JP2017508472A - 低pHでのタンパク質結晶の再可溶化 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、コンピュータ読み取り可能な形態での配列表を含み、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
a.発酵ブロスを提供するステップ、
b.任意選択で、ヒスチジン側鎖のpKaを下回る値にpHを調節するステップ、
c.任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
d.発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる。
コード配列:「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ATG、GTG、またはTTGなどの開始コドンで開始し、TAA、TAG、またはTGAなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、またはこれらの組み合わせであってよい。
(同等の残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
(同等のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)
好ましい実施形態では、プロテアーゼは、スブチリシンまたはメタロプロテアーゼである。
好適なアミラーゼ(αおよび/またはβ)は、細菌を起源とするものを含む。化学修飾、またはタンパク質改変された突然変異体も含まれる。アミラーゼとして、例えば、バチルス(Bacillus)、例えば、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)の株から得られるα−アミラーゼが挙げられ、これについては、英国特許第1,296,839号明細書にさらに詳しく記載されている。
好適なセルラーゼは、細菌または真菌を起源とするものを含む。化学修飾、またはタンパク質が操作された(置換、挿入、および/または欠失を含む)突然変異体も含まれる。好適なセルラーゼとして、米国特許第4,435,307号明細書、同第5,648,263号明細書、同第5,691,178号明細書、同第5,776,757号明細書および国際公開第89/09259号パンフレットに開示されているバチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、フミコラ(Humicola)属、フザリウム(Fusarium)属、チエラビア(Thielavia)属、アクレモニウム(Acremonium)属由来のセルラーゼ、例えば、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、ミセリオフトラ・テルモフィラ(Myceliophthora thermophila)およびフザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)から産生される真菌性セルラーゼが挙げられる。
好適なリパーゼは、細菌または真菌を起源とするものを含み、タンパク質が操作された(置換、挿入、および/または欠失を含む)突然変異体も含まれる。好適なリパーゼとして、フミコラ(Humicola)属およびリゾムコール(Rhizomucor)属由来のリパーゼ、例えば、フモコラ・ラヌギノセ(Humocola lanuginose)およびリゾムコール・ミヘイ(Rhizomucor mihei)から産生される真菌性リパーゼが挙げられる。
本発明に従い処理することができるオキシドレダクターゼとして、ペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7)、およびラッカーゼなどのオキシダーゼ、ならびにカタラーゼ(EC 1.11.1.6)が挙げられる。
「リゾチーム」活性という用語は、O−グリコシルヒドロラーゼとして本明細書に定義され、これは、2つ以上の炭水化物の間、または炭水化物と非炭水化物部分との間のグリコシド結合の加水分解を触媒する。リゾチームは、細菌細胞壁のムコ多糖体およびムコペプチド中の特定の残基間のグリコシド結合、例えば、ペプチドグリカン中のN−アセチルムラミン酸およびN−アセチル−D−グルコサミン残基の間、ならびにキトデキストリン中のN−アセチル−D−グルコサミン残基間の1,4−β−結合を切断する、溶菌をもたらす。リゾチームは、酵素クラスEC 3.2.1.17に属する。
本発明はまた、本明細書に記載する、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために1つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、または既述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により、親細胞と同一ではない親細胞のあらゆる子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびその供給源に応じて大きく変わるであろう。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、以下:(a)ポリペプチドの生成を促進する条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養するステップ;および任意選択で(b)ポリペプチドを回収するステップを含む方法にも関する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス調合物または細胞組成物にも関する。発酵ブロス製品は、さらに、発酵工程に用いる別の成分、例えば、細胞(目的のポリペプチドを生成するのに用いられる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞など)、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および/または発酵産物なども含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞および/または細胞残屑、ならびに培地を含有する細胞死滅全ブロスである。
本発明の発酵ブロスは、目的のタンパク質を産生する細胞を含み、目的のタンパク質は、その一部が、結晶および/または非晶質沈殿物として存在する。
本発明を、以下の実施形態によって説明する:
1.タンパク質生成物を精製する方法であって、タンパク質の少なくとも一部は、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を有し、この方法は以下:
