CN103540562A - 重组宿主细胞中的脱氧核糖核酸酶表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组宿主细胞中的脱氧核糖核酸酶表达，具体地涉及产生至少一种目的多肽并表达一种或多种重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的细胞，和产生目的多肽的方法，所述多肽基本不含污染的DNA，所述方法包含如下步骤：(a)培养产生至少一种目的多肽并表达一种或多种重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的细胞；和(b)分离目的多肽。
Description
本申请是申请日为2007年11月30日，申请号为200780044260.7（国际申请号为PCT/EP2007/063109），名称为“重组宿主细胞中的脱氧核糖核酸酶表达”的发明专利申请的分案申请。
序列表
本发明包含序列表。
技术领域
本发明涉及重组宿主细胞，其能够产生各种重组多肽，特别是酶，基本不含污染DNA，以及产生基本不含污染DNA的所述多肽的方法。
背景技术
很多芽孢杆菌属生产菌株都用于酶的重组生产，且常常有关于最终的酶产物中重组DNA存在的调节限制(regulatory restriction)。
将来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的核酸酶编码基因整合入几种聚(3-羟基烷酸(酯))(PHA)产生菌的基因组中并表达，以表达核酸酶并从而降低细胞裂解物(本来(otherwise))由于存在染色体DNA而导致的高粘度。葡萄球菌核酸酶易于在产生PHA的假单胞属菌株中表达，并且定位于细胞周质，偶尔定位于培养基中，而不影响PHA产生或菌株稳定性[Zhuang等Reductionof Cell Lysate Viscosity during Processing of Poly(3-Hydroxyalkanoates)byChromosomal Integration of the Staphylococcal Nuclease Gene in Pseudomonasputida.Appl Environ Microbiol.1999April;65(4):1524-1529]。
已经在转录和翻译水平对地衣芽孢杆菌的磷酸盐-饥饿(phosphate-starvation)刺激子进行了分析。显示地衣芽孢杆菌发展了自己的策略来应对这种营养限制。通过分泌蛋白质组分析，将肌醇六磷酸酶鉴定为磷酸盐-饥饿条件下丰度最高的(most abundant)蛋白质。这项研究的数据表明，不同于枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌中的磷酸盐饥饿不会诱导通常的SigmaB依赖性应激响应(Hoi等The phosphate-starvation response of Bacilluslicheniformis.2006.Proteomics,Vol.6(12)pp.3582-3601)。
在磷酸盐饥饿的过程中，枯草芽孢杆菌调节PhoP调节子中的基因，以降低细胞对这种必需底物的需要，并促进从有机来源如磷壁酸和核酸回收无机磷酸盐(phosphate)。PstS是在这些条件下高度诱导的蛋白质之一，其为高亲和性ABC-类磷酸盐转移子中与磷酸盐结合的脂蛋白组分。PstS由pst操纵子中的第一基因编码，pst操纵子中其它四个成员编码转移子的整合蛋白和细胞质组分(Allenby等2004.Post-transcriptional regulation of the Bacillussubtilis pst operon encoding a phosphate-specific ABC transporter.Microbiol150(Pt8)pp.2619-2628)。
发明内容
本发明的目的是提供重组宿主细胞，所述细胞能够产生各种产物，特别是酶，基本不含DNA，以及产生基本不含DNA的各种产物的方法，和构建所述重组宿主细胞的方法。
成功地改造得到重组芽孢杆菌属宿主细胞，在发酵过程中，特别是在发酵末期，所述细胞表达重组核酸酶(脱氧核糖核酸酶)。
我们已经克隆并表达了来自枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的胞外脱氧核糖核酸酶，所述酶能够非常有效地降解DNA。将编码来自枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的这种胞外脱氧核糖核酸酶(核酸酶)的基因nucB克隆至pstS启动子的下游。在发酵过程中，pstS启动子受培养基中磷酸盐水平的调节，调节方式为启动子由低水平的磷酸盐激活，由高水平的磷酸盐阻断。
起初，将荧光蛋白GFP用作由pstS启动子表达的标记物，并且发现这种特殊的启动子在发酵过程中受到非常严格的控制。因为当磷酸盐水平较低的时候，大多数芽孢杆菌属发酵都正在进入末期，所以由pstS启动子表达nucB基因的过程会在发酵末期被激活，并在需要清除发酵液中多余的DNA时表达核酸酶。
我们在本文表明，由pstS启动子和插入枯草芽孢杆菌染色体的nucB基因组成的表达盒在摇瓶和1升规模培养中受到磷酸盐水平的调节。当生长培养基中存在磷酸盐时，发酵上清液不能降解加入的DNA。然而，在通过发酵已经耗尽磷酸盐的生长培养基中，观察到上清液将加入的DNA非常有效地降解，从而证明上清液中存在核酸酶。用这种方法，我们成功地将酶表达阶段和核酸酶的表达分开，避免给酶的生产力(productivity)带来干扰。
因此，本发明的第一方面涉及产生至少一种目的多肽并表达一种或更多重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的细胞。
在第二方面，本发明涉及产生基本不含污染DNA的目的多肽的方法，所述方法包含步骤：
(a)培养产生至少一种目的多肽并表达一种或多种重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的细胞；和
(b)分离目的多肽。
本发明还涉及如下方面：
1.一种细胞，其产生至少一种目的多肽并表达一种或更多重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶。
2.根据项1的细胞，其为革兰氏阳性细胞。
3.根据项2的细胞，其为芽孢杆菌属细胞。
4.根据项3的细胞，其为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
5.根据项1-4中任一项的细胞，其中所述至少一种目的多肽包含酶。
6.根据项5的细胞，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
7.根据项1-6中任一项的细胞，其中将所述一种或多种重组核酸酶编码基因整合入所述细胞的基因组中。
8.根据项1-7中任一项的细胞，其中所述一种或多种重组核酸酶编码基因由经调节的启动子转录，该启动子在所述细胞的标准补料分批发酵过程中上调至少10%，优选所述启动子响应生长培养基中的物质限制而上调。
9.根据项8的细胞，其中所述启动子响应生长培养基中的磷酸盐限制而上调。
10.根据项8或9的细胞，其中所述一种或多种重组核酸酶编码基因由地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的pstS启动子转录。
