ou de fornecedores de enzimas.

[037] O contato com a asparaginase é para ser realizado a uma temperatura onde a enzima asparaginase usada está ativa. A pessoa perita será prontamente capaz de determinar a temperatura para o contato com a asparaginase.

[038] Em uma forma de realização preferencial, o contato no passo (b) é realizado a uma temperatura de cerca de 25-75 °C, preferencialmente cerca de 50-70 °C tal como cerca de 60 °C.

[039] Em outra forma de realização é usada uma asparaginase ter- moestável e o contato no passo (b) é realizado a uma temperatura mais elevada, p.ex., a uma temperatura de cerca de 75-100 °C.

[040] Uma enzima termoestável no contexto da presente invenção pode ser definida como uma asparaginase, a qual após incubação a 70 °C durante 10 minutos tem uma atividade residual de pelo menos 75 %.

[041] Os grãos de café podem ser contatados com a asparaginase por qualquer método conhecido na técnica, tal como por pulverização, em- bebição, aspersão, ou banho dominante.

[042] Em uma forma de realização, os grãos de café são contatados com asparaginase por pulverização de uma solução da asparaginase nos grãos em conjunto com agitação suave dos grãos de modo a criar uma aplicação uniforme a todas as superfícies dos grãos.

[043] Em outra forma de realização, os grãos de café são contatados com asparaginase por embebição dos grãos em uma solução da asparaginase. Pode ser aplicada uma agitação suave durante o contato.

[044] A pessoa perita será capaz de determinar a concentração à qual a asparaginase é para ser adicionada aos grãos de café. Os grãos de café podem ser contatados com asparaginase a uma concentração de cerca de 100-30.000 ASNU/kg de grãos de café, preferencialmente cerca de 500-20.000 ASNU/kg de grãos de café tal como cerca de 3.000 ASNU/kg de grãos de café.

[045] Após o contato, a asparaginase pode ser desativada por qualquer método conhecido na técnica. A desativação da enzima pode ocorrer através de aquecimento, logo o passo de desativação opcional e torrefação dos grãos de café podem ser levados a cabo simultaneamente. O processamento com calor pode desnaturar e inativar a enzima tal que os grãos de café torrados não sejam sujeitos a atividade enzimática continuada.

[046] Após o passo (b) e antes do passo (c), os grãos de café crus podem ser secos. Os grãos de café crus podem ser secos até um conteúdo de água de cerca de 5-15 % p/p, preferencialmente 7-12 % p/p. Métodos de secagem adequados podem incluir liofilização, secagem com correias, secagem em vácuo, secagem no forno, secagem em leito fluidizado, e suas combinações.

[047] Após o tratamento com asparaginase e a secagem opcional, os grãos de café são torrados para formar grãos de café torrados. Pode ser usado qualquer processo adequado compreendendo torrefação. Como usado aqui, o termo "torrefação" inclui qualquer tratamento térmico ade- quado de grãos de café para criar sabores que são indicativos de café. Técnicas de torrefação adequadas podem incluir, mas não estão limitadas a, torrefação em forno, torrefação por extrusão, torrefação com vapor (p.ex., com nenhuma pós-torrefação), torrefação com infravermelhos, torrefação com micro-ondas, torrefação com aquecimento por indução/dielétrico, e suas combinações. Os grãos de café podem ser torrados até qualquer cor de torrefação desejada. A cor de torrefação pode ser monitorizada por diferente equipamento, Hunterlab ou Teste de Cor.

[048] Os grãos de café podem ser opcionalmente triturados. A trituração pode ser realizada em qualquer etapa tal como antes da cozedura a vapor ou antes da ou após a torrefação. Preferencialmente, a trituração é realizada após torrefação.

[049] Os grãos de café torrados podem ser usados como tal ou podem ser usados para fazer uma variedade de produtos de café torrado, tais como cafés torrados e triturados, concentrados líquidos, cafés instantâneos ou em pó, bebidas de café (p.ex., cafés prontos a servir quentes e frios, cafés para venda, cafés comerciais e torrados em casa, Kahlua™, lattes, cappuccinos), misturas (p.ex., misturas de café e latte), confeitaria (p.ex., doce), sobremesas (p.ex., bolos, gelados, mousses, custards), pastelaria (p.ex., danish, donuts), molhos, e sopas (p.ex., malagueta). Em uma forma de realização, os grãos de café são secos, torrados, depois triturados para formar café torrado e triturado.

