CN108367245A - 在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法 - Google Patents

在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108367245A
CN108367245A CN201680072025.XA CN201680072025A CN108367245A CN 108367245 A CN108367245 A CN 108367245A CN 201680072025 A CN201680072025 A CN 201680072025A CN 108367245 A CN108367245 A CN 108367245A
Authority
CN
China
Prior art keywords
target protein
protein
zymotic fluid
cleaning solution
matter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680072025.XA
Other languages
English (en)
Inventor
K·特雷尔-马克森
P·德克特
A·沙德勒
V·纳维茨卡斯
V·温格特
T·凯尔丁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of CN108367245A publication Critical patent/CN108367245A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/147—Microfiltration
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/16—Feed pretreatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/18—Details relating to membrane separation process operations and control pH control
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/16—Diafiltration

Abstract

本发明涉及一种从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。

Description

在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法
发明领域
本发明涉及从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一种或多种有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。
发明背景
通过培养选定的产生有用物质的微生物的这些物质的生物技术生产现在具有相当大的工业意义。尤其是，蛋白质的工业生产，特别是洗涤-和/或清洁-活性酶，还有药物活性蛋白质，在过去几十年里通过发酵生产不断增加。
对于待掺入商业产品中的发酵产物，完成发酵过程后，通常需要从发酵液的颗粒物质中纯化。然而，从培养液收集发酵产物，尤其是收集目标蛋白质，常常受到以下情况的阻碍：相当大量的发酵产物不是溶解形式的并且粘附于发酵液中的颗粒物质，导致相当大的产量损失。
本领域中存在各种方法来提高目标蛋白质的溶解性和降低目标蛋白质与发酵液中的颗粒物质(特别是生物质)的结合。
在US6582606中，描述了一种纯化方法，包括将含有savinase的发酵液调节至pH5.2，并随后将CaCl2和活性炭添加至100％稀释的发酵液中。通过随后简单的微滤除去细菌细胞。
WO2011003784公开了一种用于从发酵液纯化淀粉酶或蛋白酶的方法，通过将发酵液的pH调节至pH6.5-pH10.5，随后600％稀释发酵液，并添加CaCl2和磷酸钠。描述了通过随后的离心分离了细菌细胞。作为除去细胞后加工蛋白质溶液的其他方式，WO2011003784建议了进一步纯化，例如，通过超滤、渗滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶。
在WO0043502A2中，公开了用于从培养液收集糖苷酶或肽酶的方法，包括在除去细胞前将培养液的pH调节至约9.5至约13的pH值的步骤。在WO0043502A2中，描述了淀粉酶的纯化，其中用水200％(w/w)稀释培养液的样品，补充絮凝剂并将样品的pH调节至pH10.5。随后，通过离心除去生物质，并且测定与酶纯化前发酵液中的酶活性相比，上清液中的淀粉酶活性为80％。
WO2008110498A1描述了一种溶解发酵液中的蛋白酶晶体和/或蛋白酶沉淀物的方法。在WO2008110498A1中，通过使用以下步骤溶解枯草芽孢杆菌蛋白酶：a)稀释发酵液300％(w/w)；b)添加3％(w/w)CaCl2(36％(w/w))；和c)将发酵液的pH值调节至pH4.5或4.2的pH值。随后通过离心除去生物质。
因此，所有已知的方法需要在除去细胞前用水大量稀释发酵液，以获得良好的蛋白质产量。
此外，现有技术中用于工业规模的发酵后的蛋白质纯化的方法中，没有一个公开在有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从发酵液的颗粒物质解吸的条件下洗涤发酵液的颗粒物质。反而，现有技术中描述的用于从发酵液大规模纯化蛋白质的所有方法需要在从发酵液除去细胞前调节发酵液有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从发酵液中的颗粒物质解吸的条件。这使得收集方法复杂化，费事且成本高，并且不可以进行连续处理。
因此，现有技术中用于大规模蛋白质纯化的技术的特征在于复杂的多步程序，其没有允许连续的纯化方法，并且其导致通常与蛋白质纯化前需要发酵液大量稀释相关的不令人满意的产量。
因此，本领域需要促进用于通过发酵方法获得的目标蛋白质的纯化方法，特别地，改进纯化方法，以允许连续的纯化方法并降低由于结晶和沉淀以及由于蛋白质与发酵液的颗粒物质结合引起的纯化过程中的蛋白质损失。
发明简述
通过本发明提供了所述问题的解决方法，其涉及从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，其中在一个或多个洗涤步骤中引用促进目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的条件。
特别地，本发明涉及一种从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤，其中所述从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。
有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物。
发明详述
通过参考以下本发明优选实施方案和本文中包括的实施例的详细描述，可以更容易地理解本发明。
定义
除非另外指出，否则本文中使用的术语根据相关领域的普通技术人员常规使用来理解。
将理解，如说明书和权利要求中使用的，“一个(a)”或“一个(an)”可以根据其中使用的内容表示一个或多个。因此，例如，提及“一个(a)细胞”可以表示可以利用至少一个细胞。
在整个本申请中，参考了各种出版物。这些出版物中的全部和这些出版物内引用的那些参考文献的全部公开内容按引用并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的状况。
术语纯化(“purification”或“purifying”)是指其中至少一种组分(例如，目标蛋白质)与至少另一种组分(例如，发酵液的颗粒物质)分离，并转移至不同的区隔或相中的过程，其中所述不同的区隔或相不必定需要通过物理屏障隔开。这样的不同区隔的实例是由滤膜或滤布分开的两个区隔，即，滤液和截留物；这样的不同相的实例分别是沉淀和上清液或滤饼和滤液。
术语“解吸”是指其中共价或非共价(例如，通过离子或疏水性相互作用)结合另一种分子或物质(例如，发酵液的颗粒物质)的分子(例如，目标蛋白质)通过破坏或松开所述分子和所述另一种分子或物质之间的键而从所述另一种分子或物质释放的过程。因此，结合发酵液的颗粒物质的目标蛋白质的纯化首先需要目标蛋白质与发酵液的颗粒物质解吸。
术语“洗涤”在本文中用于其中将特定体积的洗涤液加入颗粒物质或含有颗粒物质的溶液中并随后或同时从所得到的溶液中取出相同或相近体积的液体的过程。因此，术语“洗涤”包括同时添加特定体积的洗涤液并从包含目标蛋白质以及洗涤液中的悬浮颗粒物质的溶液中取出相同或相近体积的液体，和随后取出相同或相似体积的液体。因此，对于包含颗粒物质的发酵液，术语“洗涤”包括用洗涤液替代特定部分的包含颗粒物质的发酵液的液相，所述洗涤液在取出部分包含颗粒物质的发酵液的初始液相之前、之后或同时添加。由于添加洗涤液和取出相同或相近体积的初始液体的组合，洗涤步骤与相对于洗涤步骤前的初始体积没有工作体积的净增加。在这点上，“连续洗涤步骤”的特征在于通过同时添加和取出等量的溶液保持洗涤步骤过程中的工作体积恒定。同样的理解应当适用于术语“将颗粒物质接触洗涤液”。因此，发酵液的或发酵液中的颗粒物质的洗涤因此可以在从发酵液的或发酵液中的颗粒物质纯化目标蛋白质的同时或之前进行。
与术语“洗涤”相反，术语“稀释”描述了其中将特定体积的液体加入化合物溶液(例如，包含目标蛋白质的溶液)中的过程，由此增加工作体积，没有随后从所得到的溶液取出相同或相近体积的液体，这导致溶液中所述化合物浓度的降低。例如，将液体(例如，水)加入发酵液中并随后纯化目标蛋白质，在目标蛋白质纯化前没有取出相同或相近体积的液体，例如，而是取出了合并体积的添加的液体和发酵液的液体部分，因此认为是稀释步骤，而不是洗涤步骤。
术语“未稀释的发酵液”是指进行发酵过程后添加实质性量的稀释剂前的发酵液。因此，术语“未稀释的发酵液”还包括已经轻微稀释的发酵液，例如，由于调整发酵液的某些参数，例如，由于pH调节或电导率调节引起的稀释。在任一种情况中，术语“未稀释的发酵液”不包括已经稀释超过或等于20％(w/w)，优选10％(w/w)的发酵液。
术语“工业规模的发酵”(也称为大规模发酵)是指使用大于或等于20升发酵罐体积的发酵过程。
如本文中使用的，术语分子的“pI值”(也缩写为pH(I)或IEP值)应当是指分子(特别是氨基酸、肽或蛋白质)的等电点，其是特定分子不携带净电荷的pH值。因为实验和计算的pI值可能略有不同，因此本文中的术语“pI值”是指计算的pI值。可以使用如例如Bjellqvist等1993中所述的单个氨基酸的pK值或通过使用基于网络的接口如http://web.expasy.org/compute_pi/.来计算pI值。