a.発酵ブロスを提供するステップ、
b.任意選択で、ヒスチジン側鎖のpKaを下回る値にpHを調節するステップ、
c.任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
d.発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる、方法。
2.ヒスチジン側鎖のpKaが6.0である、実施形態1の方法。
3.タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジンが、一次配列の内部に配置される、実施形態1または2の方法。
4.目的のタンパク質の表面の2〜6個のヒスチジン残基の少なくとも1つが、置換または挿入によりもたらされる、実施形態3の方法。
5.タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジンが、タンパク質のC−および/またはN−末端延伸の形態である、実施形態1または2の方法。
6.タンパク質生成物が酵素である、実施形態1〜5の方法。
7.酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼから選択される、実施形態6の方法。
8.酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態7の方法。
9.酵素が、メタロプロテアーゼおよびスブチラーゼから選択されるプロテアーゼである、実施形態8の方法。
10.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも80%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態9の方法。
11.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも85%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態10の方法。
12.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも90%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態11の方法。
13.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも95%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態12の方法。
14.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも96%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態13の方法。
15.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも97%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態14の方法。
16.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも98%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態15の方法。
17.酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも99%の配列同一性を有するプロテアーゼである、実施形態16の方法。
18.酵素が、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態8の方法。
19.酵素が、配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態18の方法。
20.酵素が、配列番号18に対して少なくとも90%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態19の方法。
21.酵素が、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態20の方法。
22.酵素が、配列番号18に対して少なくとも96%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態21の方法。
23.酵素が、配列番号18に対して少なくとも97%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態22の方法。
24.酵素が、配列番号18に対して少なくとも98%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態23の方法。
25.酵素が、配列番号18に対して少なくとも99%の配列同一性を有するリゾチームである、実施形態24の方法。
26.pH4.5での目的のタンパク質の溶解度が、pH7.0での溶解度より少なくとも10%高い、好ましくは少なくとも20%高い、好ましくは少なくとも30%高い、好ましくは少なくとも40%高い、好ましくは少なくとも50%高い、好ましくは少なくとも60%高い、好ましくは少なくとも70%高い、好ましくは少なくとも80%高い、好ましくは少なくとも90%高い、好ましくは少なくとも100%高い、実施形態1〜25のいずれかの方法。
27.発酵ブロス中のタンパク質生成物の濃度が、少なくとも3g/l、例えば少なくとも4g/l、例えば少なくとも5g/l、例えば少なくとも6g/l;例えば少なくとも7g/l、例えば少なくとも8g/l、例えば少なくとも9g/l;例えば少なくとも10g/l、例えば少なくとも11g/l、例えば少なくとも12g/l、例えば少なくとも13g/l、例えば少なくとも14g/l、例えば少なくとも15g/l;例えば少なくとも16g/l、例えば少なくとも17g/l、例えば少なくとも18g/l;例えば少なくとも19g/l、例えば少なくとも20g/lである、実施形態1〜26のいずれかの方法。
28.ステップb)におけるpHが6.0未満、好ましくは5.5未満、好ましくは5.0未満、好ましくは4.5未満のpH値に調節される、実施形態1〜27のいずれかの方法。
29.ステップcに保持期間を含み、保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、実施形態1〜28のいずれかの方法。
30.発酵ブロスが、増殖培地中で微生物を培養することによって得られる、実施形態1〜29のいずれかの方法。
31.微生物が、細菌および真菌から選択される、実施形態30の方法。
