CN101631797A - 发酵液中蛋白酶晶体的溶解 - Google Patents

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Abstract

一种溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的方法，包括：a)稀释发酵液100－2000％(w/w)；b)加入二价盐；和c)将发酵液的pH值调节至pH 5.5以下的pH值。

Description

发酵液中蛋白酶晶体的溶解
发明领域
本发明提供一种改进的溶解发酵液(fermentation broth)中蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的方法。
背景
工业蛋白酶的发酵产率在过去数年内有了显著的提高。现在产率非常高，使得发酵液中超过60％的蛋白酶作为晶体和/或沉淀存在。
已经应用了许多方法来解决或减少这个问题，参见例如，US 6,316,240，其中将培养液的pH调节至pH9.5-13.0。
发明内容
本发明人发现了有可能溶解发酵液中超过80％的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀，所以我们提出权利要求：
一种溶解发酵液中蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的方法，包括
a)稀释发酵液100-2000％(w/w(重量/重量))；
b)加入二价盐；和
c)将发酵液的pH值调节至pH5.5以下的pH值。
详述
蛋白酶
发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶可以按照本发明溶解。在优选的实施方案中蛋白酶是枯草溶菌素(subtilisin)。
枯草溶菌素是一种丝氨酸蛋白酶，其利用由Asp32、His64和Ser221(枯草溶菌素BPN’的编号)构成的催化三联体。它包括任何属于NC-IUBMB酶分类EC 3.4.21.62的酶。
根据肽酶的分类可以将枯草溶菌素描述为：SB支(clan SB)，S8家族，MEROPS ID：S08.001。
枯草溶菌素在例如Barrett等1998.Handbook of proteolytic enzymes(蛋白水解酶手册).Academic press，第289-294页中描述。
可以使用任何测定法来测量蛋白酶活性，其中采用某种底物，该底物包括与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH和测定温度同样与所述蛋白酶相适应。
对本发明的和/或用于本发明用途的蛋白酶的来源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶，还包括它们的任何展现蛋白酶活性的突变体、变体、片段等，以及合成蛋白酶，如改组的蛋白酶，和共有蛋白酶。这些遗传工程化的蛋白酶可以按照本领域通常所知来制备，例如，通过定点诱变，通过PCR(使用含有期望突变的PCR片段作为PCR反应中的引物之一)，或通过随机诱变。共有蛋白质的制备在例如EP 897985中描述。
优选的枯草溶菌素是选自下组的枯草溶菌素：枯草溶菌素Carlsberg，枯草溶菌素BPN’，枯草溶菌素147，枯草溶菌素309和枯草溶菌素I168。
优选的可以通过商业方法获得的枯草溶菌素包括ALCALASETM，SAVINASETM，ESPERASETM，EVERLASETM，OVOZYMETM，CORONASETM，POLARZYMETM，和KANNASETM(Novozymes A/S)；MAXATASETM，MAXACALTM，MAXAPEMTM，PROPERASETM，PURAFECTTM，PURAFECTOXPTM，FN2TM，FN3TM，和FN4TM(Genencor International Inc.)；和BLAP XTM(Henkel)。
已知许多蛋白酶，特别是枯草溶菌素，在低pH(pH5.5以下，特别是pH5.0以下)不稳定。这个事实使得本发明特别令人惊奇：将包含感兴趣的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的发酵液的pH调节至pH5.5以下的pH值，并且实现100％回收(参见实施例1，其中在pH4.5在上清液中有100％活性，且在实施例2中，在pH4.2在上清液中有100％活性)。
微生物
根据本发明的蛋白酶可以从微生物获得。
微生物可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或是非单细胞微生物，例如，真核生物。有用的单细胞的细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或链霉菌属(Streptomyces)细胞，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp)。
在优选的实施方案中，细菌宿主细胞是是迟缓芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞或枯草芽孢杆菌细胞。