术语发酵液的或发酵液中的“颗粒物质”(在本文中也称为发酵液的或发酵液中的固体物质或固体部分)应当表示目标蛋白质纯化前发酵液中包含的并且可以通过本领域技术人员已知条件下的离心或过滤与剩余的发酵液分离的任何不溶性物质。发酵液的或发酵液中的颗粒物质的实例是生物质，即，死的和/或活的细胞、不溶性培养基组分，如复合氮源或复合碳源的不溶性组分、盐、絮凝剂或过滤助剂。
术语“正电荷化合物”应当描述在各自溶液包含正电荷化合物的条件下具有正净电荷的化合物，例如，肽或蛋白质，但还描述包含阳离子和阴离子的化合物(例如，盐)内的阳离子，该化合物因此不具有净电荷，但将所述化合物置于溶液中时，阴离子和阳离子将分离并且随之释放正电荷化合物。
术语“生物质”应当描述发酵过程中产生的微生物的死的和/或活的细胞，优选未破坏的细胞。
详述
本发明涉及一种从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的步骤，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物。
不希望受到理论的束缚，发明人认为在接近蛋白质pI值的pH下，蛋白质不具有净电荷并且因此易于不太溶解。相反，在低于蛋白质pI值的pH下，蛋白质具有整体正电荷，而在高于蛋白质pI值的pH下，蛋白质具有整体负电荷。两种条件，即，正以及负净电荷降低蛋白质聚集的趋势，即，正面地影响蛋白质收集。然而，因为发酵液中的大部分颗粒物质，最重要的是细胞生物质，具有净负电荷，因此具有正净电荷的蛋白质易于结合发酵液的颗粒物质，并且很可能在随后的蛋白质分离过程中丢失。可以通过添加正电荷化合物来防止目标蛋白质与颗粒物质的结合。令人惊讶地，发明人发现了在发酵液处理过程中的洗涤步骤中应用正面影响蛋白质收集的条件优于在发酵液处理前将这些条件应用于未处理的或仅仅稀释的发酵液。
本发明对于工业规模的任何发酵是有用的，例如，对于具有至少20升培养基的任何发酵，优选，至少50升，更优选至少300升，进一步优选至少1000升。实际发酵怎样进行对于本发明的纯化方法相对不重要。因此，发酵时间、pH、消泡或其他特定发酵条件可以根据本领域已知的标准条件来应用。优选，调节发酵条件以获得目标蛋白质的最大产量。发酵培养基可以是例如WO 98/37179中所述的基本培养基，或发酵培养基可以是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中复合氮源可以是部分水解的，如WO 2004/003216中所述。发酵可以作为分批、重复批次、补料-分批、重复补料-分批或连续发酵过程来进行。在补料-分批过程中，在发酵开始前没有将包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物加入培养基中，或部分加入，并且在发酵过程中分别补加包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物的全部或剩余部分。选择用于补加的化合物可以一起补加，或彼此分开补加至发酵过程中。在重复补料-分批或连续发酵过程中，在发酵过程中另外补加完整的起始培养基。起始培养基可以与结构元素补料一起补加或分开补加。在重复补料-分批过程中，以规律的时间间隔取出一部分包含生物质的发酵液，而在连续过程中，连续进行部分发酵液的取出。发酵过程由此补充对应于取出发酵液含量部分的新鲜培养基。在本发明的优选实施方案中，优选补料-分批发酵过程。
优选，发酵液的或发酵液中的颗粒物质包括至少一种选自生物质、复合培养基组分(优选，复合氮源和/或复合碳源的组分)、絮凝剂、过滤助剂，或发酵液中存在的任何固体的组分。优选，发酵液的或发酵液中的颗粒物质包括生物质，优选死的和/或活的细胞，优选完整细胞，优选未裂解的细胞。优选，生物质不包括包涵体。优选，发酵液的或发酵液中的颗粒物质包括生物质和一种或多种选自复合培养基组分(优选，复合氮源和/或复合碳源的组分)、絮凝剂、过滤助剂，或发酵液中存在的任何固体的组分。优选，发酵液的或发酵液中的颗粒物质是生物质。
本文解决了一般问题，即，回收目标蛋白质，其中目标蛋白质以相对高产量表达时，特定含量的不在溶液中的目标蛋白质是最显著的。因此，本发明的优选实施方案是从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，其中目标蛋白质以至少2g蛋白质(干物质)/kg未处理培养基的含量表达，优选以至少3g蛋白质(干物质)/kg未处理培养基的含量；更优选以至少5g蛋白质(干物质)/kg未处理培养基的含量，更优选以至少10g蛋白质(干物质)/kg未处理培养基的含量，甚至更优选以至少20g蛋白质(干物质)/kg未处理培养基的含量表达。
本发明的方法可以应用于未处理的发酵液或首先已经接受但不限于例如温度调节、pH调节、电导率调节、稀释和/或添加絮凝剂和/或过滤助剂的发酵液。优选，上述的纯化步骤应用于首先已经接受但不限于温度调节、pH调节、电导率调节、稀释的未稀释发酵液。更优选，上述纯化步骤应用于首先已经接受pH调节和/或电导率调节和/或温度调节的发酵液。
优选，在开始纯化步骤前，发酵液的温度为4-50℃，优选4至40℃。
任选，在开始蛋白质纯化前，将发酵液稀释。
因此，本发明涉及从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，开始从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质前，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物。
由此，目标蛋白质与发酵液的颗粒物质分离。
因此，本发明涉及从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括aa)一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物，
由此目标蛋白质溶解和/或从颗粒物质释放至洗涤液中，和bb)将包含目标蛋白质的洗涤液与颗粒物质分离。
在本发明的一个实施方案中，在开始目标蛋白质纯化前，将包含待纯化的目标蛋白质的发酵液稀释高达5000％(w/w)，优选高达1000％(w/w)，更优选高达500％(w/w)，优选20-5000％(w/w)，优选20-1000％(w/w)，优选20-500％(w/w)，优选10-5000％(w/w)，更优选10-1000％(w/w)，特别是10-500％(w/w)，特别是20-700％(w/w)，特别是20-500％(w/w)。
优选，从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的步骤还包括使用水的一个或多个洗涤步骤，优选去离子或部分去离子水。优选，在一个或多个包括将颗粒物质接触洗涤液的洗涤步骤前应用使用水的一个或多个洗涤步骤，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。因此，在优选实施方案中，本发明涉及从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，开始从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质前，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括aa)一个或多个使用水的洗涤步骤，优选去离子或部分去离子水，和随后bb)一个或多个洗涤步骤，其包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物，
由此目标蛋白质溶解和/或从颗粒物质释放至洗涤液中，和cc)将包含目标蛋白质的洗涤液与颗粒物质分离。
优选，所述一个或多个洗涤步骤进行足以允许目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从发酵液的颗粒物质解吸的时间。优选，在所述一个或多个洗涤步骤过程中，将颗粒物质接触洗涤液长达1min，长达5min，长达10min，长达15min，长达30min，长达60min，长达2h，长达3h，长达4h，长达5h，长达10h，或长达1天的时间段。
在本发明中，一个或多个洗涤步骤是连续的或一个或多个不连续的洗涤步骤。优选，使用1-3个洗涤步骤或连续的洗涤步骤。更优选，所述一个或多个洗涤步骤是连续的洗涤步骤。
因此，本发明的方法允许在连续或不连续过程中从颗粒物质纯化目标蛋白质。优选，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法是连续过程，其优选包括使用洗涤液的连续洗涤步骤，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。在优选实施方案中，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质与一个或多个洗涤步骤同时进行。优选，本发明的方法包括连续洗涤步骤，其中从颗粒物质分离包含目标蛋白质的洗涤液与一个或多个洗涤步骤同时进行。在这个实施方案中，从发酵液的生物质纯化目标蛋白质的步骤与一个或多个洗涤步骤同时进行。
因此，在本发明的优选实施方案中，涉及从发酵液的生物质纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的生物质纯化目标蛋白质，其中从发酵液的生物质纯化目标蛋白质的步骤包括aa)一个或多个洗涤步骤，其包括将生物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物，
由此目标蛋白质溶解和/或从生物质释放至洗涤液中，和bb)将包含目标蛋白质的洗涤液与生物质分离，其中所述一个或多个洗涤步骤是连续的洗涤步骤，优选其中从颗粒物质分离包含目标蛋白质的洗涤液与一个或多个洗涤步骤同时进行。
在一个特定实施方案中，在用洗涤液连续洗涤颗粒物质的步骤前，将发酵液的液体部分与发酵液的固体部分分离，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。在另一个特定实施方案中，将发酵液的液体部分与发酵液的固体部分分离与一个或多个洗涤步骤同时。
优选，从包含液体和固体部分的发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括渗滤步骤，其中所述渗滤步骤包括所述一个或多个使用洗涤液的洗涤步骤，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件。与不连续过程相比，使用这些连续或部分连续过程减少了对大的存储容器的需求。
