CN110100011A - Dna分子的酵母细胞提取物辅助构建 - Google Patents

Dna分子的酵母细胞提取物辅助构建 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于构建DNA分子的方法，该方法包括：在单一体外反应中将多个双链DNA片段与酵母菌株的无细胞提取物接触，以将多个DNA片段组合成DNA分子，其中每个DNA片段具有5'末端和3'末端，并且其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp同源时，DNA片段彼此组合。

Description

DNA分子的酵母细胞提取物辅助构建
序列表的引用
本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
技术领域
本发明涉及用于使用酵母细胞提取物从DNA片段构建DNA分子的方法。
背景技术
传统的DNA克隆方法涉及使用限制酶进行限制性克隆以产生适当的DNA片段，修饰DNA片段的末端以产生平端或粘性末端，并连接DNA片段以产生质粒或载体。此类克隆需要适合的限制酶和修饰酶(例如克列诺(Klenow)片段、连接酶)的可利用性。
近年来，已经开发了用于克隆的可替代的方法，涉及DNA的体外组装。
美国专利号8,609,374披露了用于在单一体外重组反应中将双链DNA片段组装成DNA分子的方法，所述方法通过双链DNA片段与源自RecA缺陷型细菌菌株的细菌提取物混合以将DNA片段组装成DNA分子。
Zhang等人(Nucleic Acids Research[核酸研究]40:e55,2012)披露了称为“无缝连接克隆提取物”(SLiCE)的克隆方法，其利用细菌细胞提取物在单一体外重组反应中将多个DNA片段组装成重组DNA分子。
Fisher等人(Front.Bioeng.Biotechnol.[生物技术与生物工程]1:12,2013)披露了一种离体DNA组装方法，其使用源自大肠杆菌的细胞裂解物连接具有嵌入引物内的短末端同源性的双链DNA。
然而，本领域需要用于从DNA片段构建DNA分子的廉价、快速且可靠的新方法。
本发明涉及用于用酵母菌株的无细胞提取物从DNA片段构建DNA分子的方法。
发明内容
本发明涉及用于构建DNA分子的方法，所述方法包括：在单一体外反应中将多个双链DNA片段与酵母菌株的无细胞提取物接触，以将多个DNA片段组合成DNA分子，其中每个DNA片段具有5'末端和3'末端，并且其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp同源时，DNA片段彼此组合。
在一个方面，该方法进一步包括将所得DNA分子转化到宿主细胞中并分离包含每个DNA分子的单菌落转化体。在另一个方面，该方法进一步包括从单个菌落转化体中回收DNA分子。在另一个方面，该方法进一步包括将编码具有目的生物活性的多肽的回收的DNA分子转化到重组宿主细胞中，其中DNA分子与指导多肽产生的一个或多个控制序列可操作地连接。在另一个方面，该方法进一步包括在适合产生具有目的生物活性的多肽的条件下培养重组宿主细胞。在另一个方面，该方法进一步包括回收具有目的生物活性的多肽。
附图说明
图1A、图1B、图1C和图1D是不同克隆能力的图像表征，其中黑色区块表示在一个或多个插入位点处的一个或多个同源序列，而灰色波浪线条表示克隆过程中非同源序列去除。图1A显示了标准克隆和多片段克隆的图示。图1B显示了在同源插入位点下游的非同源序列直接去除的图示。图1C显示了在同源插入位点上游的非同源序列直接去除的图示。图1D显示了在同源插入位点上游和下游的非同源序列去除的图示。
定义
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码目的多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
DNA文库：术语“DNA文库”意指包含来自单一基因组、两个或更多基因组、突变DNA、改组DNA等等的插入物(DNA片段)的重组表达载体或质粒的集合。该载体可以是线性或闭合环状质粒。插入DNA的来源可以是基因组、cDNA、半合成来源、合成来源或他们的任何组合。
DNA连接酶：术语“DNA连接酶”意指通过在具有游离的5'-磷酸和3'-羟基基团的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键来密封DNA分子中的切口的酶。
DNA聚合酶：术语“DNA聚合酶”意指通过复制模板链合成DNA的酶。DNA聚合酶通过将核苷酸依次添加到生长链的游离3'羟基基团上而以5'至3'方向合成DNA。模板链经由Watson-Crick碱基配对确定核苷酸的添加顺序。
下游：术语“下游”意指合成核酸的方向，即在DNA或RNA中任何给定位点的3'侧。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码所述物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码所述物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
克列诺片段：术语“克列诺片段”也称为“克列诺酶”，意指用蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶切割后形成的大肠杆菌DNA聚合酶I的两个片段中更大的一个。更大的片段保留5'→3'聚合酶和3'→5'核酸外切酶活性。
突变体：术语“突变体”意指编码包含在亲本多肽的一个或多个特定位置处的一个或多个特定氨基酸残基的一个或多个改变，例如取代、插入、缺失和/或截断的多肽变体的突变的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
亲本多肽：术语“亲本多肽”意指对其进行一种或多种改变，例如取代、插入、缺失和/或截断以产生多肽变体的多肽。亲本多肽可以是天然存在(野生型)的多肽，或者亲本蛋白质可以是通过任何适合的方法制备的氨基酸序列中已经被修饰或改变的天然存在多肽的变体。亲本多肽也可能是占据相同染色体位点的两个或更多个可替代形式的基因中的任何一个编码的多肽的等位变体。
重组：术语“重组”意指将核酸在同源区彼此联合，导致在那些序列之间产生链间DNA交换的过程。“同源重组”在这里定义为相对于输入的核苷酸序列，在同源区内核苷酸序列没有发生变化的重组。也可以通过非同源重组进行重组。“非同源重组”在这里定义为以DNA修复掺入的链交换的任何方式导致核苷酸序列不同于任何重组序列的重组。
限制酶：术语“限制酶”意指在称为限制性位点的特定识别核苷酸序列处或附近消化DNA的内切酶。限制酶也称为“限制性内切酶”。天然存在的限制性内切酶基于它们的组成和酶辅因子要求、它们的靶序列的性质以及相对于靶序列的它们的DNA切割位点的位置分为四类(I型、II型、III型和IV型)。I型酶在远离识别位点的位点切割，并且需要ATP和S-腺苷-L-甲硫氨酸起作用。II型酶在识别位点内或距识别位点近的特定距离处裂解，并且大多数需要镁。II型酶通常用于传统克隆。III型酶在距识别位点很近距离的位点切割并需要ATP。IV型酶靶向经修饰的DNA，例如甲基化的、羟甲基化的和葡糖基-羟甲基化的DNA。
转化体：术语“转化体”意指通过引入多核苷酸片段而遗传修饰的微生物。引入DNA的过程，例如转化、转染、转导等等产生转化体可以伴有源自宿主以外的不同生物的DNA，或者可以伴有使用来源于相同物种或宿主细胞的DNA。
上游：术语“上游”意指合成核酸的相反方向，即在DNA或RNA中任何给定位点的5'侧。
变体：术语“变体”意指具有生物活性的、包含一个改变(即在一个或多个(例如，数个)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
野生型多肽：术语“野生型多肽”表示天然存在的微生物表达的多肽。
在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
如在此和所附权利要求书中使用的，单数形式“一种/个”、“或”以及“该/所述”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应理解的是，在此描述的本发明的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
具体实施方式
本发明涉及用于构建DNA分子的方法，所述方法包括：在单一体外反应中将多个双链DNA片段与酵母菌株的无细胞提取物接触，以将多个DNA片段组合成DNA分子，其中每个DNA片段具有5'末端和3'末端，并且其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp同源时，DNA片段彼此组合。
在一个方面，该方法进一步包括将所得DNA分子转化到宿主细胞中并分离包含每个DNA分子的单菌落转化体。在另一个方面，该方法进一步包括从单个菌落转化体中回收DNA分子。在另一个方面，该方法进一步包括将编码具有目的生物活性的多肽的回收的DNA分子转化到重组宿主细胞中，其中DNA分子与指导多肽产生的一个或多个控制序列可操作地连接。在另一个方面，该方法进一步包括在适合产生具有目的生物活性的多肽的条件下培养重组宿主细胞。在另一个方面，该方法进一步包括回收具有目的生物活性的多肽。
本发明的方法基于使用酵母菌株的无细胞提取物在双链DNA片段中的同源区域之间的体外重组。该方法允许将DNA片段有效限制性位点非依赖性克隆到线性化载体中。
存在与本发明的方法有关的若干优点。首先，不需要用相同的限制酶消化基因片段以将基因片段克隆到载体中。其次，该方法不需要添加外源酶来将多个DNA片段组合成DNA分子。此类酶包括DNA连接酶、DNA聚合酶和克列诺片段(具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性)。第三，该方法不需要直接在同源插入位点的下游、上游或下游和上游去除非同源序列。第四，该方法允许一次快速组合多个片段。例如，可以在一个反应中组合至少5个DNA片段。
无细胞酵母提取物
无细胞酵母提取物可以从任何酵母属(Saccharomyces)菌株获得。在一个方面，该酵母属菌株是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)。在一个优选方面，该酵母属菌株是酿酒酵母。在另一个优选的方面，该酵母属菌株是卡尔酵母。在另一个优选的方面，该酵母属菌株是糖化酵母。在另一个优选的方面，该酵母属菌株是道格拉氏酵母。在另一个优选的方面，该酵母属菌株是克鲁弗酵母。在另一个优选的方面，该酵母属菌株是诺地酵母。在另一个优选的方面，该酵母属菌株是卵形酵母。在一个更优选方面，该酵母属菌株是酿酒酵母。
可以使用本领域已知的标准方法制备酵母属菌株的无细胞提取物。例如，在适合的培养基中培养酵母属菌株，并且然后通过离心回收细胞。然后将回收的细胞在缓冲液中进行适合的裂解程序，例如机械破碎，以产生提取物。有用缓冲液的实例是20mM Bis-Tris、1mM二硫苏糖醇，50mM KCl和10％甘油，pH 6.5。然后可以通过例如离心和/或过滤去除细胞和细胞碎片，以产生无细胞提取物。然后将无细胞提取物作为50％甘油溶液在-80℃下储存至少一年。
提取物的蛋白质浓度可以是适合实践本发明的方法的任何蛋白质浓度。在一个方面，蛋白质浓度优选为每μl提取物约0.1至约50μg蛋白质，更优选每μl提取物约1至约25μg蛋白质，甚至更优选每μl提取物约1至约10μg蛋白质，并且最优选每μl提取物约1至约5μg蛋白质。蛋白质浓度可以通过二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定或任何其他适合的蛋白质测定来确定。
DNA片段
DNA片段的来源可以是基因组DNA、cDNA、半合成DNA、合成DNA或其任何组合。DNA片段可以从单个基因组、两个或更多个基因组、突变DNA、改组DNA等获得。DNA片段也可以是线性化表达载体和包含编码具有目的生物活性的多肽的基因的多核苷酸。
DNA片段具有5'末端和3'末端，其中5'末端在糖的5'碳上具有磷酸基团，3'末端在糖的3'碳上具有游离羟基基团。经由氢键连接的相对互补DNA链上的两个核苷酸被称为碱基对(bp)，即鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)形成碱基对，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对。
当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少100bp、或至少200bp同源时，DNA片段可以彼此组合。如果序列相同，则碱基对的序列是“同源的”。同源区域应含有足够数量的核苷酸，例如至少15bp，其与相应的核苷酸序列高度同源，以增强同源重组的可能性。
每个DNA片段在本发明的方法中可以是任何适合的大小。在一个方面，DNA片段的大小范围为约15bp至约20kb。在另一方面，DNA片段的大小为至少15bp、至少100bp、至少500bp、至少1000bp、至少5000bp、至少10,000bp、至少15,000bp或至少20,000bp。
DNA片段还可以包含与片段的同源末端相邻的至多1,000bp的非同源序列。如果序列不相同，则碱基对的序列是“非同源的”。
在本发明的方法中，多个DNA片段可以彼此组合。例如，可以在一个反应中组合2、3、4、5、6、7、8、9、10个片段。
可以通过本领域已知的许多方法制备或获得DNA片段。DNA片段可以通过包括DNA、cDNA和RNA的核酸的PCR扩增来制备，并且可以使用本领域已知的标准方法分离。例如，cDNA探针可以使用标准方法从分离自一种或多种生物的细胞的总多腺苷酸化mRNA中获得，并逆转录成总cDNA。还可以通过用一种或多种限制酶消化双链DNA来制备DNA片段。DNA片段也可以通过已建立的标准方法合成制备，例如由Beaucage和Caruthers,1981,TetrahedronLetters[四面体快报]22:1859-1869描述的亚磷酰胺方法，或Matthes等人,(1984),EMBOJournal[欧洲分子生物学杂志]3:801-805描述的方法。
DNA片段可以从任何生物获得，包括但不限于微生物、植物和哺乳动物。
在一个优选的方面，DNA片段获自细菌，例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(llyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)以及脲原体属(Ureaplasma)。
在一个更优选的方面，该DNA片段获得自：嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)。
在另一个优选的方面，该DNA片段获得自酵母，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、或子囊菌酵母属(Yarrowia)菌株；或丝状真菌，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、或木霉属(Trichoderma)菌株。
在一个优选的方面，该DNA片段获得自卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母。
在另一个更优选的方面，该DNA片段获得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、拟球孢镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)。
应理解的是对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等效物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与他们已知的种名无关。本领域的技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