32.微生物が、バチルス(Bacillus)属に属する細菌、例えば、古草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・レンツス(B.lentus)およびバチルス・リキニホルミス(B.lichiniformis)から選択される、実施形態31の方法。
33.微生物が、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ペニシルム(Penicillum)属、フザリウム(Fusarium)属に属する真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー(A.niger)、アスペルギルス・アワモリ(A.awamori)、アスペルギルス・オリゼー(A.oryzae)、ショウユコウジカビ(A.sojae)、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(T.longibrachiatum)もしくはトリコデルマ・ビリデ(T.viride);または好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピチア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハネンスラ(Hanensula)属、クリベロマイセス(Klyveromyces)属に属する酵母;例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(S.ovarum)、ピチア・パストリス(P.Pastoris)、クルイベロマイセス・ラクチス(K.lactis)から選択される、実施形態31の方法。
34.ステップdの分離が、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを用いて実施される、実施形態1〜33のいずれかの方法。
35.方法が、ステップdの分離の前に、前処理ステップをさらに含む、実施形態1〜34のいずれかの方法。
36.前処理ステップが、希釈、塩添加およびポリマーの添加から選択される、実施形態35の方法。
37.タンパク質生成物が、所与のアミノ酸配列を有する目的のタンパク質と、2〜6個のヒスチジン残基のC−および/またはN−末端延伸以外は同じアミノ酸配列を有する修飾タンパク質とを含有する、実施形態1〜36のいずれかの方法。
38.発酵ブロスが、目的のタンパク質をコードする遺伝子の1つまたは複数のコピーと、2〜6個のヒスチジン残基によりC−および/またはN−末端が延伸された目的のタンパク質の配列から構成される修飾タンパク質をコードする修飾遺伝子の1つまたは複数のコピーとを含む組換え微生物と一緒に基質を発酵することにより得られる、実施形態37の方法。
39.組換え微生物が、目的のタンパク質をコードする遺伝子の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つのコピーと、修飾遺伝子の1つまたは2つのコピーとを含有する、実施形態38の方法。
40.ステップcに保持期間を含み、保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、実施形態1〜39のいずれかの方法。
41.目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
42.原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス(Bacillus)細胞;最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウツス(Bacillus lautus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、古草菌(Bacillus subtilis)またはバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞である、実施形態41の組換え微生物。
43.真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)またはサッカロマイセス(Saccharomyces)またはピチア(Pichia)細胞;最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum) トリコデルマ・ビレデ(Trichoderma virede)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(Saccharomyces ovarum)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である、実施形態41の組換え微生物。
44.目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも2つのコピー、好ましくは目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも3つのコピー、より好ましくは少なくとも4つのコピー、最も好ましくは少なくとも5つのコピーを含む、実施形態41〜43のいずれかの組換え微生物。
45.目的の同じタンパク質をコードする少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは目的の同じタンパク質をコードする少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは少なくとも5つのポリヌクレオチドを含む、実施形態41〜44のいずれかの組換え微生物。
46.目的のタンパク質が酵素である、実施形態41〜45のいずれかの組換え微生物。
47.酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼである、実施形態46の組換え微生物。
48.酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態47の組換え微生物。
49.酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼまたはスブチラーゼである、実施形態48のいずれかの組換え微生物。
50.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態49の組換え微生物。
51.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25から選択される、実施形態50の組換え微生物。
52.酵素が、リゾチームであり、好ましくは、リゾチームは、GH25リゾチームである、実施形態48の組換え微生物。