在优选实施方案中，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤不包括离心步骤，优选，不包括非连续的离心步骤。
或者，从颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括从发酵液分离颗粒物质的步骤，例如，通过离心，并且随后是从发酵液分离的颗粒物质的一个或多个洗涤步骤。因此，在优选实施方案中，从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的方法包括步骤
A)任选，稀释包含目标蛋白质的发酵液，
B)从发酵液分离颗粒物质，形成包含颗粒物质的发酵液的固体部分和发酵液的液体步骤，和
C)对发酵液的固体部分施用一个或多个洗涤步骤，包括将包含颗粒物质的发酵液的固体部分接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物。
在这个特定的实施方案中，优选将除去颗粒物质后的发酵液的液体部分与洗涤发酵液的固体部分后收集的一个或多个洗涤液混合。
在纯化步骤前，包含目标蛋白质的发酵液不需要稀释。稀释步骤的省略节约了时间和资源，并且减少了储存容器的数量和体积。此外，其减少了必须处置的水的量。
因此，在优选实施方案中，从未稀释的发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质。优选，在纯化前，仅存在低于低于20％、低于10％、低于5％、低于2％(w/w)的发酵液的稀释，或根本没有稀释。
因此，优选，本发明涉及从发酵液的发酵颗粒(优选生物质)纯化目标蛋白质的方法，包括从未稀释的发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，其中从未稀释的发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质与一个或多个洗涤步骤同时，所述洗涤步骤包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物。
在优选实施方案中，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质前，优选，在一个或多个洗涤步骤前，提高发酵液的颗粒物质的浓度，优选通过浓缩，优选通过不完全的过滤或通过离心结合部分去除离心浓缩物。
优选，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质开始前，进行发酵液的pH值的调节。优选，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质前，将发酵液的pH值调节至pH7.5至pH12.5，优选调节至pH8.5至pH12.0，优选pH8.5至10.0，或调节至pH4.5至pH9.5，优选，pH4.5至pH9.0，优选，pH5.0至pH8.5，优选5.5至8.0。
相对于待收集的目标蛋白质的特定特征来优化特定pH水平在技术人员的一般知识范围内。
优选，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质前，将发酵液的pH值优选调节至高于或低于目标蛋白质的pI值的0.2-0.75的pH，0.2-1.0、0.2-2.0、0.2-3.0、0.2-4.0、0.5-1.0、0.5-2.0、0.5-3.0或0.5-4.0pH值单位，或优选高于或低于目标蛋白质的pI值的至少0.2、至少0.5、至少0.75、至少1.0、至少1.25、至少1.5、至少1.75、至少2.5、至少2.75、至少3.0、至少3.25、至少3.5、至少3.75或至少4.0pH值单位。
在优选实施方案中，目标蛋白质的pI值为pH5.5至pH10.0，优选pH5.5至7.5，优选pH7.0至pH10.0，或优选pH8.0至pH9.5。
优选，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质开始前，将发酵液的电导率调节至1-100mS/cm的电导率，优选1-50mS/cm，更优选10mS/cm至50mS/cm；甚至更优选1-25mS/cm的发酵液，从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质前通过在这些条件下添加正电荷化合物来调节。
发酵液的电导率(添加正电荷组分和任选pH调节后)优选在1mS/cm至100mS/cm范围中；更优选在1mS/cm至50mS/cm范围中；更优选在10mS/cm至50mS/cm范围中；甚至更优选在1mS/cm至25mS/cm范围总。例如，可以使用电导率计来检测电导率。
在优选实施方案中，在纯化步骤中应用的有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的洗涤液条件之一包括洗涤液的pH值高于目标蛋白质的pI值，并且洗涤液的pH值高于目标蛋白质的pI值至少0.2pH值单位。在这个实施方案中，优选，将洗涤液的pH值调节至高于目标蛋白质的pI值的0.2-0.75、0.2-1.0、0.2-2.0、0.2-3.0、0.2-4.0、0.5-1.0、0.5-2.0、0.5-3.0或0.5-4.0pH值单位，或高于目标蛋白质的pI值的至少0.5、至少0.75、至少1.0、至少1.25、至少1.5、至少1.75、至少2.5、至少2.0、至少2.75、至少3.0、至少3.25、至少3.5、至少3.75或至少4.0pH值单位。优选，洗涤液的pH具有pH 8.5至pH 12.5，优选pH 8.5至pH 10.0的pH值。优选，洗涤液的pH具有pH 5.0至pH10的pH值，并且优选，目标蛋白质是蛋白质酶或淀粉酶。优选，洗涤液的pH具有pH 8.5至pH 12.5的pH值，优选，pH 8.5至pH 10.0，并且目标蛋白质的pI值在pH 5.5至pH 8.4的pH值，优选目标蛋白质是蛋白酶，优选是丝氨酸蛋白酶，或淀粉酶。
优选，洗涤液的pH具有pH 8.5至pH 12.5的pH值，优选，pH 8.5至pH 10.0，并且目标蛋白质是蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶，优选具有pH 5.5至pH 8.4的pI值的蛋白酶。
优选，洗涤液的pH具有pH 5.0至pH 12.0的pH值，优选，pH 6.0至pH 12.0，优选pH6.0至pH 11.0，并且目标蛋白质的pI值在pH 5.0至pH 7.0的pH值，优选低于pH 7.0，并且目标蛋白质是淀粉酶。
在优选实施方案中，洗涤液的pH具有pH 8.5至pH 13.0的pH值，优选，pH 8.5至pH12.0，更优选8.5至10.0，并且所述一个或多个洗涤步骤在4℃至50℃温度下进行，优选4℃至40℃。
优选，洗涤液是具有本文中所述性质的水溶液。
在优选实施方案中，在纯化步骤中应用的有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的洗涤液条件之一包括洗涤液的pH值低于目标蛋白质的pI值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm，优选1-50mS/cm，更优选10-50mS/cm，甚至更优选1-25mS/cm电导率的正电荷化合物，并且洗涤液的pH值比目标蛋白质的pI值低至少0.2pH值单位。
在这个实施方案中，优选，将洗涤液的pH调节至优选低于目标蛋白质的pI值的0.2-0.75、0.2-1.0、0.2-2.0、0.2-3.0、0.2-4.0、0.5-1.0、0.5-2.0、0.5-3.0或0.5-4.0pH值单位，或低于目标蛋白质的pI值的至少0.2、至少0.5、至少0.75、至少1.0、至少1.25、至少1.5、至少1.75、至少2.0、至少2.5、至少2.75、至少3.0、至少3.25、至少3.5、至少3.75或至少4.0pH值单位。在这个实施方案中，优选，洗涤液的电导率(添加正电荷组分和pH调节后)优选在1mS/cm至100mS/cm的范围中；更优选在1mS/cm至50mS/cm的范围中；甚至更优选在1mS/cm至25mS/cm的范围中。
优选，洗涤液的pH具有pH 4.0至9.5的pH值，优选pH 4.5至pH 8.0，优选pH 4.5至pH 7.5，优选pH 4.5至6.0，优选，pH 4.5至pH 5.5，优选pH 5.0至5.5。
优选，洗涤液的pH具有pH 5.0至pH 8.0的pH值，优选pH 5.5至pH 8.0。这个实施方案特别允许丝氨酸蛋白酶在稳定蛋白酶并且降低蛋白酶的蛋白质水解活性的pH范围中工作。
优选，洗涤液的pH具有pH 4.0至pH 5.5的pH值，优选pH 4.5至pH 5.0。这个实施方案特别允许淀粉酶的纯化。
优选，在这个实施方案中，洗涤液的pH具有pH 4.0至pH 8.0的pH值，优选，pH 5.5至pH 8.0，优选，洗涤液的pH低于蛋白质的pI至少0.2、至少0.5、至少0.75、至少1.0、至少1.25、至少1.5、至少1.75、至少2.0、至少2.5，并且洗涤液的电导率(添加正电荷组分和pH调节后)优选在1mS/cm至100mS/cm的范围中，更优选在1mS/cm至50mS/cm的范围中，更优选在1mS/cm至25mS/cm的范围中，并且目标蛋白质的pI值在pH 5.5至pH 12的pH值，优选pH 5.5至pH 7.5，优选pH 8.2至pH 12，优选pH 6.5至pH 8.4，优选目标蛋白质是蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶，或淀粉酶。
优选，在这个实施方案中，洗涤液的pH具有pH 5.0至pH 8.0的pH值，并且洗涤液的电导率(添加正电荷组分和pH调节后)优选在1mS/cm至100mS/cm的范围中，更优选在1mS/cm至50mS/cm的范围中，更优选在1mS/cm至25mS/cm的范围中，并且目标蛋白质是蛋白酶，优选丝氨酸蛋白酶，优选具有pH 8.2至pH 12.0的pI值的蛋白酶。
优选，洗涤液的pH具有pH 4.0至pH 7.0的pH值，优选pH 4.0至pH 5.5,并且洗涤液的电导率(添加正电荷组分和pH调节后)优选在1mS/cm至100mS/cm的范围中，更优选在1mS/cm至50mS/cm的范围中，更优选在1mS/cm至25mS/cm的范围中，并且目标蛋白质的pI值在pH5.5至pH 7.5的pH值，并且目标蛋白质是淀粉酶。
在优选实施方案中，本发明涉及从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，
