CN113166277A

CN113166277A - 具有脂肪酶活性的多肽及其用于小麦分离的用途

Info

Publication number: CN113166277A
Application number: CN201980075663.0A
Authority: CN
Inventors: 李明; J·拉维妮; T·谢佩德; A·肖斯; T·P·吉本斯; 彭巍; 孙天齐; L·L·H·克里斯滕森
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2021-07-23
Also published as: US20220002690A1; EP3883973A1; WO2020103861A1; CA3117735A1; AU2019382494A1

Abstract

提供了用脂肪酶处理小麦粉的改进的方法。进一步提供了分离小麦粉以提供面筋级分、淀粉级分和纤维级分的方法，其中将该小麦粉用所选择的脂肪酶处理。还提供了具有脂肪酶活性的多肽，包含多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有脂肪酶活性的多肽及其用于小麦分离的用途

序列表的引用

本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及一种使用脂肪酶进行小麦面筋淀粉分离的方法。特别地，本发明涉及新的脂肪酶的用途或先前未在小麦面筋淀粉分离中使用的脂肪酶的用途，这些脂肪酶在这种应用中具有特别良好的性能。

本发明涉及具有脂肪酶活性的新的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。

背景技术

作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖)、醇(例如乙醇)和增甜剂之前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于0.5％的杂质(包括蛋白质)，则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。

将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分是熟知的工业工艺，并且通常使用包括以下步骤的工艺进行：

a)将水和小麦粉混合；

b)将混合物孵育预先确定的一段时间以使面筋形成面筋网络；

c)将混合物分离成至少两种级分，即富含面筋级分和富含淀粉级分；以及

d)任选地进一步纯化这些级分。

一些酶(例如，脂肪酶)改进了小麦粉至面筋和淀粉的分离。

Melis等人(2017)J.Agric.Food Chem.[农业与食品化学杂志],65:1932-1940描述了脂肪酶在将小麦粉分离成面筋和淀粉中的用途。在该研究中，作者使用了商业脂肪酶并且描述了这些商业脂肪酶对小麦分离的影响。然而，商业脂肪酶最初是为了除小麦面筋淀粉分离之外的其他应用开发的，因此需要为此应用而特别选择的新的脂肪酶。

发明内容

在第一方面，本发明涉及将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的工艺，该工艺包括以下步骤：

a)将小麦粉和水混合；

b)添加具有脂肪酶活性的一种或多种多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

e)回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的该两种或更多种级分；

其中该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽选自具有脂肪酶活性并且与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24之一具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。

在第二方面，本发明涉及具有脂肪酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(i)

(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(ii)

(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严格条件下与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(iii)

(a)与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列、其cDNA序列或其全长互补序列杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(iv)

(a)与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列、其cDNA序列或其全长互补序列杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:10的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；和

(v)

(a)与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列、其cDNA序列或其全长互补序列杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:14的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(vi)

(a)与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；

(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列、其cDNA序列或其全长互补序列杂交；

(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性；

(d)SEQ ID NO:24的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入；以及

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

在第三方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物，例如全培养液配制品或细胞培养组合物。

在第四方面，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸、包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体、包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞以及使用本发明的重组宿主细胞来产生具有脂肪酶活性的多肽的方法。

定义

脂肪酶：术语“脂肪酶”意指催化游离脂肪酸(FFA)从脂质，特别是从小麦脂质释放的脂肪酶活性。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序，通过将酶与10％小麦浆液在38℃孵育20分钟确定脂肪酶活性，随后确定所释放的FFA的量。在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NQ:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少20％，例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的脂肪酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意指含有该酶的催化机构的酶的区域。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失的一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中该片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段由较短版本的成熟多肽(例如，通过进行N-和/或C-末端截短)组成。在一个实施例中，片段包含SEQID NO:4的氨基酸29至301、或SEQ ID NO:4的16至288、或SEQ ID NO:4的12至285。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:6的氨基酸32至302；或SEQ ID NO:6的35至302。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:8的氨基酸88至377。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:10的氨基酸32至343；或SEQ ID NO:10的35至306；或SEQ ID NO:10的32至306。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:12的氨基酸105至395。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:14的氨基酸30至150。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:16的氨基酸30至247。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:18的氨基酸34至255。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:20的氨基酸36至288。