微生物可以是真菌细胞。“真菌”用于本文包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)。子囊菌门的代表类群(group)包括，例如脉孢菌属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium)(＝青霉属(Penicillium))、裸孢壳(Emericella)(＝曲霉属(Aspergillus))、散囊菌属(Eurotium)(＝曲霉属)和以下所列的真酵母(true yeast)。担子菌门的实例包括蘑菇(mushroom)、锈菌(rust)和黑粉菌(smut)。壶菌门的代表类群包括，例如异水霉属(Allomyces)、小芽枝霉属(Blastocladiella)、雕蚀菌属(Coelomomyces)和水生真菌(aquatic fungi)。卵菌门的代表类群包括，例如水霉类的(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉(water mold))诸如绵霉属(Achlya)。有丝分裂孢子真菌的实例包括曲霉属、青霉属、念珠菌属(Candida)和链格孢属(Alternaria)。接合菌门的代表类群包括，例如根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。“酵母”用于本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。产子囊酵母分为蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者由四个亚科组成，分别为裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母亚科(Lipomycoideae)和酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces))。产担子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、网孢菌属(Filobasidium)和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌类的酵母分为两科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒弹孢酵母属(Bullera))和隐球菌科(Cryptococcaceae)(例如，念珠菌属)。
在另外的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。
宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物细胞，昆虫细胞或植物细胞。
发酵液
本发明可以用于任何工业规模的发酵，例如，用于任何具有至少50升，优选至少500升，更优选至少5000升，甚至更优选至少50000升发酵培养基的发酵。
产生感兴趣的蛋白酶的微生物可以通过本领域已知的任何方法发酵。发酵培养基可以是如例如WO 98/37179中所述的基本培养基，或发酵培养基可以是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中复合氮源可以是部分水解的，如WO 2004/003216中所述。
发酵可以按照分批、重复分批、补料分批、重复补料分批或连续发酵方法来进行。
在补料分批方法中，在发酵开始之前不加入包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物或加入一部分，且在发酵过程中再分别地进料全部或剩余部分的包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物。选择用于进行补料的化合物可以向发酵过程一起进料或彼此分开进料。
在重复补料分批或连续发酵方法中，在发酵过程中额外补料完全起始培养基。起始培养基可以与结构元件料一起或分别进料。在重复补料分批方法中，按固定的时间间隔移除部分包含生物质的发酵液，而在连续方法中，部分发酵液的移除连续进行。因此用对应于取出的发酵液的量的新鲜培养基部分补充(replenish)发酵过程。
在本发明优选的实施方案中，补料分批发酵方法是优选的。
溶解过程
本发明的方法可以应用于未经处理的发酵液或首先经过(但不限于)例如温度调节但在去除细胞和其它固体之前的发酵液。因此，我们提出权利要求：
一种溶解发酵培养基中蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的方法，包括
a)稀释发酵液100-2000％(w/w)；
b)加入二价盐；
c)将发酵液的pH值调节至pH5.5以下的pH值；和
d)去除产生感兴趣的蛋白酶的微生物。
按照本发明将包含蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶的发酵液稀释100-2000％(w/w)，优选100-1500％(w/w)，更优选100-1000％(w/w)，特别是200-700％(w/w)。
稀释用介质将通常是水、来自所述蛋白酶加工的超滤透过液(ultrafiltration permeate)、来自所述蛋白酶加工的循环水、来自加热器的冷凝液或上述的任何组合，例如，水和超滤透过液的混合物。
已经发现二价盐是令人惊讶的良好增溶剂，特别是钙盐和/或镁盐。优选的二价盐是磷酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙酸盐和氯化物，例如氯化钙或氯化镁。优选的实施方案是钙盐。
二价盐应该按照经稀释的发酵液的至少0.01-5％(w/w)，特别是经稀释的发酵液的0.01-1％(w/w)的浓度添加。
二价盐的配料(dosage)通常在线(in-line)完成，或在混合罐中完成，或通过本领域已知的任何其它方法完成。
除了二价盐，加入一种或多种絮凝剂可能是有利的，所述絮凝剂如铝酸盐，例如，NaAlO2，和/或阳离子聚合物，和/或阴离子聚合物。