11.产生基本不含污染DNA的目的多肽的方法，所述方法包含步骤：
(a)培养产生至少一种目的多肽并表达一种或多种重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的细胞；和
(b)分离目的多肽。
12.项11的方法，其中所述细胞是革兰氏阳性细胞。
13.根据项12的方法，其中所述细胞是芽孢杆菌属细胞。
14.根据项13的方法，其中所述细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
15.根据项11-14中任一项的方法，其中所述至少一种目的多肽包含酶。
16.根据项15的方法，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
17.根据项11-16中任一项的方法，其中将所述一种或多种重组核酸酶编码基因整合入所述细胞的基因组中。
18.根据项11-17中任一项的方法，其中所述一种或多种重组核酸酶编码基因由经调节的启动子转录，所述启动子在所述细胞的标准补料分批发酵过程中上调至少10%，优选所述启动子响应生长培养基中的物质限制而上调。
19.根据项18的细胞，其中所述启动子响应生长培养基中的磷酸盐限制而上调。
20.根据项18或19的细胞，其中所述一种或多种重组核酸酶编码基因由地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的pstS启动子转录。
附图简述
图1是显示Northern印迹的图，表示发酵过程中pst-操纵子的表达。地衣芽孢杆菌中的pst-操纵子由五个基因组成(与枯草芽孢杆菌相同)：pstS/C/A/BA/BB。调节似乎和枯草芽孢杆菌中的调节相同，其中pst-操纵子转录成为4.4kb的初级转录物，并迅速加工成为较小的产物，包括稳定的0.9kb的pstS转录物。
图2是显示发酵中取样的9个小时中在线发射光谱的变化的图，取样从磷酸盐饥饿诱导之前4小时开始(为了简单起见，这张图中显示为每小时一张光谱，但在实验过程中每10分钟就收集一次数据)。460至480nm处的峰表示激发光，而508nm处随时间增加的峰是GFP发射信号。
图3.是显示在九小时内从发酵中取样得到的数据的图，表示在线和离线的GFP测定结果、生物质(biomass)生长、磷酸盐浓度、FACS分析、碱性磷酸酶活性，以及天然(native)pstS mRNA和pstS-GFP融合mRNA的mRNA水平。
图4.是在磷酸盐饥饿响应诱导前和诱导过程中对取出样品的FACS分析和显微镜检查，显示全部群体中诱导GFP的表达情况(参见图2中在线和离线GFP数据的比较)的图。A)列显示FACS分析；FACS图中的Y轴表示侧向角散射光(反映在波长488+/-10nm处测量的激发光)，是细胞大小(或者培养基中存在的任何颗粒的大小)的量度；X轴表示530+/-30nm处的荧光强度(FL1)。光源为蓝色激光(波长488nm)。B和C)列表示使用相差显微镜和荧光显微镜观察样品的显微图片。
图5.是显示在发酵BPN100中在线测量GFP发射(507-511nm处的数值)的结果的图。31h开始磷酸盐饥饿，GFP信号增加(31-36h)，直至加入磷酸盐后约一小时。加入的磷酸盐可能在约42h耗尽，此时GFP信号再次开始增加。
图6.是显示在发酵BPN101和BPN102中在线测量GFP发射(507-511nm处的数值)的结果的图。在BPN101中，10小时后检测到磷酸盐饥饿，而在高浓度磷酸盐的发酵过程中没有发现诱导产生，直至将一半的发酵液用缺乏磷酸盐的培养基取代。这诱导了GFP发射的增加，通过加入0.5g磷酸盐，诱导停止了三个小时。
图7.是显示用于地衣芽孢杆菌的木糖诱导整合型克隆载体表达系统，命名为pAN238，SEQ ID NO:1中给出了此质粒的全长DNA序列的图。
图8.是显示名为pAN167的克隆载体表达系统，SEQ ID NO:6中给出了此质粒的全长DNA序列的图。
图9.是显示对上清液中脱氧核糖核酸酶的分析的图，上清液来自包含nucB的不同的淀粉酶产生菌株：MOL2716，MOL2717，MOL2718；发酵在TY-培养基中进行：
泳道1：DNA标记
泳道2：DNA标记+MOL2716菌株(+磷酸盐)
泳道3：DNA标记+MOL2717菌株(+磷酸盐)
泳道4：DNA标记+MOL2718菌株(+磷酸盐)
泳道5：DNA标记+MOL2684菌株(+磷酸盐)
泳道6：DNA标记+Sm-30菌株(+磷酸盐)
泳道7：DNA标记+MOL2716菌株(-磷酸盐)
泳道8：DNA标记+MOL2717菌株(-磷酸盐)
泳道9：DNA标记+MOL2718菌株(-磷酸盐)
泳道10：DNA标记+MOL2684菌株(-磷酸盐)
泳道11：DNA标记+Sm-30菌株(-磷酸盐)
泳道12：DNA标记
图10.是显示表示对上清液中脱氧核糖核酸酶的分析的图，上清液来自包含nucB的不同的淀粉酶产生菌株：MOL2717；发酵以1升规模进行，磷酸盐限制。
泳道1：DNA标记
泳道2：DNA标记+MOL2717菌株，1升发酵(-磷酸盐)，第1天(1.day)
泳道3：DNA标记+MOL2717菌株，1升发酵(-磷酸盐)，第2天
泳道4：DNA标记+MOL2717菌株，1升发酵(-磷酸盐)，第3天
泳道5：DNA标记+MOL2717菌株，1升发酵(-磷酸盐)，第4天
泳道6：DNA标记+MOL2717菌株，1升发酵(-磷酸盐)，第5天
泳道7：DNA标记+MOL2717菌株，TY培养基(-磷酸盐)，过夜
泳道8：DNA标记+MOL2684菌株，TY培养基(-磷酸盐)，过夜
泳道9：DNA标记+Sm-30菌株，TY培养基(-磷酸盐)，过夜
泳道10：DNA标记+MOL2717菌株，PS1培养基，7天
泳道11：DNA标记+MOL2684菌株，PS1培养基，7天
泳道12：DNA标记+Sm-30菌株，PS1培养基，7天
泳道13：DNA标记
发明详述
本发明的第一方面涉及产生至少一种目的多肽和表达一种或更多重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的细胞。
宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”或“细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸，将其有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明多核苷酸的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留为染色体整合体(chromosomal integrant)或作为前述的自复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不相同。宿主细胞的选择将很大程度依赖于编码多肽的基因和它的来源。
宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或非单细胞微生物，例如，真核生物。