在一个实施例中，片段包含SEQ ID NO:24的氨基酸33至339或SEQ ID NO:24的33至310。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如，宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:2的氨基酸20至413；SEQ ID NO:4的氨基酸16至339、或SEQ ID NO:4的29至301、或SEQ ID NO:4的16至288、或SEQ ID NO:4的12至285；SEQ ID NO:6的氨基酸16至339、或SEQID NO:6的32至302、或SEQ ID NO:6的35至302；SEQ ID NO:8的氨基酸28至377、或SEQ IDNO:8的88至377；SEQ ID NO:10的氨基酸18至343、或SEQ ID NO:10的32至343；或SEQ IDNO:10的35至306；或SEQ ID NO:10的32至306；SEQ ID NO:12的氨基酸29至395、或SEQ IDNO:12的105至395；SEQ ID NO:14的氨基酸17至185、或SEQ ID NO:14的30至150；SEQ IDNO:16的氨基酸18至247、或SEQ ID NO:16的30至247；SEQ ID NO:18的氨基酸20至255、或SEQ ID NO:18的34至255；SEQ ID NO:20的氨基酸24至228、或SEQ ID NO:20的36至288；SEQID NO:24的氨基酸17至339、或SEQ ID NO:24的33至339、或SEQ ID NO:24的33至310。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸158至1342，并且SEQ ID NO:1的核苷酸101至157编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸46至1020，并且SEQ ID NO:3的核苷酸1至45编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:5的核苷酸546至1163或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:5的核苷酸501至545编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸82至1134，并且SEQ ID NO:7的核苷酸1至81编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:9的核苷酸152至1237或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:9的核苷酸101至151编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:11的核苷酸185至1652或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:11的核苷酸101至184编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:13的核苷酸90至658或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:13的核苷酸42至89编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:15的核苷酸99至866或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:15的核苷酸48至98编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸158至1044或其cDNA序列，并且SEQ ID NO:17的核苷酸101至157编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:19的核苷酸89至706，并且SEQ ID NO:19的核苷酸20至88编码信号肽；该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:23的核苷酸49至97和155至1077，并且SEQ ID NO:23的核苷酸1至48编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失一个或多个(例如，几个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有脂肪酶活性的片段。在一方面，SEQ ID NO:1的子序列含有至少481个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸464至946)、至少603个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸398至1000)、或至少1053个核苷酸(例如，SEQ IDNO:1的核苷酸248至1300)，SEQ ID NO:3的子序列含有至少396个核苷酸(例如，SEQ ID NO:3的核苷酸307至702)、至少603个核苷酸(例如，SEQ ID NO:3的核苷酸223至825)、或至少902个核苷酸(例如，SEQ ID NO:3的核苷酸88至990)，SEQ ID NO:5的子序列含有至少396个核苷酸(例如，SEQ ID NO:5的核苷酸927至1322)、至少660个核苷酸(例如，SEQ ID NO:5的核苷酸776至1436)、或至少811个核苷酸(例如，SEQ ID NO:5的核苷酸701至1511)，SEQ IDNO:9的子序列含有至少391个核苷酸(例如，SEQ ID NO:9的核苷酸527至917)、至少566个核苷酸(例如，SEQ ID NO:9的核苷酸389至955)、或至少807个核苷酸(例如，SEQ ID NO:9的核苷酸299至1105)，SEQ ID NO:13的子序列含有至少383个核苷酸(例如，SEQ ID NO:13的核苷酸147至529)、至少512个核苷酸(例如，SEQ ID NO:13的核苷酸99至610)、或至少642个核苷酸(例如，SEQ ID NO:13的核苷酸99至640)。

变体：术语“变体”意指具有脂肪酶活性的、在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据某一位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，几个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。

具体实施方式

小麦面筋淀粉分离

本发明涉及将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的方法，该方法包括以下步骤：

a)将小麦粉和水混合；

b)添加具有脂肪酶活性的一种或多种多肽；

c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

其中该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽选自具有脂肪酶活性并且与SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24之一具有至少60％序列同一性的多肽。

原则上该小麦粉可以是任何小麦粉，并且本发明不限于本领域中已知的任何特定小麦品种、品牌或研磨方法。

将小麦粉和水混合是本发明方法中的第一步，并且其目的是通过有效混合使小麦粉水合和面筋团聚。此步骤是在本领域熟知的，并且有时也称为面团制备。该步骤通过在搅拌下将水和小麦粉混合来进行，从而形成混合物或面团。

添加到小麦粉中的水的量取决于以下因素，例如特定的工艺条件、特定的小麦和所使用的小麦品种，并且本领域技术人员将容易确定。典型地，添加的水的量是在0.1-3升/kg小麦粉，优选0.5-2.5升/kg小麦粉、优选1-2升/kg小麦粉的范围内。

典型地由成分决定条件(例如pH和温度)，这意味着通常无需任何pH和温度调节即可进行混合，因此pH和温度由所使用的原材料确定。

根据本发明，将具有脂肪酶活性的一种或多种多肽添加至混合物中。可以将具有脂肪酶活性的一种或多种多肽与小麦粉一起添加，或它可以在小麦粉和水已经混合后添加。当已添加具有脂肪酶活性的一种或多种多肽时，混合应持续至少足够的时间以确保其在混合物或面团中均匀分布。典型地，将具有脂肪酶活性的一种或多种多肽以0.1-500μg酶蛋白/克小麦粉(μg EP/g小麦)的范围内(例如1-200μg EP/g小麦范围内，例如5-100μg EP/g小麦范围内)的量添加。

在一些实施例中，将一种或多种另外的酶与具有脂肪酶活性的一种或多种多肽一起添加。就此而言，“一起添加”旨在意指将一种或多种另外的酶与具有脂肪酶活性的一种或多种多肽同时或依次添加，使得将该一种或多种另外的酶和该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽混合，并且当混合过程完成时，其在混合物或面团中均匀地分布。因此，可以将具有脂肪酶活性的一种或多种多肽和一种或多种另外的酶作为单一组合物或作为两种或更多种单独的组合物(每种包含一种或多种酶)添加。