53.リゾチームが、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態52の組換え微生物。
54.リゾチームが、配列番号18のアミノ酸配列を有する、実施形態53の組換え微生物。
55.ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、実施形態41〜54のいずれかの組換え微生物。
56.酵素を生成する方法であって、酵素の生成を促進する条件下で、実施形態41〜54のいずれかに定義される細胞を培養するステップを含む、方法。
57.酵素を回収するステップをさらに含む、実施形態56の方法。
58.目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、修飾タンパク質が、目的のタンパク質と比較して、タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
59.修飾タンパク質が、タンパク質のC−および/またはN−末端に結合した2〜6個のヒスチジン残基を含む、実施形態58のタンパク質生成物。
60.目的のタンパク質が酵素である、実施形態58または59のタンパク質生成物。
61.酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼである、実施形態60のタンパク質生成物。
62.酵素が、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、実施形態61のタンパク質生成物。
63.酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼまたはスブチラーゼである、実施形態62のタンパク質生成物。
64.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態63のタンパク質生成物。
65.プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25から選択される、実施形態64のタンパク質生成物。
66.目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、リゾチームが、GH25リゾチームである、実施形態62のタンパク質生成物。
67.プロテアーゼが、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態66のタンパク質生成物。
68.リゾチームが、配列番号18のアミノ酸配列を有する、実施形態67のタンパク質生成物。
プロテアーゼアッセイ(Suc−AAPF−pNAアッセイ)
pNA基質:Suc−AAPF−pNA(Bachem L−1400)。
温度:室温(25℃)
アッセイバッファー:100mMコハク酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.001%Triton X−100、pH9.0。
リゾチーム(EC3.2.1.17)は、グラム陽性細菌細胞壁中のペプチドグリカンを分解する酵素である。リゾチームの分析において、マイクロコッカス・リゾデイクティカス(Micrococcus lysodeikticus)ATCC番号4698(Sigma M3770)を分解し、これにより、450nmでの吸光度を低下させ、表1に示す条件下で測定する。吸光度の低下は、サンプル中に存在するLSU(A)DV酵素活性に比例している。
0.5000g/100ml酢酸0.1M、NaCl50mM、Triton X−100 0.1%、pH4.5
PCR、クローニング、ヌクレオチドの連結などの一般的方法は、当業者にはよく知られており、例えば、以下の文献に見出すことができる:“Molecular cloning:A laboratory manual”,Sambrook et al.(1989),Cold Spring Harbor lab.,Cold Spring Harbor,NY;Ausubel,F.M.et al.(eds.);“Current protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,(1995);Harwood,C.R.,and Cutting,S.M.(eds.);“DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II”,D.N.Glover ed.(1985);“Oligonucleotide Synthesis”,M.J.Gait ed.(1984);“Nucleic Acid Hybridization”,B.D.Hames&S.J.Higgins eds(1985);“A Practical Guide To Molecular Cloning”,B.Perbal,(1984)。
バッファーおよび基質のために使用する化学物質は、分析グレードの市販の製品であった:
− Cove:342.3g/Lのスクロース、20ml/LのCOVE塩類溶液、10mMアセトアミド、30g/Lのノーブル寒天。
− Cove上層寒天:342.3g/Lのスクロース、20ml/LのCOVE塩類溶液、10mMアセトアミド、10g/Lの低融点アガロース。
− Cove−2:30g/Lのスクロース、20ml/LのCOVE塩類溶液、10mMアセトアミド、30g/Lのノーブル寒天。
− COVE塩類溶液は、26gのKCl、26gのMgSO4・7H2O、76gのKH2PO4および50mlのCove微量金属、1リットルまでの水から構成される。
− COVEのための微量金属溶液は、0.04gのNaB4O7・10H2O、0.4gのCuSO4・5H2O、1.2gのFeSO4・7H2O、1.0gのMnSO4・H2O、0.8gの中性アミラーゼIIMoO2・2H2O、および10.0gのZnSO4・7H2O、1リットルまでの水から構成される。
− アミログルコシダーゼ微量金属溶液は、6.8gのZnCl2・7H2O、2.5gのCuSO4・5H2O、0.24gのNiCl2・6H2O、13.9gのFeSO4・7H2O、13.5gのMnSO4・H2Oおよび3gのクエン酸、1リットルまでの水から構成される。
− YPGは、4gの酵母エキス、1gのKH2PO4、0.5gのMgSO4・7H2Oおよび15gのグルコース(pH6.0)、1リットルまでの水から構成される。
− STCバッファーは、0.8Mのソルビトール、25mMのTris(pH8)、および25mMのCaCl2、1リットルまでの水から構成される。
アスペルギルス(Aspergillus)形質転換は、Christensen et al.;Biotechnology 1988 6 1419−1422により記載されている通りに実施した。好ましい手順を以下に記載する。