有用的单细胞微生物是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomycesmurinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属(Pseudomonas sp)菌种。在优选的方面，细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另外优选的方面，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌属。
可通过如下方法实现将载体引入到细菌宿主细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Molecular General Genetics168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizin,1961,Journal of Bacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,Journal of Molecular Biology56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,Journal of Bacteriology169:5771-5278)。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
在优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,In,Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)。
在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。
在甚至更加优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞。
在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另外最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
在另外更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另外的最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)。在另外最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsiscaregiea、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、浅红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、弯孢拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,Proceedings of the National Academy ofSciences USA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.,编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volume194,pp182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,Journalof Bacteriology153:163；和Hinnen等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA75:1920。
在本发明的优选实施方案中，细胞是革兰氏阳性细胞，优选芽孢杆菌属细胞；和最优选嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指，如通过SDS-PAGE测定的，其为至少20%纯，优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，最优选至少90%纯，并且甚至最优选至少95%纯的多肽。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物按重量计含有至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%纯，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选100%纯。
本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选所述多肽是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然结合的其它多肽材料。这能够通过以下方法实现，例如，通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。
在本文中，术语“基本上纯的多肽”与术语“分离的多肽”和“分离形式的多肽”同义。
在第一和第二方面的优选实施方案中，所述至少一种目的多肽包含酶，优选酶为裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶，或异构酶。
等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计含有至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯，最优选至少99%，并且甚至最优选至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即，所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然结合的其它多核苷酸材料。在本文中，术语“基本上纯的多核苷酸”与术语“分离的多核苷酸”和“分离形式的多核苷酸”同义。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的片段。当所述核酸构建体含有本发明的编码序列表达所需的调节序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
调节序列(control sequence)：术语“调节序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的或有利的所有成分。各种调节序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的。这些调节序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调节序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调节序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调节序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调节序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调节序列指导多肽编码序列的表达。