一种或多种另外的酶可以选自纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶。

在优选的实施例中，将具有木聚糖酶活性的多肽与具有脂肪酶活性的多肽一起添加。具有木聚糖酶活性的多肽可以选自GH8、GH10或GH11木聚糖酶。

根据本发明，优选的木聚糖酶是在WO 97/021785中披露的GH10木聚糖酶。

具有木聚糖酶活性的另一种优选的多肽是在WO 2011/070101中披露的GH8木聚糖酶。优选地，具有GH8木聚糖酶活性的多肽按以下量存在：优选0.0005至1.5mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.001至1mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.01至0.5mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.025至0.25mg酶蛋白/g小麦粉。

在一个优选的实施例中，具有木聚糖酶活性的多肽是木聚糖酶，该木聚糖酶是GH8木聚糖酶并且与SEQ ID NO:21具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

在另一个优选的实施例中，具有木聚糖酶活性的多肽是木聚糖酶，该木聚糖酶是GH10木聚糖酶并且与SEQ ID NO:22具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

将混合物孵育预先确定的一段时间。混合完成时，将混合物或面团在预先确定的时间孵育以使面筋形成面筋网络。此外，具有脂肪酶活性的一种或多种多肽在此期间将水解混合物或面团中的脂质，并且任选的另外的酶可在此孵育期间作用于它们的底物。这也称为面团成熟，并且其通常在熟化罐中进行。通常，孵育是在环境温度下进行的，即没有温度调节。因此，孵育通常在5℃-50℃的温度范围内进行，优选地在15℃-40℃的温度范围内进行，并且最优选地在20℃-35℃的温度范围内进行。

进行足够时间的孵育以形成面筋网络，并且本领域技术人员容易确定持续时间。混合物可以进行5分钟至8小时范围内的时间，例如15分钟至4小时范围内。

将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分。孵育期后，将混合物分离成包括富含淀粉级分和富含面筋级分的两种或更多种级分。

在本申请中，富含淀粉级分旨在意指包含至少50％(w/w)淀粉的级分，优选至少60％(w/w)淀粉、优选至少70％(w/w)淀粉、优选至少80％(w/w)淀粉、优选至少90％(w/w)淀粉的级分，其基于级分的干物质计算。

在本申请中，富含面筋级分旨在意指包含至少50％(w/w)面筋的级分，优选至少60％(w/w)面筋、优选至少70％(w/w)面筋、优选至少80％(w/w)面筋、优选至少90％(w/w)面筋的级分，其基于级分的干物质计算。

可以使用本领域已知的方法和设备基于溶解度和密度的差异来进行分离步骤。

在优选的实施例中，使用三相分离器工艺进行分离步骤，将混合物或面团分离成富含淀粉级分；富含面筋级分；以及具有高纤维含量的戊聚糖级分，特别是戊聚糖(例如阿拉伯糖基木聚糖)。

在分离步骤将混合物/面团分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分后，可以对这些级分中的每一种进行另外的分离步骤，以甚至进一步纯化这些级分并避免损失。此类操作在本领域中是已知的，是例如称为面筋洗涤、淀粉洗涤和纤维洗涤，并且通常使用本领域已知的许多倾析器、双锥筒体离心机(sedicanter)、离心机、筛网、水力旋流器等进行。

分离步骤已经完成，并且两种或更多种级分已经获得其预期的纯度，通常通过去除过量的水并获得呈干燥稳定形式的级分来回收级分。可替代地，可以将所获得的级分不进行干燥而立即进行进一步加工。

在另一方面，本发明涉及具有脂肪酶活性的一种或多种多肽在用于将小麦分离成面筋级分、淀粉级分和纤维级分的工艺中的用途，该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽选自具有脂肪酶活性并且与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24之一具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，优选地与具有木聚糖酶活性的一种或多种多肽组合的具有脂肪酶活性的一种或多种多肽的用途，该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽选自具有脂肪酶活性并且与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24之一具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。

从本发明的工艺中可以得到几个技术益处，包括改进的分离；优选地，该工艺提供了如本文所确定的降低的小麦粉浆液中的粘度和/或如本文所确定的更高的蛋白质回收。这已经反映出与之前的方法相比在第一分离步骤中将混合物或面团分离成包括富含淀粉级分和富含面筋级分的两种或更多种级分的能力。例如，使用三相分离器显示，与不添加根据本发明的脂肪酶进行的相应分离相比，使用根据本发明的脂肪酶的能力增加了超过20％。

具有脂肪酶活性的多肽

在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，这些多肽具有脂肪酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少70％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少75％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少80％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少85％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少90％的活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少95％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少至少100％的脂肪酶活性。

在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸20至413或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补序列(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的、具有脂肪酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸101至1347、核苷酸158至1347、核苷酸300至1200、或核苷酸500至1000。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:2的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，这些多肽具有脂肪酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少70％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少75％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少80％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少85％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少90％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少95％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少至少100％的脂肪酶活性。