[050] Os grãos de café produzidos de acordo com o método da invenção podem ser combinados com outros grãos de café. P.ex., os grãos de café Robusta produzidos de acordo com a invenção podem ser combinados com grãos de café Arabica que podem ou não ter sido tratados com asparaginase. Tal combinação pode ser realizada em qualquer etapa, p.ex., antes da ou após a secagem opcional, antes de ou após torrefação, e/ou antes de ou após trituração opcional.

[051] Em outro aspeto, a invenção proporciona grãos de café torrados obteníveis por um método da invenção como descrito acima.

Asparaginase

[052] Uma asparaginase no contexto da presente invenção significa uma enzima tendo atividade de asparaginase, /.e., uma enzima que catalisa a hidrólise de asparagina em ácido aspártico (EC 3.5.1.1).

[053] A atividade de asparaginase pode, p.ex., ser determinada de acordo com o ensaio de atividade de asparaginase (ASNU) descrito nos Exemplos. Em uma forma de realização, uma asparaginase a ser usada no método da presente invenção tem pelo menos 20 %, p.ex., pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de asparaginase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 quando medida a pH 7 e a 37 °C. A atividade de asparaginase pode ser determinada por micrograma de enzima asparaginase.

[054] A asparaginase pode ser obtida de qualquer fonte, p.ex., de um microrganismo, de uma planta ou de um animal.

[055] A asparaginase pode ser obtida de um microrganismo de qualquer gênero, p.ex., de uma bactéria, uma arqueobactéria ou um fungo. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que a asparaginase codificada por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido.

[056] Pode ser uma asparaginase de tipo selvagem, i.e., uma asparaginase encontrada na natureza, ou pode ser uma asparaginase variante, i.e., uma asparaginase compreendendo uma alteração, i.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (p.ex., várias) posições em comparação com uma asparaginase genitora da qual pode ter sido derivada. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição.

[057] A asparaginase ou seu genitor, preferencialmente a asparaginase, pode ser uma asparaginase bacteriana. Por exemplo, a asparaginase pode ser uma asparaginase bacteriana Gram-positiva tal como uma asparaginase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Strep- tomyces, ou uma asparaginase bacteriana Gram-negativa tal como uma asparaginase de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Urea- plasma.

[058] Em uma forma de realização, a asparaginase é uma asparaginase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thu- ringiensis.

[059] Em outra forma de realização, a asparaginase é uma asparaginase de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[060] Em outra forma de realização, a asparaginase é uma asparaginase de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Strep- tomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[061] Em uma forma de realização preferencial, a asparaginase ou seu genitor, preferencialmente a asparaginase, é uma asparaginase fúngica. Por exemplo, a asparaginase pode ser uma asparaginase de levedura tal como uma asparaginase de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccha- romyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou uma asparaginase fúngica filamentosa tal como uma asparaginase de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaeto- midium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptoter- mes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasi- dium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophtho- ra, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypo- cladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

[062] Em uma forma de realização, a asparaginase é uma asparaginase de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Sac- charomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyve- ri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis.

[063] Em outra forma de realização, a asparaginase é uma asparaginase de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awa- mori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, As-pergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium que- enslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmo- rum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotri- chioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichotheci- oides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neu- rospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phane- rochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thie- lavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspo- ra, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spe- dedonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma har- zianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[064] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, p.ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[065] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[066] A asparaginase pode ser identificada e obtida de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.). Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando a asparaginase pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Logo que tenha sido detectado um polinucleotídeo codificando uma asparaginase, o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles com perícia ordinária na técnica (ver, p.ex., Sambrook et a/., 1989, Mo/ecu/ar C/oning, A Laboratory Manua/, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[067] Em uma forma de realização preferencial, a asparaginase ou seu genitora, preferencialmente a asparaginase, é obtida de Aspergi//us, p.ex., de Aspergi//us acu/eatus, Aspergi//us awamori, Aspergi//us foetidus, Aspergi//us fumigatus, Aspergi//us japonicus, Aspergi//us nidu/ans, Asper- gi//us niger, Aspergi//us oryzae ou Aspergi//us terreus.

[068] Em outra forma de realização preferencial, a asparaginase ou seu genitor, preferencialmente a asparaginase, é obtida de Aspergi//us oryzae, p.ex., a asparaginase de SEQ ID NO: 1 ou o seu polipeptídeo maduro. Em outra forma de realização preferencial, a asparaginase ou seu genitor, preferencialmente a asparaginase, é obtida de Aspergi//us niger, p.ex., a asparaginase de SEQ ID NO: 2 ou o seu polipeptídeo maduro.