其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质与一个或多个洗涤步骤同时，所述洗涤步骤包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括高于目标蛋白质的pI值的pH值，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件包括pH 7.5至pH 13.0的pH值，优选pH 8.0至pH 12.0，更优选pH 8.5至pH 10.0，优选其中目标蛋白质是蛋白酶，优选，丝氨酸蛋白酶，或淀粉酶。
在优选实施方案中，本发明涉及从发酵液的颗粒物质(优选生物质)纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质，
其中从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的步骤包括从发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质与一个或多个洗涤步骤同时，所述洗涤步骤包括将颗粒物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的条件之一包括低于目标蛋白质的pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm的电导率的正电荷化合物，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从颗粒物质解吸的洗涤液的条件包括pH 4.0至pH 9.5的pH值，优选pH 4.5至pH 9.0，更优选pH 5.0至pH 8.5，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm的电导率的正电荷化合物，优选其中目标蛋白质是蛋白酶，优选，丝氨酸蛋白酶，或淀粉酶。
优选，上述正电荷化合物是盐的阳离子，优选，其中盐的阳离子是单价或二价阳离子，优选，钠、钙或镁离子，或其中正电荷化合物是具有高于目标蛋白质的pI值的pI值的氨基酸、肽或蛋白质，或其组合。
合适的盐的阳离子是Li、Na、K、Mg、Ca、Al、Fe或NH4阳离子的阳离子，或其组合。优选的盐的阳离子是钠、钙、氨或镁阳离子或其组合。包括阳离子的盐的优选阴离子是磷酸根、硫酸根、硝酸根、醋酸根和/或氯离子、甲酸根、碳酸根。在优选的实施方案中，将NaCl、Na2SO4、CaCl2或MgCl2、NH4SO4、醋酸钠、甲酸钠或其组合用于正电荷化合物的添加。
在优选实施方案中，通过过滤，优选通过微滤，或通过离心，优选，通过滗析器离心或碟式(disc stack)离心，来实现从颗粒物质纯化目标蛋白质。
在优选实施方案中，通过连续过滤或连续离心来实现从颗粒物质纯化目标蛋白质。
优选，通过选自错流过滤，优选，使用管式模块、板式模块，或使用中空纤维，或死端过滤，优选，转鼓过滤、盘式过滤机、带式过滤机或压滤机的方法来实现从颗粒物质纯化目标蛋白质。
在另一个优选实施方案中，洗涤液包括至少一种选自缓冲液、盐溶液、微滤滤液、超滤滤液、离心浓缩物、水和任何其他加工流的溶液。使用下游加工流节约了资源，因为将现有的流进行了循环。此外，使用下游加工流作为洗涤液提高了目标蛋白质的产量，因为通常有残余量的蛋白质包含在这些加工流中，随后将其收集。
在优选实施方案中，洗涤液是缓冲液。合适的缓冲液是磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液或甲酸盐缓冲液。
优选，发酵液获自表达目标蛋白质的微生物的发酵，优选，所述微生物是原核生物或真核生物。
优选，所述微生物是细菌、古细菌、真菌细胞、酵母细胞或真核细胞。
有用的原核生物是细菌细胞，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。优选的有用的革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌(Bacillus)细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophius)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、Bacillus Jautus、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。最优选，原核生物是芽孢杆菌细胞，优选，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。
一些其他优选的细菌包括放线菌目(Actinomycetales)的菌株，优选，链霉菌属(Streptomyces)，优选，类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC23695)、嗜热链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)、青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或Streptovertivillum verticilliumssp.verticillium。其他优选的细菌包括类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、Rhodomonas palustri、乳链球菌(Streptococcus lactis)。更多优选的细菌包括属于粘球菌(Myxococcus)的菌株，例如，变绿粘球菌(M.virescens)。
优选的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)，优选，Pseudomonas purrocinia(ATCC 15958)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)。
微生物可以是真菌细胞。如本文中使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)，以及卵菌门(Oomycota)和半知菌亚门(Deuteromycotina)，和所有有丝分裂真菌。子囊菌门的代表性组包括，例如，链孢霉属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium)(＝青霉属(Penicillium))、翘孢霉属(Emericella)(＝曲霉属(Aspergillus))、散囊菌属(Eurotium)(＝曲霉属(Aspergillus))、毁丝霉属(Myceliophthora)、C1，和以下所列的真酵母。担子菌门的实例包括蘑菇、rusts和smuts。壶菌门的代表性组包括例如异水霉属(Allomyces)、Blastocladiella、雕蚀菌属(Coelomomyces)，和水生真菌。卵菌门的代表性组包括例如Saprolegniomycetous水生真菌(水霉)，如绵霉属(Achlya)。有丝分裂真菌的实例包括曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)和链格孢属(Alternaria)。接合菌门的代表性组包括例如根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)。
一些优选的真菌包括属于半知菌亚门、丝孢菌纲(Hyphomycetes)的菌株，例如，镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Tricoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝菌属(Verticillum)、Arthromyces、Caldariomyces、单格孢属(Ulocladium)、埃里格孢属(Embellisia)、枝孢属(Cladosporium)或德氏霉属(Dreschlera)，特别是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(DSM 2672)、特异腐质霉(Humicola insolens)、里氏木霉(Trichoderma resii)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucana)(IFO 6113)、黑白轮枝菌(Verticillum alboatrum)、Verticillum dahlie、Arthromyces ramosus(FERM P-7754)、Caldariomyces fumago、纸龈枝孢(Ulocladium chartarum)、Embellisia alli或Dreschlera halodes。
其他优选的真菌包括属于担子菌亚门，担子菌纲(Basidiomycetes)的菌株，例如，鬼伞属(Coprinus)、毛平革菌(Phanerochaete)、云芝属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)，特别是Coprinus cinereus f.microsporus(IFO 8371)、长根鬼伞(Coprinusmacrorhizus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(例如，NA-12)或栓菌属(之前称为多孔菌属(Polyporus))，例如，T.versicolor(例如，PR4 28-A)。
更多优选的真菌包括属于接合菌亚门(Zygomycotina)，Mycoraceae的菌株，例如，根霉或毛霉，特别是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文中使用的“酵母”包括子囊孢子酵母(酵母目(Endomycetales))、产担子酵母和属于半知菌类(Fungi lmperfecti)的酵母(Blastomycetes)。子囊孢子酵母分成蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者由四个亚科组成，裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、Lipomycoideae和Saccharomycoideae(例如，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)和酵母属(Saccharomyces))。产担子酵母包括Leucosporidim、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、Sporidiobolus、Filobasidium和线黑粉菌属(Filobasidiella)。属于半知菌类的酵母分成两个科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属)。在另一个实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。