编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属多肽，例如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽；或链霉菌属多肽，例如，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，例如，大肠杆菌或假单胞菌属菌种多肽。
本发明的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选酵母多肽例如念珠菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属多肽；或更优选丝状真菌多肽例如枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、瘤胃壶菌属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属或木霉属多肽。
在另外的优选方面，所述多肽是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉多肽。
可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将轻易地识别适合的等同物的同一性。
这些菌种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammiung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。
此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合阅读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ ID NO:1的多肽编码区存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,Protein Expression and Purification2:95-107。
对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定。在后一种技术中，将突变引入到分子中的每个正电残基处，并且测试所得突变分子的活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等,1992,Science255:306-312；Smith等,1992,Journal of Molecular Biology224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBSLetters309:59-64)。
本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。
可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
调控序列可以是合适的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the National Academy of SciencesUSA75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteinsfrom recombinant bacteria"于Scientific American,1980,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中有所描述。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast8:423-488描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。
对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Molecular Cellular Biology15:5983-5990描述。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码区。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可能是必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。
对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews57:109-137描述。
对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和疏棉状腐质霉脂肪酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等,1992,见上文，描述。
调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化成成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)的基因获得前肽编码区。
当信号肽和前肽区二者均存在于多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调节序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在合适的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与合适的表达调节序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。
本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。
条件必需基因(conditionally essential gene)可以作为非抗生素选择性标记。细菌的条件必需的非抗生素选择性标记的非限制性实例是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其它芽孢杆菌的dal基因，其仅当在缺乏D-丙氨酸的条件下培养细胞时是必需的。当细胞在存在半乳糖的条件下生长，或者在会产生半乳糖的培养基中生长时，编码UDP-半乳糖的转换(turnover)中相关酶的基因也可以在细胞中作为条件必需的标记。这些基因的非限制性实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌编码UTP-依赖型磷酸化酶(EC2.7.7.10)、UDP-葡萄糖-依赖型脲苷酰转移酶(EC2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC5.1.3.2)的那些基因。在以木糖作为唯一碳源的基本培养基中生长的细胞中，还可将芽孢杆菌属的木糖异构酶基因，如xylA，用作选择性标记。在以葡糖酸作为唯一碳源的基本培养基中生长的细胞中，还可以将利用葡糖酸所必需的基因gntK和gntP用作选择性标记。条件必需基因的其它实例是本领域公知的。抗生素选择性标记赋予对抗生素的抗性，所述抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤。