在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:4的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:4的氨基酸16至339、SEQ ID NO:4的氨基酸29至301、或SEQ ID NO:4的16至288、或SEQ ID NO:4的12至285。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补序列(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:3的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:4的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的、具有脂肪酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:3或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:3；(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:3的核苷酸1至1020、核苷酸46至1000、核苷酸200至800、或核苷酸300至700。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ IDNO:4的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:3。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:4的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:4的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，这些多肽具有脂肪酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少70％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少75％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少80％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少85％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少90％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少95％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:6的成熟多肽的至少至少100％的脂肪酶活性。

在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:6的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:6的氨基酸16至339、SEQ ID NO:6的氨基酸32至302；或SEQ ID NO:6的35至302。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:5的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:6的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的、具有脂肪酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:5或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:5；(ii)SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:5的核苷酸501至1631、核苷酸546至1631、核苷酸648至813、或核苷酸872至1631。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQID NO:6的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:6或其cDNA序列。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，这些多肽具有脂肪酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:10的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少70％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少75％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少80％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少85％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少90％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少95％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:10的成熟多肽的至少至少100％的脂肪酶活性。

在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:10的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:10的氨基酸18至343、SEQ ID NO:10的氨基酸32至343；或SEQ ID NO:10的35至306；或SEQ ID NO:10的32至306。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:9的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:10的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的、具有脂肪酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:9或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:9；(ii)SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:9的核苷酸101至1237、核苷酸152至1237、核苷酸246至411、或核苷酸466至1237。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQID NO:10的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:9或其cDNA序列。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:9的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:10的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:10的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，这些多肽具有脂肪酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:14的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少70％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少75％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少80％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少85％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少90％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少95％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:14的成熟多肽的至少至少100％的脂肪酶活性。

在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:14的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:14的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:14的氨基酸17至185或SEQ ID NO:14的氨基酸30至150。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:13的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:14的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的、具有脂肪酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:13或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:13；(ii)SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:13的核苷酸42至658、核苷酸90至658、核苷酸90至382、或核苷酸442至658。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:14的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:13或其cDNA序列。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:13的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:14的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:14的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

在实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，这些多肽具有脂肪酶活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID NO:24的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少70％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少75％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少80％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少85％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少90％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少95％的脂肪酶活性。

在特定的实施例中，本发明涉及与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽，并且其中该多肽具有SEQ ID NO:24的成熟多肽的至少至少100％的脂肪酶活性。

在实施例中，该多肽已经被分离。本发明的多肽优选地包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列或其等位基因变体；或是其具有脂肪酶活性的片段。在另一方面，该多肽包含SEQ ID NO:24的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸17至339、或SEQ ID NO:24的氨基酸33至339、或SEQ ID NO:24的氨基酸33至310。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下项杂交：(i)SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列，(ii)其cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补序列(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约)。在实施例中，该多肽已经被分离。

SEQ ID NO:23的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:24的多肽或其片段可用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆编码来自不同属或物种的菌株的、具有脂肪酶活性的多肽的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有脂肪酶活性的多肽的DNA，对从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:23或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:23；(ii)SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:23的核苷酸49至97和155至1077。在另一方面，该核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:24的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:23或其cDNA序列。

在另一个实施例中，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有脂肪酶活性的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:23的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入的SEQ ID NO:24的成熟多肽的变体。在实施例中，引入SEQ ID NO:24的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个。氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。

具有脂肪酶活性的多肽的来源

本发明的具有脂肪酶活性的多肽可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。

在一方面，本发明的具有脂肪酶活性的多肽源自属于以下的菌株：小不整球壳属(Plectosphaerella)、丛赤壳属(Nectria)、枝顶孢霉属(Acremonium)、毛霉属(Mucor)、镰孢属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)或腐质霉属(Humicola)。

在另一方面，该多肽是泽泻小不整球壳菌(Plectosphaerella alismatis)多肽、五通桥毛霉(Mucor wutungkiao)多肽、卷枝毛霉(Mucor circinnelloides)多肽、腐皮镰孢(Fusarium solani)多肽、深绿木霉(Trichoderma atroviride)多肽、或特异腐质霉(Humicola insolens)多肽。

应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center，NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆多核苷酸。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如本文中所述。在实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自曲霉属菌株或相关有机体，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。

编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。在一个实施例中，该一个或多个控制序列对于本发明的多核苷酸可以是外源的(异源的)。

可用许多方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌crylllA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因中获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其变体、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。

酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区域的实例从以下的基因中获得：苏云金芽孢杆菌crylllA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因中获得。

酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下的基因中获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以含有对编码序列而言外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。其他信号肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews[微生物评论]57:109-137描述。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因中获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人(1992，同上)描述。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。在一个实施例中，该一个或多个控制序列对于本发明的多核苷酸可以是外源的(异源的)。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制性位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。优选的用于曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选的用于木霉属细胞中的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。在一个实施例中，本发明的多核苷酸对于宿主细胞可以是外源的(异源的)。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌亚种(B.amyloliquefacienssubsp.plantarum)、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacterial.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞中可以通过以下方式来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下方式来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fung[安斯沃思和拜斯比真菌词典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。