宿主细胞还可以真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
本发明的方法可以应用于收集任何目标蛋白质。
优选，目标蛋白质是酶，特别是归类为氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂解酶(EC 4)、异构酶(EC 5)或连接酶(EC 6)的酶(EC编号根据国际生物化学和分子生物学联合命名委员会的酶命名，推荐(1992)，包括1993-1999公开的增补)。
最优选，酶是水解酶(EC 3)，优选，糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)。尤为优选的酶是选自淀粉酶(特别是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))、纤维素酶(EC 3.2.1.4)、乳糖酶(EC3.2.1.108)、甘露聚糖酶(EC 3.2.1.25)、连接酶、植酸酶(EC 3.1.3.8)和蛋白酶的酶；特别是选自淀粉酶、蛋白酶、连接酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶的酶，优选，淀粉酶或蛋白酶，优选，丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)。最优选是丝氨酸蛋白酶。在优选实施方案中，目标蛋白酶是去污剂酶。
在特别优选的实施方案中，以下水解酶是优选的：
蛋白酶：合适的蛋白酶包括细菌或真菌来源的那些。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌的那些，例如，Novo枯草杆菌蛋白酶、Carlberg枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。优选，枯草杆菌蛋白酶是使用由Asp32、His64和Ser221组成的催化三联体的丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶BPN‘编号)，优选，枯草杆菌蛋白酶的pI值为pH 7.0至pH 10.0，优选pH 8.0至pH 9.5。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及WO89/06270和WO 94/25583中所述的镰刀菌蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例是WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所述的变体，尤其是在以下一个或多个位置具有置换的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
其他有用的蛋白酶描述于WO2012080201和WO2013060621。
更多优选的蛋白酶是根据DE102012215642A1的SEQ ID NO:1的蛋白酶及其变体，其中优选的变体包括位置3、4、99、194和199的一个或多个突变(使用来自DSM5483的碱性蛋白酶的编号)，优选包括一个或多个以下突变：S3T、V4I、R99E、V194M和V199I，优选S3T、V4I、R99E和V199I，更优选R99E，或R99E结合两个另外的选自S3T、V4I和V199I的突变，优选DE102012215642A1的SEQ ID NO:1具有R99E或S3T、V4I、V194M和V199I，或S3T、V4I和V199I。更多优选的蛋白酶是根据DE102012215642A1的SEQ ID NO:2的蛋白酶及其变体，其中优选的变体包括位置99的突变以及位置99和100之间的插入，其中插入是天冬氨酸(Asp，D)残基。在这个实施方案中，优选位置99的突变是S99A。更多优选的蛋白酶变体是DE102011118032A1的SEQ ID NO:7，包括突变S3T、V4I和V205I，或DE102011118032A1的SEQID NO:8，包括突变S3T、V4I、V193M、V199I和L211D，使用来自DSM5483的碱性蛋白酶的编号。
优选的商业上可利用的蛋白酶包括Alcalase(TM)、Savinase(TM)、Primase(TM)、Duralase(TM)、Esperase(TM)和Kannase(TM)(Novozymes A/S)，Maxatase(TM)、Maxacal(TM)、Maxapem(TM)、Properase(TM)、Purafect(TM)、Purafect OxP(TM)、FN2(TM)、和FN3(TM)(Genencor International Inc.)。
连接酶：合适的连接酶包括细菌或真菌来源的那些。有用的连接酶的实例包括来自腐质霉属(嗜热真菌属(Thermomyces)的同义词)的连接酶，例如，来自柔毛腐质霉(H.lanuginosa)(绵毛嗜热丝菌(Thermomyces lanuginosus))，如EP 258 068和EP 305216中所述的，或来自特异腐质霉，如WO 96/13580中所述的，假单胞菌连接酶，例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)、芽孢杆菌连接酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica etBiophysica Acta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO91/16422)。
其他实例是连接酶变体，如WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO97/04079和WO 97/07202中所述的那些。
优选的商业上可利用的连接酶包括Lipolase(TM)和Lipolase Ultra(TM)(Novozymes A/S)。
淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰突变体或蛋白质工程化突变体。淀粉酶包括，例如，获自芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的特定菌株，更详细地描述于GB 1,296,839中。
有用的淀粉酶的实例是WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中所述的变体，尤其是在以下的一个或多个位置具有置换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
商业上可利用的淀粉酶是Duramyl(TM)、Termamyl(TM)、Fungamyl(TM)和BANT(TM)(Novozymes A/S)、Rapidase(TM)和Purastar(TM)(来自Genencor International Inc.)。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰突变体或蛋白质工程化突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属(Thielavia)、支顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如，美国专利No.4,435,307、U.S.5,648,263、U.S.5,691,178、U.S.5,776,757和WO 89/09259中公开的产自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和尖孢镰刀菌的真菌纤维素酶。
尤其合适的纤维素酶是具有护色益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998、EP 0 531 315、美国专利No.5,457,046、U.S.5,686,593、U.S.5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些。
商业上可利用的纤维素酶包括Celluzyme(TM)和Carezyme(TM)(Novozymes A/S)、Clazinase(TM)和Puradax HA(TM)(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)(TM)(Kao Corporation)、
氧化还原酶：可以根据本发明处理的氧化还原酶包括过氧化物酶、氧化酶，如漆酶。
过氧化物酶：呈现过氧化物酶活性的酶可以是酶分类(EC 1.11.1.7)包括的任何过氧化物酶，或从其衍生的呈现过氧化物酶活性的任何片段。
特别地，优选重组产生的过氧化物酶，例如，根据WO 92/16634的源自鬼伞属的过氧化物酶，特别是长根鬼伞(C.macrorhizus)或灰盖鬼伞(C.cinereus)，或其变体，例如，WO93/24618和WO 95/10602中所述的变体。
漆酶和漆酶相关的酶：在本发明的内容中，漆酶和漆酶相关的酶考虑了由酶分类(EC 1.10.3.2)包括的任何漆酶，由酶分类(EC 1.10.3.1)包括的任何儿茶酚氧化酶，由酶分类(EC 1.3.3.5)包括的任何胆红素氧化酶或酶分类(EC 1.14.18.1)包括的任何单酚单加氧酶。
微生物漆酶可以源自细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，并且合适的实例包括源自源自曲霉属、镰孢霉属的漆酶，例如，粗糙链孢霉(N.crassa))、柄孢壳菌属(Podospora)、Botrytis、金线菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)(例如，绒毛栓菌(T.villosa)和变色栓菌(T.versicolor))、丝核菌属(Rhizoctonia)(例如，立枯丝核菌(R.solani))、鬼伞属(例如，褶皱鬼伞(C.plicatilis)和灰盖鬼伞)、小脆柄菇属(Psatyrella)、毁丝霉属(例如嗜热毁丝霉)、柱顶孢属(Schytalidium)、多孔菌属(Polyporus)(例如，P.pinsitus)、射脉菌属(Phlebia)(例如射脉菌(P.radita)(WO 92/01046))，或革盖菌属(Coriolus)(例如，毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)的漆酶，特别是可获自栓菌属、毁丝霉属、柱顶孢属或多孔菌属的漆酶。