将发酵液的pH调节至pH5.5以下的pH值，特别是调节至5.0以下的pH值。pH调节可以在加入二价盐之前进行，与加入二价盐同时进行或在加入二价盐之后进行。pH可以调节至2.0-5.5的pH值；优选调节至2.0-5.0的pH值；更优选调节至3.0-5.0之间的pH值，并且特别是调节至4.0-5.0之间的pH值。
应注意本发明的方法步骤：
a)稀释发酵液100-2000％(w/w)，
b)加入二价盐，和
c)将发酵液的pH值调节至pH5.5以下的pH值，
可以按照任意顺序进行；例如，步骤a)和步骤b)可以同时进行；步骤b)和步骤c)可以同时进行；和步骤c)可以在步骤b)之前进行。
经稀释发酵液的电导率(在加入二价盐且调节pH之后)优选在1mS/cm至100mS/cm的范围内；更优选在1mS/cm至40mS/cm的范围内；并且特别是在3mS/cm至20mS/cm的范围内。例如，电导率可以用电导计监测。
经稀释发酵液通常具有5℃-50℃的温度。可能有利的是在稀释之前、同时或之后加热发酵液，或在加入二价盐/调节pH之前、同时或之后加热发酵液。
在加入二价盐和调节pH之后，进行混合。混合时间取决于选择的温度和所述蛋白酶的晶体形貌。
按照本发明可以溶解超过80％的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶；优选可以溶解超过85％的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶；更优选可以溶解超过90％的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶；并且特别是可以溶解超过95％的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶。
在上述溶解过程之后，通过本领域已知的方法去除微生物，所述方法例如，但不限于过滤，例如鼓式过滤(drum filtration)、膜过滤或离心。
应注意的是，在从含有部分结晶或沉淀形式的感兴趣蛋白酶的培养液回收蛋白酶产物的过程中一个重要的参数当然是总提取率(overall extraction yield)。
在某些条件下，回收可以看作两步过程，在第一步中使蛋白酶成为完全可溶的形式，且在第二步中将蛋白酶与细胞物质和通常称作污泥(sludge)的其它不溶物分离。第二步中的蛋白酶与污泥的结合将对总提取率具有负面影响。遗憾的是，对快速溶解结晶或沉淀的酶有利的条件可能增加酶与污泥的结合。
然而，通过采用本发明的特定实施方案，这个问题能够通过如下方式解决，首先通过将发酵液的pH调节至5.5以下的值将结晶或沉淀的蛋白酶溶解，保持低电导率(低于20mS/cm；特别是低于15mS/cm)。
在溶解蛋白酶晶体和蛋白酶沉淀之后，加入二价盐来减少蛋白酶与污泥的结合。目前的电导率在1mS/cm至100mS/cm的范围内；更优选在1mS/cm至40mS/cm的范围内；并且特别是在3mS/cm至20mS/cm的范围内。现在蛋白酶是溶解的，并且能够通过离心、过滤或其它已知的分离方法将蛋白酶与污泥物质分离。
在进一步的实施方案中，在溶解步骤和二价盐的加入之间引入20秒到60分钟的小延迟，优选在溶解步骤和二价盐的加入之间引入20秒到45分钟的延迟；并且特别是在在溶解步骤和二价盐的加入之间引入20秒到30分钟的延迟。溶解是相对较慢的过程。根据上文提供的细节我们还提出权利要求：
一种溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶的方法，包括
a)稀释发酵液100-2000％(w/w)；
b)将发酵液的pH值调节至pH5.5以下的pH值；和
c)加入二价盐，其中在步骤b)和步骤c)之间存在20秒到60分钟的延迟。
应注意的是，通过二价盐的添加从污泥中释放蛋白酶是一个快速过程，意味着在通过例如离心或过滤将蛋白酶从污泥级分分离之前常常不需要延迟。
当蛋白酶在回收过程中所用的pH下具有强的净正电荷并且污泥具有净负表面电荷时，可以有利地应用在步骤b)和步骤c)之间有延迟的两步方法。
后续下游操作
所得蛋白酶可以通过本领域已知的方法进一步分离。例如，蛋白酶可以通过常规方法回收，所述常规方法包括但不限于，进一步的过滤，例如，超滤和微滤(micro-filtration)，提取，喷雾干燥，蒸发，沉淀或结晶。
本发明在下列实施例中进行进一步阐述，下列实施例不应以任何方式限制如权利要求所述的本发明的范围。
实施例1
pH和钙对溶解蛋白酶(枯草溶菌素309)晶体的影响
枯草溶菌素：枯草溶菌素是如EP 0396608B1中所述的枯草溶菌素309。
芽孢杆菌属菌种：芽孢杆菌属菌种是如WO 02/00907中所述插入了枯草溶菌素拷贝的地衣芽孢杆菌。
溶解过程：
发酵液具有6.8的pH。
将发酵液用水稀释300％(w/w)，意味着将1kg发酵液(即培养液＝CB)用3kg水稀释。
取8份样品。在其中4份样品中不加钙。在其他4份样品中加入了相对于未经稀释的发酵液的3％(w/w)的CaCl2(36％(w/w))，意味着二价盐相对于经稀释的发酵液的浓度是：
[(3×0.36)/4]％＝0.27％。
将pH调节至10.5；7.5；7.0；和4.5。
将所有样品在室温混合1小时，除了pH7的样品。
然后将样品离心并且测定了离心液(centrifugate)中的蛋白酶活性。
结果显示于下表1。
CB 稀释  CaCl2(36％)[％wt/CB] pH   时间[分钟] 活性
  样品1*  100   0  0   7   NA   100％
  上清液中的活性
 100   300  0   4.5   60   45％
 100   300  0   7   0   53％