[069] Em outra forma de realização preferencial, a asparaginase tem pelo menos 50 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer um de SEQ ID NOs: 1 ou 2, tal como pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer um de SEQ ID NOs: 1 ou 2.

[070] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de asparaginase de Aspergillus oryzae.

[071] No contexto da presente invenção, o termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo na sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, trun- cação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipep- tídeos maduros diferentes (i.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N- terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[072] Com base na sequenciação N-terminal e análise de espectro- metria de massa (MS) parece que o processamento N-terminal da asparaginase de SEQ ID NO: 1 é relativamente heterogêneo. Em uma forma de realização, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 20 a 378 de SEQ ID NO: 1 com base em SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 1 são um peptí- deo sinal.

[073] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos de asparaginase de Aspergillus niger. Em uma forma de realização, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é os aminoácidos 18 a 378 de SEQ ID NO: 2 com base em o peptídeo sinal previsto ser os aminoácidos 1-17.

[074] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[075] Em outra forma de realização preferencial, a asparaginase é uma variante de uma asparaginase genitora tendo pelo menos 50 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer um de SEQ ID NOs: 1 ou 2, tal como pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96%, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de qualquer um de SEQ ID NOs: 1 ou 2.

[076] Em uma forma de realização mais preferencial, a asparaginase é uma variante de uma asparaginase genitora tendo pelo menos 50 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NOs: 1, tal como pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[077] Em outra forma de realização preferencial, a asparaginase compreende no máximo 100, preferencialmente no máximo 80 ou no máximo 50, mais preferencialmente no máximo 25, no máximo 20, no máximo 15, no máximo 10 ou no máximo 5 diferenças de aminoácidos em comparação com o polipeptídeo maduro de qualquer um de SEQ ID NOs: 1 ou 2.

[078] Em outra forma de realização, a asparaginase é uma asparaginase termoestável, p.ex., a asparaginase de Pyrococcus furiosus divulgada em WO2008/151807.

EXEMPLOS Materiais e métodos Ensaio de atividade de asparaginase (ASNU)

[079] A atividade de asparaginase pode ser medida em ASNU. Uma unidade de asparaginase (ASNU) é definida como a quantidade de enzima necessária para gerar 1,0 micromole de amônia em 1 minuto a 37 °C e pH 7,0, em tampão MOPS a 0,1 M com 9,2 mg/mL de asparagina.

[080] A asparaginase hidrolisa a asparagina em ácido aspártico e amônio. O amônio produzido é combinado com α-cetoglutarato para formar ácido glutâmico por meio do que NADH é oxidado em NAD+. A reação é catalisada por um excedente de glutamato desidrogenase. O consumo de NADH é medido por fotometria a 340 nm. NADH tem uma absorvância a 340 nm, enquanto NAD+ não tem absorvância. Uma diminuição na cor é assim medida, e pode ser correlacionada com atividade de asparaginase.

[081] A atividade é determinada em relação a um padrão de asparaginase de atividade conhecida. Um produto comercial tendo uma atividade declarada como Acrylaway® pode ser usado como padrão. Quantificação de asparagina e ácido aspártico usando HPLC

[082] O conteúdo de asparagina e ácido aspártico de amostras pode ser analisado em um sistema de cromatografia líquida de elevada pressão WPS3000 da ThermoFisher compreendendo uma bomba quaternária, um autoamostrador com controle de temperatura, um forno de coluna e um detector de fluorescência ajustável.

[083] As amostras são analisadas após derivatização pré-coluna automatizada. 30 μL de água milli-Q, 10 μL de tampão borato a 0,4 M pH 10,2, 2 μL de amostra, e 2 μL de orto-ftalaldeído a 10 g/L em tampão borato a 0,4 M pH 10,2 são coletados e misturados por pipetagem para cima e para baixo em um frasco de mistura; 100 μL de água milli-Q são adicionados, e 2 μL são finalmente injetados para análise cromatográfica em uma coluna zorbax eclipse AAA da Agilent (4,6 mm por 150 mm, tamanho das partículas 3,5 μm) com a coluna guarda correspondente.