真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌纲(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适的程序在EP 238023、Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474、以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的合适的方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156以及WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和任选地(b)回收该多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地(b)回收该多肽。

宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。

可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规程序，包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一方面，回收包含多肽的发酵液。

可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。

在替代性方面，不回收多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作多肽的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的脂肪酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichmentfactor)增加。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，几种)酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。

下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。组合物的剂量以及使用组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

在以下编号的实施例中进一步描述本发明。

实施例1.一种将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的工艺，该工艺包括以下步骤：

(a)将小麦粉和水混合；

(b)添加具有脂肪酶活性的一种或多种多肽；

(c)将混合物孵育预先确定的一段时间；

(d)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

(e)回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的该两种或更多种级分；

实施例2.如实施例1所述的工艺，其中在步骤a)中，将水和小麦粉以0.1-3升水/kg小麦粉，优选0.5-2.5升水/kg小麦粉、优选1-2升水/kg小麦粉的比率混合。

实施例3.如实施例1或2所述的工艺，其中将该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽以0.1-500μg酶蛋白/克小麦粉(μg EP/g小麦)，例如1-200μg EP/g小麦粉范围内，例如5-100μg EP/g小麦粉范围内的量添加。

实施例4.如前述实施例中任一项所述的工艺，其中将木聚糖酶与该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽一起添加。

实施例5.如实施例4所述的工艺，其中该木聚糖酶选自属于GH8、GH10或GH11家族的木聚糖酶。

实施例6.如实施例5所述的工艺，其中该木聚糖酶是GH8木聚糖酶并且与SEQ IDNO:21具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

实施例7.如实施例5所述的工艺，其中该木聚糖酶是GH10木聚糖酶并且与SEQ IDNO:22具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

实施例8.如实施例4-7中任一项所述的工艺，其中将该木聚糖酶按以下量添加：0.0005至1.5mg酶蛋白/g小麦粉，优选0.001至1mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.01至0.5mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.025至0.25mg酶蛋白/g小麦粉。

实施例9.如前述实施例中任一项所述的工艺，其中步骤c)中的孵育进行5分钟至8小时，优选15分钟至4小时。

实施例10.如前述实施例中任一项所述的工艺，其中步骤d)在三相分离器中进行并且提供富含面筋级分、富含淀粉级分和富含戊聚糖/纤维级分。

实施例11.如前述实施例中任一项所述的工艺，该工艺与不添加具有脂肪酶活性的多肽的类似工艺相比具有选自以下的一个或多个益处：降低的小麦粉浆液中的粘度、更高的蛋白质回收和分离步骤中更高的通量。

实施例12.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例13.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例14.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例15.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例16.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:10的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例17.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:12的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例18.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:14的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例19.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:16的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例20.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:18的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例21.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:20的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例22.如实施例1所述的工艺，其中该脂肪酶选自：

(a)与SEQ ID NO:24的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多肽；和

(b)(a)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例23.如实施例12至22中任一项所述的工艺，其中这些片段选自由以下组成的组：

(a)SEQ ID NO:4的氨基酸29至301、或SEQ ID NO:4的16至288、或SEQ ID NO:4的12至285；

(b)SEQ ID NO:6的氨基酸32至302；或SEQ ID NO:6的35至302；

(c)SEQ ID NO:8的氨基酸88至377；

(d)SEQ ID NO:10的氨基酸32至343；或SEQ ID NO:10的35至306；或SEQ ID NO:10的32至306；

(e)SEQ ID NO:12的氨基酸105至395；

(f)SEQ ID NO:14的氨基酸30至150；

(g)SEQ ID NO:16的氨基酸30至247；

(h)SEQ ID NO:18的氨基酸34至255；

(i)SEQ ID NO:20的氨基酸36至288；以及

(j)SEQ ID NO:24的氨基酸33至339、或SEQ ID NO:24的33至310。

实施例24.一种具有脂肪酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(i)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(ii)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(iii)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(iv)

(v)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(vi)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

实施例25.如实施例24所述的多肽，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24；或SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24的成熟多肽。

实施例26.如实施例25所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至413；SEQ ID NO:4的氨基酸16至339；SEQ ID NO:6的氨基酸16至339；SEQ ID NO:10的氨基酸18至343，SEQ ID NO:14的氨基酸17至185；或SEQ ID NO:24的氨基酸20至339。

实施例27.如实施例24-26所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24的片段，其中该片段具有脂肪酶活性。

实施例28.如实施例27所述的多肽，其中该片段选自由以下组成的组：

(i)SEQ ID NO:4的氨基酸29至301、或SEQ ID NO:4的16至288、或SEQ ID NO:4的12至285；

(ii)SEQ ID NO:6的氨基酸32至302；或SEQ ID NO:6的35至302；

(iii)SEQ ID NO:10的氨基酸32至343；或SEQ ID NO:10的35至306；或SEQ ID NO:10的32至306；

(iv)SEQ ID NO:14的氨基酸30至150；以及

(v)SEQ ID NO:24的氨基酸33至339、或SEQ ID NO:24的33至310。

实施例29.一种组合物，该组合物包含如实施例24-28中任一项所述的多肽。

实施例30.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如实施例24-28中任一项所述的多肽。

实施例31.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如实施例24-28中任一项所述的多肽。

实施例32.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如实施例31所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