对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。
为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数目的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制基因(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Research15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或包括与多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增的拷贝的细胞，并由此得到多核苷酸的额外拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。
在本发明的优选实施方案中，将一种或多种重组核酸酶编码基因整合入所述细胞的基因组中。这可以如本文所述或者如WO2002/000907中所公开而实现。
在本发明另外的优选实施方案中，将一种或多种重组核酸酶编码基因由经调节的启动子转录，所述启动子在所述细胞的标准补料分批发酵过程中上调至少10%，优选上调至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多，甚至更优选所述启动子响应生长培养基中的物质限制而上调，最优选所述启动子响应生长培养基中的磷酸盐限制而上调。
在本发明的最优选实施方案中，将一种或多种重组核酸酶编码基因由地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的pstS启动子转录。
生产方法
在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过多种本领域已知的方法纯化本发明的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,编,VCH Publishers,New York,1989)。
实施例
当使用DNA微阵列以实验室规模进行基因调节时，多种细胞响应都可以看作是改变发酵培养基的结果。
实施例1.地衣芽孢杆菌中磷酸盐饥饿响应
在我们的第一个微阵列实验中，已经使用包含约200个感兴趣的基因的部分地衣芽孢杆菌微阵列片，检测了发酵后期样品的磷酸盐饥饿。细胞并未“真正”限制磷酸盐，因为细胞壁中的磷壁酸中通常并入了大量的磷酸盐。当细胞感应到培养基中低浓度的磷酸盐时，响应之一是用不含磷酸盐的磷壁酸代替这些磷壁酸，从而释放磷酸盐。
因此如果只计划制作一个生物传感器的话，为磷酸盐限制制作生物传感器会被质疑。然而，将用于不同的痕量金属的生物传感器组合，如上所述，磷酸盐饥饿生物传感器是必需的。很多其它事实也表明磷酸盐生物传感器是一个非常有吸引力的选择来开始进行研究：
1)pst-操纵子(与磷酸盐的高亲和性摄取有关)受到非常严格的调节，即，在磷酸盐不饥饿的细胞中转录的背景水平最低，而当细胞经受磷酸盐饥饿时转录水平非常高(参见图1)。
2)在磷酸盐饥饿过程中受到诱导的另一个基因是编码碱性磷酸酶/磷酸二脂酶的phoD基因。这种碱性磷酸酶的活性容易测量(将无色的对硝基苯酚水解成游离的对硝基苯酚，颜色变为黄色)，并由此可能确认以pstS-GFP融合观察到的结果。
3)无机磷酸盐浓度可以用商业试剂盒或通过HPCE容易地确定。这是因为磷酸盐是一种主要的生物要素，而且在约0.5g/L时就已经诱导了磷酸盐饥饿。
实施例2.构建芽孢杆菌属菌株检测磷酸盐饥饿
当磷酸盐水平较低时，某些基因的转录发生强烈的响应。在芽孢杆菌属的pst操纵子中发现了一组这样的基因。在我们的实验中，编码绿色荧光蛋白变体的基因，命名为BioST(突变：F64L、S65T)，来自水母Aequorea victoria，已经与pst转录物转录融合[New Unstable Variants of Green Fluorescent Proteinfor studies of Transient gene expression in bacteria.App.Env.Mic.1998p2240-2246,通过提述并入本文]。
制备构建体，其中将bioST基因插入1)紧邻pst启动子区的下游和pst操纵子的上游“Ppst bioST”；或2)转录物中操纵子中最后一个基因(pstBB)的下游“pstBB bioST”。
使用标准方法，将Ppst bioST融合体插入枯草芽孢杆菌染色体的amyE基因座中(PP2203-1)，并将融合基因插入地衣芽孢杆菌的bglC基因中(PP2244)。
使用标准方法，将pstBB bioST转录融合体插入另一株枯草芽孢杆菌菌株染色体的pst操纵子中(PP2216-1)。
枯草芽孢杆菌pst构建体中使用的DNA序列来自公开的枯草芽孢杆菌168基因组。地衣芽孢杆菌pst构建体中使用的DNA序列分离自享有专利的(proprietary)地衣芽孢杆菌Si3菌株。
PP2203-1和PP2244-1中bioST后面的终止子都是来自克劳氏芽孢杆菌的aprH终止子。在PP2216-1中bioST的C-端插入序列中，终止子是pst操纵子的原始终止子。
在上述菌株中，对于要了解在当前时刻发酵中发生了什么情况，GFP的积累可能是个缺点-因为我们第一步先产生带不稳定性标签(ssrA标签)的BioST变体，这将细胞质肽导向clpX clpP降解复合物。
来自枯草芽孢杆菌的ssrA标签已知为GKTNSFNQNVALLA。而来自地衣芽孢杆菌Si3的同源物为VKTHLNITGKSNQNLALAA。
制备了BioST上带有C-端枯草芽孢杆菌ssrA标签的枯草芽孢杆菌菌株。枯草芽孢杆菌PP2239-1中的GFP积累远远低于在同样条件下操作的平行的PP2203-1菌株。
得到的菌株：
PP2203-1：枯草芽孢杆菌168aprE,nprE,amyE:(cat)Ppst bioST。
PP2216-1：枯草芽孢杆菌168aprE,nprE,pstBB+::bioST。
PP2244-1：地衣芽孢杆菌Si3aprL,bglC::Ppst bioST。
PP2239-1：枯草芽孢杆菌168aprE,nprE,amyE:(cat)Ppst bioST_ssrA。
实施例3.磷酸盐饥饿的在线测量
设备
1)分光光度计，可检测329-1100nm之间所有的发射波长(AVANTESTMAVASPECTM-2048FT-SPU)，通过光缆(AVANTESTMFC-UV600-2)连接至位于防光照盒(见下文)中的准直透镜。BioST最大发射在大约508nm。
2)光源，在约470nm发出强烈的激发光，而且没有波长大于500nm的光，因为激发光反射进分光光度计会干扰对GFP蛋白(BioST最大激发在大约470nm处)发射光的检测。我们测试了AVANTESTMAVALIGHTTM-LED-470nm，使用了光通带滤波器(470+/-10nm，来自KNIGHT OPTICALTM(UK)Ltd)，但是发现光强度过低。我们取而代之使用了自制光源，其由5mm高亮度蓝色LED(2000mcd，峰值波长为470nm)组成，与上述光滤波器组合。将LED置于防光照盒中，位置非常接近流通管。