此外，通过重组DNA技术或通过化学修饰制得的目标蛋白质的蛋白质工程化变体可以是特别感兴趣的。
从本发明的方法得到的纯化蛋白酶可以进一步通过本领域已知的方法来加工。例如，可以通过常规程序来收集蛋白酶，所述常规程序包括，但不限于，进一步的过滤，例如，超滤和微滤、萃取、脱色、色谱、除臭、喷雾干燥、蒸发、沉淀或结晶和离心。
从本发明的发酵液的颗粒物质纯化目标蛋白质的方法可以用于制备液体蛋白质制剂。优选，液体蛋白质制剂是蛋白质浓缩物，优选包含一种或多种酶稳定剂的稳定的酶制剂。在另一个实施方案中，液体蛋白质制剂是去污剂制剂。因此，本发明的方法可以用于制备去污剂制剂。在优选实施方案中，目标蛋白质是去污剂酶，并且液体蛋白质制剂是包括去污剂酶、一种或多种去污剂、一种或多种酶稳定剂和任选一种或多种其他去污剂酶的去污剂制剂。
在以下实施例中进一步说明本发明，所述实施例并不是打算以任何方式限制所要求的本发明的范围。
实施例
以下实施例只是用于说明本发明。本领域技术人员显而易见的各种可能的变化也落入本发明的范围内。
除非另外指出，通过应用遗传工程和通过培养微生物发酵生产化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品，来进行以下实验。还可以参见Sambrook等(MolecularCloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和Chmiel等(Bioprocesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)。
实施例1
使用低于pI值的pH洗涤
通过培养产生衍生自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌来获得含蛋白酶的发酵液，如例如DE 102012215642A1的SEQ ID NO:1中所述的，包括突变R99E，使用来自DSM5483的碱性蛋白酶的编号。
使用具有管式模块(所述管式模块具有一个通道)的微滤膜和四体积的渗滤洗涤液，在1.3巴跨膜压力下，通过渗滤未稀释的发酵液来纯化蛋白酶，之前没有通过离心或其他方式去除生物质。将渗滤洗涤液进行缓冲，分别地，对于pH＝6，使用10mM醋酸钠(NaOAc)，对于pH＝7.5，使用醋酸铵(NH4OAc)，将pH调节至pH6或pH7.5，并且用Na2SO4调节洗涤液的电导率至15mS/cm。不同发酵液的蛋白酶活性在5％CV(变异系数或相对标准偏差)范围中。
表1
*)发酵液的
从表1显示的数据，可以获知在微滤过程中使用具有低于蛋白酶的pI(pI＝pH8.3)的pH(即，pH7.5)并结合使用正电荷化合物(例如，Na2SO4)具有15mS/cm电导率的渗滤洗涤液时，蛋白酶在微滤截留物中的损耗平均为6.2％。将渗滤洗涤液的pH进一步降至pH6.0时，微滤截留物中的蛋白酶损耗进一步降至平均5％。因此，表1中的数据证明了在渗滤洗涤液中包括正电荷化合物时(在这种情况中，至15mS/cm电导率的Na2SO4)，将渗滤洗涤液的pH降至低于目标蛋白酶的pI(pI在此为pH8.3)降低了微滤步骤中的蛋白酶损耗(即，纯化过程中目标蛋白酶的产量提高)。
实施例2
使用高于pI值的pH洗涤
在这个实施例中，使用与实施例1中相同的设定，除了在渗滤洗涤液中调节pH高于蛋白酶的pI值，并且没有添加另外的正电荷化合物(洗涤液仅用10mM NaHCO3进行了缓冲)。不同发酵液的蛋白酶活性在2％CV(变异系数或相对标准偏差)范围中。
表2
*)发酵液的
从表2中显示的数据，可以获知在微滤过程中使用具有高于蛋白酶的pI(pH8.3)的pH(即，pH8.5)的渗滤洗涤液时，微滤截留物中的蛋白酶损耗为6.0％。pH进一步提高至pH9时，微滤截留物中的蛋白酶损耗进一步降至平均4.3％。
因此，表2的数据证明了将渗滤洗涤液的pH提高至高于蛋白酶的pI(pH8.3)降低了微滤步骤中目标蛋白质的损耗。不需要添加正电荷化合物。
实施例3
与简单稀释相比的洗涤的效果
如上所述，通过培养产生枯草杆菌蛋白酶的地衣芽孢杆菌获得含蛋白酶的发酵液。
通过发酵液的微滤纯化蛋白酶。发酵液在微滤前用洗涤液(用10mM NaOAc，pH6缓冲，用Na2SO4将电导率调节至15mS/cm)稀释，或在微滤过程中使用相同量的相同种类的洗涤液洗涤。不同发酵液的蛋白酶活性在3.6％CV(表3)和1.1％CV(表4)范围中。
表3
MK＝1：无浓缩
MA＝0：无渗滤
*)发酵液的
表4
MK＝1：无浓缩
MA＝0：无渗滤
*)发酵液的
从表3和4显示的数据，可以获知替代使用相同类型的溶液的简单稀释步骤，使用有利于蛋白酶溶解和/或蛋白酶从颗粒物质解吸的洗涤液进行洗涤步骤时，微滤过程中的蛋白酶损耗分别从39.2％降至24.7％(表3)以及从28％降至4.2％(表4)。
因此，表3和4中的数据证明了使用有利于目标蛋白质溶解和/或蛋白质从颗粒物质解吸的溶液的洗涤步骤优于仅仅使用具有洗涤液相同性质的稀释剂稀释发酵液。
实施例4
使用和未用解吸条件的洗涤
按照实施例1所述获得了含蛋白酶的发酵液。
使用具有一个通道和3mm内径的管式微滤膜，通过未稀释的发酵液的渗滤纯化了蛋白酶，之前没有通过离心去除生物质。微滤过程中的洗涤使用水(pH7.5)或使用渗滤洗涤液进行，所述渗滤洗涤液用含有100mM NaCl的pH7.5的10mM NaHCO3缓冲。不同发酵液的蛋白酶活性在10％CV范围中。
表5
*)发酵液的
从表5中显示的数据，可以获知在微滤步骤过程中使用水洗涤导致微滤截留物中8％的蛋白酶损耗。使用盐水溶液导致微滤截留物中降低的3％的蛋白酶损耗。
因此，表5中的数据证明了在微滤过程中使用pH低于蛋白质的pI值(在此pI为pH8.3)的洗涤液，正电荷化合物的添加导致微滤截留物中蛋白质损耗的降低。
在相似的实验设定中，使用具有一个通道和6mm内径的管式微滤膜，通过未稀释发酵液的渗滤纯化了蛋白酶，之前没有通过离心去除生物质。微滤过程中的洗涤在1.3巴的跨膜压力下使用四体积的渗滤洗涤液来进行。渗滤洗涤液是水，用10mM NaHCO3、甲酸钠(NaForm)或NaOAc缓冲的溶液，或超滤透过液(具有大约17mS/cm的电导率)。如表6中所示的调节渗滤洗涤液的pH。不同发酵液的蛋白酶活性在7.4％CV范围中。
表6
*)发酵液的
从表6中显示的数据，可以获知微滤步骤过程中使用水或具有低于蛋白酶的pI值(pH8.3)的pH的缓冲液的洗涤导致微滤截留物中大约13％的蛋白酶损耗。使用盐水溶液导致微滤截留物中降低的大约4.6％的蛋白酶损耗。使用具有pH9.0(即，高于蛋白酶pI值的pH值)的洗涤液导致微滤截留物中降低的4.2％的蛋白酶损耗。此外用具有相似条件的超滤透过液(UF-透过液)替代限定的洗涤液产生了微滤截留物中降低的3.8％的蛋白酶损耗。
因此，表6中的数据再次证明了在微滤过程中使用具有低于蛋白酶的pI值(pH8.3)的pH的洗涤液时，添加正电荷化合物导致微滤截留物中目标蛋白质的损耗降低。此外，表6中的数据显示了通过使用具有高于蛋白质pI值的pH的洗涤液，获得了相似的结果。在这种情况中，为了获得这种提高的蛋白酶产量，不需要添加正电荷化合物。此外，还有满足所述要求的加工流，即，高于目标蛋白质的pI值的pH值或低于目标蛋白质的pI值的pH值，且具有5-20mS/cm电导率，可以用作洗涤液。
实施例5
离心沉淀物的洗涤
按照实施例1中所述的获得含蛋白酶的发酵液。
通过在烧杯离心机中离心发酵液来纯化蛋白酶。在一个实验中，将未稀释的发酵液离心，并且用洗涤液洗涤离心沉淀物，所述洗涤液用具有pH 6.0的10mM NaOAc缓冲并包含至洗涤液15mS/cm电导率的正电荷化合物(Na2SO4)。在另一个实验中，用相同体积的这种溶液稀释发酵液，并且随后离心。离心沉淀物没有用洗涤液洗涤。在两种情况中，测定了离心沉淀物中的蛋白酶损耗。不同发酵液的蛋白酶活性在4.3％CV范围中。
表7
*)发酵液的
从表7中显示的数据，可以获知用合适的洗涤液(低于pI的pH并包括正电荷化合物)洗涤离心沉淀物导致离心沉淀物7.8％的蛋白质酶损耗。仅用相似体积的具有洗涤液相同条件的稀释剂稀释发酵液，没有随后的离心沉淀物的洗涤步骤，导致离心沉淀物中12.9％的蛋白质酶损耗。
因此，表6中的数据证明了对于蛋白质损耗而言，分离生物质前用洗涤液简单稀释发酵液不如离心沉淀物的洗涤步骤。
实施例6
不同的复合氮源
使用不同的复合氮源，按照实施例1中所述的，通过培养产枯草杆菌蛋白质酶的地衣芽孢杆菌，获得了含蛋白质酶的发酵液。
在1.3巴的跨膜压力下，使用具有3mm内径和一个通道的管式微滤膜以及四体积的渗滤洗涤液，通过渗滤未稀释的发酵液来纯化蛋白质酶，之前没有通过离心或其他方式去除生物质。分别用醋酸铵(NH4Oac)缓冲渗滤洗涤液，将pH调节至pH7.5，并用Na2SO4调节洗涤液的电导率至15mS/cm。没有进行浓缩，并应用四体积的渗滤洗涤液。不同发酵液的蛋白质酶活性在2.7％CV的范围中。
表8
*)发酵液
从表8中显示的数据，可以获知在发酵培养液中使用不同的复合氮源，例如，谷蛋白、玉米浆或马铃薯，使用具有pH7.5(即，低于蛋白酶的pI值)和15mS/cm电导率的渗滤洗涤液时，获得了截留物中降低的蛋白酶损耗。
因此，表8中的数据证明了使用具有低于蛋白质pI值的pH值的洗涤液和包含正电荷化合物的洗涤液进行洗涤步骤时，与发酵液的组成无关，可以获得目标蛋白质损耗的降低。
实施例7
使用水接着高于pI值的pH调节的洗涤
按照实施例1中所述的，通过培养产枯草杆菌蛋白酶的地衣芽孢杆菌，获得了含蛋白酶的发酵液。通过渗滤，从发酵液纯化蛋白酶。简而言之，将发酵液接受微滤，其中同时用4体积的水洗涤截留物。第二个洗涤体积后，通过将截留物的pH调节至pH9，将pH调节至解吸条件。随后，用2体积的水洗涤截留物。
从表9中的数据可以看到，洗涤步骤过程中，将条件调节至解吸条件，即，高于蛋白质pI值的pH值，导致微滤截留物中的低蛋白酶损耗。
表9
*)发酵液的电导率
实施例8
使用水接着提高电导率的洗涤
按照实施例1中所述的，通过培养产枯草杆菌蛋白酶的地衣芽孢杆菌，获得了含蛋白酶的发酵液。通过渗滤从发酵液纯化蛋白酶。简而言之，将发酵液接受微滤，其中同时用4体积的洗涤液洗涤截留物，其中在洗涤程序过程中，将洗涤液从水变成具有低于蛋白质pI值的pH(pH7.5)和10mS/cm Na2SO4电导率的缓冲液。在试验3和4中，在第二个洗涤体积后，将截留物的pH调节至pH7.5，并将电导率变成15mS/cm。随后，用2体积表10中所示的洗涤液洗涤截留物。
如从表10中的数据可以看到，在洗涤步骤过程中，将条件调节至解吸条件，在这种情况中，调节至低于蛋白质pI值的pH值和添加正阳离子，导致微滤截留物中的低蛋白酶损耗。
表10
*)发酵液的电导率。