リゾチーム分析に用いるSDSゲルは、BioRad製のAny kD(商標)Mini−PROTEAN(登録商標)TGX Stain−Free(商標)ゲルであった。16ulのサンプルをゲルにロードした(8μlの各サンプルを8ulのローディングバッファーと混合した)。また、10ulのMW Marker:(Amersham製のLow Molecular Weight Calibration Kit for SDS Electrophoresis #17−0446−01)も適用した。ゲルを1×SDSバッファー(BioRad)において、200Vの定電圧で25分間電気泳動させた後、BioRadクライテリオン(criterion)システムを用いることにより、製造者が推奨するように分析した。
変異体の調製および発現
以下に、発現カセットの突然変異および古草菌(Bacillus subtilis)への発現カセットの導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。
参照:配列番号1
1HIS:N−末端に結合した1ヒスチジンを有する配列番号1
2HIS:N−末端に結合した2ヒスチジンを有する配列番号1
3HIS:N−末端に結合した3ヒスチジンを有する配列番号1
4HIS:N−末端に結合した4ヒスチジンを有する配列番号1
3intHIS:配列番号1+V239H+N243H+N247H
実施例1で産生された参照および変異体を、欧州特許第1 520 012B1号明細書、実施例2に記載の方法を用いて、MGPは添加せずに、標準的実験室規模の発酵槽中で発酵させた。
実施例2からの発酵ブロスを水で3倍希釈し、HClを用いて、40℃でpHをpH4.5に調節した後、発酵ブロスを60分間攪拌した。
変異体の調製および発現
以下に、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業が再現することができる。
精製
実施例4から得られた発酵ブロスを水で6倍希釈し、酢酸を用いて、40℃でpHをpH4.5に調節した後、伝導性を調節するために、塩を添加し、発酵ブロスを40℃の水浴中で60分間攪拌した。
以下に、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。
以下に、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)への発現カセットの突然変異および導入をまとめる。DNA操作は全て、PCR(例えば、Sambrook et al.;Molecular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press)により実施したが、これは、全ての当業者が再現することができる。
アスペルギルス(Aspergillus)発現カセットpJaL1470の構築
発現プラスミドpJaL1468は、プラスミドpHUda1260を鋳型として用い、それぞれ、プライマーセットoJaL519(GTTGTAAAACGACGGCCAGTTTCATCTTGAAGTTCCTA、配列番号5)/oJaL522(CTGGCCGTCGTTTTAC、配列番号6)、oJaL521(GGATTTAGTCTTGATCGCGGCCGCACCATGCGTTTCATTTC、配列番号7)/oJaL524(ATCAAGACTAAATCCTC、配列番号8)、oJaL523(TGGAAGTTACGCTCGCATTCTGTAAACGGGC、配列番号9)/oJaL526(CGAGCGTAACTTCCACC、配列番号10)、oJaL525(GAGGGGATCGATGCGTCCGCGGGCGGAGAAGAAG、配列番号11)/oJaL528 (CGCATCGATCCCCTCGTC、配列番号12)、oJaL527(GATATCGGAGAAGCGTCCGCAGTTGATGAAGG、配列番号13)/oJaL530(GCTTCTCCGATATCAAG、配列番号14)およびoJaL529(AGCTTGGCGTAATCATG、配列番号15)/oJaL520(ACCATGATTACGCCAAGCTGCATGCATTAATTAACTTG、配列番号16)による、以下:844bp、2972bp、3514bp、155bp、1548bpおよび2633の6つのPCR断片の増幅によって作製した。6つのPCR断片を、製造者の指示に従い、Infusionクローニングによって互いに連結することにより、プラスミドpJaL1468を作出した。
プラスミドpHUda1260は、pRika147において、アスペルギルス・ニズランス(A.nidulans)オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrG)からアスペルギルス・ニズランス(A.nidulans)アセトアミダーゼ遺伝子(amdS)へと変更することにより構築した。
アクレモニウム・アルカロフィルス(Acremonium alcalopphilus)由来のリゾチーム遺伝子の0.85kb領域をプライマーペアHTJP−483(agtcttgatcggatccaccatgaagcttcttccctccttg、配列番号22)、およびHTJP−504(cgttatcgtacgcaccacgtgttagtggtggtggtggtctccgttagcgagagc、配列番号23)を用いたPCRにより、プラスミドpJal1470から増幅した。
アスペルギルス・ニガー(A.niger)(国際公開第2012/160093号パンフレットに記載されている_NN059280の誘導体)へのネイティブリゾチーム(pJaL1470)またはamdS選択マーカー含有のC−末端テトラヒスチジンタグ遺伝子を含むその変異体(pHiTe158)のいずれかの染色体挿入を国際公開第2012/160093号パンフレットに記載の通りに実施した。良好に増殖した株を精製し、サザンブロッティング分析に付すことにより、pJaL1470またはpHiTe158のいずれかにおけるリゾチーム遺伝子が、NA1、NA2、SP288またはPAY遺伝子座に正しく導入されたか否かを確認した。非放射性プローブを作製するための以下のプライマーセットを用いて、選択した形質転換体を分析した。
HTJP−483 Agtcttgatcggatccaccatgaagcttcttccctccttg(配列番号22)
HTJP−513 Ctggtagcagtggtaggg(配列番号24)
his−タグ付きリゾチームを含む株およびネイティブリゾチーム遺伝子を含む参照株を実験室規模のタンクにおいて発酵させた。
発酵は、フェドバッチ発酵として実施した(H.Pedersen 2000,Appl Microbiol Biotechnol,53:272−277)。選択した株を液体培地中で前培養した後、さらなる酵素生成の培養のために、増殖した菌糸体をタンクに移した。培養は、グルコースおよびアンモニウムを供給しながら(酵素生成を妨げる過剰投与はせずに)、pH4.75で、34℃にて7日間実施した。遠心分離後、培養ブロスおよび上清を酵素アッセイのために使用した。