3)流通管，发酵液可以从中通过，然后重新循环回发酵罐中。循环由蠕动泵驱动。
4)防光照盒(自制)，其中流通管、准直透镜和光源的安装角度能够产生发射信号的最大检测值。
使用枯草芽孢杆菌菌株PP2203-1(amyE基因座中的pstS-GFP融合体)
的结果
为了能够使用用于发酵调节的生物传感器，必须满足多个重要的标准：
1)必须有可能在细胞第一次感应到饥饿之后很快检测细胞对饥饿条件的响应的信号。
2)整个群体应该以同样的方式反应，使得调节不基于细胞亚群体中发生的反应。
3)在通过加入限制营养物质而终止饥饿条件后信号的增加应立刻停止。
为了确定是否满足了这些标准，我们以低磷酸盐浓度开始发酵，并在九小时中每小时取样，用于不同的分析：
1)使用Northern印迹的pstS和pstS-GFP的mRNA水平测定，
2)离线GFP浓度测定，
3)碱性磷酸酶活性测定，
4)FACS分析，
5)无机磷酸盐浓度测定。
在检测到磷酸盐饥饿信号之前四小时开始取样。图1显示在这九小时中，光谱如何发生变化。图2显示在这九小时中收集的数据，以及GFP信号(在线与离线)和碱性磷酸酶活性同时增加。
对样品的FACS分析和显微镜观察显示，在同一时间点对GFP生产的诱导，并且非常重要的是，还显示细胞全部群体都以同样的方式反应(参见图3)。
最重要的是，Northern印迹结果显示，pstS和pstS-GFP全体受到共同调节(totally co-regulated)，我们首次检测到在mRNA水平的诱导之后，很快观察到了GFP，而且最后，磷酸盐的加入迅速关闭了启动子的转录。用磷酸盐关闭启动子还导致加入磷酸盐后约一小时停止产生GFP。这种延迟可能是相当稳定的pstS-GFP mRNA的作用(在加入磷酸盐之后52分钟中，pstS-GFP水平降低了5至10倍)。图4显示在取样开始后的20个小时中，GFP发射变化的在线数据。在这里，我们看到加入磷酸盐约一小时后，信号强度停止增加，而且强度缓慢下降。加入的磷酸盐可能在约42h耗尽，此时GFP信号再次开始增加。
为了保证高生物质浓度不会干扰GFP信号，又进行了两次发酵，其中一次以低磷酸盐浓度开始发酵(BPN102)，一次以高磷酸盐浓度开始发酵(BPN101)。结果示于图6中。BPN101中没有发生GFP诱导，而BPN102中观察到了快速的GFP诱导。
为了测试我们是否能在BPN101中诱导磷酸盐饥饿，在发酵47小时，用缺乏磷酸盐的培养基交换约一半罐体积。很快，观察到GFP信号的增加，并加入0.5g磷酸盐。这使GFP的产生停止了3小时，然后，当加入的磷酸盐耗尽时，GFP信号再次开始增加。
实施例4.用于地衣芽孢杆菌的木糖诱导的表达系统
枯草芽孢杆菌中的木糖利用需要产生木糖异构酶(XylA)和木酮糖激酶(XylB)，而且在转录水平上受到由xylR编码的木糖响应抑制蛋白的调节，并受到分解代谢物抑制的调节。xylR和xylAB基因各自由常见的基因间区(intergenic region)转录，所述基因间区包含xyl操纵基因序列，该序列在缺乏诱导物时与xylR结合。枯草芽孢杆菌的木糖操纵子是受到严格转录调节、经过充分表征的调节系统。Bhavsar等(2001)开发了木糖依赖型系统，用于表达来自枯草芽孢杆菌中amyE基因座的克隆基因。我们已经构建了相似的系统，用于表达来自地衣芽孢杆菌Si3菌株中xyl基因座的克隆基因。
从地衣芽孢杆菌Si3的染色体扩增木糖基因座并测序。选择两个区作为靶物用于通过双同源重组事件(double homologous recombination events)在染色体上整合。上游区(xyl-us)包括编码木糖抑制子(xylR)的基因的5’-末端、基因间的xyl操纵基因序列、xylA启动子，和编码21aa的xylA的5’-末端，之后是人工终止子。下游区(xyl-ds)包括xylB基因间区。
表达盒包含四个唯一的限制性位点，但是不含用于翻译克隆基因的Shine-Dalgarno序列。
因此，选择用于克隆和进行木糖依赖型表达的基因需要带有其自己的Shine-Dalgarno序列。这可以通过仔细的引物设计和PCR扩增而容易地实现，上游引物应具有含克隆用识别位点的额外序列、SD-序列、用于待表达基因的起始密码子。下游引物应该包含终止密码子，但是不包含终止子序列，因为终止子序列将阻止构建体中与GFP-编码BioST-表达报告物-基因的共表达。
将得到的克隆表达载体命名为pAN238(图7)，在pAN238中克隆扩增的“基因X”可以确保其与BioST共表达。通过双交换事件将表达盒整合入地衣芽孢杆菌的染色体，这样来恢复xylR，但是会由于严重的截短而使xylAB失活。克隆基因将在存在木糖的情况下与BioST一起表达。SEQ ID NO:1中提供了pAN238的完整DNA序列。
实施例4.地衣芽孢杆菌中木糖诱导的核酸酶表达
在第一种克隆策略中，我们将两种nucB基因各自插入到pAN238载体中，这一载体设计用于整合入地衣芽孢杆菌的xyl基因座。
这样的整合使得可以通过向培养基中加入木糖而诱导nucB表达，因为nucB基因是在xyl启动子的控制之下。然而，作为地衣芽孢杆菌中的游离质粒，xyl启动子具有组成性活性，因为XylR抑制子可被滴定出来(because theXylR repressor is out-titrated)，可以期望的是，在这些条件下，nucB会充分表达。通过PCR分别扩增这两个nucB基因并克隆入质粒中。
地衣芽孢杆菌nucB的PCR：
引物480596(SEQ ID NO:2):
TTTATTATCGATCAAGAGGAGGTTGTTTTTGTCATGATC
引物480597(SEQ ID NO:3):
TTTATTACGCGTATCCCCCACAACGATTTTCCTGTC
枯草芽孢杆菌nucB的PCR：
引物480598(SEQ ID NO:4):
TTATTTATCGATAAGGTATGGGGGGATGGGGATGAAAAAATGG
引物480599(SEQ ID NO:5):
TTATTTACGCGTCAGCTCGGCGAAGGATTGTAACAAC
将这些质粒分别转入枯草芽孢杆菌中并制备质粒制备物。质粒的限制性消化显示了DNA的主要分解(情况)，说明枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的nucB基因受到充分的诱导，而且编码的核酸酶均可以表达到培养基中。将两个菌株保存为：
MOL2676(地衣芽孢杆菌nucB)pMOL2676
MOL2677(枯草芽孢杆菌nucB)pMOL2677
将供体菌株保存为：
MOL2680(地衣芽孢杆菌nucB)pMOL2676
MOL2681(枯草芽孢杆菌nucB)pMOL2677
在更严格控制的实验中，我们将菌株接种于TY中，在37℃过夜培养，并将不含细胞的10ml上清液与DNA标记(1Kb阶梯标记物(ladder))混合。将样品在37℃温育不同的时间间隔。将含有克隆nucB基因的菌株的DNA标记的主要降解(条带)与对照菌株相比较。结论为两种nucB基因均能在枯草芽孢杆菌中表达成为具有功能的核酸酶。
实施例5.Ppst诱导的nucB表达的结果
第二种克隆策略是在磷酸盐限制的条件下，如趋于发酵末期，用来自地衣芽孢杆菌的严格受控的pstS启动子表达核酸酶。再一次，通过PCR扩增两个nucB基因并与pstS启动子一起克隆入另一个质粒pAN167中，所述质粒pAN167设计用于整合入枯草芽孢杆菌染色体中的pel基因座。SEQ ID NO:6中提供了pAN167的DNA序列，限制性图谱示于图8中。