[084] A bomba é definida para um caudal constante de 2 mL/minuto, a coluna é inicialmente equilibrada com tampão fosfato a 20 mM pH 7,5 e a asparagina é eluída com um gradiente linear de 4 minutos a 12 minutos de 0 % a 100 % de uma mistura de metanol a 45 %, acetonitrila a 45 % e água a 10 %. A fluorescência do derivado de asparagina é excitada com luz a 340 nm e a emissão é quantificada a 450 nm. As amostras são analisadas por comparação com ácido aspártico e asparagina padrão na gama de concentrações de 0,05 g/L a 0,75 g/L. Exemplo 1 Tratamento com asparaginase de grãos de café Robusta com e sem cozedura a vapor Instalação piloto de asparaginase para tratamento de grãos Robusta do Vietnã Procedimento de cozedura a vapor

[085] Na autoclave usada se poderia somente obter um conteúdo de água final nos grãos de 20 % p/p pois a entrada de água/vapor não poderia ser ajustada acima deste nível. Portanto era introduzido um passo de pré- embebição antes do procedimento de cozedura a vapor levado a cabo na autoclave. No entanto, para o dado propósito, equipamento de cozedura a vapor mais flexível está comercialmente disponível, caso em que a pré- embebição pode não ser necessária uma vez que o conteúdo de água dos grãos de café pode ser aumentado até ao nível desejado pelo tratamento com vapor.

[086] Pré-embebição: 5,0 kg de grãos Robusta do Vietnã + até 2,25 L de água da torneira foram suavemente misturados. A mistura procedeu até toda a água ter sido absorvida pelos grãos, aprox. 20-30 min.

[087] Cozedura a vapor: A cozedura foi levada a cabo por uma Autoclave XV 65 da Systec, programa no. 3, a cozedura a vapor teve lugar a 110-120 °C durante 15 min. Tratamento com enzima e secagem

[088] A 5,0 kg de grãos (quantidade original), 4,5 L de água da torneira e 0 ou 3000 ASNU/kg de grãos de Acrylaway® CB, L foram adicionados sob mistura suave a 60 °C durante 60-120 minutos. Água e enzima são lentamente adicionadas. Após o tratamento com enzima, os grãos de café imaturos foram secos até cerca de 10 % p/p de água em um leito fluidizado com uma temperatura de entrada de 60 °C e com um fluxo de ar de 300 m3/h durante as primeiras 1,5 h e com uma temperatura de entrada de 50 °C e um fluxo de ar de 250 m3/h durante 2,5 h adicionais. Torrefação e análise de Acrilamida

[089] 125 g dos grãos de café secos do ensaio de efeito de enzima foram torrados até valor de cor LRU de 80. De seguida, os grãos foram analisados quanto a Acrilamida usando LC-MS/MS. Resultados

[090] Inicialmente, 5 kg de grãos Robusta do Vietnã foram cozidos a vapor a 110 °C a 35 % p/p de conteúdo de água total (obtido durante pré- embebição e cozedura a vapor como descrito acima). 0 ou 3000 ASNU/kg de grãos de café de Acrylaway® CB, L foram adicionados e se permitiu que reagissem durante 120 min sob mistura suave. Após secagem e torrefação, a mitigação da acrilamida foi medida até 38 % para os tratados com enzima enquanto o controle resultou em uma mitigação da acrilamida de 3 %. Em ambos os casos, a redução foi comparada com o controle de processo correspondente sem enzima.

[091] O tempo para o tratamento com enzima foi depois reduzido de 120 min para 60 min; os outros parâmetros foram mantidos constantes. Este último resultou em uma mitigação do conteúdo de acrilamida de 33 %. Subsequentemente, o teste de aumento da temperatura de cozedura a vapor de 110 até 120 °C foi testado. Surpreendentemente, a mitigação da acrilamida obtida agora foi somente 4 %.