DNA片段也可以获得自：从环境样品中直接纯化的DNA材料或从环境样品中扩增的DNA材料，所述环境样品包括未经培养的生物的集合，例如来自土壤样品、淡水样品、盐水样品、昆虫肠、动物胃、废水、污泥或沉积物。(Liles等人,2003,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]69:2684-2691；Beja等人,2000,Science[科学]289:1902-1906；Tyson等人,2004,Nature[自然]428:37-43；Venter等人,2004,Science[科学]304:66-74,美国专利号6,723,504)。
在本发明的方法中，DNA片段可以与线性化载体组合以产生DNA文库。DNA文库是含有DNA片段(也称为插入物)的重组载体的集合。如上所述，DNA片段可以来自单个基因组、两个或更多个基因组、突变DNA、改组DNA等。DNA片段可以是基因组DNA片段、cDNA片段、半合成DNA片段、合成DNA片段或其任何组合。
DNA文库中使用的载体可以是任何质粒，其可以进行重组DNA程序以根据本发明的方法引入插入物。质粒可以是穿梭质粒，其可以在大肠杆菌中维持和复制，然后可以用于转化宿主细胞用于表达。
载体优选地包含允许容易地选择转化细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、pyrG、以及tk基因。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中所述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
在一个方面，每个DNA片段或插入物包含编码具有目的生物活性的多肽或其保留生物活性的片段的核苷酸序列。
该多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。该多肽对于所用的宿主细胞可以是天然的或异源的。此外，该多肽可以是亲本多肽的变体。术语“多肽”在此不意在是指特定长度的编码产物，并且因此，涵盖肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”还涵盖多肽的天然存在的多肽的等位基因或工程化变体。
在优选的方面，该多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、转录因子和转运蛋白。
在更优选的方面，该多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在最优选的方面，该多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、裂解多糖单氧酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。
DNA片段可包含编码变体多肽的多个突变基因。此类变体可包含亲本多肽的修饰，例如在亲本多肽的一个或多个位置处的取代、插入和/或缺失。
可以通过本领域已知的程序引入突变，例如PCR或易错PCR。PCR扩增可以使用适合的物理或化学诱变剂与诱变步骤组合，例如诱导转换(transition)、颠换(transversion)、倒位(inversion)、颠倒(scrambling)、取代、缺失和/或插入的诱变剂。在本发明的优选的方面，在导致低、中或高随机诱变频率的条件下制备DNA片段。为了获得低诱变频率，可以通过标准PCR扩增方法制备核苷酸序列(包含一个或多个DNA片段)(美国专利号4,683,202或Saiki等人,1988,Science[科学]239:487-491)。通过在降低热稳定聚合酶复制保真度并增加核苷酸的错误掺入的条件下进行PCR扩增，可以获得中或高诱变频率，例如如在Deshler,1992,GAT A 9:103-106；Leung等人,1989,BioTechniques[生物技术]1:11-15中所述的。
用于产生突变基因的其他方法是本领域已知的，例如寡核苷酸定向诱变、组装PCR、体内诱变、位点特异性诱变、区域定向诱变和寡核苷酸盒诱变(Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；WO 95/22625；Lowman等人,1991,Biochem.[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204；Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
体外反应
在本发明的方法中，在单个体外反应中使多个双链DNA片段与酵母菌株的无细胞提取物接触，以将多个DNA片段组合成DNA分子。当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp同源时，DNA片段彼此结合。
当无细胞提取物与多个双链DNA片段接触时，无细胞酵母提取物优选以饱和量存在。例如，基于蛋白质浓度的无细胞提取物的量可以是超过一个或多个DNA片段的量的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、或至少50倍或至少100倍。也可以使用更低和更高的量。
反应可在任何适合的温度、pH和时间段内进行。例如，该反应可以在20℃至45℃范围的温度下进行，例如30℃或37℃，并且pH值为4.0至8.0的范围，例如pH 5.0或6.5，持续数分钟至数小时的时间段，例如1分钟至5小时，例如1小时。
转化
本发明的方法进一步包括将所得DNA分子转化到宿主细胞中并分离包含每个DNA分子的单菌落转化体。
在本发明的方法中，任何适合的宿主细胞可用于分离单菌落转化体。该宿主细胞可以是原核细胞(例如，革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属(Streptomyces)，或革兰氏阴性细菌例如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(llyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)以及脲原体属(Ureaplasma))，或真核细胞(例如，酵母，例如假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，或丝状真菌，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma))。
芽孢杆菌宿主细胞可以是但不限于：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
酵母宿主细胞可以是但不限于乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
丝状真菌宿主细胞可以是但不限于泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
在一个方面，特别是对于DNA文库，优选大肠杆菌菌株。任何大肠杆菌菌株都可用于分离DNA分子的单个菌落转化体，例如引入大肠杆菌菌株的DNA文库。可用于实施本发明的大肠杆菌菌株的实例包括但不限于DH5αTM(英杰公司(Invitrogen))[F-80d/acZΔM 15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk -,mk +)phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 re/A1]；ONEINValphaF'(英杰公司(Invitrogen))[F'endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+)supE44 thi-1 gyrA96 relA1/acZ.M15.(lacZYA-argF)U169λ-]；Top10(英杰公司(Invitrogen))F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)/acZΔM15Δ/acX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 ga/U ga/K rpsL(StrR)endA1 nupG；和大肠杆菌STELLARTM感受态细胞(克罗泰克实验有限公司(Clontech Laboratories,Inc.))。
可以通过使用化学感受态或电穿孔感受态大肠杆菌细胞将DNA分子引入大肠杆菌中。例如，可以用如下完成DNA文库的引入：电穿孔-感受态细胞(斯特拉塔吉恩(Stratagene)，美国专利号6,338,965、6,040,184、6,017,748、和5,552,314以及等效的外国专利)、XL1-Blue电穿孔-感受态细胞(斯特拉塔吉恩(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚，美国专利号6,338,965和6,040,184)、XL10-Ultra感受态细胞(斯特拉塔吉恩(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚，美国专利号5,512,468和5,707,841)、和感受态细胞(斯特拉塔吉恩(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚，美国专利号6,017,748、5,707,841、5,552,314、和5,512,468；美国专利号6,017,748、和5,552,314；和美国专利号6,338,965、6,040,184、6,017,748、和5,552,314)。
使用选择性培养基选择转化体，例如含有液体或固体营养物的混合物，其允许转化的微生物生长，但不允许未转化的细胞生长。可以通过在培养基中包含对未转化生物体有毒的物质来获得选择，使得当含有如本文所述的选择性标记的表达载体存在于转化的微生物中时，标记物的表达使毒素解毒或提供对毒素的抗性。还可以通过利用在不存在补充营养素的情况下不能生长的微生物来获得选择。例如，可以对营养缺陷型突变体进行转化，并且可以通过在不存在所需代谢物的情况下进行筛选来提供选择，所述代谢物仅可以通过含有表达载体的菌株合成，所述表达载体提供合成代谢物所需的多核苷酸序列。
DNA分子的单菌落大肠杆菌转化体的分离可以手动完成或使用菌落挑选装置完成。可以使用可商购的装置。此类装置包括但不限于Genetix QPIXTM(金克斯有限公司(Genetix Limited))和VERSARRAYTM菌落选择器和阵列系统(伯乐实验室有限公司(Bio-RadLaboratories,Inc.))。
可以将单菌落大肠杆菌转化体转移到多孔板的各个孔中，这可以手动完成或使用菌落挑选装置(如上所述)完成。
DNA分子的回收
在本发明方法的另一个方面，该方法进一步包括从单菌落转化体中回收DNA分子。
在本发明的方法中，从每个单菌落转化体(例如大肠杆菌转化体)中回收DNA分子可以以本领域已知的任何形式进行。DNA的回收优选在多孔板的独立的孔中进行。然而，DNA的制备可以使用本领域已知的任何程序完成。参见，例如，Sambrook,等人,1989,MolecularCloning:a Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册]Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社],第2版,第1.21-1.49页：用于煮沸、SDS和碱裂解的方法，以及通过诸如氯化铯梯度的方法的纯化。可以使用Utterback等人修改的先进基因技术公司(Advanced Genetic Technologies Corporation)的96孔Miniprep试剂盒方案分离DNA。(1995,Genome Sci.Technol.[基因组科学与技术]1:1-8)。此外，滚环扩增可用于从单菌落大肠杆菌转化体制备DNA(Nelson等人,2002,Biotechniques[生物技术],六月,增刊:44-47)。
在一个优选的方面，回收DNA分子是自动化的。例如，可以使用机器人装置，例如通用系统(凯杰公司(QIAGEN Inc.))制备来自大肠杆菌菌株的质粒DNA。还可以使用Qiabot Miniprep Station(凯杰公司(QIAGEN Inc.))按照制造商的说明从培养物中分离质粒DNA。另一个装置是AutoGenprep 960仪器(AutoGen公司(AutoGen,Inc.))，它是一种全自动高通量仪器，用于96孔格式的DNA提取。
在另一个优选的方面，将从单菌落转化体中回收的DNA分子转化到宿主细胞中以表达DNA分子。
DNA分子的表达
从单菌落转化体中回收的DNA分子可以转化到宿主细胞中以表达DNA分子。因此，本发明的方法进一步包括将编码具有目的生物活性的多肽的回收的DNA分子转化到重组宿主细胞中，其中DNA分子与指导多肽产生的一个或多个控制序列可操作地连接。
可以以多种方式操纵编码具有目的生物活性的多肽的回收的DNA分子，以提供多肽的表达。取决于表达载体，DNA分子在插入载体之前的操作可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
DNA分子可以与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导多肽的编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码多肽的DNA分子进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，其介导该多肽的表达。启动子可以是在宿主细胞中示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于以下文献中：“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”,Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例公开于WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导核酸构建体的转录的适合启动子的实例是获得自以下酶的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导序列已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换；非限制性实例包括来自中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的DNA分子的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上。
所述控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加所述基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例从以下获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该DNA分子的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
对于酵母宿主细胞适合的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，一种可操作地连接至DNA分子的3'-末端的序列，并且当转录时被宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加到转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
该控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽的信号肽编码区。该DNA分子的编码序列的5'-端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码该多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替换天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。进一步的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上。