实施例33.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如实施例31所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

实施例34.一种产生具有脂肪酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如实施例33所述的宿主细胞。

实施例35.如实施例34所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

酶：

脂肪酶：Lipolase^TM，可获得自诺维信公司(Novozymes A/S)，鲍斯韦(

)，丹麦

菌株：

使用购自天根(TIANGEN)(天根生物科技有限公司(TIANGEN Biotech Co.Ltd.)，北京，中国)的大肠杆菌Top-10菌株来繁殖本文的表达载体。

使用米曲霉MT3568菌株用于编码多肽的基因的异源表达，该多肽与具有脂肪酶活性的多肽具有同源性。米曲霉MT3568是米曲霉JaL355的amdS(乙酰胺酶)破坏的基因衍生物(WO 02/40694)，其中通过用pyrG基因破坏米曲霉乙酰胺酶(amdS)基因来恢复pyrG营养缺陷型。

培养基

YPM培养基由以下构成：10g酵母提取物、20g细菌用蛋白胨(Bacto-peptone)、20g麦芽糖、以及补足至1000ml的去离子水。

LB板由以下构成：10g细菌用胰蛋白胨(Bacto-tryptone)、5g酵母提取物、10g氯化钠、15g细菌用琼脂(Bacto-agar)、以及补足至1000ml的去离子水。

LB培养基由以下构成：1g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g氯化钠、以及补足至1000ml的去离子水。

COVE蔗糖板由以下构成：342g蔗糖、20g琼脂粉、20ml COVE盐溶液、以及补足至1升的去离子水。将培养基在15psi下通过高压灭菌进行灭菌15分钟。将培养基冷却至60℃并且添加10mM乙酰胺、15mM CsCI、Triton X-100(50μg/500ml)。

用于分离的COVE-2板/管：30g/L蔗糖、20ml/L COVE盐溶液、10mM乙酰胺、30g/L纯净琼脂(noble agar)(Difco，目录号214220)。

COVE盐溶液由以下构成：26g MgSO₄·7H₂O、26g KCL、26g KH₂PO₄、50ml COVE痕量金属溶液、以及补足至1000ml的去离子水。

COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g Na₂B₄O₇·10H₂O、0.4g CuSO₄·5H₂O、1.2gFeSO₄·7H₂O、0.7g MnSO₄·H₂O、0.8g Na₂MoO₄·2H₂O、10g ZnSO₄·7H₂O、以及补足至1000ml的去离子水。

成熟多肽：

使用本领域熟知的技术来确定脂肪酶多肽及其具有脂肪酶活性的片段的成熟形式，例如，用EndoH去糖基化后通过LC-MS确定的精确完整质量。

实例1：小麦蛋白质回收

将大约250g的小麦粉转移到适当大小的混合用碗中。然后将150mL加热的自来水添加至粉中。将棘孢曲霉木聚糖酶(在WO 2005/118769中披露)以15μg EP/g粉施用，并且将脂肪酶(Lipolase^TM)以3ug EP/g粉施用。包括具有木聚糖酶但不具有脂肪酶的对照。将内容物用立式搅拌器(装配有和面钩并将转速设置为4)(Kitchen Aid Model:Ultra Power最大值300瓦)混合4分钟。之后，将形成的面团静置8分钟，然后将250mL加热的自来水添加至混合用碗中。用平板式搅拌器将内容物在搅拌速度设置下再混合25分钟。然后将1000mL加热的自来水添加至混合用碗中。将内容物再次搅拌35分钟，然后倒在425-um筛上。振动筛以使其分离。将大约1000mL加热的自来水添加至混合用碗中以进行最终冲洗，然后倒在所述筛上并如之前一样振动。回收保留在筛顶部的材料，然后使用总氮分析仪(LECO公司型号FP628)分析蛋白质含量。结果示于表1中，其中显然脂肪酶使蛋白质回收提高了约1.5％-2％。

表1

处理	蛋白质回收％
		木聚糖酶	17
木聚糖酶+Lipolase<sup>TM</sup>	18.8

实例2：鉴定并克隆来自泽泻小不整球壳菌的脂肪酶基因

通过QIAamp DNA血液迷你试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离来自泽泻小不整球壳菌的染色体DNA。将5ug的染色体DNA送至FASTERIS SA，瑞士进行测序。针对编码脂肪分解酶的可读框分析基因组序列，并且鉴定泽泻小不整球壳菌脂肪酶。通过PCR反应来扩增该泽泻小不整球壳菌脂肪酶基因。对于PCR反应，在PCR反应中使用了20pmol的引物对(正向和反向中每一个)，该PCR反应由以下构成：1μl的包含质粒DNA的SEQ ID NO:1、10μl 5X GC缓冲液、1.5μl DMSO、2.5mM的dATP、dTTP、dGTP及dCTP中每一种，以及0.6单位的Phusion^TM高保真度DNA聚合酶(费泽姆公司(FinnzymesOy)，埃斯波，芬兰)，最终体积为50pl。使用Peltier热循环仪(MJ研究公司(M J ResearchInc.)，南旧金山，加利福尼亚州，美国)进行扩增，其程序为在98℃变性1分钟；10个循环，每循环在98℃变性15秒，在65℃退火30秒，其中每个循环降低1℃，并在72℃延伸90秒；和另外的26个循环，每循环在98℃持续15秒，在60℃持续30秒，并在72℃持续90秒；最后在72℃延伸持续10分钟。加热块然后进入4℃浸泡循环。