[092] Os nos. 3 e 4 mostram que o tratamento com asparaginase sem o passo de cozedura a vapor prévio não dá quase nenhuma redução da acrilamida. A comparação dos no.s 5 e 6 com os no.s 7 e 8 mostra que a temperatura de cozedura a vapor é importante para a mitigação da acrilamida. A comparação do nível de acrilamida dos grãos imaturos (não torrados) para os no.s 5 e 6 tendo um conteúdo de água de 35 % com no. 10 onde é realizada a cozedura a vapor em grãos imaturos como tal tendo um conteúdo de água de 8 % mostra que o conteúdo de água é importante. Quando grãos imaturos tendo um baixo conteúdo de água foram tratados com vapor, 140 ppb de acrilamida foram medidos antes da torrefação. A acrilamida formada durante o tratamento com vapor não será reduzida pelo tratamento com asparaginase subsequente. Exemplo 2 Tratamento com asparaginase de grãos de café Arabica com e sem cozedura a vapor

[093] Grãos Arabica tratados com asparaginase à escala de 5 g foram testados com e sem o passo de cozedura a vapor antes do tratamento com enzima. Em este caso, somente a redução da asparagina foi monitorizada; no entanto é bem conhecido que o principal precursor da mitigação da acrilamida é a asparagina.

[094] Grãos de café Arabica imaturos não lavados foram obtidos da CR3 (CR3 - Kaffeeveredelung M. Hermsen GmbH, Bremen, Alemanha) em 2010. Estes foram testados à escala laboratorial com e sem a asparaginase, Acrylaway® CB, L e com e sem cozedura a vapor.

[095] Porções de 5 g de grãos de café Arabica imaturos não lavados, com um conteúdo de água de 6,5 % p/p, foram cozidos a vapor durante 45 minutos a 100 °C em pequenos cestos de fios inseridos em uma caldeira a vapor contendo 1 L de água desionizada em ebulição. Após cozedura a vapor, a quantidade de água absorvida foi quantitativamente determinada. Os grãos foram depois adicionados a 4,2 mL de água desionizada aquecida (60 °C) contendo ou 0 ASNU de Acrylaway® CB, L/kg ou 3000 ASNU/kg de Acrylaway® CB, L. Outras porções de 5 g de grãos foram somente adicionadas a 4,2 mL de água desionizada aquecida (60 °C) contendo ou 0 ASNU de Acrylaway® CB, L/kg ou 3000 ASNU/kg de Acrylaway® CB, L. Todas as dosagens foram testadas em quatro replicados. As amostras foram incubadas a 60 °C durante 45 minutos com uma velocidade de agitação de 20 rpm. Após 45-60 minutos, a água foi completamente absorvida pelos grãos.

[096] Uma quantidade correspondente a 5 g dos grãos imaturos secos originais foi triturada; ácido clorídrico foi adicionado para inativar a enzima e para extração de asparagina. Após extração, os grãos foram filtrados e mantidos a -18 °C até análise adicional.

[097] O conteúdo de asparagina foi analisado usando um sistema de cromatografia líquida de elevada pressão, os aminoácidos foram analisados por derivatização pré-coluna e a fluorescência foi quantificada.

[098] Quando se usam grãos de café Arabica é observada redução de asparagina induzida por enzima significativa também sem um passo prévio de cozedura a vapor.

Claims

1. Método para produção de grãos de café torrados caracterizado por compreender: (a) tratamento de grãos de café Robusta com vapor a uma temperatura de 105 a 115°C; (b) contato dos grãos de café crus tratados com vapor com uma asparaginase; e (c) torrefação dos grãos de café crus tratados com asparaginase.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, antes do ou durante o passo (a), o conteúdo de água dos grãos de café ser aumentado até um nível de 30 % p/p a 45 % p/p tal como 35 % p/p.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o conteúdo de água dos grãos de café ser aumentado pelo tratamento com vapor.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o passo (a) ser realizado durante 5 a 60 minutos, preferencialmente durante 10 a 30 minutos tal como durante 15 minutos.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o contato no passo (b) ser durante 10 a 240 minutos, preferencialmente durante 30 a 180 minutos, mais preferencialmente durante 45 a 180 minutos.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o passo (b) ser realizado por contato com uma asparaginase a uma concentração de 100 a 30.000 ASNU/kg de grãos de café, preferencialmente 500 a 20.000 ASNU/kg de grãos de café tal como 3.000 ASNU/kg de grãos de café.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por, após o passo (b) e antes do passo (c), os grãos de café crus serem secos até um conteúdo de água de 5 a 15 % p/p, preferencialmente 7 a 12 % p/p.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por os grãos de café serem triturados após o passo (c).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por a asparaginase ser obtida de Aspergillus, preferencialmente A. oryzae ou A. niger, ou é uma variante de uma asparaginase genitora obtida de Aspergillus, preferencialmente A. oryzae ou A. niger.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a asparaginase ser de SEQ ID NOs: 1 ou 2..

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por a asparaginase ser uma asparaginase termoestável.