Claims (32)
- タンパク質生成物を精製する方法であって、前記タンパク質の少なくとも一部は、前記タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を有し、前記方法は、以下:
a.発酵ブロスを提供するステップ、
b.任意選択で、pHを6.0未満の値に調節するステップ、
c.任意選択で、混合物をある期間にわたって保持するステップ、および
d.前記発酵ブロスからの固体材料の少なくとも一部から、前記溶解したタンパク質生成物を分離するステップ
を含むステップで行われる、方法。 - 前記タンパク質の前記表面に位置する2〜6個のヒスチジンが、一次配列の内部に配置されるか、または前記タンパク質の前記表面に位置する前記2〜6個のヒスチジンが、前記タンパク質のC−および/またはN−末端延伸の形態である、請求項1に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質の前記表面の前記2〜6個のヒスチジン残基の少なくとも1つが、置換または挿入によりもたらされる、請求項2に記載の方法。
- 前記タンパク質生成物が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ;例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノトランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼから選択される酵素である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するプロテアーゼである、請求項4に記載の方法。
- 前記酵素が、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するリゾチームである、請求項4に記載の方法。
- pH4.5での前記目的のタンパク質の溶解度が、pH7.0での溶解度より少なくとも10%高い、好ましくは少なくとも20%高い、好ましくは少なくとも30%高い、好ましくは少なくとも40%高い、好ましくは少なくとも50%高い、好ましくは少なくとも60%高い、好ましくは少なくとも70%高い、好ましくは少なくとも80%高い、好ましくは少なくとも90%高い、好ましくは少なくとも100%高い、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵ブロス中の前記タンパク質生成物の濃度が、少なくとも3g/l、例えば少なくとも4g/l、例えば少なくとも5g/l、例えば少なくとも6g/l;例えば少なくとも7g/l、例えば少なくとも8g/l、例えば少なくとも9g/l;例えば少なくとも10g/l、例えば少なくとも11g/l、例えば少なくとも12g/l、例えば少なくとも13g/l、例えば少なくとも14g/l、例えば少なくとも15g/l;例えば少なくとも16g/l、例えば少なくとも17g/l、例えば少なくとも18g/l;例えば少なくとも19g/l、例えば少なくとも20g/lである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb)における前記pHが6.0未満、好ましくは5.5未満、好ましくは5.0未満、好ましくは4.5未満のpH値に調節される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ステップcに保持期間を含み、前記保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵ブロスが、増殖培地中で微生物を培養することによって得られる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微生物が、バチルス(Bacillus)属に属する細菌、例えば、古草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・レンツス(B.lentus)およびバチルス・リキニホルミス(B.lichiniformis)、またはアスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ペニシルム(Penicillum)属、フザリウム(Fusarium)属に属する真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー(A.niger)、アスペルギルス・アワモリ(A.awamori)、アスペルギルス・オリゼー(A.oryzae)、ショウユコウジカビ(A.sojae)、トリコデルマ・レエセイ(T.reesei)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム(T.longibrachiatum)もしくはトリコデルマ・ビリデ(T.viride);または好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピチア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハネンスラ(Hanensula)属、クリベロマイセス(Klyveromyces)属に属する酵母;例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(S.ovarum)、ピチア・パストリス(P.Pastoris)、クルイベロマイセス・ラクチス(K.lactis)から選択される、請求項11に記載の方法。
- ステップdの前記分離が、ろ過、遠心分離またはデカンテーションを用いて実施される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- ステップdの前記分離の前に、希釈、塩添加およびポリマーの添加などの前処理ステップをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質生成物が、所与のアミノ酸配列を有する目的のタンパク質と、2〜6個のヒスチジン残基のC−および/またはN−末端延伸以外は同じアミノ酸配列を有する修飾タンパク質とを含有する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- ステップcに保持期間を含み、前記保持期間が、10秒〜90分の範囲、好ましくは1分〜90分の範囲、好ましくは1分〜60分の範囲、好ましくは1分〜30分の範囲、例えば5分〜30分の範囲、最も好ましくは10〜20分の範囲である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 目的のタンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされた前記目的のタンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドと、修飾タンパク質をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドであって、前記修飾タンパク質が、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に位置する2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを含む組換え微生物であって、修飾遺伝子が、前記修飾タンパク質の産生を指令する1つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクされている、組換え微生物。