来自菌株PP2201-1-Ppst-GFP的Ppst的PCR
引物Cat，aa49，正向(SEQ ID NO:7):
CCTTTATTAATGAATTTTCCTGCTG
引物GFP，aa17，反向(SEQ ID NO:8):
CAACAAGAATTGGGACAACTCCAGTG
地衣芽孢杆菌nucB的PCR
引物491264(SEQ ID NO:9):
TTTATTACGCGTCAAGAGGAGGTTGTTTTTGTCATGATC
引物492902(SEQ ID NO:10):
TTTATTAAGCTTATCCCCCACAACGATTTTCCTGTC
枯草芽孢杆菌nucB的PCR
引物491266(SEQ ID NO:11):
TTATTTACGCGTAAGGTATGGGGGGATGGGGATGAAAAAATGG
引物492903(SEQ ID NO:12):
TTATTTAAGCTTCAGCTCGGCGAAGGATTGTAACAAC
将连接产物转化入枯草芽孢杆菌中，并制备质粒制备物。限制性消化显示已经发生了正确的克隆。将含有pst启动子的nucB表达盒通过双交换重组整合入pel基因座，并通过PCR证实整合正确。保存下述菌株：
MOL2684，MOL2685：整合含有来自地衣芽孢杆菌的nucB的构建体
MOL2686，MOL2687：整合含有来自枯草芽孢杆菌的nucB的构建体
为了研究pst启动子是否能在低磷酸盐浓度激活nucB基因，建立了一系列样品。将两个菌株MOL2684和MOL2686接种于含有或不含有添加的磷酸盐的TY培养基中。在37℃过夜生长后，将细胞沉淀(pelleted)，根据图9通过将上清液与DNA标记混合来考察上清液的核酸酶活性。取10μl不含细胞的上清液与DNA标记(1Kb阶梯标记物)一起上样。将样品在37℃温育不同的时间间隔。
如图9所示，将含有克隆地衣芽孢杆菌nucB基因的DNA标记的主要降解(条带)与对照菌株相比较，但只比较了未加入磷酸盐的发酵(情况)。在加入磷酸盐的发酵中，没有降解的迹象(there is no trace of degradation)。
结论是来自地衣芽孢杆菌的nucB基因能够由Ppst启动子表达，而且受到培养基中磷酸盐水平的严格控制。
实施例6.商业上相关的条件下Ppst诱导的nucB表达
我们想要在商业上相关发酵条件下，测试用于表达食品酶的相关淀粉酶生产菌株中的Ppst-nucB构建体。
使用来自菌株MOL2684和MOL2685的染色体DNA转化生产菌株，根据氯霉素抗性进行筛选。通过PCR确认nucB表达盒的存在。
将得到的由整合入pel基因座的Ppst启动子表达nucB的菌株保存为：MOL2716、MOL2717、MOL2718(整合含有来自地衣芽孢杆菌的nucB的构建体)。
然后将得到的菌株之一，即MOL2717，以1升的规模发酵，研究NucB核酸酶的初始表达和活性是否足以消化DNA(to investigate if the initiation ofexpression and activity of the NucB nuclease was sufficient to digest DNA)。发酵以磷酸盐限制过程进行了四天，每天取样。将样品通过离心清除细胞，并与DNA标记混合以检验脱氧核糖核酸酶活性。此次实验的结果示于图10中。与较早的实验相比，来自1升规模发酵的样品所在泳道显示DNA的缓慢降解，但是240分钟后，DNA发生了显著的降解，得到弥散的条带。对照显示出期望的活性。
Claims (6)
1.一种杆菌细胞，其产生至少一种目的酶并表达一种或更多重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶，所述重组核酸酶编码基因被整合入所述杆菌细胞的基因组。
2.根据权利要求1的细胞，其为嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
4.产生基本不含污染DNA的目的酶的方法，所述方法包含步骤：
(a)培养产生至少一种目的酶并表达一种或多种重组核酸酶编码基因从而产生核酸酶的杆菌细胞，所述重组核酸酶编码基因被整合入所述杆菌细胞的基因组；和
(b)分离目的酶。
5.根据权利要求4的方法，其中所述细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述酶是裂合酶、连接酶、水解酶、氧化还原酶、转移酶或异构酶。
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| WO2013043860A1 (en) * | 2011-09-22 | 2013-03-28 | Danisco Us Inc. | Endogenous dnase activity to reduce dna content |
| KR102178036B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2020-11-13 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 핵산 분해를 위한 호열성 뉴클레아제의 용도 |
| AU2015279831A1 (en) * | 2014-06-25 | 2017-01-12 | Jhl Biotech, Inc. | Methods and reagents for purification of proteins |
| CN108291212A (zh) * | 2015-10-14 | 2018-07-17 | 诺维信公司 | 多肽变体 |
| US11053483B2 (en) * | 2017-03-31 | 2021-07-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having DNase activity |
| US20220112478A1 (en) * | 2019-01-30 | 2022-04-14 | Novozymes A/S | Cognate Foldase Co-Expression |
| WO2021001297A1 (en) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Basf Se | Method for preparing a fermentation medium |
| EP3926039A1 (en) * | 2020-06-17 | 2021-12-22 | AB Enzymes GmbH | Use of a nuclease for reducing the viscosity and/or preventing an increase in viscosity of a fermentation broth |
| WO2023023644A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Danisco Us Inc. | Polynucleotides encoding novel nucleases, compositions thereof and methods thereof for eliminating dna from protein preparations |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024873A9 (en) * | 1998-10-28 | 2000-11-02 | Genentech Inc | Process for recovering heterologous polypeptides from bacterial cells |