使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，其中在UV光下看到1.1kb的产物带。然后，根据制造商的说明书，通过使用GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE医疗集团(GE Healthcare)，白金汉郡，英国)从溶液中纯化出PCR产物。

遵循制造商的建议，用来自NEB(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，法兰克福，德国)的BamHI和Xhol消化质粒pCaHj505(WO 2013029496)，并且根据制造商的说明书，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离产生的片段，并且使用GFX PCR DNA和凝胶带纯化试剂盒(GE医疗集团，白金汉郡，英国)进行纯化。

根据制造商的说明书，通过与IN-FUSION^TM CF脱水克隆试剂盒(克隆技术实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.)，山景城，加利福尼亚州，美国)连接，将60ng的该纯化的PCR产物克隆到200ng的之前消化的表达载体pCaHj505中。

将2.5μl体积的稀释的连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10化学感受态细胞(描述于Strains[菌株]中)。从每ml含有100ug氨苄青霉素的LB琼脂糖板选择4个菌落，并且通过菌落PCR用载体引物证实。通过DNA测序用载体引物(由诺赛基因有限公司(SinoGenoMaxCompany Limited)，北京，中国)验证泽泻小不整球壳菌脂肪酶合成序列。选择包含SEQ IDNO:1的质粒用于在米曲霉宿主细胞MT3568(描述于菌株章节中)中进行原生质体转化及其编码的脂肪酶的异源表达。包含菌落的SEQ ID NO:1在3ml的、每ml补充有100ug的氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。根据制造商的说明书，使用凯杰公司旋转迷你制备型(SpinMiniprep)试剂盒(目录27106)(凯杰股份有限公司(QIAGEN GmbH)，希尔登，德国)纯化质粒DNA。

实例3：用编码来自泽泻小不整球壳菌的脂肪酶的基因转化米曲霉并且选择最好的转化体

米曲霉MT3568(参见菌株章节)的原生质体是根据WO 95/002043制备的。将100μl的原生质体与2.5-10ug的包含SEQ ID NO:23的曲霉属表达载体和250μl的60％PEG 4000、10mM CaCl₂、和10mM Tris-HCl(pH 7.5)混合，并且轻轻混合。将混合物在37℃孵育30分钟，并且将这些原生质体涂布到COVE蔗糖板上用于选择。在37℃孵育4-7天后，将4个转化体的孢子接种到3ml的YPM培养基中。在30℃下培养3天后，使用

4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司(Invitrogen Corporation)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)通过SDS-PAGE分析培养液，以鉴定从泽泻小不整球壳菌产生最大量的重组脂肪酶的转化体。

使用橄榄油/琼脂糖板(1％蛋白级琼脂糖；1％橄榄油；0.008％亮绿；50mM HepespH 7.2)研究由曲霉属转化体产生的脂肪酶的水解活性。将来自不同转化体的20μl等分试样的培养液、缓冲液(阴性对照)分配到直径为3mm的冲孔中并且在37℃下孵育1小时。随后检查这些板中的孔周围存在或不存在对应于脂肪分解活性的深绿区。

基于这两个选择标准，将最好的转化体的孢子涂布于用于再分离的COVE-2板上，以分离单个菌落。然后将单个菌落涂布于COVE-2管上直到孢子形成。

实例4：用编码来自泽泻小不整球壳菌的脂肪酶的基因转化的米曲霉的发酵

在80rpm搅拌下在30℃温度下的3天期间，将来自最好转化体的孢子在摇瓶中的2400ml YPM培养基中培养。使用0.2pm过滤装置通过过滤收获培养液。将过滤的发酵液用于酶表征。

实例5：制备新的脂肪酶

使用基本上如实例2-4中所述的方法，克隆并产生来自以下微生物的另外的脂肪酶。如表2中所概述的，共从微生物中克隆了5种新的脂肪酶并且针对每种脂肪酶制备了酶。

表2

实例6：小麦粉浆液中的脂肪酶活性

如上所述制备实例2-5中描述的脂肪酶和表3中列出的脂肪酶，并且测试其在小麦粉浆液中的脂肪酶活性。

表3.