- 原核生物細胞、好ましくは、グラム陽性細胞、より好ましくは、バチルス(Bacillus)細胞;最も好ましくは、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウツス(Bacillus lautus)、バチルス・レンツス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、古草菌(Bacillus subtilis)またはバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞である、請求項17に記載の組換え微生物。
- 真核生物細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)またはサッカロマイセス(Saccharomyces)またはピチア(Pichia)細胞;最も好ましくは、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus .oryzae)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・アクレアツス(Aspergillus aculeatus)、トリコデルマ・レエセイ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum) トリコデルマ・ビレデ(Trichoderma virede)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・オバルム(Saccharomyces ovarum)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である、請求項17に記載の組換え微生物。
- 前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも2つのコピー、好ましくは前記目的のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの少なくとも3つのコピー、より好ましくは少なくとも4つのコピー、最も好ましくは少なくとも5つのコピーを含む、請求項17〜19のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも2つの異なるポリヌクレオチド、好ましくは前記目的の同じタンパク質をコードする少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは少なくとも5つのポリヌクレオチドを含む、請求項17〜20のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項17〜21のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項22のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記酵素が、リゾチームであり、好ましくは、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項22のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体中に異なる遺伝子座において組み込まれる、請求項17〜24のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 酵素を生成する方法であって、前記酵素の生成を促進する条件下で、請求項17〜25のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップを含む、方法。
- 前記酵素を回収するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 目的のタンパク質と、修飾タンパク質であって、前記目的のタンパク質と比較して、前記タンパク質の表面に2〜6個のヒスチジン残基を含有するように修飾されている修飾タンパク質とを含む、タンパク質生成物。
- 前記修飾タンパク質が、前記タンパク質のC−および/またはN−末端に結合した2〜6個のヒスチジン残基を含む、請求項28に記載のタンパク質生成物。
- 前記目的のタンパク質が、酵素、好ましくは、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アスパラギナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、緑色蛍光タンパク質、グルカノ−トランスフェラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼである、請求項28または29に記載のタンパク質生成物。
- 前記酵素が、プロテアーゼであり、好ましくは、前記プロテアーゼが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号25の1つに対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項30に記載のタンパク質生成物。
- 前記目的の酵素が、リゾチームであり、好ましくは、前記リゾチームが、配列番号18に対して少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、好ましくは少なくとも95%の配列同一性、好ましくは少なくとも96%の配列同一性、好ましくは少なくとも97%の配列同一性、好ましくは少なくとも98%の配列同一性、好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項30に記載のタンパク質生成物。
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