该控制序列也可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的DNA分子会与调节序列可操作地连接。
可以将DNA分子插入重组表达载体中以在所选宿主细胞中表达。重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起DNA分子表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
如在本文所述的，载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的DNA分子序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以向宿主细胞中插入多于一个拷贝的DNA分子，以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该DNA分子一起的可扩增的选择性标记基因可以获得DNA分子的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该DNA分子的另外的拷贝的细胞。
在本发明的方法中，可以使用本领域已知的任何形式将每种DNA分子引入宿主细胞的单独悬浮液中，例如丝状真菌的原生质体，以获得其转化体。每个转化体包含个体DNA分子的一个或多个拷贝。转化优选在多孔板的独立的孔中进行。
宿主细胞可以是在多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(llyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)以及脲原体属(Ureaplasma)。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
可以通过如下方法实现将DNA引入芽孢杆菌属细胞中：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.[叶线形微生物学](Praha)49:399-405)、接合(参见，例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域中已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
该宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fung[安斯沃思和拜斯比真菌词典]，第8版，1995，CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner、Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母(Saccharomyces diastaticus)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等人,1995，同上，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、Talaromyces emersonii、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁重建的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023、Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA [美国国家科学院院刊]81:1470-1474，和Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属(Fusarium)物种的适合方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156、和WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
宿主细胞是在适合使用本领域已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵器中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，该培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。
在另一个方面，该方法进一步包括回收具有目的生物活性的多肽。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以通过使用本领域已知的对目的多肽特异的方法测量活性或性质来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。性质包括但不限于改变的温度依赖性活性谱、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。多肽的表达或多肽的性质的测量可以手动或通过自动化完成。
活性或性质的测量可以自动化。可以使用允许自动化的任何装置，例如机器人装置。可商购的装置包括但不限于Fx液体处理机器人(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.))、板处理机器人臂(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter,Inc.))、SciClone ALH300工作站(凯里铂生命科学公司(Caliper LifeSciences))、和QBot机器人(金克斯有限公司(Genetix Limited))。为了增加在给定时间内进行的个体活性测定的数量，可以使用多孔板在高通量筛选系统中方便地测定活性。多孔板包括但不限于96孔HARD-微孔板(MJ研究公司(MJ Research))、3370 96孔透明聚苯乙烯板(康宁公司(Corning))、聚丙烯超刚性深孔板(英国拜力公司(ABgene))、3950 1536孔测定板(康宁公司(Corning))、3706 384孔透明底部聚苯乙烯板(康宁公司(Corning))和24孔细胞培养板(康宁公司(Corning))。此类筛选技术在本领域中是熟知的，参见，例如，Taylor等人,2002,J.Biomolec.Screening[生物分子筛选杂志]7:554-569；Decker等人,2003,Appl.Biochem.Biotech.[应用生物化学与生物技术]105-108:689-703；Dove,1999,NatureBiotech.[自然生物技术]17:859-863，和Kell,1999,Trends in Biotechnology[生物技术的发展趋势]17:89-91。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基回收多肽。在一个方面中，回收包含多肽的整个发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化该多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，ProteinPurification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版公司],纽约,1989)，以便获得基本上纯的多肽。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
培养基和溶液
2XYT/氨苄青霉素平板由以下各项构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母萃取物、5g的NaCl、15g的细菌培养用琼脂(Bacto agar)、1ml的氨苄青霉素(100mg/ml)、以及水补足至1升。
SOC培养基由以下各项构成：20g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.5g的NaCl、10ml的250mM KCl、以及水补足至1升。
TE缓冲液由以下各项构成：10ml的1M Tris pH8.0、2ml的0.5M EDTA pH 8.0、以及水补足至1升。
TBE由以下各项构成：10.8g的Tris碱、5.5g的硼酸、4ml的0.5M EDTA(pH 8.0)、以及水补足至1升。
酵母提取物缓冲液由以下各项构成：20mM Bis-Tris、1mM二硫苏糖醇、50mM KCl和10％甘油，pH6.5。
YPG培养基由以下各项构成：10g的细菌培养用酵母提取物、20g的细菌培养用蛋白胨、2％的葡萄糖、以及水补足至1升。
YPD平板由以下各项构成：10g细菌培养用酵母提取物、20g细菌用蛋白胨、20g细菌培养用琼脂、40ml 50％的葡萄糖，以及水补足至1升。
实例1：酵母提取物的分离和定量
酿酒酵母菌株JG169(美国公开申请2009/0317866)和酿酒酵母菌株HiP19(WO2014/072481)用作产生酵母提取物的来源。以下方案用于从每个菌株产生酵母提取物。将菌株划线接种到YPD平板上并在30℃下孵育48-72小时。从平板中收集一圈酵母细胞，并接种到含有100ml YPG培养基的500ml玻璃摇瓶中。将摇瓶在30℃下以250rpm孵育过夜。然后将酵母培养物转移到离心瓶中并以3,090x g离心10分钟。轻轻倒出上清液，将细胞沉淀重悬于200ml水中。然后将细胞再次以3090x g离心10分钟。轻轻倒出上清液，将细胞沉淀转移到含有1-5ml液氮的预冷杵中。用研钵将冷冻的沉淀轻微压碎，并转移到含有金属小块的预冷的SamplePrep冷冻研磨瓶(赛默飞世尔科技(Fisher Scientific))中，以粉碎沉淀。将小瓶插入SamplePrep 6970EFM冷冻/磨机(赛默飞世尔科技(FisherScientific))中，设置如下：6个循环，预冷1分钟、运行2分钟、冷却2分钟，速率12cps。将粉碎的沉淀物转移到50ml锥形管中，重悬于3-5ml酵母提取物缓冲液中，并以21,130x g离心5分钟以去除细胞碎片。离心后，收集上清液并添加等体积的100％甘油。然后将每种酵母提取物在-80℃下储存在LoBind微量离心管(Eppendorf)中。
使用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定来定量酵母提取物。在定量之前，从样品中去除甘油。为了去除甘油，将100μl制备的酵母提取物装载到VIVASPINTM 500样品浓缩器(GE医疗(GE Healthcare))上，并在21,130x g下离心至少60分钟。用100μl TE缓冲液洗涤柱两次，并在21,130x g下离心至少15分钟。然后用100μl TE缓冲液洗脱蛋白质。
使用BCA蛋白质测定试剂盒(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))进行BCA蛋白质测定。将牛血清白蛋白(BSA)标准设定为0μg、5μg、10μg、25μg和50μg以产生标准曲线。将酵母提取物装载在75％、50％、25％、10％和5％的水中不稀释或稀释。将BCA试剂A与BCA试剂B分别以9.8ml和200μl混合。将体积为25μl的标准品或样品添加到96孔平底培养板(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))中的200μl混合的BCA试剂中，并在室温下孵育30分钟。在340PC微板读数器(分子仪器公司(Molecular Devices))上读取板，波长设定为562nm。然后根据BSA对照标准产生的最佳拟合趋势对酵母提取物样品进行定量。酿酒酵母菌株JG169的酵母提取物每μl含有2.64μg蛋白质。酿酒酵母菌株HiP19的酵母提取物每μl含有1.77μg蛋白质。
实例2：使用酵母提取物进行体外DNA组装和转化
组装方法首先涉及在多片段组装的情况下产生线性化载体和含有同源序列的一个或多个插入片段到所希望的插入区域或相邻片段；第二，使用酵母提取物组装所有DNA区段的体外反应；第三，转化至大肠杆菌感受态细胞中。
用由至少100ng线性化载体、至少300ng每一种或多种插入物，2.64μg(2μl)的酵母提取物(实例1)、1μl酵母提取物缓冲液和水补足至10μl组成的混合物进行体外DNA组装。将DNA组装混合物在37℃下孵育1小时。将1μl DNA组装混合物转化到50μl大肠杆菌STELLARTM感受态细胞(克罗泰克实验室有限公司(Clontech Laboratories,Inc.))中。将转化反应物在冰上孵育30分钟，在42℃下热激45秒，并在冰上再孵育2分钟。添加100μl体积的SOC培养基，并将转化的细胞涂布在含有适当抗生素的琼脂平板上，例如2XYT/氨苄青霉素平板。
实例3：质粒pSPT001的构建
通过拼接编码棘孢曲霉β-葡糖苷酶的密码子优化的编码序列的全部或2至4个区段部分(DNA序列：SEQ ID NO:1和推导的氨基酸序列：SEQ ID NO:2)至表达载体pBM120构建pSPT001质粒(美国专利号8,586,330)。
设计引物对(表1)以通过PCR扩增来自质粒pDFng181-25的棘孢曲霉β-葡糖苷酶的密码子优化的编码序列的全部或区段。将五十皮摩尔的各引物对用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的质粒pDFng181-15，具有MgCl2的1X高保真PCR缓冲液(罗氏诊断产品有限公司(Roche Diagnostics Corporation))，dATP、dTTP、dGTP、和dCTP中的每种各0.25mM，以及2.6单位的酶混合物(罗氏诊断产品有限公司(RocheDiagnostics Corporation))，最终体积为50μl。使用热循环仪进行具有20至30bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃持续20秒、60℃持续30秒、并且在72℃持续3分钟；和在72℃最终延伸7分钟。使用热循环仪进行具有40至50bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；20个循环，各自为在94℃持续20秒，在72℃持续3分钟；和在72℃最终延伸7分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
表1.用于产生片段的引物描述，这些片段用于产生pSPT001质粒
表2提供了构建pSPT001质粒的信息，包括同源突出端长度、制备的一个或多个片段数、片段大小和所用引物。使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中观察到正确大小的片段条带(表2)。用Dpn I消化PCR，并使用NUCLEOSPI凝胶和PCRClean-up试剂盒(克罗泰克实验有限公司(Clontech Laboratories,Inc.))纯化。将一体积的样品与2体积的缓冲液NTI(克罗泰克实验有限公司(Clontech Laboratories,Inc.))混合。将混合物装载到NUCLEOSPI凝胶和PCR Clean-up试剂盒柱中，并以11,000x g离心30秒。弃去流过液体。用700μl缓冲液NT3(克罗泰克实验有限公司(ClontechLaboratories,Inc.))洗涤柱，并以11,000x g离心30秒。弃去流过液体，将柱以11,000x g再离心一分钟。通过将30μl缓冲液NE(克罗泰克实验有限公司(Clontech Laboratories,Inc.))应用于柱1分钟洗脱DNA，并以11,000x g离心1分钟。
表2.用于构建pSPT001的片段生成的描述