来源	参考文献	序列
			五通桥毛霉	WO 2017/093318	SEQ ID NO:7/8
卷枝毛霉	WO 2014/147127	SEQ ID NO:11/12
			深绿木霉	WO 2014/081884	SEQ ID NO:15/16
青霉属物种	WO 2018/099965	SEQ ID NO:17/18
			特异腐质霉	WO 2015/085920	SEQ ID NO:19/20

为了确定脂肪酶活性，使用0.01％Triton X-100将每种脂肪酶稀释至100、50、25和12.5μg/ml。然后将30μl稀释的脂肪酶样品添加到96孔微量滴定板的孔中，该微量滴定板含有预热至38℃的150μl 20％w/w小麦粉浆液，从而产生浓度为100、50、25和12.5μg脂肪酶/g小麦粉。伴随搅拌在38℃孵育20min后，通过添加50μl终止试剂(1M磷酸，7.5％TritonX-100)来终止反应。在50℃加热30min以溶解游离脂肪酸后，将微量滴定板离心1min。使用NEFA试剂盒(非酯化脂肪酸(NEFA)，FUJIFILM和光诊断公司(FUJIFILM Wako DiagnosticsCorporation)，加利福尼亚州，美国)来确定上清液中游离脂肪酸的浓度。用1％Triton X-100稀释2倍后，将10μl稀释的上清液与50μl 0.2M MES pH 7和50μl R1试剂(来自NEFA试剂盒)混合。在室温下孵育15min后，读取546nm处的吸光度。然后添加来自NEFA试剂盒的25μlR2试剂，并且伴随搅拌在室温下孵育15min后，再次读取546nm处的吸光度。将与油酸标准曲线得出的结果组合的546处的吸光度差(添加R2试剂之前和之后)用于计算游离脂肪酸的释放浓度。将可商购的脂肪酶Lipolase^TM包括为对照酶。

结果示于表4中。

表4 FFA(mM)的释放

结果表明，新的脂肪酶在小麦浆液中具有高活性，几乎等于或甚至优于商业脂肪酶Lipolase^TM。

本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims

1.一种将小麦粉分离成包括面筋级分和淀粉级分的两种或更多种级分的工艺，该工艺包括以下步骤：

f)将小麦粉和水混合；

g)添加具有脂肪酶活性的一种或多种多肽；

h)将混合物孵育预先确定的一段时间；

i)将混合物分离成包括富含面筋级分和富含淀粉级分的两种或更多种级分；以及

j)回收包括富含面筋级分和富含淀粉级分的该两种或更多种级分；

其中该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽选自具有脂肪酶活性并且与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24之一具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽。

2.如权利要求1所述的工艺，其中在步骤a)中，将水和小麦粉以0.1-3升水/kg小麦粉、优选0.5-2.5升水/kg小麦粉、优选1-2升水/kg小麦粉的比率混合。

3.如权利要求1或2所述的工艺，其中将该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽以0.1-500μg酶蛋白/克小麦粉(μg EP/g小麦)，例如1-200μg EP/g小麦粉范围内，例如5-100μgEP/g小麦粉范围内的量添加。

4.如前述权利要求中任一项所述的工艺，其中将木聚糖酶与该具有脂肪酶活性的一种或多种多肽一起添加。

5.如权利要求4所述的工艺，其中该木聚糖酶选自属于GH8、GH10或GH11家族的木聚糖酶。

6.如权利要求5所述的工艺，其中该木聚糖酶是GH8木聚糖酶并且与SEQ ID NO:21具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

7.如权利要求5所述的工艺，其中该木聚糖酶是GH10木聚糖酶并且与SEQ ID NO:22具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

8.如权利要求4-7中任一项所述的工艺，其中将该木聚糖酶按以下量添加：0.0005至1.5mg酶蛋白/g小麦粉，优选0.001至1mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.01至0.5mg酶蛋白/g小麦粉、优选0.025至0.25mg酶蛋白/g小麦粉。

9.如前述权利要求中任一项所述的工艺，其中步骤c)中的孵育进行5分钟至8小时，优选15分钟至4小时。

10.如前述权利要求中任一项所述的工艺，其中步骤d)在三相分离器中进行并且提供富含面筋级分、富含淀粉级分和富含戊聚糖/纤维级分。

11.如前述权利要求中任一项所述的工艺，该工艺与不添加具有脂肪酶活性的多肽的类似工艺相比具有选自以下的一个或多个益处：降低的小麦粉浆液中的粘度、更高的蛋白质回收和分离步骤中更高的通量。

12.一种具有脂肪酶活性的多肽，该多肽选自由以下组成的组：

(i)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(ii)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(iii)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(iv)

(v)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性；

(vi)

(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有脂肪酶活性。

13.如权利要求12所述的多肽，该多肽包含如下或由如下组成：SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24；或SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24的成熟多肽。

14.如权利要求13所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至413；SEQID NO:4的氨基酸16至339；SEQ ID NO:6的氨基酸16至339；SEQ ID NO:10的氨基酸18至343，SEQ ID NO:14的氨基酸17至185；或SEQ ID NO:24的氨基酸20至339。

15.如权利要求12-14中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失和/或插入。

16.如权利要求12-14所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、4、6、10、14或24的片段，其中该片段具有脂肪酶活性。

17.一种组合物，该组合物包含如权利要求12-16中任一项所述的多肽。

18.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如权利要求12-16中任一项所述的多肽。

19.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求12-16中任一项所述的多肽。

20.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求19所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。

21.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如权利要求19所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

22.一种产生具有脂肪酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞。

23.如权利要求22所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。