| CN1659282A (zh) * | 2002-04-10 | 2005-08-24 | 诺维信公司 | 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞 |
| CN1659283A (zh) * | 2002-04-10 | 2005-08-24 | 诺维信公司 | 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞 |
| WO2006026125A2 (en) * | 2004-08-16 | 2006-03-09 | Nature Technology Corp. | Improved strains of e. coli for plasmid dna production |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5624829A (en) * | 1984-07-03 | 1997-04-29 | Gist-Brocades, B.V. | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them |
| DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
| CN1192108C (zh) | 1994-06-03 | 2005-03-09 | 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 | 纯化的毁丝霉属漆酶及编码该酶的核酸 |
| CN1151762A (zh) | 1994-06-30 | 1997-06-11 | 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 | 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达系统及所用启动子和终止子 |
| DE69932345T2 (de) | 1998-10-26 | 2007-07-19 | Novozymes A/S | Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen |
| EP2278016B1 (en) | 1999-03-22 | 2012-09-26 | Novozymes Inc. | Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof |
| AU2001265835A1 (en) | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Novozymes A/S | Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes |
| EP1356060B1 (en) * | 2000-09-18 | 2005-12-14 | Genencor International, Inc. | Twin-arginine translocation in bacillus |
| DE60235892D1 (de) | 2001-07-30 | 2010-05-20 | Genencor Int | Phosphatlimitierter induzierbarer promotor und bacillus-expressionssystem |
-
2007
- 2007-11-30 EP EP11191295.2A patent/EP2431470B1/en active Active
- 2007-11-30 EP EP07857238A patent/EP2089524B1/en not_active Not-in-force
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-
2012
- 2012-06-25 US US13/532,268 patent/US8569029B2/en active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024873A9 (en) * | 1998-10-28 | 2000-11-02 | Genentech Inc | Process for recovering heterologous polypeptides from bacterial cells |
| CN1659282A (zh) * | 2002-04-10 | 2005-08-24 | 诺维信公司 | 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞 |
| CN1659283A (zh) * | 2002-04-10 | 2005-08-24 | 诺维信公司 | 地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞 |
| WO2006026125A2 (en) * | 2004-08-16 | 2006-03-09 | Nature Technology Corp. | Improved strains of e. coli for plasmid dna production |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| G.D. COOKE ET AL.: "A modified Escherichia coli protein production strain expressing staphylococcal nuclease, capable of auto hydrolysing host nucleic acid", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| JANNE KEROVUO ET AL.: "A new efficient expression system for Bacillus and its application to production of recombinant phytase", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 * |
| 刘勇 等: "蜡样芽孢杆菌分泌超氧化物歧化酶特性的研究", 《饲料工业》 * |
| 周冰 等: "枯草芽孢杆菌蛋白质分泌机制研究进展", 《生物技术通讯》 * |
| 邓兵兵: "外源蛋白在芽孢杆菌中分泌表达的研究进展", 《生物工程进展》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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