Claims (19)

1.一种从发酵液的生物质纯化目标蛋白质的方法，包括步骤
A)任选，稀释包含目标蛋白质的发酵液，和
B)从发酵液的生物质纯化目标蛋白质，其中从发酵液的生物质纯化目标蛋白质的步骤包括aa)一个或多个洗涤步骤，其包括将生物质接触洗涤液，所述洗涤液包括一个或多个有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的条件，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的条件之一包括
a)高于目标蛋白质pI值的pH值；或
b)低于目标蛋白质pI值的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物，
由此目标蛋白质溶解和/或从生物质释放至洗涤液中，和bb)将包含目标蛋白质的洗涤液与生物质分离。
2.权利要求1的方法，其中从发酵液的生物质纯化目标蛋白质的步骤与一个或多个洗涤步骤同时进行。
3.权利要求1或2的方法，其中从未稀释的发酵液的生物质纯化目标蛋白质。
4.之前任一项权利要求的方法，其中在从发酵液的生物质纯化目标蛋白质之前，进行发酵液的pH值的调节。
5.之前任一项权利要求的方法，其中在从发酵液的生物质纯化目标蛋白质之前，通过在这些条件下添加正电荷化合物，将发酵液的电导率调节至1-100mS/cm的电导率。
6.之前任一项权利要求的方法，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的洗涤液条件之一包括洗涤液的pH值高于目标蛋白质的pI值，并且洗涤液的pH值高于目标蛋白质的pI值至少0.2pH单位。
7.权利要求1-5的方法，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质从生物质解吸的洗涤液条件之一包括洗涤液的pH值低于目标蛋白质的pI值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物，并且洗涤液的pH值低于目标蛋白质的pI值至少0.2pH单位。
8.权利要求6的方法，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质解吸的条件包括pH7.0至pH 13.0，优选pH 8.5至pH 12.0的pH值。
9.权利要求7的方法，其中有利于目标蛋白质溶解和/或目标蛋白质解吸的条件包括pH4.0至pH 9.5，优选pH 4.0至pH 8.0的pH值，并且在这些条件下，浓度导致洗涤液1-100mS/cm电导率的正电荷化合物。
10.权利要求7或9的方法，其中所述正电荷化合物是盐的阳离子，优选，其中盐的阳离子是单价或二价阳离子，优选，钠、钙或镁离子，或其中正电荷化合物是pI值高于目标蛋白质pI值的氨基酸、肽或蛋白质，或其组合。
11.之前任一项权利要求的方法，其中通过过滤，优选通过微滤，或通过离心，优选通过滗析器离心或碟式离心，来实现从生物质纯化目标蛋白质。
12.之前任一项权利要求的方法，其中通过选自错流过滤，优选，使用管式模块、板式模块，或使用中空纤维，或死端过滤，优选，转鼓过滤、盘式过滤机、带式过滤机或压滤机的方法，来实现从生物质纯化目标蛋白质。
13.之前任一项权利要求的方法，其中所述洗涤液包括至少一种选自缓冲液、盐溶液、微滤滤液、超滤滤液、离心浓缩物、水和任何其他加工流的溶液。
14.之前任一项权利要求的方法，其中从表达目标蛋白质的微生物的发酵获得发酵液。
15.权利要求14的方法，其中所述微生物是原核生物或真核生物。
16.权利要求15的方法，其中所述原核生物是芽孢杆菌细胞，优选，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)或迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)的芽孢杆菌细胞。
17.之前任一项权利要求的方法，其中所述蛋白质是酶。
18.权利要求17的方法，其中所述酶选自淀粉酶、蛋白酶、连接酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，优选，淀粉酶或蛋白酶，优选枯草杆菌蛋白酶。
19.之前任一项权利要求的方法用于制备液体蛋白质制剂的用途。
CN201680072025.XA 2015-12-09 2016-12-08 在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法 Pending CN108367245A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15198622 2015-12-09
EP15198622.1 2015-12-09
PCT/EP2016/080165 WO2017097869A1 (en) 2015-12-09 2016-12-08 Method of purifying a protein from fermentation solids under desorbing conditions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108367245A true CN108367245A (zh) 2018-08-03