 100   300  0   7.5   60   64％
 100   300  0   10.5   60   66％
 100   300  3   4.5   60   100％
 100   300  3   7   0   63％
 100   300  3   7.5   60   79％
 100   300  3   10.5   60   65％
样品1*：测量了全部蛋白酶活性(来自沉淀和离心液)并且设为100％。
从以上表1能够看出，如果不加钙，在较低的pH下离心液中的蛋白酶活性会降低：pH10.5的蛋白酶活性是66％；在pH7.5活性是64％；而在pH4.5活性是45％。
如果在离心液中加入钙盐，在较低的pH下蛋白酶活性将显著提高：在pH10.5的蛋白酶活性是65％；在pH7.5活性是79％；而在pH4.5活性是100％。
应注意的是，在pH10.5时，钙的加入没有效果。
实施例2
pH和钙对溶解蛋白酶(枯草溶菌素309变体)晶体的影响
枯草溶菌素：枯草溶菌素是如WO 00/37599中所述的枯草溶菌素309的变体。
芽孢杆菌属菌种：芽孢杆菌属菌种是如WO 02/00907中所述的插入了枯草溶菌素拷贝的地衣芽孢杆菌。
溶解过程：
发酵液具有7.4的pH。
将发酵液用水稀释300％(w/w)，意味着将1kg发酵液(即，培养液＝CB)用3kg水稀释。
取8份样品。在其中4份样品中不加钙。在其他4份样品中加入了相对于未经稀释的发酵液的3％(w/w)的CaCl2(36％(w/w))，意味着二价盐相对于经稀释的发酵液的浓度是：
[(3×0.36)/4]％＝0.27％。
将pH调节至10.5；7.5；7.0；和4.2。
将所有样品在室温混合1小时，除了pH7的样品。
测量了8份样品的电导率。它们全部在10.5至14.3mS/cm的范围内。
然后将样品离心并且测定了离心液中的蛋白酶活性。
结果示于下表2。
  CB   稀释   CaCl2(36％)[％wt/CB]   pH   时间[分钟]   活性
  样品1*   100   0   0   7   0   100％
  上清液中的活性
  100   300   0   4.2   60   67％
  100   300   0   7   0   63％
  100   300   0   7.5   60   39％
  100   300   0   10.5   60   19％
  100   300   3   4.2   60   100％
  100   300   3   7   0   48％
  100   300   3   7.5   60   65％
  100   300   3   10.5   60   10％
样品1*：测量了全部蛋白酶活性(来自沉淀和离心液)并且设为100％。
从以上表2能够看出，如果加入钙盐，在较低的pH下离心液中的蛋白酶活性将显著提高：在pH10.5的蛋白酶活性是10％；在pH7.5活性是65％；而在pH4.2活性是100％。
应注意的是，在pH10.5时，钙的加入具有负面效果(negative effect)。

Claims (21)

1.一种溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀的方法，包括：
a)稀释发酵液100-2000％(w/w)；
b)加入二价盐；和
c)将发酵液的pH值调节至pH 5.5以下的pH值。
2.根据权利要求1的方法，其中蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀获得自微生物。
3.根据权利要求2的方法，其中微生物是原核生物或真核生物。
4.根据权利要求2的方法，其中原核生物是芽孢杆菌属细胞。
5.根据权利要求1的方法，其中蛋白酶是枯草溶菌素。
6.根据权利要求1的方法，其中用水稀释发酵液。
7.根据权利要求6的方法，其中用超滤透过液稀释发酵液。
8.根据权利要求1的方法，其中用水和超滤透过液的混合物进行稀释。
9.根据权利要求1的方法，其中二价盐是钙盐和/或镁盐。
10.根据权利要求1的方法，其中二价盐以相对于稀释发酵液的0.01-5％的浓度添加。
11.根据权利要求1的方法，其中将pH调节至pH 2.0-5.0。
12.根据权利要求11的方法，其中将发酵液调节至pH 3.0-5.0。
13.根据权利要求12的方法，其中将发酵液调节至pH 4.0-5.0。
14.根据权利要求1的方法，其中发酵液具有5℃-50℃的温度。
15.根据权利要求1的方法，其中向发酵液额外地加入一种或多种其它絮凝剂。
16.根据权利要求1的方法，其中步骤a)和步骤b)同时进行。
17.根据权利要求1的方法，其中步骤b)和步骤c)同时进行。
18.根据权利要求1的方法，其中步骤c)在步骤b)之前进行。
19.一种溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶的方法，包括
a)稀释发酵液100-2000％(w/w)；
b)将发酵液的pH值调节至pH 5.5以下的pH值；和
c)加入二价盐，其中在步骤b)和步骤c)之间存在20秒至60分钟的延迟。
20.根据权利要求1或权利要求19的方法，其中在步骤a)、b)和c)之后的电导率在1mS/cm至100mS/cm的范围。
21.根据权利要求1或权利要求19的方法，其中将超过80％的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀和/或与细胞物质/不溶物结合的蛋白酶溶解。
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