将质粒pBM120用Nco I和Pac I消化，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用TriPrep试剂盒进行纯化(马歇雷-纳高公司(Macherey-Nagel))。使用实例2中描述的酵母提取物DNA组装方法，用酿酒酵母菌株JG169提取物组装一个或多个基因片段和消化的载体。将1μl反应物转化到大肠杆菌STELLARTM感受态细胞中。将转化反应物在冰上孵育30分钟，在42℃下热激45秒，并在冰上再孵育2分钟。添加100μl体积的SOC培养基，并将转化的细胞涂布在2XYT/氨苄青霉素平板上。使用通用系统(凯杰公司(QIAGEN Inc.))从大肠杆菌转化体制备质粒DNA。通过Bam HI和Nco I消化和/或DNA测序确认转化体。插入位点的DNA测序是用珀金埃尔默(Perkin-Elmer)应用生物系统模型377XL自动化DNA测序仪(珀金埃尔默应用生物公司(Perkin-Elmer/Applied Biosystems,Inc.))，使用染料终止子化学(Giesecke等人,1992,Journal of Virology Methods[病毒学方法杂志]38:47-60)进行的。使用以下引物(表3)进行测序：
表3.测序引物
实例4：pSPT002质粒的构建
通过拼接编码雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)纤维二糖水解酶I(CBHI)的密码子优化的编码序列的全部或2至4个区段部分(DNA序列：SEQ ID NO:46和推导的氨基酸序列：SEQ ID NO:47)至表达载体pAllo2构建pSPT002质粒(美国专利号7,393,664)。
设计引物对(表4)以通过PCR扩增来自质粒pLsBf96的雷塞氏篮状菌(T.leycettanus)CBHI的密码子优化的基因的全部或区段。将五十皮摩尔的各以下引物用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的质粒pLsBf96，具有MgCl2的1X高保真PCR缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、和dCTP中的每种各0.25mM，以及2.6单位的酶混合物，最终体积为50μl。使用热循环仪进行具有20至30bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃持续20秒、60℃持续30秒、并且在72℃持续3分钟；和在72℃最终延伸7分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
表4.用于产生片段的引物描述，这些片段用于产生pSPT002质粒
表5提供了构建pSPT002质粒的信息，包括同源突出端长度、制备的一个或多个片段数、片段大小和所用引物。使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中观察到正确大小的片段条带(表5)。用Dpn I消化PCR混合物，并使用TriPrep试剂盒纯化。
表5.用于构建质粒pSPT002的片段生成的描述
将质粒pAllo2用Nco I和Pac I消化，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用TriPrep试剂盒进行纯化。使用实例2中描述的酵母提取物DNA组装方法，用酿酒酵母菌株JG169提取物组装一个或多个基因片段和消化的载体。根据实例3，将1μl反应物转化到大肠杆菌STELLARTM感受态细胞中。使用通用系统从大肠杆菌转化体制备质粒DNA。通过Bam HI和Nco I消化和/或DNA测序确认转化体。插入位点的DNA测序是用珀金埃尔默(Perkin-Elmer)应用生物系统模型377XL自动化DNA测序仪，使用染料终止子化学(Giesecke等人,1992,同上)进行的。表6中所示的引物用于测序。
表6.测序引物
实例5：质粒pSPT003的构建
通过将墙粘鞭霉(Gliomastix murorum)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的整个基因(DNA序列：SEQ ID NO:66和推导的氨基酸序列：SEQ ID NO:67)克隆到表达载体pMJ09中来构建质粒pSPT003(美国专利号8,318,458)。
设计引物对(如下所示)以通过PCR扩增来自质粒pDFng194-5的墙粘鞭霉(G.murorum)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶编码序列。将五十皮摩尔的各引物用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的质粒pDFng194-5，具有MgCl2的1X高保真PCR缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、和dCTP中的每种各0.25mM，以及2.6单位的酶混合物，最终体积为50μl。使用热循环仪进行具有20至30bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃持续20秒、60℃持续30秒、并且在72℃持续1.5分钟；和在72℃最终延伸7分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
SPT_GH62F20：
5'-GTCAACCGCGGACTGCGCACATGAAGTTCCATCTGGCATC-3'(SEQ I D NO:68)
SPT_GH62R20：
5'-GGCTTTCGCCACGGAGCTTACTAAGTGCACTGAGAGTACC-3'(SEQ ID NO:69)
粗体字母代表编码序列。剩余的序列与pMJ09中的插入位点是同源的。
使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行分离，其中观察到1.2kb产物条带。用Dpn I消化PCR混合物，并使用TriPrep试剂盒纯化。
将质粒pMJ09用Nco I和Pac I消化，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用TriPrep试剂盒进行纯化。使用实例2中描述的酵母提取物DNA组装方法，用酿酒酵母菌株JG169提取物组装基因片段和消化的载体。根据实例3，将1μl反应物转化到大肠杆菌STELLARTM感受态细胞中。使用通用系统从大肠杆菌转化体制备质粒DNA。通过Sal I消化和/或DNA测序确认转化体。插入位点的DNA测序是用珀金埃尔默(Perkin-Elmer)应用生物系统模型377 XL自动化DNA测序仪，使用染料终止子化学(Giesecke等人,1992,同上)进行的。表7中所示的引物用于测序。
表7.测序引物
实例6：质粒pSPT004的构建
通过将编码棘孢曲霉β-葡糖苷酶的密码子优化的编码序列(DNA序列：SEQ ID NO：1和推导的氨基酸序列：SEQ ID NO：2)克隆到表达载体pBM120中同时直接去除pBM120载体中插入位点下游的196bp的不想要的非同源序列来构建质粒pSPT004。
设计引物对(如下所示)以通过PCR扩增来自质粒pDFng181-25的棘孢曲霉β-葡糖苷酶密码子优化的基因(实例3)。将五十皮摩尔的各以上引物用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的质粒pDFng181-15，具有MgCl2的1X高保真PCR缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、和dCTP中的每种各0.25mM，以及2.6单位的酶混合物，最终体积为50μl。使用热循环仪进行具有20至30bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃持续20秒、60℃持续30秒、并且在72℃持续3分钟；和在72℃最终延伸7分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
SPT_AaBG F40：
SPT_AaBG-term R40：
粗体字母代表编码序列。其余序列与pBM120的插入位点附近的区域同源。
使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行分离，其中观察到2.66kb产物条带。用Dpn I消化PCR混合物，并使用TriPrep试剂盒纯化。
将质粒pBM120用Nco I和Pac I消化，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用TriPrep试剂盒进行纯化。使用实例2中描述的酵母提取物DNA组装方法，用酿酒酵母菌株JG169提取物组装基因片段和消化的载体。根据实例3，将1μl反应物转化到大肠杆菌STELLARTM感受态细胞中。使用通用系统从大肠杆菌转化体制备质粒DNA。通过Bam HI和Nco I消化和/或DNA测序确认转化体。插入位点的DNA测序是用珀金埃尔默(Perkin-Elmer)应用生物系统模型377XL自动化DNA测序仪，使用染料终止子化学(Giesecke等人,1992,同上)进行的。表8中所示的引物用于测序。
表8.测序引物
实例7：质粒pSPT005的构建
通过将编码棘孢曲霉β-葡糖苷酶的密码子优化的编码序列(DNA序列：SEQ ID NO：1和推导的氨基酸序列：SEQ ID NO：2)克隆到表达载体pBM120中同时直接去除pBM120载体中插入位点上游的614bp的不想要的非同源序列来构建质粒pSPT005。
设计引物对(如下所示)以通过PCR扩增来自质粒pDFng181-25的棘孢曲霉β-葡糖苷酶密码子优化的基因(实例3)。将五十皮摩尔的各以上引物用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的质粒pDFng181-15，具有MgCl2的1X EXPANDTM高保真PCR缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、和dCTP中的每种各0.25mM，以及2.6单位的EXPANDTM酶混合物，最终体积为50μl。使用热循环仪进行具有20至30bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃持续20秒、60℃持续30秒、并且在72℃持续3分钟；和在72℃最终延伸7分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
SPT_AaBG-prom F40：
SPT_AaBG R40：
粗体字母代表编码序列。其余序列与pBM120载体中的插入位点附近的区域同源。
使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行分离，其中观察到2.66kb产物条带。用Dpn I消化PCR混合物，并使用TriPrep试剂盒纯化。
将质粒pBM120用Nco I和Pac I消化，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用TriPrep试剂盒进行纯化。使用实例2中描述的酵母提取物DNA组装方法，用酿酒酵母菌株JG169提取物组装基因片段和消化的载体。根据实例3，将1μl反应物转化到大肠杆菌STELLARTM感受态细胞中。使用通用系统从大肠杆菌转化体制备质粒DNA。通过Bam HI和Nco I消化和/或DNA测序确认转化体。插入位点的DNA测序是用珀金埃尔默(Perkin-Elmer)应用生物系统模型377XL自动化DNA测序仪，使用染料终止子化学(Giesecke等人,1992,同上)进行的。表9中所示的引物用于测序。
表9.测序引物
实例8：质粒pSPT006的构建
通过将棘孢曲霉β-葡糖苷酶的密码子优化的编码序列(DNA序列：SEQ ID NO：1和推导的氨基酸序列：SEQ ID NO：2)克隆到表达载体pBM120中同时直接分别去除198bp和196bp的pBM120载体中插入位点上游和下游的不想要的非同源序列来构建质粒pSPT006(图1D)。
设计引物对(如下所示)以通过PCR扩增来自质粒pDFng181-25的棘孢曲霉β-葡糖苷酶密码子优化的基因(实例3)。将五十皮摩尔的各以上引物用于如下PCR中，该PCR由以下构成：10ng的质粒pDFng181-15，具有MgCl2的1X高保真PCR缓冲液，dATP、dTTP、dGTP、和dCTP中的每种各0.25mM，以及2.6单位的酶混合物，最终体积为50μl。使用热循环仪进行具有20至30bp突出端的PCR，所述热循环仪编程为在94℃下1个循环持续2分钟；30个循环，每个循环在94℃持续20秒、60℃持续30秒、并且在72℃持续3分钟；和在72℃最终延伸7分钟。加热块然后进入10℃浸泡循环。
SPT_AaBG-200prom F40：
SPT_AaBG-term R40：
粗体字母代表编码序列。其余序列与pBM120的插入位点附近的区域同源。
使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行分离，其中观察到2.66kb产物条带。用Dpn I消化PCR混合物，并使用TriPrep试剂盒纯化。
将质粒pBM120用Nco I和Pac I消化，使用TBE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用TriPrep试剂盒进行纯化。使用实例2中描述的酵母提取物DNA组装方法，用酿酒酵母菌株JG169提取物组装基因片段和消化的载体。根据实例3，将1μl反应物转化到大肠杆菌STELLARTM感受态细胞中。使用通用系统从大肠杆菌转化体制备质粒DNA。通过Bam HI和Nco I消化和/或DNA测序确认转化体。插入位点的DNA测序是用珀金埃尔默(Perkin-Elmer)应用生物系统模型377XL自动化DNA测序仪，使用染料终止子化学(Giesecke等人,1992,同上)进行的。表10中所示的引物用于测序。
表10.测序引物
实例9：酵母提取物辅助DNA组装的总体结果
实例的总体结果表明，酵母提取物辅助的DNA组装方法是一种有效且新颖的限制性位点独立克隆方法，其在体外利用酵母提取物。
虽然大多数实验评估了使用酿酒酵母菌株JG169酵母提取物组装DNA的有效性，但在2例中也测试了来自酿酒酵母菌株HiP19的酵母提取物。在与实例3和4相同的条件下，分别进行1个插入物和1个消化载体的简单克隆以产生pSPT001和pSPT002。除了JG169酵母提取物实验之外，还进行了HiP19酵母提取物实验，以比较来自不同菌株的酵母提取物。这样做是为了确保酵母提取物辅助DNA组装不仅仅依赖于酿酒酵母菌株JG169。两种菌株都能够产生所需的构建体(表12和14)。
还测试了一系列片段长度和载体长度以确定对该系统是否存在任何尺寸限制。从5.6kb到8.7kb的载体长度(表11)和从395bp到2.6kb的插入物长度(实例3-8)以各种组合组装。所有实验都成功地产生了所需的构建体(表5-7)。使用四种不同的基因与4种不同的载体一起制备片段，并且全部在酵母提取物辅助体外组装中起作用。
表11
载体名称 载体长度
pBM120 6.8kb
pAllo2 5.6kb
pMJ09 7.2kb
为了初步确定酵母提取物辅助DNA组装的能力，测试了DNA片段的简单组装。尝试由一个载体和一个插入物组成的组装，其具有从20bp至40bp的范围的同源突出端。用少至20bp的突出端实现组装，成功率为46％-83％(表12，实验#1-7)。接下来测试了3路组装，其包括2个插入物和1个载体(表12，实验#8-9)。使用具有30bp的同源突出端并且能够产生预期的构建体，成功率为46％-53％。还测试了4路组装，其包括3个插入物和1个载体(表12，实验#10-13)。使用具有30-50bp的同源突出端并且全部能够产生正确的构建体，成功率为16％-25％。测试了5路组装，其包括4个插入物和1个载体(表12，实验#14-16)。使用具有30-40bp的同源突出端并且全部能够产生正确的构建体，成功率为6％-19％。通常观察到，随着突出长度的增加，正确克隆的百分比也增加。
还检查了酵母提取物去除插入位点周围不想要的一个或多个非同源序列同时组装DNA片段的能力。通过直接去除插入位点下游的196bp的非同源序列构建质粒pSPT004，成功率为38％(表13，实验#17；图1B)。成功率是正确克隆的数量(通过限制性消化和/或测序验证)/挑选的克隆总数。通过直接去除插入位点上游的614bp的非同源序列构建质粒pSPT005，成功率为69％(表13，实验#18；图1C)。通过分别直接去除插入物的上游和下游的198bp和196bp的异源序列来产生质粒pSPT006(表13，实验#19；图1D)，成功率为38％。pSPT004、pSPT005和pSPT006的同源突出端是40bp。还观察到增加的突出端长度伴随正确克隆的增加的百分比的趋势。
使用酵母提取物在体外组装DNA片段的本发明方法简便、经济且通用。酵母提取物制备简单，并且可以源自任何常见的实验室酿酒酵母菌株。酵母提取物可以在-80℃下储存至少一年，并经历若干次冷冻/解冻循环，对产率的影响最小。组装DNA片段的方法不仅解决了使用一个插入物和一个载体的简单克隆，而且还解决了更复杂的克隆问题。已经测试该方法用于多片段克隆，多达5个片段或4个插入物和1个载体，并且还具有在5'和/或3'末端去除一个或多个不需要的非同源序列的能力，允许限制性位点独立克隆并且不需要针对DNA重组的插入位点周围的特定同源区域。
表12
表13
使用来自酿酒酵母菌株JG169的酵母提取物构建pSPT001-006的实验条件和结果。
表14
使用来自酿酒酵母菌株HiP19的酵母提取物构建pSPT001-006的实验条件和结果。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等效方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，对于本领域的技术人员而言本发明的各种修改将从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
在此引用了多个参考，其披露内容通过援引以其全部内部结合在此。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
Bohan, Doreen
<120> DNA分子的酵母细胞提取物辅助构建
<130> 13186-WO-PCT
<150> US 62/425,005
<151> 2016-11-21
<160> 89
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 2583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA序列
<400> 1
atgaagctca gttggctcga ggccgccgct ctgacggccg cttctgtagt cagcgccgat 60
gaattggctt tctctccacc attctaccct tcgccttggg ctaatggcca gggagagtgg 120
gcagaagcct accagcgcgc cgtcgccatc gtttctcaga tgacactgga tgagaaggtt 180
aaccttacaa cgggtactgg atgggaactg gagaagtgcg tcggtcaaac cggcggtgtt 240
cccagactta acatcggtgg tatgtgtctt caggattccc ctttgggtat ccgtgattct 300
gactacaact ccgccttccc tgctggtgtc aatgtcgccg cgacatggga caagaacctc 360
gcctaccttc gtggccaggc catgggtcaa gaattcagtg acaagggcat tgacgttcaa 420
ctggggcctg ctgctggtcc tctcggcagg agcccggacg gcggcagaaa ctgggaaggc 480
ttctctcctg atccggctct cactggtgta cttttcgccg aaactatcaa gggtatccaa 540
gacgcgggtg tggtggctac tgccaagcat tacattctga atgaacagga gcatttccga 600
caggttgcag aggccgccgg atatggtttc aacatctccg acacgatcag ctccaacgtg 660
gatgacaaga ccattcacga gatgtacctt tggccctttg cagatgctgt gcgcgctggc 720
gttggcgcta tcatgtgttc ctacaatcaa atcaacaaca gctacggttg tcaaaacagt 780
tacactctca acaagctcct caaggctgag ctgggcttcc aaggcttcgt catgagtgac 840
tggggtgctc accacagcgg tgtcggctct gccctcgctg ggttggatat gtcgatgcct 900
ggagacatta ccttcgactc tgccacttcc ttctggggca cgaacctaac tattgctgtt 960
cttaacggca ccgttccaca gtggcgtgtc gatgacatgg ctgttcgtat catggctgcg 1020
tactacaagg ttggtcgtga ccgtctttac cagcccccta acttcagctc ctggacccgg 1080
gatgagtacg gcttcaagta tttctacccc caggagggac cctatgagaa ggtgaaccac 1140
ttcgtcaatg tgcagcgcaa ccactctgag gttatccgta agttgggtgc cgacagtaca 1200
gtgctcttga agaacaacaa tgctcttcct ttgaccggca aggagcgaaa agtggctatc 1260
ctcggtgaag acgctggttc caactcgtac ggtgctaacg gctgctctga ccgcggctgt 1320
gataacggca ctcttgctat ggcctggggt agtggtactg ccgaattccc ttaccttgtc 1380
acccccgagc aggctatcca ggccgaggtc ctcaagcata agggcagcgt ctacgctatc 1440
actgataact gggctctcag ccaggtggag accctcgcaa aacaagccag cgtgtctttg 1500
gtgtttgtca actcggacgc gggagagggt tatatcagtg tcgacggcaa cgagggtgac 1560
cgcaacaatc tcactctgtg gaagaacggc gacaacctca ttaaggctgc tgcaaacaac 1620
tgcaacaaca cgattgtggt tattcacagt gttgggcccg tcttggttga cgagtggtat 1680
gatcacccca acgtcactgc catcctctgg gccggcttgc ccggtcagga gagtggcaac 1740
tccctggctg acgtgctcta tggccgcgtc aaccccggcg ccaagtctcc gttcacctgg 1800
ggcaagactc gggaggctta cggggattac ttggtccgtg agctcaacaa tggcaatggt 1860
gctccccagg atgatttctc ggagggcgtc ttcattgact accgtggatt tgacaagcgc 1920
aatgagaccc ccatttatga gtttggccat ggcttgagct acaccacctt taactactct 1980
ggccttcaca tccaggttct caatgcttcg agtaacgcac aagtcgccac tgagaccggc 2040
gccgcgccaa ccttcggtca agtcggtaat gccagtgact acgtgtatcc cgagggtctc 2100
accagaatta gcaagtttat ttacccttgg ctcaactcga ccgacctcaa ggcctcttct 2160
ggcgacccgt actacggcgt cgacaccgct gagcacgtgc ccgaaggcgc tactgatggg 2220
tctcctcaac ccgttctgcc tgctggcggc ggcttcggtg gtaaccctag actttatgat 2280
gagcttatca gggtgtcggt gaccgtcaag aacactggtc gtgtcgccgg tgatgctgtc 2340
cctcaattgt atgtttcact gggcggaccg aacgagccta aggtcgttct gcgcaagttc 2400
gaccgactca ccctgaagcc ttccgaggag acggtttgga ccacgactct tacccgtcgt 2460
gatctctcta attgggatgt ggccgctcag gactgggtca tcacatctta ccccaagaaa 2520
gtgcacgtcg gcagctcctc gcgtcagctg cctctgcacg cggctctgcc caaggtccaa 2580
tag 2583
<210> 2
<211> 860
<212> PRT
<213> 棘孢曲霉
<400> 2
Met Lys Leu Ser Trp Leu Glu Ala Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Val Ser Ala Asp Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro
20 25 30
Trp Ala Asn Gly Gln Gly Glu Trp Ala Glu Ala Tyr Gln Arg Ala Val
35 40 45
Ala Ile Val Ser Gln Met Thr Leu Asp Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Gly Trp Glu Leu Glu Lys Cys Val Gly Gln Thr Gly Gly Val
65 70 75 80
Pro Arg Leu Asn Ile Gly Gly Met Cys Leu Gln Asp Ser Pro Leu Gly
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Asp Tyr Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Val Asn Val
100 105 110
Ala Ala Thr Trp Asp Lys Asn Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Gln Ala Met
115 120 125
Gly Gln Glu Phe Ser Asp Lys Gly Ile Asp Val Gln Leu Gly Pro Ala
130 135 140
Ala Gly Pro Leu Gly Arg Ser Pro Asp Gly Gly Arg Asn Trp Glu Gly
145 150 155 160
Phe Ser Pro Asp Pro Ala Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile
165 170 175
Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Val Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile
180 185 190
Leu Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Ala Glu Ala Ala Gly Tyr
195 200 205
Gly Phe Asn Ile Ser Asp Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr
210 215 220
Ile His Glu Met Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly
225 230 235 240
Val Gly Ala Ile Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly
245 250 255
Cys Gln Asn Ser Tyr Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly
260 265 270
Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser Gly Val
275 280 285
Gly Ser Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile Thr
290 295 300
Phe Asp Ser Ala Thr Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Ile Ala Val
305 310 315 320
Leu Asn Gly Thr Val Pro Gln Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg
325 330 335
Ile Met Ala Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Tyr Gln Pro
340 345 350
Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Phe Lys Tyr Phe
355 360 365
Tyr Pro Gln Glu Gly Pro Tyr Glu Lys Val Asn His Phe Val Asn Val
370 375 380
Gln Arg Asn His Ser Glu Val Ile Arg Lys Leu Gly Ala Asp Ser Thr
385 390 395 400
Val Leu Leu Lys Asn Asn Asn Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Arg
405 410 415
Lys Val Ala Ile Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Ser Tyr Gly Ala
420 425 430
Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala
435 440 445
Trp Gly Ser Gly Thr Ala Glu Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln
450 455 460
Ala Ile Gln Ala Glu Val Leu Lys His Lys Gly Ser Val Tyr Ala Ile
465 470 475 480
Thr Asp Asn Trp Ala Leu Ser Gln Val Glu Thr Leu Ala Lys Gln Ala
485 490 495
Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ser Asp Ala Gly Glu Gly Tyr Ile
500 505 510
Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Asn Asn Leu Thr Leu Trp Lys
515 520 525
Asn Gly Asp Asn Leu Ile Lys Ala Ala Ala Asn Asn Cys Asn Asn Thr
530 535 540
Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Val Asp Glu Trp Tyr
545 550 555 560
Asp His Pro Asn Val Thr Ala Ile Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln
565 570 575
Glu Ser Gly Asn Ser Leu Ala Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro
580 585 590
Gly Ala Lys Ser Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ala Tyr Gly
595 600 605
Asp Tyr Leu Val Arg Glu Leu Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Asp
610 615 620
Asp Phe Ser Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg Gly Phe Asp Lys Arg
625 630 635 640
Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr
645 650 655
Phe Asn Tyr Ser Gly Leu His Ile Gln Val Leu Asn Ala Ser Ser Asn
660 665 670
Ala Gln Val Ala Thr Glu Thr Gly Ala Ala Pro Thr Phe Gly Gln Val
675 680 685
Gly Asn Ala Ser Asp Tyr Val Tyr Pro Glu Gly Leu Thr Arg Ile Ser
690 695 700
Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Lys Ala Ser Ser
705 710 715 720
Gly Asp Pro Tyr Tyr Gly Val Asp Thr Ala Glu His Val Pro Glu Gly
725 730 735
Ala Thr Asp Gly Ser Pro Gln Pro Val Leu Pro Ala Gly Gly Gly Phe
740 745 750
Gly Gly Asn Pro Arg Leu Tyr Asp Glu Leu Ile Arg Val Ser Val Thr
755 760 765
Val Lys Asn Thr Gly Arg Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gln Leu Tyr
770 775 780
Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Lys Val Val Leu Arg Lys Phe
785 790 795 800
Asp Arg Leu Thr Leu Lys Pro Ser Glu Glu Thr Val Trp Thr Thr Thr
805 810 815
Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Asn Trp Asp Val Ala Ala Gln Asp Trp
820 825 830
Val Ile Thr Ser Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser Ser Ser Arg
835 840 845
Gln Leu Pro Leu His Ala Ala Leu Pro Lys Val Gln
850 855 860
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 3
ctctatatac acaactggcc atgaagctca gttggctcga 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 4
gtgtcagtca cctctagtta ctattggacc ttgggcagag 40
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 5
ttcctcaatc ctctatatac acaactggcc atgaagctca gttggctcga 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 6
ctaccgccag gtgtcagtca cctctagtta ctattggacc ttgggcagag 50
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 7
cttctcttcc ttcctcaatc ctctatatac acaactggcc atgaagctca gttggctcga 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 8
gattgattgt ctaccgccag gtgtcagtca cctctagtta ctattggacc ttgggcagag 60
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 9
gcagccgtta gcaccgtacg agttggaacc agcgtcttca ccgaggatag 50
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 10
ggttccaact cgtacggtgc taacggctgc tctgaccgcg gctgtgataa 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 11
gggcagagcc gacaccgctg tggtgagcac cccagtcact catgacgaag 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 12
gtgctcacca cagcggtgtc ggctctgccc tcgctgggtt ggatatgtcg 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 13
actctcctga ccgggcaagc cggcccagag gatggcagtg acgttggggt 50
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 14
ctctgggccg gcttgcccgg tcaggagagt ggcaactccc tggctgacgt 50
<210> 15
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 15
cacgttggag ctgatcgtgt cggagatgtt gaaaccatat ccggcggcct 50
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 16
aacatctccg acacgatcag ctccaacgtg gatgacaaga ccattcacga 50
<210> 17
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 17
catggccaaa ctcataaatg ggggtctcat tgcgcttgtc aaatccacgg 50
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 18
atgagacccc catttatgag tttggccatg gcttgagcta caccaccttt 50
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 19
tcagagcagc cgttagcacc gtacgagttg gaaccagcgt cttcaccgag gatagccact 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 20
acgctggttc caactcgtac ggtgctaacg gctgctctga ccgcggctgt gataacggca 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 21
agcgagggca gagccgacac cgctgtggtg agcaccccag tcactcatga cgaagccttg 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 22
ctggggtgct caccacagcg gtgtcggctc tgccctcgct gggttggata tgtcgatgcc 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 23
ttgccactct cctgaccggg caagccggcc cagaggatgg cagtgacgtt ggggtgatca 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> .人工DNA引物
<400> 24
ccatcctctg ggccggcttg cccggtcagg agagtggcaa ctccctggct gacgtgctct 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 25
tcatccacgt tggagctgat cgtgtcggag atgttgaaac catatccggc ggcctctgca 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 26
gtttcaacat ctccgacacg atcagctcca acgtggatga caagaccatt cacgagatgt 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 27
caagccatgg ccaaactcat aaatgggggt ctcattgcgc ttgtcaaatc cacggtagtc 60
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 28
gcgcaatgag acccccattt atgagtttgg ccatggcttg agctacacca cctttaacta 60
<210> 29
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 29
tctatccaca cttctcttcc ttcctcaatc ctctatatac acaactggcc atgaagctca 60
gttggctcga 70
<210> 30
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 30
tagcgaaatg gattgattgt ctaccgccag gtgtcagtca cctctagtta ctattggacc 60
ttgggcagag 70
<210> 31
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 31
cgcggtcaga gcagccgtta gcaccgtacg agttggaacc agcgtcttca ccgaggatag 60
ccacttttcg 70
<210> 32
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 32
tgaagacgct ggttccaact cgtacggtgc taacggctgc tctgaccgcg gctgtgataa 60
cggcactctt 70
<210> 33
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 33
aacccagcga gggcagagcc gacaccgctg tggtgagcac cccagtcact catgacgaag 60
ccttggaagc 70
<210> 34
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 34
agtgactggg gtgctcacca cagcggtgtc ggctctgccc tcgctgggtt ggatatgtcg 60
atgcctggag 70
<210> 35
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 35
gggagttgcc actctcctga ccgggcaagc cggcccagag gatggcagtg acgttggggt 60
gatcatacca 70
<210> 36
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 36
cactgccatc ctctgggccg gcttgcccgg tcaggagagt ggcaactccc tggctgacgt 60
gctctatggc 70
<210> 37
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 37
tcttgtcatc cacgttggag ctgatcgtgt cggagatgtt gaaaccatat ccggcggcct 60
ctgcaacctg 70
<210> 38
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 38
atatggtttc aacatctccg acacgatcag ctccaacgtg gatgacaaga ccattcacga 60
gatgtacctt 70
<210> 39
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 39
tagctcaagc catggccaaa ctcataaatg ggggtctcat tgcgcttgtc aaatccacgg 60
tagtcaatga 70
<210> 40
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 40
gacaagcgca atgagacccc catttatgag tttggccatg gcttgagcta caccaccttt 60
aactactctg 70
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 41
actcaattta cctctatcca cactt 25
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 42
cacatgactt ggcttcc 17
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 43
gtacttttcg ccgaaactat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 44
acggcttcaa gtatttctac 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 45
tgggccggct tgcccggtca 20
<210> 46
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA序列
<400> 46
atgcttttgc aagccttcct tttccttttg gctggttttg cagccaagat ctctgcacag 60
caggccggca ccctgaccac cgaaacccat ccttctctga cctggcagca atgctctgcc 120
ggcggcagct gcaccactca gaacggcaag gtcgtcatcg acgccaactg gcgctgggtt 180
cacagcacca gcggctcgaa caactgctac actggcaaca cttgggatgc tactctctgc 240
cctgacgacg tgacttgcgc tgccaactgc gccctggacg gcgctgacta ctcgggcacc 300
tacggtgtca ccaccagcgg caactctctg cgcctgaact tcgtcaccca ggcgtcgcag 360
aagaacgtcg gctctcgtct ctatctgatg gagaatgaca caacctacca gatcttcaag 420
ttgctgaacc aggagttcac ctttgacgtt gatgtctcca accttccctg cggtctcaac 480
ggtgctctct acctggttgc catggatgcc gacggcggca tggccaagta cccaaccaac 540
aaggctggtg cgaagtacgg aaccggttac tgcgactccc agtgccctcg cgacctgaag 600
ttcatcaacg gtgaggccaa tgttgaggga tggcagcctt cttccaatga ccccaactct 660
ggcattggca accacggctc ttgctgtgct gagatggaca tctgggaggc caacagcatc 720
tccaatgcag tcactcctca cccttgcgac accccgggac aggtcatgtg caccggcaac 780
aactgtggtg gcacttacag cactactcgc tatgctggca cttgcgatcc tgatggctgc 840
gacttcaacc cctaccgcat gggcaaccac tccttctacg gccccaaaca gatcgtcgac 900
accagctcca agttcactgt tgttactcag ttcctcaccg atgatggcac ctccaccggc 960
accctcagcg agatcaggcg cttctacgtt cagaacggcc aggtcatccc caactccgtg 1020
tccacgatca gcggcgtctc cggcaactcc atcaccaccg agttctgcac ggcccagaag 1080
caggctttcg gcgacactga tgacttcagc aagcacggcg gtctgtctgg catgtccgcc 1140
gccctctccc agggtatggt tctcgtcatg agcttgtggg acgaccacgc cgccaacatg 1200
ctctggcttg acagcaccta cccgaccaac gccacctctt ccacccccgg tgccgcccgt 1260
ggtacttgcg acatctcctc cggtgtcccc gccgatgttg agtccaacga ccccaacgcc 1320
tacgtcgtct actccaacat caaggtcggc ccgatcggct ctaccttcag cagctctggc 1380
tctggctcta gctccagctc cagcaccacc accaccacca ccgcttcccc aaccacgacc 1440
acctccagcg cttccagcac cggcactggc gttgctcagc actggggtca gtgcggtggc 1500
cagggatgga ccggtccgac cacctgcgtt agcccctaca cctgccagga gctgaacccc 1560
tactactacc agtgcctgta a 1581
<210> 47
<211> 526
<212> PRT
<213> 雷塞氏篮状菌（Talaromyces leycettanus）
<400> 47
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ser Ala Gln Gln Ala Gly Thr Leu Thr Thr Glu Thr His Pro Ser
20 25 30
Leu Thr Trp Gln Gln Cys Ser Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn
35 40 45
Gly Lys Val Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Ser Thr Ser
50 55 60
Gly Ser Asn Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Thr Leu Cys
65 70 75 80
Pro Asp Asp Val Thr Cys Ala Ala Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp
85 90 95
Tyr Ser Gly Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu
100 105 110
Asn Phe Val Thr Gln Ala Ser Gln Lys Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr
115 120 125
Leu Met Glu Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Asn Gln
130 135 140
Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn
145 150 155 160
Gly Ala Leu Tyr Leu Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ala Lys
165 170 175
Tyr Pro Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp
180 185 190
Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val
195 200 205
Glu Gly Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asp Pro Asn Ser Gly Ile Gly Asn
210 215 220
His Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile
225 230 235 240
Ser Asn Ala Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Met
245 250 255
Cys Thr Gly Asn Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Arg Tyr Ala
260 265 270
Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly
275 280 285
Asn His Ser Phe Tyr Gly Pro Lys Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys
290 295 300
Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Asp Asp Gly Thr Ser Thr Gly
305 310 315 320
Thr Leu Ser Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Gln Val Ile
325 330 335
Pro Asn Ser Val Ser Thr Ile Ser Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr
340 345 350
Thr Glu Phe Cys Thr Ala Gln Lys Gln Ala Phe Gly Asp Thr Asp Asp
355 360 365
Phe Ser Lys His Gly Gly Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Leu Ser Gln
370 375 380
Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met
385 390 395 400
Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Ala Thr Ser Ser Thr Pro
405 410 415
Gly Ala Ala Arg Gly Thr Cys Asp Ile Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp
420 425 430
Val Glu Ser Asn Asp Pro Asn Ala Tyr Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys
435 440 445
Val Gly Pro Ile Gly Ser Thr Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser
450 455 460
Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ser Pro Thr Thr Thr
465 470 475 480
Thr Ser Ser Ala Ser Ser Thr Gly Thr Gly Val Ala Gln His Trp Gly
485 490 495
Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Pro
500 505 510
Tyr Thr Cys Gln Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Tyr Gln Cys Leu
515 520 525
<210> 48
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 48
atatacacaa ctggatttac atgcttttgc aagccttcct 40
<210> 49
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 49
gtgtcagtca cctctagtta ttacaggcac tggtagtagt 40
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 50
tcaatcctct atatacacaa ctggatttac atgcttttgc aagccttcct 50
<210> 51
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 51
ctaccgccag gtgtcagtca cctctagtta ttacaggcac tggtagtagt 50
<210> 52
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 52
tcttccttcc tcaatcctct atatacacaa ctggatttac atgcttttgc aagccttcct 60
<210> 53
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 53
gattgattgt ctaccgccag gtgtcagtca cctctagtta ttacaggcac tggtagtagt 60
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 54
gtagtgctgt aagtgccacc acagttgttg ccggtgcaca tgacctgtcc 50
<210> 55
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 55
caacaactgt ggtggcactt acagcactac tcgctatgct ggcacttgcg 50
<210> 56
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 56
ttgttggttg ggtacttggc catgccgccg tcggcatcca tggcaaccag 50
<210> 57
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 57
cggcggcatg gccaagtacc caaccaacaa ggctggtgcg aagtacggaa 50
<210> 58
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 58
tgcagaactc ggtggtgatg gagttgccgg agacgccgct gatcgtggac 50
<210> 59
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 59
ccggcaactc catcaccacc gagttctgca cggcccagaa gcaggctttc 50
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 60
tggtaggttg tgtcattctc catcagatag agacgagagc cgacgttctt 50
<210> 61
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 61
ctatctgatg gagaatgaca caacctacca gatcttcaag ttgctgaacc 50
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 62
gcatgttggc ggcgtggtcg tcccacaagc tcatgacgag aaccataccc 50
<210> 63
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 63
gcttgtggga cgaccacgcc gccaacatgc tctggcttga cagcacctac 50
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 64
tgtcccttgt cgatgcg 17
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 65
cacatgactt ggcttcc 17
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<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA序列
<400> 66
atgaagttcc atctggcatc tgtggccgcc gggctgtcgg cattgatcac cgccgtctac 60
ggccagtgcg atctcccatc gagctaccgc tggtcctcga gcggtgtact caccgatccc 120
aagaacggct gggcctccct caaggacttc accattgctc cctacaacgg ccagcacctg 180
gtgtatgcca ccaaggttga gaatggcaac tggggctcca tggccttcgg tctcttcagc 240
gacttcagca gcatgagctc cgtcgcccag aacggcatga gctcgtccac cgtcgctccc 300
acgctcttct acttcgcccc caagagcgtc tggatcctgg cctaccaatg gggcgcctgg 360
ccgttcatct acaggacgtc caccaacccc accaaccaga acggctggtc tgcgccccag 420
gccctgttca ccggatccat caccggatcg tcgaccggcc cgatcgacca gacgctgatc 480
ggcgacggca ccaacatgta cctcttcttc accggcgaca acggcaagat ctaccgtgcc 540
agcatgccca tcggcaactt cccgggcagc ttcggctcca actacgtcac cgtcctgagc 600
gacaccacca acaacctctt cgaagccgtc caggtgtaca agctcaaggg cctccagaag 660
tacctcatga tcgtcgaggc catcggcgcc aacggccgct acttccgctc cttcaccgct 720
accagccttg gtggttcctg gacccttcag gccggttccg agagcagccc gttcgccggc 780
aaggccaaca gcggcgccac ctggaccaac gacatcagcc acggcgagct cgtccgctcc 840
tcgagcgacc agaccttcga ggtcgacgcc tgcaacctgc gcctgctgta ccagggccgc 900
aacccgagct ccggcggcga ctacaccctt ctgccgtacc gcccgggtct gctgacgctg 960
cagaacccca gcggcaaccc gcagcccgtg actacgacga cgcggaccac cagctcgcct 1020
cagccgacgg gggcttgtgc gccgctttac ggtcagtgtg gtggaagtgg gtggactggg 1080
cctacgtgct gcgcgagcgg tacctgcaag gccgggaacg agtggtactc tcagtgcact 1140
tag 1143
<210> 67
<211> 380
<212> PRT
<213> 墙粘鞭霉（Gliomastix murorum）
<400> 67
Met Lys Phe His Leu Ala Ser Val Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Ile
1 5 10 15
Thr Ala Val Tyr Gly Gln Cys Asp Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Trp Ser
20 25 30
Ser Ser Gly Val Leu Thr Asp Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ser Leu Lys
35 40 45
Asp Phe Thr Ile Ala Pro Tyr Asn Gly Gln His Leu Val Tyr Ala Thr
50 55 60
Lys Val Glu Asn Gly Asn Trp Gly Ser Met Ala Phe Gly Leu Phe Ser
65 70 75 80
Asp Phe Ser Ser Met Ser Ser Val Ala Gln Asn Gly Met Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Leu Phe Tyr Phe Ala Pro Lys Ser Val Trp Ile
100 105 110
Leu Ala Tyr Gln Trp Gly Ala Trp Pro Phe Ile Tyr Arg Thr Ser Thr
115 120 125
Asn Pro Thr Asn Gln Asn Gly Trp Ser Ala Pro Gln Ala Leu Phe Thr
130 135 140
Gly Ser Ile Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Ile Asp Gln Thr Leu Ile
145 150 155 160
Gly Asp Gly Thr Asn Met Tyr Leu Phe Phe Thr Gly Asp Asn Gly Lys
165 170 175
Ile Tyr Arg Ala Ser Met Pro Ile Gly Asn Phe Pro Gly Ser Phe Gly
180 185 190
Ser Asn Tyr Val Thr Val Leu Ser Asp Thr Thr Asn Asn Leu Phe Glu
195 200 205
Ala Val Gln Val Tyr Lys Leu Lys Gly Leu Gln Lys Tyr Leu Met Ile
210 215 220
Val Glu Ala Ile Gly Ala Asn Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Phe Thr Ala
225 230 235 240
Thr Ser Leu Gly Gly Ser Trp Thr Leu Gln Ala Gly Ser Glu Ser Ser
245 250 255
Pro Phe Ala Gly Lys Ala Asn Ser Gly Ala Thr Trp Thr Asn Asp Ile
260 265 270
Ser His Gly Glu Leu Val Arg Ser Ser Ser Asp Gln Thr Phe Glu Val
275 280 285
Asp Ala Cys Asn Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Gly Arg Asn Pro Ser Ser
290 295 300
Gly Gly Asp Tyr Thr Leu Leu Pro Tyr Arg Pro Gly Leu Leu Thr Leu
305 310 315 320
Gln Asn Pro Ser Gly Asn Pro Gln Pro Val Thr Thr Thr Thr Arg Thr
325 330 335
Thr Ser Ser Pro Gln Pro Thr Gly Ala Cys Ala Pro Leu Tyr Gly Gln
340 345 350
Cys Gly Gly Ser Gly Trp Thr Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Thr
355 360 365
Cys Lys Ala Gly Asn Glu Trp Tyr Ser Gln Cys Thr
370 375 380
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 68
gtcaaccgcg gactgcgcac atgaagttcc atctggcatc 40
<210> 69
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 69
ggctttcgcc acggagctta ctaagtgcac tgagagtacc 40
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 70
cccatctact catcaactca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 71
ataaatcacc cggggccatg 20
<210> 72
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 72
cttctcttcc ttcctcaatc ctctatatac acaactggcc atgaagctca gttggctcga 60
<210> 73
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 73
cagggactgt ctgtctggtc ttctacacga aggaaagagc ctattggacc ttgggcagag 60
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 74
cacatgactt ggcttcc 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
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tgggccggct tgcccggtca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工DNA引物
<400> 76
catttatgag tttggccatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
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agcttaaagt atgtcccttg tcgatgcgat gtatgaattc atgaagctca gttggctcga 60
<210> 78
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 78
gattgattgt ctaccgccag gtgtcagtca cctctagtta ctattggacc ttgggcagag 60
<210> 79
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 79
tgtcccttgt cgatgcg 17
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 80
actcaattta cctctatcca cactt 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 81
cggagatgtt gaaaccatat 20
<210> 82
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 82
tcaaccacaa atcacagtcg tccccggtaa tttaacggct atgaagctca gttggctcga 60
<210> 83
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 83
cagggactgt ctgtctggtc ttctacacga aggaaagagc ctattggacc ttgggcagag 60
<210> 84
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 84
tgtcccttgt cgatgcg 17
<210> 85
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 85
cacatgactt ggcttcc 17
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 86
tgggccggct tgcccggtca 20
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 87
actcaattta cctctatcca cactt 25
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工DNA引物
<400> 88
catttatgag tttggccatg 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工DNA引物
<400> 89
cggagatgtt gaaaccatat 20

Claims (18)

1.一种将多个双链DNA片段组合成DNA分子的方法，所述方法包括：在单一体外反应中将所述多个双链DNA片段与酵母菌株的无细胞提取物接触，以将所述多个DNA片段组合成所述DNA分子，其中每个所述DNA片段具有5'末端和3'末端，并且其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp同源时，所述DNA片段彼此组装。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过以下方式获得所述DNA片段：通过用一种或多种限制酶消化染色体DNA；通过PCR扩增DNA；通过化学合成；或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段从单个基因组、两个或多个基因组、突变DNA或改组DNA中获得。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA片段的来源是基因组DNA、cDNA、半合成DNA、合成DNA或其任何组合。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述DNA片段与线性化质粒或载体组合以产生DNA文库。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述DNA文库是突变DNA文库。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述酵母菌株是酵母属菌株。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述酵母属菌株是酿酒酵母。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中当一个片段的5'末端与另一个片段的3'末端具有至少15bp、至少20bp、至少30bp、至少40bp、至少50bp、至少100bp、或至少200bp同源时，所述DNA片段彼此组合。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其中在不添加一种或多种选自由以下组成的组的外源酶的情况下进行所述体外反应：外源DNA限制酶、外源DNA修饰酶、外源DNA连接酶和外源DNA聚合酶。
11.如权利要求1至10任一项所述的方法，其中在将所述DNA片段组装成DNA分子之前，将同源区侧翼多达至少1000bp的非同源序列去除。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：将所得DNA分子转化到宿主细胞中，并分离包含所述DNA分子的单菌落转化体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌菌株。
14.如权利要求12或13所述的方法，所述方法进一步包括：从所述单菌落转化体中回收DNA分子。
15.如权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括：将所述回收的DNA分子转化到宿主细胞中，并选择转化体。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述回收的DNA分子与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列指导产生由所述DNA分子编码的具有目的生物活性的多肽。
17.如权利要求15或16所述的方法，所述方法进一步包括：在适合产生所述具有目的生物活性的多肽的条件下培养所述转化体。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括：回收所述具有目的生物活性的多肽。
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