Family

ID=55023859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680072025.XA Pending CN108367245A (zh) 2015-12-09 2016-12-08 在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20190024038A1 (zh)
EP (2) EP4218992A3 (zh)
JP (1) JP2018536418A (zh)
KR (1) KR20180085737A (zh)
CN (1) CN108367245A (zh)
BR (1) BR112018011567A2 (zh)
CA (1) CA3005292A1 (zh)
MX (1) MX2018007067A (zh)
RU (1) RU2018124771A (zh)
WO (1) WO2017097869A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117024567A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 健通(济南)生物科技有限公司 一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3606936B1 (en) 2017-04-03 2021-10-20 Novozymes A/S Recovery process
EP3927809A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and trace element feed
CN114096676A (zh) 2019-02-20 2022-02-25 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和镁补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
EP3983425A1 (en) 2019-06-13 2022-04-20 Basf Se Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation
CN114096677A (zh) * 2019-07-05 2022-02-25 巴斯夫欧洲公司 使用补料分批预培养的微生物细胞工业发酵方法
WO2024033135A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033134A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Enzyme compositions comprising protease, mannanase, and/or cellulase
WO2024033136A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033133A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Enzyme compositions comprising an amylase

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1213376A (zh) * 1996-03-14 1999-04-07 诺沃挪第克公司 利用固体吸附材料以提高的产率结晶蛋白质的方法
CN1337999A (zh) * 1999-01-25 2002-02-27 诺维信公司 在高pH下蛋白质的回收
WO2002055537A1 (en) * 2001-01-12 2002-07-18 Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc. Extractive purification of lipopeptide antibiotics
CN1396176A (zh) * 2001-07-06 2003-02-12 阿尔法·瓦瑟曼公司 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
CN1429131A (zh) * 2000-05-18 2003-07-09 诺维信公司 用活性炭进行微过滤
CN1681837A (zh) * 2002-09-11 2005-10-12 中外制药株式会社 纯化蛋白质的方法
CN101368177A (zh) * 2008-10-13 2009-02-18 西北农林科技大学 微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺
CN101631797A (zh) * 2007-03-15 2010-01-20 诺维信公司 发酵液中蛋白酶晶体的溶解

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (zh) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
JPH0697997B2 (ja) 1985-08-09 1994-12-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 新規の酵素的洗浄剤添加物
ATE110768T1 (de) 1986-08-29 1994-09-15 Novo Nordisk As Enzymhaltiger reinigungsmittelzusatz.
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
JP2624859B2 (ja) 1988-01-07 1997-06-25 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素洗剤
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
JP2728531B2 (ja) 1988-03-24 1998-03-18 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ セルラーゼ調製品
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
JPH02238885A (ja) 1989-03-13 1990-09-21 Oji Paper Co Ltd フェノールオキシダーゼ遺伝子組換えｄｎａ、該組換えｄｎａにより形質転換された微生物、その培養物及びフェノールオキシダーゼの製造方法
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
JP3112937B2 (ja) 1990-04-14 2000-11-27 カリ―ヒエミー アクチエンゲゼルシヤフト アルカリ性バチルスーリパーゼ、これをコード化するｄｎａ配列およびこのリパーゼを生産するバチルス
KR100237148B1 (ko) 1990-05-09 2000-01-15 한센 핀 베네드 엔도글루칸아제 효소를 함유하는 셀룰라제 제조물
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
FI903443A (fi) 1990-07-06 1992-01-07 Valtion Teknillinen Framstaellning av lackas genom rekombinantorganismer.
ATE169671T1 (de) 1990-09-13 1998-08-15 Novo Nordisk As Lipase-varianten
ES2174820T3 (es) 1991-01-16 2002-11-16 Procter & Gamble Composiciones detergentes compactas con celulasa de alta actividad.
ES2148168T3 (es) 1991-03-22 2000-10-16 Novo Nordisk As Proceso para la produccion de proteinas peroxidasas de una cepa de aspergillus.
DK0583339T3 (da) 1991-05-01 1999-04-19 Novo Nordisk As Stabiliserede enzymer og detergentsammensætninger
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
DE69334295D1 (de) 1992-07-23 2009-11-12 Novo Nordisk As MUTIERTE -g(a)-AMYLASE, WASCHMITTEL UND GESCHIRRSPÜLMITTEL
JP3681750B2 (ja) 1992-10-06 2005-08-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セルラーゼ変異体
NZ262623A (en) 1993-02-11 1998-03-25 Genencor Int Alpha-amylase mutant, dna and vectors encoding such and detergent compositions thereof
JP3618748B2 (ja) 1993-04-27 2005-02-09 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体
DK52393D0 (zh) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
CA2173946A1 (en) 1993-10-13 1995-04-20 Anders Hjelholt Pedersen H2o2-stable peroxidase variants
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
WO1995022615A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Novo Nordisk A/S A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
EP1632557B1 (en) 1994-03-08 2011-02-23 Novozymes A/S Novel alkaline cellulases
DE69528524T2 (de) 1994-05-04 2003-06-26 Genencor Int Lipasen mit verbesserten tensiostabilitaet
WO1995035381A1 (en) 1994-06-20 1995-12-28 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
AU2884695A (en) 1994-06-23 1996-01-19 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
EP1995303A3 (en) 1994-10-06 2008-12-31 Novozymes A/S Enzyme preparation with endoglucanase activity
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
WO1996013580A1 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
CN101955921A (zh) 1995-03-17 2011-01-26 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
CN1193346A (zh) 1995-07-14 1998-09-16 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的修饰酶
AU6655196A (en) 1995-08-11 1997-03-12 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
AU3938997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
DE69735767T2 (de) 1996-09-17 2007-04-05 Novozymes A/S Cellulasevarianten
EP0948610B1 (en) 1996-11-04 2011-05-25 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions
CA2270180C (en) 1996-11-04 2011-01-11 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
US6159731A (en) 1997-02-12 2000-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis
CN100351386C (zh) 1997-02-20 2007-11-28 Dsm公司 用化学上确定的培养基以工业规模发酵生产有价值的化合物
CN1665924A (zh) 2002-07-01 2005-09-07 诺维信公司 水解氮源
CN102471755A (zh) 2009-07-09 2012-05-23 诺维信公司 用二价盐和磷酸盐进行絮凝
DE102010063457A1 (de) 2010-12-17 2012-06-21 Henkel Ag & Co. Kgaa Lagerstabiles flüssiges Wasch- oder Reinigungsmittel enthaltend Protease und Cellulase
DE102011118032A1 (de) 2011-05-31 2012-12-06 Henkel Ag & Co. Kgaa Expressionsvektoren zur verbesserten Proteinsekretion
DE102011118021A1 (de) 2011-10-28 2013-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Leistungsverbesserte und temperaturstabile Proteasevarianten
DE102012215642A1 (de) 2012-09-04 2014-03-06 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- oder Reinigungsmittel mit verbesserter Enzymleistung
JP6474992B2 (ja) 2014-10-21 2019-02-27 浜松ホトニクス株式会社 光検出ユニット

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1213376A (zh) * 1996-03-14 1999-04-07 诺沃挪第克公司 利用固体吸附材料以提高的产率结晶蛋白质的方法
CN1337999A (zh) * 1999-01-25 2002-02-27 诺维信公司 在高pH下蛋白质的回收
CN1429131A (zh) * 2000-05-18 2003-07-09 诺维信公司 用活性炭进行微过滤
WO2002055537A1 (en) * 2001-01-12 2002-07-18 Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc. Extractive purification of lipopeptide antibiotics
CN1396176A (zh) * 2001-07-06 2003-02-12 阿尔法·瓦瑟曼公司 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
CN1681837A (zh) * 2002-09-11 2005-10-12 中外制药株式会社 纯化蛋白质的方法
CN101631797A (zh) * 2007-03-15 2010-01-20 诺维信公司 发酵液中蛋白酶晶体的溶解
CN101368177A (zh) * 2008-10-13 2009-02-18 西北农林科技大学 微生物发酵法生产枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的生产工艺

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117024567A (zh) * 2023-10-09 2023-11-10 健通(济南)生物科技有限公司 一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺

Also Published As

Publication number Publication date
MX2018007067A (es) 2018-08-01
WO2017097869A1 (en) 2017-06-15
JP2018536418A (ja) 2018-12-13
BR112018011567A2 (pt) 2018-11-27
RU2018124771A (ru) 2020-01-13
EP3386612A1 (en) 2018-10-17
EP4218992A3 (en) 2023-08-09
KR20180085737A (ko) 2018-07-27
CA3005292A1 (en) 2017-06-15
EP4218992A2 (en) 2023-08-02
US20190024038A1 (en) 2019-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108367245A (zh) 在解吸条件下从发酵固体纯化蛋白质的方法
US8828677B2 (en) Protease crystals in broth
JP2010530733A (ja) 微生物成長のためのバイオマスの調整
CN1216899C (zh) 从含蛋白质溶液中纯化蛋白质的方法
US6031082A (en) Increased yields of a crystallized protein by using a solid adsorption material
EP3484996B1 (en) Fermentation medium comprising chelating agent
WO2017133974A1 (de) Verbesserte waschleistung durch eine alpha-amylase aus bacillus cereus
DE69734779T2 (de) Erhöhte ausbeuten an einem kristallisierten protein unter verwenden eines festen adsorptionsmaterials
EP0892810B1 (en) Crystallization of a protein with a sulphur salt
US20220275355A1 (en) Method of Recovering a Protein from Fermentation Broth Using a Divalent Cation
WO2020002187A1 (de) Laccasehaltiges waschmittel mit verbesserter reinigungsleistung
DE102018208446A1 (de) Verbesserte Waschleistung durch eine neue alpha-Amylase aus Fomes fomentarius (Ffo)
Bezawada Production Améliorée, Récupération et Application D'une Protéase Alcaline Produite en Utilisant les Boues D'épuration Comme Substrat
WO2017133973A1 (de) Verbesserte waschleistung durch eine alpha-amylase aus bacillus cereus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination