ES2632011T3 - Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos - Google Patents

Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos Download PDF

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Abstract

Polipéptido aislado con actividad de alfa-amilasa, seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido con al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia con amino ácidos 21-619 de la SEC ID N.º: 4; donde % identidad se determina utilizando el programa Needle del paquete EMBOSS con una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5, y el EBLOSUM62 por el cálculo: (residuos idénticos x 100)/(longitud de alineamiento - número total de espacios en el alineamiento).

Description

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Polipeptidos con actividad de alfa-amilasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere a polipeptidos con actividad de alfa-amilasa, dominios catalfticos y
dominios de union de carbohidrato, y polinucleotidos que codifican los polipeptidos, dominios catalfticos y
dominios de union de carbohidrato.
La invencion tambien se refiere a constructos de acidos nucleicos, vectores y celulas huesped que comprenden los polinucleotidos al igual que metodos de produccion y uso de los polipeptidos, dominios catalfticos y dominios de union de carbohidrato.
Descripcion de las tecnicas relacionadas
[0002] Alfa-amilasas (alfa-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrolisis de almidon y otros lineales y ramificados 1,4-glucosidic oligo y polisacaridos.
[0003] Durante un numero de anos, han usado enzimas de alfa-amilasa para una variedad de fines diferentes, el
mas importante de los cuales es licuefaccion de almidon, desencolado textil, lavado textil, modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa, y para la destilacion, produccion de etanol y coccion.
[0004] El objeto de la presente invencion es proporcionar alfa-amilasas para la conversion de almidon en
maltodextrinas, mono- y disacaridos y/o util en procesos que implican licuefaccion de almidon, lavado textil, desencolado textil, modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa, y para la elaboracion de cerveza, produccion de etanol y coccion.
[0005] Un polipeptido de Aspergillus fumigatus con actividad de alfa-amilasa se describe en la WO 2003/012071 (GeneseqP:ABB80178).
Un polipeptido de Aspergillus terreus con actividad de alfa-amilasa se describe en la WO 2010/091221.
Una alfa-amilasa putativa de Aspergillus flavus se describe en UNIPROT:B8N2R4 B8N2R4 ASPFN.
Una alfa-amilasa putativa de Neosartorya fischeri se describe en UNIPROT:A1CYB1 A1CYB1 NEOFI.
Resumen de la invencion
[0006] La presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen actividad de alfa-amilasa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) un polipeptido con al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia para amino acidos 21-619 de SEC ID N.°: 4; donde % de identidad se determina utilizando el programa Needle del paquete EMBOSS con una penalizacion por apertura de espacio de 10, una penalizacion por extension de espacio de 0,5, y el EBLOSUM62 por el calculo: (residuos identicos x 100)/(longitud de alineamiento - numero total de espacios en el alineamiento).
[0007] La presente invencion tambien se refiere a polipeptidos aislados que comprenden un dominio catalftico seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un dominio catalftico con al menos 95 % de identidad de secuencia con amino acidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4.
[0008] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican los polipeptidos de la presente invencion y metodos de produccion de los polipeptidos.
[0009] La presente invencion tambien se refiere a usar la presente alfa-amilasa para la conversion de almidon, modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa, licuefaccion de almidon, lavado textil, desencolado textil, destilacion, produccion de etanol y/o coccion.
[0010] La presente invencion tambien se refiere a una composicion que comprende el polipeptido de la presente invencion y una enzima seleccionada del grupo que consiste en: una alfa-amilasa fungica (EC 3.2.1.1), una beta- amilasa (E.C. 3.2.1.2), una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3), unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41), una fitasa (E.C.3.1.2.28) y una proteasa (E.C. 3.4.).
[0011] La presente invencion tambien se refiere a una formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular que comprende el polipeptido de la invencion.
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Breve descripcion de las figuras
[0012]
La Figura 1 muestra una construccion de P243SV y pLIZG8HQ.
La Figura 2 muestra una construccion de P23WU1 y pLIZG8HQ.
Definiciones
[0013]
Alfa-amilasa: el termino "alfa-amilasa" significa una actividad de alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) que cataliza la endohidrolisis de enlaces (1D4)-alpha-D-glucosidic en polisacaridos que contienen tres o mas unidades de D-glucosa (1 D4)-alpha-vinculadas.
El termino "actividad de alfa-amilasa" corresponde a las enzimas reagrupadas en E.C. 3.2.1.1. para fines de la presente invencion, la actividad de alfa-amilasa se determina segun el procedimiento descrito en los ejemplos.
En un aspecto, los polipeptidos de la presente invencion tienen al menos 20 %, por ejemplo, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 100 % de la actividad de alfa-amilasa del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 2 o el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4.
Actividad de glucoamilasa: el termino "actividad de glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucan glucohidrolasa, EC 3,2,1,3)" se define aquf como una actividad enzimatica, que cataliza la liberacion de D-glucosa desde las extremidades no-reducidas de almidon o moleculas oligo- y polisacaridas relacionadas.
La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades AGU.
Variante alelica: el termino "variante alelica" significa cualquiera de dos o mas formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosomico.
La variacion alelica surge naturalmente a traves de la mutacion y puede resultar en el polimorfismo dentro de poblaciones.
Las mutaciones geneticas pueden ser silenciosas (ningun cambio en el polipeptido codificado) o pueden codificar polipeptidos con secuencias de aminoacidos alteradas.
Una variante alelica de un polipeptido es un polipeptido codificado por una variante alelica de un gen.
Dominio de union de carbohidrato: el termino "dominio de union de carbohidrato" o "CBD" se define aquf como una secuencia de aminoacidos que comprende un CBD de familia 20, conocido tambien como un dominio de union de almidon (SBD).
En la SEC ID N.°: 4, los aminoacidos 511 a 619 son el CBD.
Dominio catalftico: el termino "domino catalftico" significa la region de una enzima que contiene la maquinaria catalftica de la enzima.
ADNc: el termino "ADNc" significa una molecula de ADN que se puede preparar por transcripcion inversa a partir de una molecula de ARNm madura, unida obtenida a partir de una celula eucariotica o procariotica. ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genomico correspondiente. La transcripcion de ARN inicial primaria es un precursor para ARNm que se procesa a traves de una serie de pasos, incluyendo la union antes de aparecer como ARNm maduro unido.
Secuencia codificante: el termino "secuencia codificante" significa un polinucleotido, que especifica directamente la secuencia de aminoacidos de un polipeptido.
Los lfmites de la secuencia de codificacion se determinan generalmente por un marco de lectura abierto, que empieza con un codon de inicio tal como ATG, GTG o TTG y extremidades con un codon de terminacion tal como, TAA, TAG o TGA.
La secuencia codificante puede ser un ADN genomico, ADNc, ADN sintetico o una combinacion de los mismos.
Secuencias de control: el termino "secuencias de control" significa secuencias de acido nucleico necesarias para la expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro de la presente invencion.
Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, desde el mismo gen) o foranea (es decir, a partir de un gen diferente) al polinucleotido que codifica el polipeptido o nativo o foraneo entre si.
Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un lfder, secuencia de poliadenilacion, secuencia de propeptido, promotor, secuencia de peptido senal y terminador de transcripcion.
Como mfnimo, las secuencias de control incluyen un promotor y senales de parada transcripcional y traslacional.
Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlaces con motivo de introducir sitios de restriccion especfficos que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la region de codificacion del polinucleotido que codifica un polipeptido.
Expresion: el termino "expresion" incluye cualquier paso implicado en la produccion de un polipeptido que incluye, pero no de forma limitativa, transcripcion, modificacion postranscripcional, traduccion, modificacion postraduccional y secrecion.
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Vector de expresion: el termino "vector de expresion" significa una molecula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido y esta operativamente vinculado para controlar secuencias que proveen para su expresion.
Fragmento: el termino "fragmento" significa un polipeptido o un catalftico o dominio de union de carbohidrato con uno o mas (por ejemplo; diferentes) aminoacidos ausentes del amino y/o carboxilo terminal de un polipeptido maduro o dominio; donde el fragmento tiene alfa-amilasa o actividad de union de carbohidrato.
En un aspecto, un fragmento contiene al menos 508 residuos de aminoacidos, preferiblemente, al menos 538 residuos de aminoacidos, mas preferiblemente 568 residuos de aminoacidos de la SEC ID N.°: 4.
[0014] En una forma de realizacion especffica, un fragmento comprende aminoacidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4.
En una forma de realizacion especffica, un fragmento comprende aminoacidos 511 a 619 de SEC ID N.°: 4.
Celula huesped: el termino "celula huesped" significa cualquier tipo celular que sea susceptible de transformacion, transfeccion, transduccion o similar con un constructo de acidos nucleicos o vector de expresion que comprende un polinucleotido de la presente invencion.
El termino "celula huesped" abarca cualquier descendiente de una celula madre que no es identica a la celula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicacion.
Aislado: el termino "aislado" significa una sustancia en una forma o ambiente que no se produce en la naturaleza.
Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia que no se produzca de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero no se limite a, cualquier enzima, variante, acido nucleico, protefna, peptido o cofactor, que se retire al menos parcialmente de uno o mas o todos los constituyentes de origen natural con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a la sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los que se asocia naturalmente (por ejemplo, produccion recombinante en una celula huesped; copias multiples de un gen que codifica la sustancia; y uso de un promotor mas fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica la sustancia).
Polipeptido maduro: el termino "polipeptido" significa un polipeptido en su forma final siguiente a la traduccion y cualquier modificacion postraduccional, tal como tratamiento N-terminal, truncamiento C- terminal, glicosilacion, fosforilacion, etc. En un aspecto, el polipeptido maduro es aminoacidos 21 a 619 de la SEC ID N.°: 4, basado en los programas (por ejemplo, peptido senal (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6)) que predice que los aminoacidos 1 a 20 de la SEC ID N.°: 4 son peptidos senal.
Se conoce en la tecnica que una celula huesped puede producir una mezcla de dos o mas polipeptidos maduros diferentes (es decir, con un C-terminal diferente y/o aminoacido N-terminal) expresado por el mismo polinucleotido.
La secuencia codificadora del polipeptido maduro: el termino "polipeptido maduro que codifica la secuencia" significa un polinucleotido que codifica un polipeptido maduro con actividad de alfa-amilasa.
En un aspecto, la secuencia de codificacion del polipeptido maduro es nucleotidos 61 a 2351 de la SEC ID N.°: 3 o nucleotidos 76 a 1584 de la SEC ID N.°: 1 o la secuencia de ADNc de los mismos, basada en el programa por ejemplo, SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice que los nucleotidos 1 a 60 de la SEC ID N.°: 3 codifican un peptido senal.
Condiciones de astringencia bajas: el termino "conditiones de astringencia bajas" significa para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42 °C en 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramos/ml ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 25 % de formamida, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar durante 12 a 24 horas.
El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2 % SDS a 50 °C. Condiciones de astringencia media: el termino "conditiones de astringencia media" significa para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42 °C en 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 35 % de formamida, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar durante 12 a 24 horas.
El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2 % SDS a 55 °C. Condiciones de astringencia medio altas: el termino "condiciones de astringencia medio altas" significa para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42 °C en 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y cualquiera de 35 % de formamida, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar durante 12 a 24 horas.
El material portador es finalmente lavado tres veces cada 15 minutos utilizando 2X SSC, 0.2% SDS a 60°C. Condiciones de astringencia altas: el termino "condiciones de astringencia altas" significa para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42°C en 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 50 % de formamida, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar durante 12 a 24 horas.
El material portador es finalmente lavado tres veces cada 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2 % SDS a 65°C. Constructo de acidos nucleicos: el termino "constructo de acidos nucleicos" significa una molecula de acido nucleico, bien uni- o bicatenaria, que se aisla de un gen de origen natural o bien se modifica para contener segmentos de acidos nucleicos de forma que de otro modo no existirfan en la naturaleza o que es sintetico, que comprende una o mas secuencias de control.
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Operativamente vinculado: el termino "operativamente vinculado" significa una configuracion en la que una secuencia de control se coloca a una posicion apropiada relativa a la secuencia de codificacion de un polinucleotido tal que la secuencia de control dirige la expresion de la secuencia de codificacion.
Identidad de secuencia: la relacion entre dos secuencias de aminoacidos o entre dos secuencias de nucleotidos se describe por el parametro "identidad de secuencia".
Para fines de la presente invencion, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoacidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443453) como implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente version 5.0.0 o posterior.
Los parametros usados son la penalizacion por apertura de espacio de 10, penalizacion por extension de espacio de 0,5 y la matriz de sustitucion EBLOSUM62 (EMBOSS version BLOSUM62).
El resultado de Needle etiquetado "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:
(residuos identicos x 100)/(longitud de alineamietno - numero total de espacios de alineamiento)
[0015] Para fines de la presente invencion, la identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleotidas se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) como se ha implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferiblemente version 5.0.0 o posterior.
Los parametros usados son la penalizacion por apertura de espacio de 10, penalizacion por extension de espacio de 0,5 y la matriz de sustitucion EDNAFULL (version EMBOSS de NCBl NUC4.4).
El resultado de Needle etiquetado "identidad mas larga" (obtenido utilizando la opcion -nobrief) se usa como la identidad en porcentaje y se calcula de la siguiente manera:
(Deoxiribonucleotidos identicos x 100)(longitud de alineamiento - numero total de espacios en alineamiento)
Subsecuencia: el termino "subsecuencia" significa un polinucleotido con uno o mas (por ejemplo; diferentes) nucleotidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia de codificacion del polipeptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento con actividad de alfa-amilasa.
En un aspecto, una subsecuencia contiene al menos 1524 nucleotidos, preferiblemente, al menos 1614 nucleotidos, mas preferiblemente, al menos 1704 nucleotidos de la SEC ID N.°: 3.
Variante: el termino "variante" significa un polipeptido con actividad de alfa-amilasa que incluye una alteracion, es decir, una sustitucion, insercion, y/o delecion, a una o mas (por ejemplo; diferentes) posiciones.
Una sustitucion significa la sustitucion del aminoacido que ocupa una posicion con un aminoacido diferente; una eliminacion implica la delecion del aminoacido que ocupa una posicion; y una insercion significa que se anade un aminoacido adyacente a e inmediatamente despues del aminoacido que ocupa una posicion. Condiciones de astringencia muy altas: el termino "condiciones de astringencia muy altas" significa para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42 °C en 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 50 % de formamida, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar durante 12 a 24 horas.
El material portador finalmente se lava tres veces cada 15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2 % SDS a 70°C. Condiciones de astringencia muy bajas: el termino "condiciones de astringencia muy bajas" significa para sondas de al menos 100 nucleotidos de longitud, prehibridacion e hibridacion a 42 °C en 5X SSPE, 0,3 % SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmon cortado y desnaturalizado, y 25 % de formamida, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar durante 12 a 24 horas.
El material portador finalmente se lava tres veces cada15 minutos utilizando 2X SSC, 0,2 % SDS a 45 °C.
Descripcion detallada de la invencion
Polipeptidos con actividad de alfa-amilasa
[0016] En una forma de realizacion, la presente invencion se refiere a polipeptidos aislados que tienen una identidad de secuencia al polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4 de al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100%, que tiene actividad de alfa-amilasa.
[0017] En un aspecto, los polipeptidos diferen en no mas de 10 aminoacidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4.
[0018] Un polipeptido de la presente invencion preferiblemente comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N.°: 4.
En otro aspecto, el polipeptido comprende o consiste en el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4.
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En otro aspecto, el polipeptido comprende o consiste en los aminoacidos 21 a 619 de la SEC ID N.°: 4.
[0019] En otra forma de realizacion, la presente descripcion se refiere a un polipeptido aislado con actividad de alfa-amilasa codificada por un polinucleotido que hibridiza bajo condiciones de astringencia muy bajas, condiciones de astringencia bajas, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas con (i) la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3, (ii) la secuencia de ADNc del mismo o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edicion, Cold Spring Harbor, New York).
[0020] El polinucleotido de la SEC ID N.°: 3 o una subsecuencia del mismo, al igual que el polipeptido de la SEC ID N.°: 4 o un fragmento del mismo, se puede utilizar para disenar sondas de acido nucleico y clonar polipeptidos de codificacion de ADN con actividad de alfa-amilasa de cepas de diferentes generos o especies segun metodos bien conocidos en la tecnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridacion con el ADN genomico o ADNc de una celula de interes, seguida de procedimientos de transferencia de Southern estandar, para identificar y aislar el gen correspondiente en estos.
Tales sondas pueden ser considerablemente mas cortas que la secuencia entera, pero deberfan ser al menos 15, por ejemplo, al menos 25, al menos 35 o al menos 70 nucleotidos de longitud.
Preferiblemente, la sonda de acidos nucleicos es al menos 100 nucleotidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleotidos, al menos 300 nucleotidos, al menos 400 nucleotidos, al menos 500 nucleotidos, al menos 600 nucleotidos, al menos 700 nucleotidos, al menos 800 nucleotidos o al menos 900 nucleotidos de longitud.
Se pueden usar tanto sondas de ADN como de ARN.
Las sondas estan tfpicamente marcadas para la deteccion del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina).
Tales sondas estan incluidas en la presente invencion.
[0021] Una genoteca de ADN genomico o ADNc obtenido a partir de tales otras cepas se puede seleccionar para ADN que hibridiza con las sondas anteriormente descritas y codifica un polipeptido con actividad de alfa-amilasa. Genomico u otro ADN de tales otras cepas se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras tecnicas de separacion.
ADN desde las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en la nitrocelulosa u otro material portador adecuado.
Para identificar un clon o ADN que hibridiza con la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de codificacion del polipeptido maduro del mismo o una subsecuencia del mismo, el material portador se usa en una transferencia Southern.
[0022] Para fines de la presente descripcion, la hibridacion indica que el polinucleotido hibridiza a una sonda de acidos nucleicos marcada que corresponde con la (i) SEC ID N.°: 3; (ii) la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3; (iii) la secuencia de ADNc del mismo; (iv) el complemento en toda su longitud del mismo; o (v) una subsecuencia del mismo; bajo condiciones de astringencia muy bajas a altfsimas. Moleculas a las que la sonda de acidos nucleicos hibridiza bajo estas condiciones se pueden detectar usando, por ejemplo, una pelfcula radiografica o cualquier otro medio de deteccion conocido en la tecnica.
[0023] En un aspecto, la sonda de acidos nucleicos es nucleotidos 61 a 2351 de la SEC ID N.°: 3.
En otro aspecto de la divulgacion, la sonda de acidos nucleicos es un polinucleotido que codifica el polipeptido de la SEC ID N.°: 4; el polipeptido maduro de la misma; o un fragmento de la misma.
En otro aspecto, la sonda de acidos nucleicos es la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de ADNc de la misma.
[0024] En otra forma de realizacion, la presente descripcion se refiere a un polipeptido aislado con actividad de alfa-amilasa codificada por un polinucleotido con una identidad de secuencia a la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de ADNc del mismo de al menos 80 %, por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %.
En otra forma de realizacion, la presente divulgacion se refiere a variantes del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4 que comprenden una sustitucion, delecion y/o insercion a una o mas (por ejemplo; diferentes) posiciones. En una forma de realizacion, el numero de sustituciones de aminoacidos, deleciones y/o inserciones introducidas en el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4 es al menos 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
El aminoacido puede ser de una naturaleza menor, que las sustituciones de aminoacidos conservadores o inserciones que significativamente no afectan al plegado y/o actividad de la protefna; deleciones pequenas, tfpicamente de 1-30 acidos de amino; extensiones terminadas de amino pequeno o carboxilo, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un peptido enlazador pequeno de hasta 20-25 residuos; o una extension pequena que facilita la purificacion cargando la red de cambio u otra funcion, tal como un tracto de polihistidina, un epftopo antigenico o un dominio de union.
[0025] Ejemplos de sustituciones conservadoras son en los grupos de aminoacidos basicos (arginina, lisina e histidina), aminoacidos acidos (acido glutamico y acido aspartico), aminoacidos polares (glutamina y asparagina),
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aminoacidos hidrofobicos (leucina, isoleucina y valina), aminoacidos aromaticos (fenilalanina, triptofano y tirosina), y aminoacidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina y metionina).
Las sustituciones de aminoacidos que generalmente no alteran una actividad especffica se conocen en la tecnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, New York.
Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
[0026] Alternativamente, los cambios de aminoacidos son de tal naturaleza que las propiedades ffsico qufmicas de los polipeptidos se alteran.
Por ejemplo, los cambios de aminoacidos pueden mejorar la termoestabilidad del polipeptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH optimo y similar.
[0027] Los aminoacidos esenciales en un polipeptido se pueden identificar segun procedimientos conocidos en la tecnica, tal como mutagenesis dirigida al sitio o mutagenesis de escaneado de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085).
En la tecnica anterior, las mutaciones de alanina unicas se introducen en cada residuo en la molecula y las moleculas mutantes resultantes se evaluan para actividad de alfa-amilasa para identificar residuos de aminoacidos que son crfticos para la actividad de la molecula.
Ver tambien, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708.
El sitio activo de la enzima u otra interaccion biologica puede tambien ser determinado por analisis ffsico de estructura, como se determina por tales tecnicas como resonancia magnetica nuclear, cristalograffa, difraccion electronica o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con la mutacion de aminoacidos de sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64.
La identidad de aminoacidos esenciales tambien se puede inferir a partir de un alineamiento con un polipeptido relativo.
[0028] Sustituciones de aminoacidos unicas o multiples, deleciones, y/o inserciones se pueden hacer y evaluar usando metodos conocidos de mutagenesis, recombinacion y/o redistribucion, seguidos de un procedimiento de seleccion pertinente, tal como los descritos en Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625.
Otros metodos que se pueden usar incluyen PCR con tendencia al error, presentacion en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente EEUU n° 5,223,409; WO 92/06204), y mutagenesis dirigida por region (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0029] Metodos de mutagenesis/redistribucion se pueden combinar con alto rendimiento, metodos de seleccion automatizados para detectar la actividad de polipeptidos clonados, mutagenizados expresados por celulas huesped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896).
Las moleculas de ADN mutagenizadas que codifican polipeptidos activos se pueden recuperar de las celulas huesped y secuenciar rapidamente usando metodos estandar en la tecnica. Estos metodos permiten la determinacion rapida de la importancia de residuos de aminoacidos de individuo en un polipeptido.
[0030] El polipeptido puede ser un polipeptido hfbrido donde una region de un polipeptido se fusiona en el N- terminal o el C-terminal de una region de otro polipeptido.
[0031] El polipeptido puede ser un polipeptido de fusion o polipeptido de fusion escindible donde otro polipeptido se fusiona en el N-terminal o el C-terminal del polipeptido de la presente invencion.
Un polipeptido de fusion se produce por la fundicion de un polinucleotido que codifica otro polipeptido a un polinucleotido de la presente invencion.
Las tecnicas para producir polipeptidos de fusion se conocen en la tecnica e incluyen la ligadura de las secuencias codificantes que codifican los polipeptidos de modo que estas estan en el marco y que la expresion del polipeptido de fusion esta bajo control del mismo promotor(es) y terminador.
Los polipeptidos de fusion tambien se pueden construir usando tecnologfa de interna donde los polipeptidos de fusion se crean postraduccionalmente (cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
[0032] Un polipeptido de fusion puede ademas comprender un sitio de escision entre los dos polipeptidos.
En la secrecion de la protefna de fusion, el sitio se divide liberando los dos polipeptidos.
Los ejemplos de sitios de escision incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en el Martin et al., 2003, J.
Ind. Microbiol. Biotecnol. 3: 568-576; Svetina et a/., 2000, J.Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl.Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
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[0033] En un aspecto, los polipeptidos con actividad de alfa-amilasa de la presente invencion muestran una termoestabilidad optima.
Los polipeptidos con actividad de alfa-amilasa de las presentes invenciones son estables a 10 °C- 100 °C, preferiblemente 20 °C- 80 °C, mas preferiblemente 30 °C- 70 °C.
Fuentes de polipeptidos con actividad de alfa-amilasa
[0034] Un polipeptido con actividad de alfa-amilasa de la presente invencion se puede obtener de microorganismos de cualquier genero.
Para fines de la presente invencion, el termino "se obtiene de" como se utiliza en este caso en relacion con una fuente dada debe significar que el polipeptido codificado por un polinucleotido se produce por la fuente o por una cepa donde el polinucleotido ha sido insertado desde la fuente.
En un aspecto, el polipeptido obtenido a partir de una fuente dada es secretado extracelularmente.
[0035] El polipeptido puede ser un polipeptido fungico.
En otro aspecto, el polipeptido es un polipeptido de Penicillium, por ejemplo, un polipeptido obtenido de Penicillium oxalicum, Penicillium funiculosum o Penicillium purpurogenum.
[0036] Se entiende que para las especies anteriormente mencionadas, la invencion abarca los estados perfectos e imperfectos y otros equivalentes taxonomicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especies por el que estos son conocidos.
Los expertos en la tecnica facilmente reconoceran la identidad de equivalentes apropiados.
[0037] Las cepas de estas especies son accesibles facilmente al publico en un numero de colecciones de cultivo, tal como la (ATCC) American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0038] El polipeptido se puede identificar y obtener de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas.
Las tecnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente de habitats naturales se conocen en la tecnica. Un polinucleotido que codifica el polipeptido puede luego ser obtenido seleccionando de forma similar un ADN genomico o genoteca de ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado.
Una vez un polinucleotido que codifica un polipeptido ha sido detectado con la sonda(s), el polinucleotido se puede aislar o clonar por la utilizacion de tecnicas que se conocen por aquellos tecnicos en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Dominios catalfticos
[0039] En una forma de realizacion, la presente invencion tambien se refiere a dominios catalfticos con una identidad de secuencia para amino acidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4 de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %.
En un aspecto, los dominios catalfticos comprenden secuencias de aminoacidos que difieren en hasta 10 aminoacidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, de aminoacidos 21 a 493 de la sEc ID N.°: 4.
[0040] El dominio catalftico preferiblemente comprende o consiste en los aminoacidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4.
[0041] En otra forma de realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a dominios catalfticos codificados por polinucleotidos que hibridan bajo condiciones de astringencia muy bajas, condiciones de astringencia bajas, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas (como se ha definido arriba) con nucleotidos (i) 61 a 1973 de la SEC ID N.°: 3, (ii) la secuencia de ADNc de los mismos o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).
[0042] En otra forma de realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a dominios catalfticos codificados por polinucleotidos con una identidad de secuencia para nucleotidos 61 a 1973 de la SEC ID N.°: 3 de al menos 80 %, por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % o la secuencia de ADNc de los mismos.
El polinucleotido que codifica el dominio catalftico preferiblemente comprende o consiste en los nucleotidos 61 a 1973 de la SEC ID N.°: 3.
Dominios de union
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[0043] En una forma de realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a dominios de union de carbohidrato con una identidad de secuencia con amino acidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4 de al menos 80 %, por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %.
En un aspecto, los dominios de union de carbohidrato comprenden secuencias de aminoacidos que difieren en hasta 10 aminoacidos, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de aminoacidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4.
[0044] El dominio de union de carbohidrato preferiblemente comprende o consiste en los aminoacidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4 o una variante alelica del mismo; o es un fragmento del mismo con actividad de union de carbohidrato.
[0045] En otra forma de realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a dominios de union de carbohidrato codificados por polinucleotidos que hibridan bajo condiciones de astringencia muy bajas, condiciones de astringencia bajas, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas (como se ha definido arriba) con (i) los nucleotidos 2025 a 2351 de la SEC ID N.°: 3 (ii) la secuencia de ADNc de los mismos o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, supra).
[0046] En otra forma de realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a dominios de union de carbohidrato codificados por polinucleotidos con una identidad de secuencia para nucleotidos 2025 a 2351 de la SEC ID N.°: 3 de al menos 80 %, por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, por ejemplo, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %.
[0047] El polinucleotido que codifica el dominio de union de carbohidrato preferiblemente comprende o consiste en los nucleotidos 2025 a 2351 de la SEC ID N.°: 3.
[0048] En otra forma de realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a variantes de dominio de union de carbohidrato de aminoacidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4 que comprende una sustitucion, delecion y/o insercion a una o mas (por ejemplo; diferentes) posiciones.
En un aspecto, el numero de sustituciones de aminoacidos, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4 es hasta 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 o 10.
[0049] Un dominio catalftico operativamente vinculado al dominio de union de carbohidrato puede ser a partir de una amilasa, preferiblemente, una alfa-amilasa, mas preferiblemente, una alfa-amilasa acida.
El polinucleotido que codifica el dominio catalftico puede ser obtenido de cualquier procariotico, eucariota u otra fuente.
Polinucleotidos
[0050] La presente invencion tambien se refiere a polinucleotidos aislados que codifican un polipeptido, un dominio catalftico o dominio de union de carbohidrato de la presente invencion, como se describe en este caso.
[0051] Las tecnicas usadas para aislar o clonar un polinucleotido se conocen en la tecnica e incluyen el aislamiento de ADN genomico o ADNc o una combinacion del mismo.
La clonacion de los polinucleotidos de ADN genomico se pueden efectuar, por ejemplo, usando la reaccion en una cadena de polimerasa bien conocida (PCR) o seleccion de anticuerpo de bibliotecas de expresion para detectar fragmentos de ADN clonados con caracterfsticas estructurales compartidas.
Ver, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York.
Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificacion de acido nucleico tales como (LCR) reaccion en cadena de la ligasa, transcripcion activada de ligadura (LAT) y amplificacion basada en polinucleotido (NASBA).
Los polinucleotidos se pueden clonar a partir de una cepa de polipeptido de Penicillium o un organismo relativo y asf, por ejemplo, puede ser un alelico o variante de especies del polipeptido que codifican la region del polinucleotido.
[0052] La modificacion de un polinucleotido que codifica un polipeptido de la presente invencion se puede necesitar para la sintetizacion de polipeptidos sustancialmente similares al polipeptido.
El termino "sustancialmente similar" al polipeptido se refiere a formas que no se producen de manera natural del polipeptido.
Estos polipeptidos pueden diferir en alguna via disenada del polipeptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en la actividad especffica, termoestabilidad, pH optimo o similar.
Las variantes se pueden construir basandose en el polinucleotido presentado como la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de ADNc del mismo, por ejemplo, una subsecuencia del mismo y/o por introduccion de sustituciones de nucleotido que no suponen un cambio en la secuencia de
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aminoacidos del polipeptido, pero que corresponden al uso de codon del organismo huesped destinado a la produccion de la enzima o por introduccion de sustituciones de nucleotido que pueden dar lugar a una secuencia de aminoacidos diferente.
Para una descripcion general de sustitucion de nucleotido, ver, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Constructos de acidos nucleicos
[0053] La presente descripcion tambien se refiere a constructos de acidos nucleicos que comprenden un polinucleotido de la presente invencion operativamente vinculada a una o mas secuencias de control que dirigen la expresion de la secuencia de codificacion en una celula huesped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0054] Un polinucleotido se puede manipular en una variedad de vfas para proveer la expresion del polipeptido.
La manipulacion del polinucleotido antes de su insercion en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresion.
Las tecnicas para la modificacion de polinucleotidos utilizando metodos de ADN recombinante se conocen en la tecnica.
[0055] La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleotido que se reconoce por una celula huesped para la expresion de un polinucleotido que codifica un polipeptido de la presente invencion.
El promotor contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresion del polipeptido.
El promotor puede ser cualquier polinucleotido que muestre la actividad transcripcional en la celula huesped incluyendo mutante, truncado y promotores hfbridos, y puede ser obtenido de genes que codifican polipeptidos extracelulares o intracelulares bien homologos o heterologos a la celula huesped.
[0056] Los ejemplos de promotores adecuados para transcripcion dirigente de los constructos de acidos nucleicos de la presente invencion en una celula huesped bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amilo), gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), gen de amilasa maltogenica Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, gen Bacillus thuringiensis crilllA (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. Coli, promotor trc de E. Coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y gen de beta- lactamasa procariotica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.Natl. Acad. Sci. Ee.UU 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc.Natl. Acad. Sci. EE.UU 80: 21-25).
Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilberto et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.
Ejemplos de promotores en conjunto se describen en la WO 99/43835.
[0057] Ejemplos de promotores adecuados para la transcripcion dirigente de los constructos de acidos nucleicos de la presente invencion en una celula huesped fungica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en acido de Aspergillus niger, Aspergillus niger o glucoamilasa de Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa de Trichoderma reesei I, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa de Trichoderma reesei I, xilanasa de Trichoderma reesei II, xilanasa de Trichoderma reesei III, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei y factor de alargamiento de traduccion de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un promotor modificado a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus donde el lfder no traducido ha sido sustituido por un lfder no traducido a partir de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados a partir de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger donde el lfder no traducido ha sido sustituido por un lfder no traducido a partir de un Aspergillu nidulans o gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae); y mutante, truncado, y promotores hfbridos de los mismos.
Otros promotores se describen en la patente EEUU n° 6,011,147.
[0058] En un huesped de levadura, los promotores utiles se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), deshidrogenasa de dehidrogenasa/gliceraldehfdo-3-fosfato de alcohol de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, aDH2/GAP) triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae, (TPI) metalotionefna de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y quinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae.
Otros promotores utiles para celulas huesped de levadura se describen por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423488.
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[0059] La secuencia de control tambien puede ser un terminador de transcripcion, que se reconoce por una celula huesped para terminar la transcripcion.
El terminador esta operativamente vinculado al 3'-terminus del polinucleotido que codifica el polipeptido.
Cualquier terminador que sea funcional en la celula huesped se puede utilizar en la presente invencion.
[0060] Los terminadores preferidos para celulas huesped bacterianas son obtenidas de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amilo) y RNA ribosomico de Escherichia coli (runB).
[0061] Los terminadores preferidos para celulas huesped fungicas filamentosas se obtienen de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa de Trichoderma reesei I, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa de Trichoderma reesei I, xilanasa de Trichoderma reesei II, xilanasa de Trichoderma reesei III, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei y factor de alargamiento de traduccion de Trichoderma reesei.
[0062] Los terminadores preferidos para celulas huesped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo de Saccharomyces cerevisiae C (CYC1) y gliceraldehfdo-3-fosfato- deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae.
Otros terminadores utiles para celulas huesped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.
[0063] La secuencia de control tambien puede ser una region de estabilizador de ARNm abajo de un promotor y arriba de la secuencia de codificacion de un gen que aumenta la expresion del gen.
[0064] Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuado se obtienen a partir de un gen bacillus thuringiensis criIIIA (WO 94/25612) y un gen bacillus subtilis SP82 (Hue et al., 1995, Journal of bacteriology 177: 3465-3471).
[0065] La secuencia de control tambien puede ser un lfder, una region no traducida de un ARNm que es importante para la traduccion por la celula huesped.
El lfder esta operativamente vinculado al 5'-terminal del polinucleotido que codifica el polipeptido.
Cualquier lfder que sea funcional en la celula huesped puede ser utilizado.
[0066] Lfderes preferidos para celulas huesped fungicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0067] Los lfderes adecuados para celulas huesped de levadura se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), quinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae, alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae y deshidrogenasa de dehidrogenasa/gliceraldehfdo-3-fosfato de alcohol de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
[0068] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia de poliadenilacion, una secuencia operativamente vinculada al 3'-terminal del polinucleotido y, cuando se transcribe, se reconoce por la celula huesped como una senal para anadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito.
Cualquier secuencia de poliadenilacion que sea funcional en la celula huesped puede ser utilizada.
[0069] Las secuencias de poliadenilacion preferidas para celulas huesped fungicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0070] Las secuencias de poliadenilacion utiles para celulas huesped de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol.Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0071] La secuencia de control tambien puede ser una region de codificacion del peptido senal que codifica un peptido senal vinculado al N-terminal de un polipeptido y dirige el polipeptido a la via secretora de la celula.
El 5'-extremo de la secuencia de codificacion del polinucleotido puede contener intrfnsecamente una secuencia de codificacion del peptido senal naturalmente vinculado en el marco de lectura de traduccion con el segmento de la secuencia de codificacion que codifica el polipeptido.
Alternativamente, el 5'-extremo de la secuencia de codificacion puede contener una secuencia de codificacion del peptido senal que es extranjera a la secuencia de codificacion.
Se puede requerir una secuencia de codificacion del peptido senal foraneo donde la secuencia de codificacion naturalmente no contiene una secuencia de codificacion del peptido senal.
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Alternativamente, una secuencia de codificacion del peptido senal foraneo puede sencillamente reemplazar la secuencia de codificacion del peptido senal natural para mejorar la secrecion del polipeptido.
Sin embargo, cualquier secuencia de codificacion del peptido senal que dirige el polipeptido expresado en la via secretora de una celula huesped puede ser utilizada.
[0072] Las secuencias codificantes del peptido senal eficaces para celulas huesped bacterianas son las secuencias de codificacion del peptido senal obtenidas de los genes para amilasa maltogenica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutrales de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis prsA.
Otros peptidos senal se describen en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0073] Las secuencias codificantes del peptido senal eficaces para celulas huesped fungicas filamentosas son las secuencias codificantes del peptido senal obtenidas de los genes para amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa Humicola lanuginosa y proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei.
[0074] Los peptidos senal utiles para celulas huesped de levadura se obtienen de los genes para alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae.
Otras secuencias codificantes del peptido senal utiles se describen en Romanos et al., 1992, supra.
[0075] La secuencia de control tambien puede ser una secuencia codificante del propeptido que codifica un propeptido posicionado en el N-terminal de un polipeptido.
El polipeptido resultante se conoce como una proenzima o propolipeptido (o un zimogeno en algunos casos).
Un propolipeptido es inactivo generalmente y se puede convertir a un polipeptido activo por escision catalftica o autocatalftica del propeptido desde el propolipeptido.
La secuencia codificante del propeptido se puede obtener de los genes para proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacasa myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei y alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae.
[0076] Donde estan presentes ambos peptidos senal y secuencias de propeptido, la secuencia de propeptido esta
situada junto al N-terminal de un polipeptido y la secuencia de peptido senal esta situada junto al N-terminal de la secuencia de propeptido.
[0077] Tambien puede ser deseable anadir secuencias reguladoras que regulen la expresion del polipeptido relativa al crecimiento de la celula huesped.
Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que causan expresion del gen que se va a activar o desactivar en respuesta a una sustancia qufmica o estfmulo ffsico, con la presencia de un compuesto regulador.
Las secuencias reguladoras en sistemas procarioticos incluyen sistemas operadores lac, tac y trp.
En la levadura, se puede utilizar el sistema ADH2 o sistema GAL1.
En hongos filamentosos, el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilasa Aspergillus oryzae y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae, promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei I y promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei II se puede utilizar.
Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten para amplificacion genica.
En sistemas eucarioticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotionefna que se amplifican con metales pesados.
En estos casos, el polinucleotido que codifica el polipeptido estarfa operativamente vinculado a la secuencia reguladora.
Vectores de expresion
[0078] La presente descripcion tambien se refiere a vectores de expresion recombinantes que comprenden un polinucleotido de la presente invencion, un promotor y senales de parada transcripcionales y traslacionales.
Las varias secuencias de nucleotidos y de control se pueden unir para producir un vector de expresion recombinante que puede incluir uno o mas sitios de restriccion convenientes para permitir la insercion o sustitucion del polinucleotido que codifica el polipeptido a tales sitios.
Alternativamente, el polinucleotido se puede expresar por la insercion del polinucleotido o un constructo de acidos nucleicos que comprende el polinucleotido en un vector apropiado para la expresion.
En la creacion del vector de expresion, la secuencia de codificacion se localiza en el vector de modo que la secuencia de codificacionn esta operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresion.
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[0079] El vector de expresion recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plasmido o viral) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinantes y pueden provocar la expresion del polinucleotido.
La eleccion del vector tfpicamente dependera de la compatibilidad del vector con la celula huesped en la que el vector debe ser introducido.
El vector puede ser un plasmido lineal o cerrado circular.
[0080] El vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosomica, la replicacion del cual es independiente de la replicacion cromosomica, por ejemplo, un plasmido, un elemento extracromosomico, un minicromosoma o un cromosoma artificial.
El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicacion.
Alternativamente, el vector puede ser uno que cuando se haya introducido en la celula huesped, se integre en el genoma y se replique con el cromosoma(s) en que se ha integrado.
Ademas, se puede usar un vector unico o plasmido o dos o mas vectores o plasmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la celula huesped o un transposon.
[0081] El vector contiene preferiblemente uno o mas marcadores seleccionables que permiten la seleccion facil de celulas transformadas, transfectadas, transducidas o similar.
Una etiqueta seleccionable es un gen, el producto del cual proporciona resistencia biocida o vfrica, resistencia a metales pesados, prototrofia para auxotrofos y similar.
[0082] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son bacillus licheniformis o genes dal de Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiotica tal como ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina o resistencia a tetraciclina.
Los marcadores adecuados para celulas huesped de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3.
Los marcadores seleccionables para usar en una celula huesped fungica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, adeA (sintasa de fosforribosilaminoimidazol-succinocarboxamida), adeB (sintasa de fosforibosilaminoimidazole), amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato-reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato- descarboxilasa), sC (adeniltransferasa de sulfato) y trpC (antranilato sintasa), al igual que equivalentes de los mismos.
Preferidos para usar en una celula de Aspergillus son Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae amdS y genes pyrG y un gen bar Streptomyces hygroscopicus.
Preferidos para usar en una celula de Trichoderma son adeA, adeB, amdS, hph y genes pyrG.
[0083] El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable doble como se describe en la WO 2010/039889.
En un aspecto, el marcador seleccionable doble es un sistema de marcador seleccionable doble hf-tk.
[0084] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite la integracion del vector en el genoma de la celula huesped o replicacion autonoma del vector en la celula independiente del genoma.
[0085] Para la integracion en el genoma de la celula huesped, el vector puede depender de la secuencia del polinucleotido que codifica el polipeptido o cualquier otro elemento del vector para la integracion en el genoma por recombinacion homologa o no-homologa.
Alternativamente, el vector puede contener polinucleotidos adicionales para dirigir la integracion por recombinacion homologa en el genoma de la celula huesped a una ubicacion(es) precisa en el cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integracion a una ubicacion precisa, los elementos integracionales deberfan contener un numero suficiente de acidos nucleicos, tal como 100 a 10,000 pares de bases, 400 a 10,000 pares de bases y 800 a 10,000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia a la secuencia diana correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinacion homologa.
Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que es homologa a la secuencia diana en el genoma de la celula huesped.
Ademas, los elementos integracionales pueden ser polinucleotidos de no codificacion o codificacion.
Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la celula huesped por recombinacion no-homologa.
[0086] Para replicacion autonoma, el vector puede comprender ademas un origen de replicacion que permita al vector replicarse autonomamente en la celula huesped en cuestion.
El origen de replicacion puede ser cualquier replicador de plasmido que media la replicacion autonoma que funciona en una celula.
El termino "origen de replicacion" o "replicador de plasmido" significa un polinucleotido que permite replicar in vivo un plasmido o vector.
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[0087] Ejemplos de orfgenes bacterianos de replicacion son los orfgenes de replicacion de plasmidos pBR322; pUC19; pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicacion en el E. Coli, y pllB110; pE194; pTA1060 y pAMB1 que permiten la replicacion en el Bacillus.
[0088] Ejemplos de orfgenes de replicacion para usar en una celula huesped de levadura son el origen de replicacion de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinacion de ARS1 y CEN3, y la combinacion de ARS4 y CEN6.
[0089] Ejemplos de orfgenes de replicacion utiles en una celula fungica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883).
El aislamiento del gen AMA1 y la construccion de plasmidos o vectores que comprenden el gen se pueden realizar segun los metodos descritos en la WO 00/24883.
[0090] Mas de una copia de un polinucleotido de la presente invencion se puede insertar en una celula huesped para aumentar la produccion de un polipeptido.
Un aumento en el numero de copias del polinucleotido se puede obtener por la integracion de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la celula huesped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleotido donde las celulas que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, por tanto, copias adicionales del polinucleotido, se puede nseleccionar por el cultivo de las celulas en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0091] Los procedimientos usados para enlazar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresion recombinantes de la presente invencion se conocen por un experto en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Celulas huesped
[0092] La presente invencion tambien se refiere a celulas huesped recombinantes, que comprenden un polinucleotido de la presente invencion operativamente vinculado a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion de un polipeptido de la presente invencion.
Una construccion o vector que comprende un polinucleotido se introduce en una celula huesped de modo que la construccion o vector se mantiene como un integrante cromosomico o como un vector extracromosomal que se duplica como se describe anteriormente.
El termino "celula huesped" abarca cualquier descendiente de una celula madre que no es identico a la celula madre debido a mutaciones que se producen durante la replicacion.
La eleccion de una celula huesped dependera en gran parte del gen que codifica el polipeptido y su fuente.
[0093] La celula huesped puede ser cualquier celula util en la produccion recombinante de un polipeptido de la presente invencion, por ejemplo, una procariota o una eucariota.
[0094] La celula huesped procariotica puede ser cualquier bacteria gram-positiva o gram-negativa.
Bacterias gram-positivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces.
Las bacterias gram-negativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, helicobacteria, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
[0095] La celula huesped bacteriana puede ser cualquier celula de Bacillus que incluye, pero no esta limitado a, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Celulas Bacillus thuringiensis.
[0096] La celula huesped bacteriana tambien puede ser cualquier celula Streptococcus que incluye, pero no esta limitada a, Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. celulas de Zooepidemicus.
[0097] La celula huesped bacteriana tambien puede ser cualquier celula de Streptomyces que incluya, pero no este limitada a, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y celulas de Streptomyces lividans.
[0098] La introduccion de ADN en una celula de Bacillus se puede efectuar por transformacion de protoplasto (ver, por ejemplo, Chang and Cohen, 1979, Mol.Gen. Genet. 168: 111-115), transformacion celular competente (ver, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J.Bacteriol. 81: 823-829 o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J.Mol. Biol. 56: 209-221), electroporacion (ver, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751) o conjugacion (ver, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introduccion de ADN en una celula de E. coli se puede efectuar por transformacion de protoplasto (ver, por ejemplo, Hanahan, 1983,
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La introduccion de ADN en una celula de Streptomyces se puede efectuar por transformacion de protoplasto, electroporacion (ver, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugacion (ver, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J.Bacteriol. 171: 3583-3585) o transduccion (ver, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc.Natl. Acad. Sci. EE.UU 98: 6289-6294).
La introduccion de ADN en una celula de Pseudomonas se puede efectuar por electroporacion (ver, por ejemplo, Choi et al., 2006, J.Microbiol. Methods 64: 391-397) o conjugacion (ver, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57).
La introduccion de ADN en una celula de Streptococcus se puede efectuar por competencia natural (ver, por ejemplo, Perry y Kuramitsu, 1981, Infect.Immun. 32: 1295-1297), transformacion de protoplasto (ver, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), electroporacion (ver, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl.
Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o conjugacion (ver, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Sin embargo, se puede usar cualquier metodo conocido en la tecnica para la introduccion de ADN en una celula.
[0099] La celula huesped tambien puede ser una eucariota, tal como un mamffero, insecto, planta o celula fungica.
[0100] La celula huesped puede ser una celula fungica. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye el Ascomycota fila, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota al igual que la Oomycota y todos los hongos mitosporicos (como se ha definido por Hawkswort et al., en, Ainswort and Bisby's Dictionary of THe Fungi, 8th edition, 1995, CAB Internacional, University Press, Cambridge, UK).
[0101] La celula huesped fungica puede ser una celula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura ascoesporogena (Endomycetales), levadura basidioesporogenea y levadura de los Fungi Imperfecti (Blastomicetos).
Ya que la clasificacion de levadura puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invencion, la levadura debe ser definida como se describe en Biology and Activities of Yeast, (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App.
Bacteriol. Serie de Simposios n° 9,1980).
[0102] La celula huesped de levadura puede ser una Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o celula de Yarrowia, tal como un Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o celula de Yarrowia lipolytica.
[0103] La celula huesped fungica puede ser una celula fungica filamentosa. "Fungiga filamentosa" incluye todas formas filamentosas de la subdivision Eumycota y Oomycota (como se ha definido por Hawkswort et al., 1995, supra).
Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacaridos complejos.
Crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y catabolismo de carbono es aerobico estrictamente.
En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tal como Saccharomyces cerevisiae es por el injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0104] La celula huesped fungica filamentosa puede ser un Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromices, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes o celula Trichoderma.
[0105] Por ejemplo, la celula huesped fungica filamentosa puede ser un Aspergillu awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera, adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o celula de Trichoderma viride.
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[0106] Las celulas fungicas se pueden transformar por un proceso que implica la formacion de protoplasto, transformacion de los protoplastos y regeneracion en cierto modo de la pared celular conocida per se.
Los procedimientos adecuados para transformacion de Aspergillus y celulas huesped de Trichodermat se describen en EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc.Natl. Acad. Sci. EE.UU 81: 1470-1474 y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422.
Los metodos adecuados para la transformacion de especies Fusarium se descrien por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787.
La levadura se puede transformar utilizando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J.Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc.Natl. Acad. Sci. EE.UU 75: 1920.
Metodos de produccion
[0107] La presente invencion tambien se refiere a metodos de produccion de un polipeptido de la presente invencion, que comprende (a) cultivo de una celula, que en su forma tipo salvaje produce el polipeptido, bajo condiciones conductoras para la produccion del polipeptido; y opcionalmente (b) recuperacion del polipeptido.
En un aspecto preferido, la celula es una celula de Penicillium.
En un aspecto mas preferido, la celula es una celula de Penicillium oxalicum.
[0108] La presente invencion tambien se refiere a metodos de produccion de un polipeptido de la presente invencion, que comprende (a) cultivo de una celula huesped recombinante de la presente invencion bajo condiciones conductoras para la produccion del polipeptido; y opcionalmente (b) recuperacion del polipeptido.
[0109] Las celulas huesped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la produccion del polipeptido usando metodos de utilizacion conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las celulas se pueden cultivar por cultivo en matraz de agitacion o fermentacion a pequena o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, lote, lote alimentado o de estado solido) en el laboratorio o fermentadores industriales en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan al polipeptido ser expresado y/o aislado.
El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrogeno y carbono, y sales inorganicas, que usan procedimientos conocidos en la tecnica. Los medios adecuados estan disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar segun composiciones publicadas (por ejemplo, en catalogos de la American Type Culture Collection).
Si el polipeptido se segrega en el medio nutritivo, el polipeptido se puede recuperar directamente desde el medio. Si el polipeptido no se segrega, se puede recuperar de lisatos de celula.
[0110] El polipeptido se puede detectar utilizando los metodos conocidos en la tecnica que son especfficos para los polipeptidos.
Estos metodos de deteccion incluyen, pero de forma no limitativa, uso de anticuerpos especfficos, formacion de un producto enzimatico o desaparicion de un sustrato enzimatico.
Por ejemplo, un ensayo enzimatico se puede utilizar para determinar la actividad del polipeptido.
[0111] El polipeptido se puede recuperar utilizando metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el polipeptido se puede recuperar desde el medio nutritivo por procedimientos convencionales que incluyen, pero no de forma limitativa, coleccion, centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por pulverizacion, evaporacion o precipitacion.
En un aspecto, se recupera un caldo de fermentacion entero que comprende el polipeptido.
[0112] El polipeptido se puede purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la tecnica que incluyen, pero no estan limitados a, cromatograffa (por ejemplo, intercambio ionico, afinidad, cromatoenfoque hidrofobico y exclusion de tamano), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion de sulfato amonico), SDS-PAGE o extraccion (ver, por ejemplo, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) para obtener polipeptidos sustancialmente puros.
[0113] En un aspecto alternativo, el polipeptido no esta recuperado, sino que una celula huesped de la expresion de presente invencion del polipeptido se usa como una fuente del polipeptido.
Formulaciones de caldo de fermentacion o composiciones celulares
[0114] La presente invencion tambien se refiere a una formulacion de caldo de fermentacion o una composicion celular que comprende un polipeptido de la presente invencion.
El producto de caldo de fermentacion comprende ademas ingredientes adicionales usados en el proceso de fermentacion, tal como, por ejemplo, celulas (incluyendo, las celulas huesped con el gen que codifica de polipeptido de la presente invencion que se usan para producir el polipeptido de interes), detrito celular, biomasa, medios de fermentacion y/o productos de fermentacion.
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En algunas formas de realizacion, la composicion es un caldo completo con inactivacion celular que contiene acido(s) organico(s), celulas inactivadas y/o detrito celular, y medio de cultivo.
[0115] El termino "caldo de fermentacion" como se utiliza en este caso se refiere a una preparacion producida por fermentacion celular que sufre una recuperacion minima o inexistente y/o purificacion.
Por ejemplo, los caldos de fermentacion se producen cuando los cultivos microbianos crecen para saturacion, incubados bajo condiciones de limitacion de carbon para permitir sintesis de proteina (por ejemplo, expresion de enzimas por celulas huesped) y secrecion en el medio de cultivo celular.
El caldo de fermentacion puede comprender contenidos no fraccionados o fraccionados de los materiales de fermentacion derivados al final de la fermentacion.
Tipicamente, el caldo de fermentacion no es fraccionado y comprende el medio de cultivo consumido y detrito celular presente despues de las celulas microbianas (por ejemplo, celulas fungicas filamentosas) son retiradas, por ejemplo, por centrifugacion.
En algunas formas de realizacion, el caldo de fermentacion contiene medio de cultivo celular consumido, enzimas extracelulares y celulas microbianas viables y/o no viables.
[0116] En una forma de realizacion, la formulacion de caldo de fermentacion y composiciones celulares comprenden un primer componente de acido organico que comprende al menos un 1-5 acido organico de carbono y/o una sal derivada y un segundo componente de acido organico que comprende al menos un 6 o mas acido organico de carbono y/o una sal derivada.
En una forma de realizacion especifica, el primer componente de acido organico es acido acetico, acido formico, acido propionico, una sal derivada o una mezcla de dos o mas de los anteriormente mencionados y el segundo componente de acido organico es acido benzoico, acido ciclohexanecarboxilico, acido 4-metilvalerico, acido fenilacetico, una sal derivada o una mezcla de dos o mas de los anteriormente mencionados.
[0117] En un aspecto, la composicion contiene un acido(s) organico y opcionalmente otro contiene celulas inactivadas y/o detrito celular.
En una forma de realizacion, las celulas inactivadas y/o detrito celular se retiran a partir de un caldo completo con inactivacion celular para proporcionar una composicion que esta libre de estos componentes.
[0118] Las formulaciones de caldo de fermentacion o composiciones celulares pueden comprender ademas un conservante y/o anti-microbiano (por ejemplo; agente bacterioestatico), incluyendo, pero no de forma limitada, sorbitol, cloruro sodico, sorbato de potasio y otros conocidos en la tecnica.
[0119] Las formulaciones de caldo de fermentacion o composiciones celulares pueden comprender ademas actividades enzimaticas multiples, tales como una o mas (por ejemplo; diferentes) enzimas seleccionadas del grupo que comprende; una alfa-amilasa fungica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3), unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41 una fitasa (E.C.3.1.2.28) y una proteasa (E.C. 3.4.). La glucoamilasa puede preferiblemente derivarse de una cepa de Aspergillus sp., tal como Aspergillus niger o de una cepa de Talaromyces sp. y en particular derivarse de Talaromyces leycettanus como la glucoamilasa descrita en la patente EEUU no. Re. 32,153, Talaromyces duponti y/o Talaromyces termopilas tales como las glucoamilasas descritas en la patente EEUU n° 4,587,215 y mas preferiblemente derivadas de Talaromyces emersonii.
De la forma mas preferible, la glucoamilasa se deriva de la cepa de Talaromyces emersonii CBS 793.97 y/o con la secuencia descrita como SEC ID N.°: 7 en la WO 99/28448.
Mayormente, es preferible una glucoamilasa que tiene una secuencia de aminoacidos con al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o incluso al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoacidos anteriormente mencionada.
[0120] El caldo completo con inactivacion celular o composicion puede contener los contenidos no fraccionados de los materiales de fermentacion derivados al final de la fermentacion.
Tipicamente, el caldo completo con inactivacion celular o composicion contiene el medio de cultivo consumido y detrito celular presente despues de que las celulas microbianas (por ejemplo, celulas fungicas filamentosas) crezcan por saturacion, condiciones incubadas bajo limitacion de carbon para permitir la sintesis de proteina (por ejemplo, expresion de celulasa y/o enzima(s) de glucosidasa).
En algunas formas de realizacion, el caldo completo con inactivacion celular o composicion contiene el medio de cultivo celular consumido, enzimas extracelulares y celulas fungicas filamentosas sin actividad.
En algunas formas de realizacion, las celulas microbianas presentes en el caldo completo con inactivacion celular o composicion se pueden permeabilizar y/o lisar usando metodos conocidos en la tecnica.
[0121] Un caldo completo o composicion celular como se describe en este caso es tipicamente un lfquido, pero puede contener componentes insolubles, tales como celulas inactivadas, detrito celular, componentes de medios de cultivo y/o enzima(s) insolubles.
En algunas formas de realizacion, los componentes insolubles se pueden retirar para proporcionar una composicion lfquida clarificada.
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[0122] Las formulaciones de caldo completo y composiciones celulares de la presente invencion se pueden producir por un metodo descrito en la WO 90/15861 o la WO 2010/096673.
[0123] Abajo se dan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de la presente invencion.
La dosificacion de la composicion y otras condiciones bajo las que se usa la composicion se pueden determinar basandose en metodos conocidos en la tecnica.
Composiciones enzimaticas
[0124] La presente invencion tambien se refiere a composiciones que comprenden un polipeptido de la presente invencion.
Preferiblemente, las composiciones se enriquecen con tal polipeptido.
El termino "enriquecido" indica que la actividad de mejora celulolftica de la composicion ha sido aumentada, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1.1.
[0125] Las composiciones pueden comprender un polipeptido de la presente invencion como el componente enzimatico principal, por ejemplo, una composicion monocomponente.
Alternativamente, las composiciones pueden comprender actividades enzimaticas multiples, tal como una o mas (por ejemplo; varias) enzimas seleccionadas del grupo que comprende; una alfa-amilasa fungica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3), unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41), una fitasa (E.C.3.1.2.28) y una proteasa (E.C. 3.4.). La glucoamilasa preferiblemente se puede derivar de una cepa de Aspergillus sp., tal como Aspergillus niger o de una cepa de Talaromyces sp. y en particular derivada de Talaromyces leycettanus como la glucoamilasa descrita en la patente EEUU n°.
Re. 32,153, Talaromyces duponti y/o Talaromyces termopilas tal como las glucoamilasas descritas en la patente EEUU n° 4,587,215 y, mas preferiblemente, derivadas de Talaromyces emersonii.
De la forma mas preferible, la glucoamilasa se deriva de la cepa Talaromyces emersonii CBS 793.97 y/o tienen la secuencia descrita como SEC ID N.°: 7 en la WO 99/28448.
Mayormente, es preferible una glucoamilasa que tiene una secuencia de aminoacidos con al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o incluso al menos 99 % de identidad a la secuencia de aminoacidos anteriormente mencionada. Una preparacion comercial de glucoamilasa de Talaromyces se suministra por Novozymes A/S como SPIRIZYME FUEL.
[0126] Para una composicion que comprende el polipeptido de la presente invencion y una glucoamilasa tambien se prefieren polipeptidos con actividad de glucoamilasa que se derivan a partir de una cepa del genero Trametes, preferiblemente Trametes cingulata.
Mayormente, es preferible polipeptido con actividad de glucoamilasa y tiene al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o incluso al menos 95 % de identidad con aminoacidos para polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 2 en la WO 2006/069289.
[0127] Para una composicion que comprende el polipeptido de la presente invencion y una glucoamilasa tambien se prefieren polipeptidos con actividad de glucoamilasa que se derivan de una cepa del genero Pachykytospora, preferiblemente Pachykytospora papyracea o la cepa de E. Coli depositada en DSMZ y dado el n°. DSM 17105. Ademas, se prefieren polipeptidos con actividad de glucoamilasa y con al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o incluso al menos 95 % de identidad con aminoacidos para polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 5 en la WO 2006/069289.
[0128] La composicion anteriormente descrita puede comprender preferiblemente alfa-amilasa acida presente en una cantidad de 0,01 a 10 AFAU/g DS, preferiblemente 0,1 a 5 AFAU/g DS, mas preferiblemente 0,15 a 3 AFAU/g DS y de la forma mas preferible 0,3 a 2 AFAU/g DS.
La dosificacion de la composicion de polipeptido de la invencion y otras condiciones bajo las que se usa la composicion se pueden determinar basandose en metodos conocidos en la tecnica.
[0129] Las composiciones de polipeptido se pueden preparar conforme a metodos conocidos en la tecnica y pueden estar en forma de un lfquido o una composicion seca.
Por ejemplo, la composicion de polipeptido puede estar en forma de granulado o un microgranulado.
El polipeptido que se va a incluir en la composicion se puede estabilizar conforme a metodos conocidos en la tecnica.
Usos
[0130] La presente invencion tambien esta dirigida a metodos para utilizar los polipeptidos con actividad de alfa- amilasa o composiciones de los mismos.
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[0131] El polipeptido o la composicion de la presente invencion se puede utilizar en la conversion de almidon, conversion de almidon a azucar y produccion de etanol, etc, por ejemplo, en la licuefaccion y/o sacarificacion de un almidon gelatinizado o un almidon granulado, al igual que un almidon gelatinizado parcialmente.
Un almidon gelatinizado parcialmente es un almidon que hasta cierto punto esta gelatinizado, es decir, donde parte del almidon se ha hinchado irreversiblemente y gelatinizado, y parte del almidon sigue estando presente en un estado granulado. Se puede usar en un proceso para el almidon de licuefaccion, donde un sustrato de almidon granulado o gelatinizado se trata en un medio acuoso con la enzima.
El polipeptido o la composicion de la presente invencion tambien se puede usar en un proceso para sacarificacion de un sustrato de almidon licuado.
Un uso preferido es en un proceso de fermentacion donde un sustrato de almidon es licuado y/o sacarificado en presencia del polipeptido o la composicion de la presente invencion para producir glucosa y/o maltosa adecuada para la conversion en un producto de fermentacion por un organismo fermentador, preferiblemente una levadura. Tales procesos de fermentacion incluyen un proceso para producir etanol para combustible o etanol potable (alcohol portatil), un proceso para producir una bebida, un proceso para producir compuestos organicos deseados, tal como acido cftrico, acido itaconico, acido lactico, acido gluconico, gluconato de sodio, gluconato de calcio, gluconato de potasio, glucono delta lactona o eritorbato de sodio; cetonas; aminoacidos, tal como acido glutamico (monoglutaminato de sodio), pero tambien compuestos mas complejos tales como antibioticos, tal como penicilina, tetraciclina; enzimas; vitaminas, tal como riboflavina, B12, beta-caroteno; hormonas, que son diffciles de producir sinteticamente.
[0132] Ademas, debido a la actividad de hidrolisis superior del polipeptido de la presente invencion, la cantidad de glucoamilasa durante la etapa de sacarificacion puede ser reducida.
La glucoamilasa puede preferiblemente derivarse a partir de una cepa dentro de Aspergillus sp., Talaromyces sp., Pachykytospora sp. o Trametes sp., mas preferiblemente de Aspergillus niger, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata o Pachykytospora papyracea.
[0133] En una forma de realizacion preferida, el polipeptido de la presente invencion se usa en un proceso que comprende fermentacion para producir un producto de fermentacion, por ejemplo, etanol, a partir de un almidon gelatinizado.
Tal proceso para producir etanol de almidon gelatinizado por fermentacion comprende:
(i) licuefaccion del almidon gelatinizado con un polipeptido con actividad de alfa-amilasa de la presente invencion; (ii) sacarificacion del triturado licuado obtenido; (iii) fermentacion del material obtenido en la etapa
(ii) en presencia de un organismo fermentador.
Opcionalmente, el proceso comprende ademas la recuperacion del etanol.
La sacarificacion y fermentacion se puede realizar como una sacarificacion simultanea y proceso de fermentacion (SSF proceso).
[0134] En otra forma de realizacion preferida, el polipeptido de la presente invencion se usa en un proceso que comprende la fermentacion para producir un producto de fermentacion, por ejemplo, etanol, a partir de un almidon no gelatinizado ("crudo").
Tal proceso para producir etanol de material que contiene almidon no gelatinizado por fermentacion comprende: (i) contacto del almidon no gelatinizado con un polipeptido con actividad de alfa-amilasa de la presente invencion para degradar el almidon no gelatinizado; (ii) sacarificacion del triturado obtenido; (iii) fermentacion del material obtenido en la etapa (ii) en presencia de un organismo fermentador.
Opcionalmente, el proceso comprende ademas la recuperacion del etanol.
La sacarificacion y fermentacion se puede realizar como una sacarificacion simultanea y proceso de fermentacion (SSF proceso).
[0135] En otras formas de realizacion, el polipeptido de la presente invencion tambien puede ser util en textil, tejido o desencolado de prenda o lavado, en la coccion, detergente y pulpa, y produccion de papel.
[0136] En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo de uso de la alfa-amilasa de la presente invencion para producir glucosa o maltosa, o similar de almidon.
[0137] Las alfa-amilasas de la invencion tambien se pueden usar en procesos de elaboracion de cerveza. Ademas, la alfa-amilasa de la invencion se puede utilizar para produccion de maltosa.
El jarabe rico en maltosa se produce tfpicamente de la siguiente manera.
Para producir "jarabe rico en maltosa" (con un contenido de 50-55 % en maltosa), el almidon se licua para DE 10-20.
El pH y temperatura del almidon licuado se ajusta a 65 °C y a un pH alrededor de 5.0, respectivamente, y esta sujeto a actividad de alfa-amilasa maltogenica (por ejemplo, amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como Maltogenase™ 4000 L, 0.4 I/t DS (Novozymes)), actividad de pululanasa (por ejemplo, pululanasa de Bacillus, tal como Promozyme™ 600 L, 0.3 I/t DS (Novozymes)) y actividad de alfa-amilasa (por ejemplo, BAN 240 L o Termamyl™ 120 L, tipo LS, 0.4 kg/t DS (Novozymes)) durante 24-41 horas.
El tiempo de proceso especffico depende del espectro de sacarido deseado que se va a conseguir.
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Mediante el aumento de la dosificacion de la alfa-amilasa maltogenica y pululanasa, el contenido de maltosa puede ser aumentado.
[0138] Alternativamente, "jarabe rico en maltosa" se puede producir por el primer almidon de licuefaccion para DE 10-20 y luego ajustar el pH y temperature a 55 °C o mas alta y un pH alrededor de 5,5 o menos, y luego se somete el almidon licuado a una actividad de alfa-amilasa fungica (por ejemplo, amilasa de Bacillus stearothermophilus, tal como Fungamyl™ 800L (Novozymes)) durante 22-44 horas.
La dosificacion de Fungamyl™ fungica 800L depende del tiempo de sacarificacion previsto, por ejemplo, 200 g/t DS durante 44 horas y 400 g/t DS durante 22 horas.
Las alfa-amilasas de la invencion pueden sustituir el Fungamyl™ 800L en el proceso anterior, y luego la temperatura puede ser incluso mas alta, y el pH aun inferior, dando como resultado un fndice de conversion mas rapida, y asf una mejor economfa en general.
[0139] Para producir almidon "jarabe rico en maltosa" con contenido en maltosa de 55-65 % el almidon se licua para De 10-20.
La temperatura y el pH del almidon licuado se ajusta a 60 °C o mas alto, y a un pH alrededor de 6 o inferior, y esta sujeto a una actividad de alfa-amilasa maltogenica (por ejemplo, Maltogenase™ 4000 L, 0.25-1.0 I/t DS (Novozymes)), y actividad de alfa-amilasa fungica (por ejemplo, amilasa de Aspergillus, tal como Fungamyl™ 800 L, 0.4-1.0 kg/t DS (Novo Nordisk) durante 24-48 horas; o la alfa-amilasa de la presente invencion para un tiempo mas corto.
[0140] La presente invencion posteriormente se describe por los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Materiales
[0141] Productos qufmicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos una calidad reactiva.
Cepas
[0142] La cepa fungica NN051380 fue aislada a partir de una muestra de tierra recogida de China con medio PDA a 25 °C utilizando el metodo de placa de dilucion.
Luego se purifico por transferencia un conidio unico sobre una placa de agar YG.
La cepa NN051380 se identifico como Penicillium oxalicum basada tanto en caracterfsticas morfologicas como en su secuencia ADNR.
Medios
[0143] El medio PDA fue compuesto por 39 gramos de agar de dextrosa de patata y agua desionizada a 1 litro.
[0144] Las placas de agar YG estaban compuestas por 5,0 g de extracto de levadura, 10, 0 g de glucosa, 20, 0 g de agar y agua desionizada a 1 litro.
[0145] El medio YPG contenfa 0,4 % de extracto de levadura, 0,1 % de KH2PO4, 0,05 % de MgSO47H2O, 1,5 % de glucosa en la agua desionizada.
[0146] El medio YPM contenfa 1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona y 2 % de maltosa en el agua desionizada.
[0147] El medio MD estba compuesto por 1, 34 % YNB, 4X10-5 % biotina y 2 % dextrosa.
Para placas, se anadio 7,5 g de agar a 200ml de agua autoclave, se enfrio a 60 °C y luego se anadieron 25 ml de 10X YNB, 25ml de 10 X D-glucosa y 400 pl de 500X biotina.
[0148] BMSY se compuso por 1 % extracto de levadura, 2 % peptona (bacto), 100mM tampon de fosfato potasico, pH 6.0, 1.34 % YNB, 4X10-5 % biotina y 1,82 % Sorbitol.
10 G de extracto de levadura, 20 g peptona (bacto) y 18.2g Sorbitol se disolvieron en 800 ml agua y fueron sometidas a autoclave durante 20 minutos en el ciclo lfquido.
Cuando el medio sometido a autoclave se enfrio para la camara de temperatura, se anadieron 100 ml de 1 M tampon de fosfato potasico (pH 6.0) y 100 ml de 10X YNB y 2 ml de 500X biotina.
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[0149] La actividad de cualquier alfa-amilasa acida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa fungica acida), que se determinan con respecto a un estandar enzimatico. 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg de almidon de sustancia seca por hora bajo las condiciones estandar mencionadas debajo.
[0150] Alfa-amilasa acida, es decir, alfa-amilasa estable en acido, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucan- glucano-hidrolasa, E.C. 3,2,1, 1) hidroliza enlaces alfa-1,4-glucosfdicos en las regiones internas de la molecula de almidon para formar dextrinas y oligosacaridos con longitudes de cadena diferentes.
La intensidad de color formada con yodo es directamente proporcional a la concentracion de almidon.
La actividad amilasa se determina utilizando colorimetrfa inversa como una reduccion en la concentracion de almidon bajo las condiciones analfticas especfficas.
[0151] Condicion de reaccion: se mezclan 10 microlitros estandar o muestra enzimatica, 70 microlitros H2O y 80 microlitros solucion de trabajo de almidon (la concentracion final fue almidon 0,35 g/L, tampon acetato 50 mM pH 5,0, NaCl 0,1 M, CaCl2 3 mM) y reaccionan durante 2 minutos con la agitacion a 37 °C.
Se anaden 40 microlitros de solucion de trabajo de yodo (la concentracion de yodo final fue 0,04 g/L) y reacciona a 37 °C durante 1 minuto.
Lectura OD590 (antes de lectura, agitar 10 segundos).
[0152] FUNGAMYL™ (disponible de Novozymes A/S) se usa como estandar.
Ejemplo 1: extraccion de ADN genomico Penicillium oxalicum
[0153] Cepa Penicillium oxalicum NN051380 fue inoculada sobre una placa PDA e incubada durante 3 dfas a 25 °C en la oscuridad.
Los diferentes tapones de mycelios-PDA fueron inoculados en frascos de agitacion de 500 ml que contenfan 100 ml de medio YPG.
Los matraces fueron incubados durante 3 dfas a 25 °C con la agitacion a 160 r.p.m..
Los micelios fueron recogidos por filtracion a traves de MIRACLOTH® (Calbiochem, La Jolla, CA, EE.UU) y congelados en el nitrogeno lfquido.
Los micelios congelados fueron molidos, por un mortero y una mano de mortero, a un polvo fino, y ADN genomico fue aislado utilizando la columna a gran escala fungica DNA (BAOMAN biotecnologfa, Shanghai, China) seguida de la instruccion del fabricante.
Ejemplo 2: secuenciacion de genoma, ensamblaje y anotacion
[0154] Las muestras de ADN genomico extrafdas fueron entregadas al Beijing Genome Institute (BGI, Shenzhen, China) para secuenciacion de genoma usando el sistema ILLUMINA® GA2 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA). Las lecturas de crudo se ensamblaron a BGI usando el programa SOAPdenovo (Li et al. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing.Genoma Res (2010) vol. 20 (2) pags. 265-72).
Las secuencias ensambladas se analizaron utilizando metodos de bioinformatica estandar para el hallazgo del gen y prediccion funcional.
Brevemente, genID (Parra et al., 2000, Genome Research 10(4):511-515) se uso para prediccion de gen.
Blastall version 2.2.10 (Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (October 1990). "herramienta de busqueda de alineamiento local basico".
J Mol Biol 215 (3): 403-410,
http://blast.NCBI.NLM.nih.gov/Blast.cgi) y HMMER version 2.1.1
(
http://hmmer.janelia.org/) se usaron para predecir la funcion basada en homologfa estructural.
La familia GH13 de polipeptidos enzimaticos fueron identificados directamente por analisis de los resultados de Blast.
Agene programa (Munch K, Krogh A.
Automatic generation of gene finders for eukaryotic species. BMC Bioinformatics. BMC. 2006, 7: 263) y programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) se usaron para identificar codones de inicio.
Programa SignalP ademas se uso para estimar la longitud del peptido senal.
El programa Pepstats (Rice P, Longden I, Bleasby A: EMBOSS: THE European Molecular Biology Open Software Suite.
Trends Genet. 2000,16(6):276-277) se uso para estimar el punto isoelectrico de protefnas y peso molecular. Ejemplo 3: preparacion de ARN total de la cepa Penicillium oxalicum y ADNc
[0155] ARN total se obtuvo a partir de los micelios en polvo usando equipo mini planta RNeasi, (QIAGEN, CAt. No.74904). El ADNc fue sintetizado siguiendo la instruccion de 3' amplificcion rapida de sistema de extremo de ADNc (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA).
5
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60
[0156] Dos genes, S1 (P243SV, correspondientes a SEC ID N.°: 1) y S2 (P23WU1, correspondientes a SEC ID N.°: 3), identificados como GH13 alfa-amilasa se seleccionaron para la expresion de clonacion.
[0157] Basados en la informacion de ADN obtenida de secuenciacion de genoma, los cebadores oligonucleotidos, mostrados a continuacion en la tabla 1, se disenaron para amplificar todos los ADNc de Penicillium oxalicum.
Cebadores fabricados por Invitrogen (Invitrogen, Pekin, China).
Tabla 1: cebadores
Cebadores
Secuencia (5'-3')
S1 avance (SEC ID N.°: 5)
ATTATTCGAAGGATCCACC atgttcttcacatcctcg gtctg ct
S1 retroceso (SEC ID N.°: 6)
GGTGCTGATGGAATTC ggaataaccacacaatccgctgc
S2 avance (SEC ID N.°: 7)
ATTATTC GAAG GATCCACC atgaaattccttggactagctgctttgtt
S2 retroceso (SEC ID N.°: 8)
GGT GCT GAT GGAATTC cctccacgtagcagtgacagtgg
[0158] Los caracteres minusculos representan las regiones de codificacion de los genes, mientras las partes capitalizadas fueron homologas a los sitios de insercion del vector pLIZG8HQ.
El vector de expresion pLIZG8HQ contenfa el factor a la senal de secrecion derivada de S. cerevisiae, el 5'AOX1 promotor derivado de Pichia pastoris y los elementos terminadores 3'AOX1 alcoholico oxidase1.
Ademas pLIZG8HQ tenia pBR322 secuencias derivadas para la seleccion y propagacion en el E. coli y un gen His4, que codifico una deshidrogenasa de histidinol derivada de Pichia pastoris para la seleccion de un transformante de una cepa His Pichia mutante.
[0159] Para cada gen, los 20 picomoles de par de cebador (cada hacia delante e inversa) fueron usados en una reaccion PCR compuesta por 2pl de ADNc oxalicum de Penicillium, tampon 5X GC de 10 pl, 1,5pl de DMSO, 2,5 mM cada uno de dATP, dTTP dGTP, y dCTP, y 0,6 unidades de polimerasa de DNA de alta fidelidad de Phusion™ (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia) en un volumen final de 50 pl.
La amplificacion se realizo utilizando un ciclador termico de Peltier (M J Research Inc., South San Francisco, CA, EE.UU) programado para la desnaturalizacion a 98 °C durante 1 minuto; 8 ciclos de la desnaturalizacion de 98 °C durante 15 segundos, recocimiento a 65 °C durante 30 segundos, con una reduccion de 1 °C por ciclo y alargamiento a 72°C durante 75 segundos; y otros 24 ciclos cada uno a 98 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 75 segundos; extension final a 72 °C durante 10 minutos.
El bloque de calor luego fue a un ciclo de absorcion de 4 °C.
[0160] Los productos PCR se aislaron por electroforesis en gel de agarosa 1,0 % utilizando 90mM Tris-borate y 1 mM tampon (TBE) de EDTA donde una banda de producto unico a 2.0kb de cada reaccion fue visualizada bajo luz UV.
Los productos PCR fueron luego purificados de la solucion usando un PCR GFX ADN ilustra y equipo de purificacion de banda de Gel (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) segun las instrucciones del fabricante.
[0161] Plasmido pLIZG8HQ se digirio con Bam I y EcoR I, aislado por 1,0 % de electroforesis en gel de agarosa usando un tampon TBE (Tris/Borate/EDTA tampon), y purifico utilizando un PCR GFX ADN ilustra y equipo de purificacion de banda de Gel segun las instrucciones del fabricante.
[0162] Un equipo de clonacion in fusion CF Dry-down (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EE.UU) se uso para clonar el fragmento directamente en el vector de expresion pLIZG8HQ, sin la necesidad de digestion de restriccion y ligamiento.
[0163] Los productos PCR respectivos S1 y S2 se ligaron al vector digerido pLIZG8HQ utilizando un equipo de clonacion en fusion CF Dry-down PCR (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EE.UU) dando como resultado plasmidos pS1 y pS2 respectivamente.
La operacion de clonacion se realizo segun la instruccion del fabricante.
En resumen, para cada reaccion de ligamiento 30 ng de pLIZG8HQ digerida con Bam I y EcoR I, y 60 ng del producto PCR purificado de alfa-amilasa Penicillium oxalicum se anadieron al frasco de reaccion y se resuspendieron el polvo en un volumen final de 10pl con adicion de agua desionizada.
La reaccion se incubo a 37 °C durante 15 minutos y luego a 50 °C durante 15 minutos.
Tres microlitros de los productos reactivos se usaron para transformar celulas competentes E. Coli TOP10 (TIANGEN Biotech (Beijing) Co.
Ltd., Beijing, China). Transformantes de E. Coli que contienen constructos de expresion fueron detectados por colonia PCR y ADN plasmido se preparo utilizando un equipo de minipreparacion Qiaprep Spin (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).
Los genes de alfa-amilasa Penicillium oxalicum insertados en pS1 y pS2 se confirmaron por la secuenciacion del ADN utilizando 3730XL analizadores de ADN (Applied Biosystems Inc, Foster city, CA, uSa).
5
10
15
20
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40
45
50
55
Preparacion celular competente de Pichia pastoris
[0164] La densidad optica (OD) del cultivo durante toda la noche de Pichia pastoris en YPM en el matraz de agitacion fue 1,0. Las celulas fueron granuladas por centrifugacion a 2000rpm, 5 min, 4 °C.
El granulado celular fue luego suspendido en el YPD mas acido 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonico (HEPES) y (DTT) ditiotreitol y en posicion a 30 °C durante 15 minutos.
Las celulas fueron granuladas y lavadas con agua frfa y 1 M de sorbitol subsequencialmente.
Finalmente, las celulas fueron suspendidas en una pequena cantidad de 1 M sorbitol y almacenadas en 40pl partes alfcuotas a -70 °C.
Transformacion de pS1 y pS2 a Pichia pastoris
[0165] Cinco miligramos de ADN plasmido pS1 o pS2 se linealizaron con Pmel conduciendo a la insercion del plasmido en el locus cromosomico 5'AOX1.
ADN plasmido linealizado (500ng) se mezclo con 40pl de celulas competentes y almacenadas en el hielo durante 5 min. Las celulas fueron transferidas a un hielo de 0,2 cm de cubeta de electroporacion.
La transformacion se realizo utilizando un GenePulser II (BioRad, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547). Los parametros usados fueron 1500 V, 50pF y 200Q.
Inmediatamente despues de la pulsacion, las celulas fueron suspendidas en 1 ml de 1 M sorbitol helado.
Las mezclas fueron colocadas en placas MD.
Las placas fueron incubadas a 28 °C durante 3-4 dfas.
La seleccion de clones para la expresion a pequena escala
[0166] Cuatro clones candidatos de cada transformacion se cultivaron en una escala de 3 ml utilizando placas de 24-de profundidad (Whatman, UK).
Las celulas crecieron en medios BMSY durante 2.5 dfas a 28 °C con agitacion vigorosa. 0,5 % de netanol se anadio al cultivo para inducir la expresion genica heterologa.
El cultivo crecio continuamente durante 4 dfas con una adicion diaria de 0,5 % de metanol bajo la misma condicion de crecimiento.
Se tomaron a diario muestras de cultivo durante la induccion y se almacenaron a -20 °C para analisis SDS-PAGE y ensayo de actividad de amilasa.
[0167] El cultivo de pS1 y pS2 mostro una banda protefnica a 55KD y 65KD visualizada respectivamente en SDS-PAGE y la actividad de amilasa por la prueba contra la AZCL amilosa.
Ejemplo 6: la purificacion de las alfa-amilasas de la presente invencion
[0168] El pH del cultivo de sobrenadante se ajusto a 7.0 con NaOH, luego se filtro a traves de un filtro 0,45 pm.
La solucion se aplico a una columna de alto rendimiento 30ml Ni-sepharose (GE Healthcare) equilibrada con 20mM de suero salino tamponado con fosfato (PBS) que contiene 0,3 M NaCl a pH 7,0. La protefna se eludio con un gradiente de imidazol lineal (0-500mM).
Las fracciones de la columna se analizaron para actividad de amilasa.
[0169] Las fracciones con actividad de amilasa se controlaron por SDS-PAGE y las fracciones puras fueron agrupadas.
El SDS-PAGE mostro que el peso molecular de P243SV fue aproximadamente 55 kDa y el peso molecular de P23WU1 fue aproximadamente 65 kDa.
Ejemplo 7: caracterizacion de la alfa-amilasa de la presente invencion
[0170] Estas dos alfa-amilasas como se han purificado en el ejemplo 6 fueron analizadas.
Los resultados fueron mostrados en la tabla 2 y tabla 3, respectivamente.
Tabla 2 el resultado analftico de P243SV
Analisis
Protefna entera
Longitud
505 aa
Peso molecular
56742,60 Dalton
1 Microgramo =
17, 623 pMoles
Coeficiente de extincion Molar
92660
A[280] de 1 mg/ml
1.63 AU
Punto isoelectrico
5,12
carga a pH 7
-13,51
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 3 el resultado analftico de P23WU1
Analisis
Protefna entera
Longitud
619 aa
Peso molecular
66895,60
1 Microgramo =
14, 949 pMoles
Coeficiente de extincion Molar
128010
A[280] de 1 mg/ml
1,91 AU
Punto isoelectrico
5,62
Carga a pH 7
-6,67
[0171] Estas dos alfa-amilasas como se han purificado en el ejemplo 6 fueron ademas caracterizadas segun los metodos siguientes.
Ensayo de AZCL-HE-amilosa
[0172] Tres microlitros de muestras de alfa-amilasa y 100pl 0,2 % AZCL-HE-amilosa (Megazyme internacional Ireland Ltd.) a pH 4,3 se mezclaron separadamente en una placa de microtitulacion y se colocaron en el hielo antes de la reaccion.
El ensayo se inicio por transferencia de la placa de microtitulacion a un termomezclador Eppendorf, que fue establecido a la temperatura de ensayo 40 °C.
Luego el 60pl sobrenadante fue transferido a una placa de microtitulacion nueva.
Densidad optica a 595 nm (OD595) se leyo como una medida de actividad de amilasa.
Toda la reaccion se hizo con duplicado y un tampon ciego fue incluido en el ensayo (en vez de enzima).
[0173] Las adsorbancias para P243SV y P23WU1 a OD595 son 0,33 y 0,67, respectivamente, que muestran que P243SV y P23WU1 tienen actividad de amilasa.
Perfil de pH
[0174] Tres microlitros de muestras de enzima y 40 pl 1% AZCL-HE-amilosa en 100 pl B&R tampon (tampon Britton-Robinson: 0,1 M acido borico, 0,1 M acido acetico y 0,1 M acido fosforico) ajustado a valores de pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0,10.0, 11.0 con HCl o NaOH se mezclaron en una placa de microtitulacion y se colocaron en el hielo antes de la reaccion.
El ensayo fue iniciado por transferencia de la placa de microtitulacion a un termomezclador de Eppendorf, que fue establecido en la temperatura de ensayo a 50 °C.
Luego el sobrenadante 60pl fue transferido a una placa de microtitulacion nueva.
OD595 se leyo como una medida de actividad de amilasa.
Se hizo toda la reaccion con duplicado y se incluyo un tampon ciego en el ensayo (en vez de enzima).
[0175] Ambas alfa-amilasas son acido amilasas y su pH optimo es pH4,0 como se muestra en la tabla 4.
Tabla 4 perfil de pH de alfa-amilasas
ph
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
P243SV
0.14 0.15 0.50 0.19 0.14 0.14 0.15 0.14 0.16 0.16
P23WU1
0.11 0.20 0.77 0.73 0.66 0.68 0.64 0.36 0.14 0.11
Estabilidad de pH
[0176] Veinte microlitros de enzima fueron adicionados a un tampon 100pl (100mM Na-acetato) a pH4.0, incubados a 37 °C durante 0, 10, 30, 60 y 120 min.
La enzima se anadio en 40 pl 1 % AZCL-HE-amilosa en el agua a 37 °C durante 20 min, 60 pl se tomaron para
OD595.
[0177] Ambas alfa-amilasas son estables a pH4,0 como se muestra en la tabla 5.
Tabla 5 estabilidad de pH de las alfa-amilasas
Tiempo (min)
0 10 30 60 120
P243SV
0.56 0,85 0,67 0,63 0,60
P23WU1
1,34 1,54 1,34 1,46 1,47
Perfil de temperatura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0178] Tres microlitros de enzima se anadieron en un 100|jl tampon (50mM NaAc) a pH 4,3 que contenfa 0,2 % de AZCL-HE-amilosa, incubando durante 20 min y 60jl de sobrenadante se tomo para OD595.
[0179] P23WU1 muestra una temperatura optima mas alta (60 °C) que P243SV (40 °C) como se muestra en la tabla 6.
Tabla 6 perfil de temperatura de las alfa-amilasas
Temperatura (°C)
30 40 50 60 70 80 90
P243SV
0,30 0,33 0,14 0,10 0,10 0,08 0,09
P23WU1
0,57 0,67 0,81 0,86 0,21 0,15 0,14
Estabilidad de temperatura
[0180] Tres microlitros de muestras de enzima fueron adicionados en 100jl 50 mM NaAc a pH4,3 e incubados a 50 °C (P243SV) y 65 °C (P23WU1) durante 0,10,30,60 y 120 minutos, y luego se les puso hielo en cada momento establecido.
Cuarenta microlitros de 1 % AZCL-HE-amilosa en el agua fueron anadidos a 37 °C durante 20 minutos, 60jl se tomaron para OD595.
[0181] P243SV es mas estable a 50 °C y P23WU1 es estable relativamente a alta temperatura (65 °C), como se muestra en la tabla 7.
Tabla 7 estabilidad de temperatura de las alfa-amilasas
Tiempo (min)
0 10 30 60 120
P243SV (50 °C)
0,86 0,82 0,78 0,75 0,45
P23WU1 (65 °C)
0,74 0,58 0,42 0,27 0,13
Ejemplo 8: sacarificacion simultanea y rendimiento de fermentacion (SSF) de alfa-amilasa Penicillium oxalicum recombinante
[0182] El rendimiento de SSF de alfa-amilasa Penicillium oxalicum purificado (P243SV o P23WU1) fue evaluado a dosis de enzima diferentes en combinacion con una dosis constante (equivalente a 0,56 AGU/gDS) de glucoamilasa de Talaromyces emersonii purificada (descrita en la publicacion internacional WO 99/28448 como SEC ID N.°: 7) o en combinacion con una mezcla de glucoamilasa de Talaromyces emersonii y glucoamilasa de Trametes cingulata (descrita en la publicacion internacional WO 2006/069289 como SEC ID NO:2).
Glucoamilasa de Talaromyces emersonii y glucoamilasa de Trametes cingulata fueron ambos expresados en el Aspergillus niger.
[0183] La fermentacion se realizo bajo las condiciones siguientes:
Sustrato: triturado de mafz licuado industrialmente 33,9 % DS (% en peso)
Temperatura: 32 °C PH inicial: 5,0
Dosis de alfa-amilasa: alfa-amilasa Penicillium oxalicum (obtenida por ejemplo 6) a 3 y 10 jg de protefna/g enzimatica solida en seco (jg EP/g DS).
[0184] Experimento A, alfa-amilasas de Penicillium oxalicum se compararon con una muestra purificada de la glucoamilasa de Talaromyces emersonii dosificada en las mismas dosificaciones.
La dosis de Talaromyces emersonii glucoamilasa es equivalente a una industria pertinente 0,56 AGU/gDS.
[0185] Experimento B, alfa-amilasas Penicillium oxalicum se compararon con una mezcla de glucoamilasa de Talaromyces emersonii comercial y glucoamilasa de Trametes cingulata.
La dosis de glucoamilasa total es equivalente a una industria pertinente 0,56 AGU/gDS.
Fermentacion
[0186] El sustrato para SSF fue probado despues del paso de licuefaccion en una instalacion de etanol.
El mafz molido se mezclo con contratiempo y otro agua reciclada, y se ajusto su sustancia seca a aproximadamente 33, 9 % (p/p), y luego se envio en la licuefaccion a 85 °C y pH 5,8. Antes de las fermentaciones lab, 1000 urea de ppm como fuente de nitrogeno y se anadieron 3 ppm de penicilina para control bacteriano; el pH luego se ajusto a 5,0 con H2SO4.
Las partes alfcuotas de sustrato correspondientes a aproximadamente 5g de triturado fueron transferidas a 15 ml de tubos centrifugadores, con un agujero peforado en la parte superior para liberacion de CO2.
Se anadieron enzimas y levadura (30 millones de celulas/ml) y los tubos se colocaron en un bano maria sin agitacion a 32 °C.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Se analizaron las muestras en la cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) para la determinacion de las concentraciones de carbohidrato y etanol.
[0187] El etanol producido durante la fermentacion se da en las tablas 8 y 9.
Tabla 8 el etanol de la (g/l) producido durante SSF con alfa-amilasa Penicillium oxalicum anadida (P243SV o P23WU1) se evaluo a una dosis enzimatica diferente en combinacion con glucoamilasa de Talaromyces emersonii) a 0,56 AGU/gDS en comparacion solo con glucoamilasa de Talaromyces emersonii, experimento A
1
Dosis enzimatica (pgEP/gDS)
3 10
Ninguna alfa-amilasa
126,3
Penicillium oxalicum - P243SV
125,6 126,0
Penicillium oxalicum - P23WU1
129,0 129,8
Tabla 9 etanol (g/l) producido durante SSF con alfa-amilasa Penicillium oxalicum anadido (P23WU1) se evaluo a una dosis enzimatica diferente en combinacion con una mezcla de glucoamilasa de Talaromyces emersonii y glucoamilasa de Trametes cingulata a 0,56 AGU/gDS en comparacion solo ______________________con la mezcla de glucoamilasa experimento B______________________
Dosis enzimatica (pgEP/gDS)
3
10
Ninguna alfa-amilasa
120,8
Penicillium oxalicum - P23WU1
122,6 123,6
Ejemplo 9: el efecto de la alfa-amilasa Penicillium oxalicum en el volumen del pan
[0188] Los mini rollos se hicieron de 12 g de harina de Kolibri® (Meneba, Rotterdam, Pafses Bajos) segun un procedimiento de masa recta con la adicion de 56 % de agua, 4,5 % levadura, 1,5 % sacarosa, 1,5 % sal y 40 acido ascorbico ppm basado en la harina.
La masa fue suplementada con dosificaciones diferentes de enzimas segun la tabla 10 de abajo.
Todos los ingredientes se mezclaron en un mezclador mini (NS1-33R, National MFG Co., Lincoln, Nebraska, Estados Unidos) durante 3.5 min a velocidad 3.
Despues de la mezcla, la masa se formo y se coloco en una forma de aluminio redondo (diametro 90 mm y altura lateral 15 mm).
Despues de la prueba de 55 min. a 32 °C y una humedad relativa del 86 % (RH), la masa se horneo a 230 °C durante 17 min.
Tabla 10 dosificaciones de enzimas
1 2 3 4 5 6 7
P23WU1 (mg protefna enzimatica/kg harina)
0,33 1 3
P243SV (mg protefna enzimatica/kg harina)
0,33 1 3
[0189] El efecto de la enzima en el volumen de los panes se evaluo por un metodo de desplazamiento de agua, es decir, medicion de la cantidad de agua desplazada por el pan a temperatura ambiente.
Un vaso de precipitados que contiene agua se puso en una balanza, que fue luego ajustada a 0,000 g. El pan se impregno con parafina a 80 °C durante 3 segundos, se pudo enfriar durante 10 segundos y luego se sumergio en agua en el vaso de precipitados por presion.
La masa del (gramo) de agua desplazada o la presion aplicada se leyo de la balanza (gramos).
La masa del agua desplazada correspondfa al volumen del pan (ml).
[0190] El pan se pondero en un equilibrio y el volumen especffico se calculo por la division del volumen de pan (de metodo de desplazamiento de agua )) por el peso de pan (determinado por el peso del pan).
Un fndice de volumen especffico se calculo por el ajuste del volumen especffico del pan de control a 100 % y se calculo el volumen especffico del pan tratado enzimatico relativamente al control (ninguna enzima).
[0191] El efecto de amilasa P23WU1 y amilasa P243SV en el volumen de rollos mini puede verse en la tabla 2 debajo.
Tabla 2 volumen de rollos con amilasas diferentes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Enzima
Volumen especffico (ml/g) Indice de volumen especffico (%)
Control (ninguna enzima)
2,993 100
P23WU1 (0,33 mg/kg)
3,138 105
P23WU1 (1 mg/kg)
3,055 102
P23WU1 (3 mg/kg)
3,107 104
P243SV (0,33 mg/kg)
3,036 101
P243SV (1 mg/kg)
3,035 101
P243SV (3 mg/kg)
2,924 98
[0192] La amilasa P23WU1 fue capaz de mejorar el volumen del pan a 0,33 mg protefna enzimatica/kg harina, 1 mg protefna enzimatica/kg harina y 3 mg de protefna enzimatica/kg harina, respectivamente.
La amilasa P243SV pudo mejorar el volumen del pan a 0,33 mg de protefna enzimatica/kg harina y 1 mg de protefna enzimatica/kg harina, respectivamente.
[0193] La presente invencion esta posteriormente descrita por los siguientes parrafos numerados:
[1] Polipeptido aislado con actividad de alfa-amilasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un polipeptido con al menos 80 %, por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia al polipeptido maduro de SEC ID N.°: 4; o un polipeptido con al menos 65 %, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia al polipeptido maduro de SEC ID NO:2;
(b) un polipeptido codificado por un polinucleotido que hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas con (i) la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3, o la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 1, (ii) las secuencias de ADNc de los mismos, o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii);
(c) un polipeptido codificado por un polinucleotido con al menos 80 %, por ejemplo, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia a la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de ADNc del mismo; o un polipeptido codificado por un polinucleotido con al menos 65 %, por ejemplo, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia a la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 1 o la secuencia de ADNc del mismo;
(d) una variante del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4 o el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 2 que comprende una sustitucion, delecion y/o insercion a una o mas posiciones; y
(e) un fragmento del polipeptido de (a); (b), (c), o (d) que tiene actividad de alfa-amilasa.
[2] Polipeptido del parrafo 1, con al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia al polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4; o al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de la secuencia de identidad con el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 2.
[3] Polipeptido del parrafo 1 o 2, que se codifica por un polinucleotido que hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas, condiciones de astringencia medio-bajas, condiciones de astringencia medias, condiciones de astringencia medio altas, condiciones de astringencia altas o condiciones de astringencia muy altas con (i) la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii).
[4] Polipeptido de cualquiera de parrafos 1-3, que se codifica por un polinucleotido con al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia a la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de ADNc del mismo; o que se codifica por un polinucleotido con al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de codificacion del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 1 o la secuencia de ADNc del mismo.
[5] Polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-4, que comprende o consistente en la SEC ID N.°: 4 o SEC ID N.°: 2, el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4 o el polipeptido maduro de SEC ID N.°: 2.
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[6] Polipeptido del parrafo 5, donde el polipeptido maduro es aminoacidos 21 a 619 de la SEC ID N.°: 4 o aminoacidos 26 a 505 de la SEC ID N.°: 2.
[7] Polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-4, que es una variante del polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 4 o el polipeptido maduro de la SEC ID N.°: 2, que comprende una sustitucion, delecion y/o insercion a una o mas posiciones; o que es un fragmento de la SEC ID N.°: 2 o la SEC ID N.°: 4, donde el fragmento tiene actividad de alfa-amilasa.
[8] Polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-7, que es estable a 10 °C-100 °C, preferiblemente, 20 °C- 80 °C, mas preferiblemente, 30 °C- 70 °C.
[9] Polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-8, que es un fragmento del polipeptido de la SEC ID N.°: 4 o la sEc ID N.°: 2, con actividad de alfa-amilasa.
[10] Polipeptido aislado que comprende un dominio catalftico seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un dominio catalftico con al menos un 80 % de identidad de secuencia con amino acidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4 o al menos 65 % de identidad de secuencia con amino acidos 26 a 503 de la SEC ID N.°: 2;
(b) un dominio catalftico codificado por un polinucleotido que hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas, medias, medio altas, altas o muy altas con nucleotidos 61 a 1973 de la SEC ID N.°: 3 o nucleotidos 76 a 1578 de la SEC ID N.°: 1, (ii) la secuencia de ADNc del mismo o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii);
(c) un dominio catalftico codificado por un polinucleotido con al menos 80 % de identidad de secuencia a nucleotidos 61 a 1973 de la SEC ID N.°: 3 o al menos 65 % de identidad de secuencia con nucleotidos 76 a 1578 de la SEC ID N.°: 1;
(d) una variante de aminoacidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4 o aminoacidos 26 a 503 de la SEC ID N.°: 2, que comprende una sustitucion, delecion y/o insercion a una o mas posiciones; y
(e) un fragmento del dominio catalftico de (a); (b), (c) o (d) que tiene actividad de alfa-amilasa.
[11] Polipeptido del parrafo 10, que comprende ademas un dominio de union de carbohidrato.
[12] Polipeptido aislado que comprende un dominio de union de carbohidrato, donde el dominio de union se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un dominio de union de carbohidrato con al menos 80 % de identidad de secuencia a amino acidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4;
(b) un dominio de union de carbohidrato codificado por un polinucleotido que hibridiza bajo condiciones de astringencia bajas, medias, medio altas, altas o muy altas con nucleotidos (i) 2025 a 2351 de la SEC ID N.°: 3, (ii) la secuencia de ADNc del mismo o (iii) el complemento en toda su longitud de (i) o (ii);
(c) un dominio de union de carbohidrato codificado por un polinucleotido con al menos 80 % de identidad de secuencia para nucleotidos 2025 a 2351 de la SEC ID N.°: 3 o la secuencia de ADNc de los mismos;
(d) una variante de aminoacidos 511 a 619 de la SEC ID N.°: 4 que comprende una sustitucion, delecion y/o insercion en una o mas posiciones; y
(e) un fragmento de (a); (b), (c); (d) o (e) que tiene una actividad de union de carbohidrato.
[13] Polipeptido del parrafo 12, donde el dominio de union de carbohidrato esta operativamente enlazado a un dominio catalftico.
[14] Polipeptido del parrafo 13, donde el dominio catalftico se obtiene de amilasa.
[15] Polipeptido del parrafo 14, donde el dominio catalftico se obtiene de alfa-amilasa.
[16] Polipeptido del parrafo 15, donde el dominio catalftico se obtiene de alfa-amilasa acida.
[17] Formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular que comprende el polipeptido de cualquiera
de parrafos 1-16.
[18] Composicion que comprende el polipeptido de cualquiera de parrafos 1-16 y una enzima seleccionada del grupo que consiste en: una alfa-amilasa fungica (EC 3.2.1.1), una beta-amilasa (E.C. 3.2.1.2), una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3), unas pululanasas (E.C. 3.2.1.41), una fitasa (E.C.3.1.2.28) y una proteasa (E.C. 3.4.).
[19] Polinucleotido aislado que codifica el polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-16.
[20] Constructo de acidos nucleicos o vector de expresion que comprende el polinucleotido del parrafo 19 operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion del polipeptido en un huesped de expresion.
[21] Celula huesped recombinante que comprende el polinucleotido del parrafo 19 operativamente enlazado a una o mas secuencias de control que dirigen la produccion del polipeptido.
[22] Metodo para producir el polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-16, que comprende:
Cultivo de una celula, que en su forma tipo salvaje produce el polipeptido, bajo condiciones de conduccion para la produccion del polipeptido.
[23] Metodo del parrafo 22, que comprende ademas la recuperacion del polipeptido.
[24] Metodo para producir un polipeptido con actividad de alfa-amilasa, que comprende:
Cultivo de la celula huesped del parrafo 21 bajo condiciones conductivas para la produccion del polipeptido.
[25] Metodo del parrafo 24, que comprende ademas la recuperacion del polipeptido.
[26] Planta transgenica, parte de planta o celula vegetal transformada con un polinucleotido que codifica el polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-16.
[27] Metodo para producir un polipeptido con actividad de alfa-amilasa, que comprende:
Cultivo de la planta transgenica o celula vegetal del parrafo 26 bajo condiciones conductivas para la produccion del polipeptido.
5
10
15
20
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55
60
[28] Metodo del parrafo 27, que comprende ademas la recuperacion del polipeptido.
[29] Metodo para producir un mutante de una celula madre, que comprende inactivar un polinucleotido que codifica el polipeptido de cualquiera de los parrafos 1-16, que resulta en el mutante que produce menos del polipeptido que la celula madre.
[30] Celula mutante producida por el metodo del parrafo 29.
[31] Celula mutante del parrafo 30, que comprende ademas un gen que codifica una protefna nativa o heterologa.
[32] Mtodo para producir una protefna, que comprende:
Cultivo de la celula mutante del parrafo 30 o 3 bajas condiciones conductivas para la produccion de la protefna.
[33] Metodo del parrafo 32, que comprende ademas la recuperacion del polipeptido.
[34] Molecula de ARN inhibitorio bicatenario (ARNbc) que comprende una subsecuencia del polinucleotido del parrafo 19, donde opcionalmente el ARNbc es un ARNsi o una molecula ARNmi.
[35] Molecula de ARN inhibitoria bicatenaria de (ARNbc) del parrafo 34, que es aproximadamente 15,16,17,18,19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o mas nucleotidos duplex de longitud.
[36] Metodo de la inhibicion de la expresion de un polipeptido con actividad de alfa-amilasa en una celula, que comprende la administracion a la celula o expresion en la celula de la molecula de ARN inhibitorio bicatenario (ARNbc) del parrafo 34 o 35.
[37] Celula producida por el metodo del parrafo 36.
[38] Celula del parrafo 37, que comprende ademas un gen que codifica una protefna nativa o heterologa.
[39] Metodo para producir una protefna, que comprende:
Cultivo de la celula del parrafo 37 o 38 bajas condiciones conductivas para la produccion de la protefna.
[40] Metodo del parrafo 39, que comprende ademas la recuperacion del polipeptido.
[41] Polinucleotido aislado que codifica un peptido senal que comprende o consiste en aminoacidos 1 a 20 de la SEC ID N.°: 4 o aminoacidos 1 a 25 de la SeC ID N.°: 2.
[44] Constructo de acidos nucleicos o vector de expresion que comprende un gen que codifica una protefna operativamente enlazada al polinucleotido del parrafo 41, donde el gen es foraneo al polinucleotido que codifica el peptido senal.
[45] Celula huesped recombinante que comprende un gen que codifica una protefna operativamente vinculada al polinucleotido del parrafo 41, donde el gen es foraneo al polinucleotido que codifica el peptido senal.
[46] Metodo para producir una protefna, que comprende:
Cultivo de una celula huesped recombinante que comprende un gen que codifica una protefna operativamente vinculada al polinucleotido del parrafo 41, donde el gen es foraneo para el polinucleotido que codifica el peptido senal, bajo condiciones conductivas para la produccion de la protefna.
[47] Metodo del parrafo 46, que comprende ademas la recuperacion de la protefna.
[48] Uso del polipeptido segun cualquier de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para la conversion de almidon.
[49] Uso del polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para la modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa.
[50] Uso del polipeptido, segun cualquiera de parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para licuefaccion de almidon y/o sacarificacion.
[51] Uso del polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion del caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para lavado textil.
[52] Uso del polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para desencolado textil.
[53] Uso del polipeptido, segun cualquier de parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para la destilacion.
[54] Uso del polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para produccion de etanol.
[55] Uso segun parrafo 54 para la produccion de etanol en un proceso que comprende hidrolizacion de almidon.
[56] Uso del polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18 para la coccion.
[57] Uso segun parrafo 56 para la mejora del volumen de un pan.
[58] Metodo para la conversion de almidon, almidon preferiblemente gelatinizado, donde se anade un polipeptido segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[59] Metodo para la modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa, donde se anade un polipeptido segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o la composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[60] Metodo para la licuefaccion y/o almidon de sacarificacion, donde se anade un polipeptido segun cualquier de parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
5
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15
20
25
30
35
40
45
50
55
[61] Metodo para el lavado textil, donde se anade un polipeptido segun cualquier de los parrafos 1-16, la formulacion del caldo completo o la composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[62] Metodo para el desencolado textil, donde se anade un polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[63] Metodo para la elaboracion de cerveza, donde se anade un polipeptido segun cualquiera de los parrafos 116, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[64] Metodo para la produccion de etanol, donde se anade un polipeptido, segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[65] Metodo segun el parrafo 64, donde el etanol se produce en un proceso que comprende almidon de hidrolizacion.
[66] Metodo para la coccion, donde se anade un polipeptido segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
[67] Metodo segun el parrafo 66, donde se anade a la masa un polipeptido segun cualquiera de los parrafos 1-16, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular segun el parrafo 17 o la composicion segun el parrafo 18.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Novozymes A/S
Novozymes North America, Inc.
Li, Ming Duan, Junxin Tsutsumi, Noriko Coward-Kelly, Guillermo Lundkvist, Henrik
<120> POLIPEPTIDOS CON ACTIVIDAD DE ALFA-AMILASA Y POLYNUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS MISMOS
<130> 12277-WO-PCT[2]
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 1587
<212> ADN
<213> Penicillium oxalicum
<2 2 0>
<221> sig_peptide <222> (1)..(75)
<2 2 0>
<221> exon
<222> (1)..(1011)
<2 2 0>
<221> exon
<222> (1081) .. (1584)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
atg 48
ttc ttc aca tcc tcg gtc tgc tgg
Met 1
Phe Phe Thr Ser 5 Ser Val Cys Trp
tca 96
tgc ctg ctg aac ccg gtt ctc gcc
Ser
Cys Leu Leu 20 Asn Pro Val Leu Ala 25
act 144
cga tcc gtg tac caa acc atg acc
Thr
Arg Ser 35 Val Tyr Gln Thr Met 40
Thr
ggg 192
tcg atg acg gct ccg tgc aac gcc
Gly
Ser 50 Met Thr Ala Pro Cys 55 Asn Ala
gga 240
acg tgg aag ggg aca atg aat aag
Gly 65
Thr Trp Lys Gly Thr 70 Met Asn Lys
gga 288
ttc gac gcg atc atg atc tcc ccg
Gly
Phe Asp Ala Ile 85 Met Ile Ser Pro
cgg 336
gtc tgg tat ggt gaa gcc tat cac
Arg
Val Trp Tyr 100 Gly Glu Ala Tyr His 105
tac 384
caa ctc aac cct cac ttt ggc acc
Tyr
Gln Leu 115 Asn Pro His Phe Gly 120 Thr
gtc 432
gat gcc att cat gcg cgc ggc atg
Val
Asp 130 Ala Ile His Ala Arg 135 Gly Met
att 480
aac aac atg gcc tgg atg acc cgc
Ile 145
Asn Asn Met Ala Trp 150 Met Thr Arg
atc 528
gac tat tcc gcc ttg acc ccg ttc
Ile
Asp Tyr Ser Ala 165 Leu Thr Pro Phe
cca 576
tac tgc aag atc aag aat tgg aac
gcg
gca ggc ctc acc acc ctg
Ala
Ala
Gly Leu Thr Thr Leu
10
15
gcg
gac atg gct gca tgg aag
Ala
Asp Met Ala Ala Trp Lys
30
gat
cgg ttc gct cgc ccg gac
Asp
Arg Phe Ala Arg Pro
Asp
45
tcc
gcg ggc ctt tac tgc gga
Ser
Ala Gly Leu Tyr Cys Gly
60
ttg
gat tat att cag gac atg
Leu
Asp Tyr Ile Gln Asp Met
75 80
atc
gta aag aac atc gag ggt
Ile
Val Lys Asn Ile Glu Gly
90
95
ggg
tac tgg cca cag gat atg
Gly
Tyr Trp Pro Gln Asp Met
110
gag
caa gag ttg cat gat ctc
Glu
Gln Glu Leu His Asp Leu
125
tat
atc ctc ttg gac agc gtc
Tyr
Ile Leu Leu Asp Ser Val
140
ggc
cag aac ccg gcc acg cac
Gly
Gln Asn Pro Ala Thr His
155 160
aac
aac
cag cag tac tat cac
Asn
Asn
Gln Gln Tyr Tyr His
170
175
aac
tac acg gat gcc caa ctg
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Pro
Tyr Cys Lys Ile Lys Asn Trp Asn Asn Tyr Thr Asp Ala Gln Leu
180 185 190
tgc
caa aca gga gac gac cag gtc gcc ttg ccc gat ctg ttt acc gaa
624
Cys
Gln Thr Gly Asp Asp Gln Val Ala Leu Pro Asp Leu Phe Thr Glu
195 200 205
cat
gag gac gtt cag aag aca ttg gag gac tgg gca acc gac gtg atc
672
His
Glu Asp Val Gln Lys Thr Leu Glu Asp Trp Ala Thr Asp Val Ile
210 215 220
aag
aaa tat aac atc gac ggc ctt cga ctc gat gcg gtc aag agt ttg
720
Lys
Lys
Tyr Asn Ile Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val Lys Ser Leu
225
230 235 240
aca
ccg agc ttc ctg gcc aag ttt gtc aag aac gtc gga ggc ttc atg
768
Thr
Pro Ser Phe Leu Ala Lys Phe Val Lys Asn Val Gly Gly Phe Met
245 250 255
acc
gga gaa cag ttc gaa aga gac tcc aag atc atc tgc gac tgg caa
816
Thr
Gly Glu Gln Phe Glu Arg Asp Ser Lys Ile Ile Cys Asp Trp Gln
260 265 270
aag
aac tat atc tcc agc atg ccc aac tac ccc atg tac tat tcc atg
864
Lys
Asn Tyr Ile Ser Ser Met Pro Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ser Met
275 280 285
gtc 912
gag gcc ttt acc cag gga aac atg tca gat ctc gct gtc caa att
Val
Glu Ala Phe Thr Gln Gly Asn Met Ser Asp Leu Ala Val Gln Ile
290 295 300
gag 960
acg atg aag tcg ctt tgt gcg gac gtg aca gag atg gtc tcc ttc
Glu
Thr Met Lys Ser Leu Cys Ala Asp Val Thr Glu Met Val Ser Phe
305
310 315 320
tca 1008
gaa aat cac gat att gct cgc gtt cgt gcg ctg agg gac gat ctc
Ser
Glu Asn His Asp 325 Ile Ala Arg Val Arg 330 Ala Leu Arg Asp Asp 335 Leu
tcg gtatgtataa tcctatggtc cccagcagtg aatgatcact gaccgagtct 1061 Ser
ctctcttccc ccgacgcag att gcc aaa acc ttc ctc acg ttc acg tta ctg 1113
Ile Ala Lys Thr Phe Leu Thr Phe Thr Leu Leu 340 345
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ttc 1161
gac gga atc ccc atg ctc tat cag ggc caa gaa cag ttc ttg gac
Phe
Asp Gly Ile Pro Met Leu Tyr Gln Gly Gln Glu Gln Phe Leu Asp
350 355 360
ggg 1209
ttg tct agt ccc gag aat cgt caa gcg atc tgg ctc acg ggc tac
Gly
Leu Ser Ser Pro Glu Asn Arg Gln Ala Ile Trp Leu Thr Gly Tyr
365
370 375 380
aac
tcc aac gcg ccc ctc tac cag ctc acc aag gcc ctc aac agc ctt
1257
Asn
Ser Asn Ala Pro Leu Tyr Gln Leu Thr Lys Ala Leu Asn Ser Leu
385 390 395
cgg 1305
cgc cat gcc ctt gag ctg gat ccc aac tac gtc aac atc cca acc
Arg
Arg
His Ala Leu Glu Leu Asp Pro Asn Tyr Val Asn Ile Pro Thr
400 405 410
tac
ccc atc tat cgg ggt gcc agt gag att gcg gtc agt aag ggt gtg
1353
Tyr
Pro Ile Tyr Arg Gly Ala Ser Glu Ile Ala Val Ser Lys Gly Val
415 420 425
cag 1401
ggt cga cag gtc gtc acc gtc gtc acc aat caa ggc gtc aag ggt
Gln
Gly Arg Gln Val Val Thr Val Val Thr Asn Gln Gly Val Lys Gly
430 435 440
ggc 1449
tcc tac acg ctc acc ttg ccc gcg tcc ttc aac gcg atg acg ccc
Gly
Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Pro Ala Ser Phe Asn Ala Met Thr Pro
445
450 455 460
gtg 1497
acg gag atc atc acc tgt tcg aat tac acg gtc gat gcc cgg gga
Val
Thr Glu Ile Ile Thr Cys Ser Asn Tyr Thr Val Asp Ala Arg Gly
465 470 475
tcg 1545
ctg gtc gtg cag atg gac aaa gga gag cct cgg gtc ttc ttc ccg
Ser
Leu Val Val Gln Met Asp Lys Gly Glu Pro Arg Val Phe Phe Pro
480 485 490
aca
cag ttg atg gaa ggc agc gga ttg tgt ggt tat tcc taa
1587 Thr
Gln Leu Met Glu Gly Ser Gly Leu Cys Gly Tyr Ser
495 500 505
<210> 2 <211> 505
<212> PRT
<213> Penicillium oxalicum
Met Phe Phe Thr Ser Ser Val Cys 1 5 5
Trp Ala Ala Gly Leu Thr Thr Leu 10 15
Ser Cys Leu Leu Asn Pro Val Leu 20
Ala Ala Asp Met Ala Ala Trp Lys 25 30
10 Thr Arg Ser Val Tyr Gln Thr Met 35 40
Thr Asp Arg Phe Ala Arg Pro Asp 45
15 Gly Ser Met Thr Ala Pro Cys Asn 50 55
Ala Ser Ala Gly Leu Tyr Cys Gly 60
Gly Thr Trp Lys Gly Thr Met Asn 20 65 70
Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Asp Met 75 80
Gly Phe Asp Ala Ile Met Ile Ser 25 85
Pro Ile Val Lys Asn Ile Glu Gly 90 95
Arg Val Trp Tyr Gly Glu Ala Tyr 100 30
His Gly Tyr Trp Pro Gln Asp Met 105 110
Tyr Gln Leu Asn Pro His Phe Gly 115 120
Thr Glu Gln Glu Leu His Asp Leu 125
35 Val Asp Ala Ile His Ala Arg Gly 130 135
Met Tyr Ile Leu Leu Asp Ser Val 140
40 Ile Asn Asn Met Ala Trp Met Thr 145 150
Arg Gly Gln Asn Pro Ala Thr His 155 160
Ile Asp Tyr Ser Ala Leu Thr Pro 45 165
Phe Asn Asn Gln Gln Tyr Tyr His 170 175
Pro Tyr Cys Lys Ile Lys Asn Trp 180 50
Asn Asn Tyr Thr Asp Ala Gln Leu 185 190
Cys Gln Thr Gly Asp Asp Gln Val 195 200
Ala Leu Pro Asp Leu Phe Thr Glu 205
55 His Glu Asp Val Gln Lys Thr Leu 210 215
Glu Asp Trp Ala Thr Asp Val Ile 220
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

Lys Lys Tyr Asn Ile Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val Lys Ser Leu 225 230 235 240

Thr Pro Ser Phe Leu Ala Lys Phe Val Lys Asn Val Gly Gly Phe Met 245 250 255

Thr Gly Glu Gln Phe Glu Arg Asp Ser Lys Ile Ile Cys Asp Trp Gln 260 265 270

Lys Asn Tyr Ile Ser Ser Met Pro Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ser Met 275 280 285

Val Glu Ala Phe Thr Gln Gly Asn Met Ser Asp Leu Ala Val Gln Ile 290 295 300

Glu Thr Met Lys Ser Leu Cys Ala Asp Val Thr Glu Met Val Ser Phe 305 310 315 320

Ser Glu Asn His Asp Ile Ala Arg Val Arg Ala Leu Arg Asp Asp Leu 325 330 335

Ser Ile Ala Lys Thr Phe Leu Thr Phe Thr Leu Leu Phe Asp Gly Ile 340 345 350

Pro Met Leu Tyr Gln Gly Gln Glu Gln Phe Leu Asp Gly Leu Ser Ser 355 360 365

Pro Glu Asn Arg Gln Ala Ile Trp Leu Thr Gly Tyr Asn Ser Asn Ala 370 375 380

Pro Leu Tyr Gln Leu Thr Lys Ala Leu Asn Ser Leu Arg Arg His Ala 385 390 395 400

Leu Glu Leu Asp Pro Asn Tyr Val Asn Ile Pro Thr Tyr Pro Ile Tyr 405 410 415

Arg Gly Ala Ser Glu Ile Ala Val Ser Lys Gly Val Gln Gly Arg Gln 420 425 430

Val Val Thr Val Val Thr Asn Gln Gly Val Lys Gly Gly Ser Tyr Thr 435 440 445
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Leu
Thr Leu Pro Ala Ser Phe Asn
450 455
Ile
Thr Cys Ser Asn Tyr Thr Val
465
470
Gln
Met Asp Lys Gly Glu Pro Arg
485
Glu
Gly Ser Gly c;nn Leu Cys Gly Tyr
500
<210> 3
<211> 2354
<212> ADN
<213> Penicillium oxalicum
Ala
Met Thr Pro Val Thr Glu Ile
460
Asp
Ala Arg Gly Ser Leu Val Val
475 480
Val
Phe Phe Pro Thr Gln Leu Met
490 495
Ser
505
<2 2 0>
<221> sig_peptide <222> (1)..(60)
<2 2 0>
<221> exon <222> (1)..(156)
<2 2 0>
<221> exon <222> (235)..(273)
<2 2 0>
<221> exon <222> (335)..(450)
<2 2 0>
<221> exon <222> (503)..(611)
<2 2 0>
<221> exon <222> (671)..(899)
<2 2 0>
<221> exon
<222> (962)..(1124)
<2 2 0>
<221> exon
<222> (1173)..(1319)
<2 2 0>
<221> exon
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<2 2 0>
<221> exon
<222> (1695) .. (2354)
<400>
3
atg
aaa ttc ctt gga cta gct gct ttg ttt ctt gcc cag acc gtg gcg
48
Met
Lys Phe Leu Gly Leu Ala Ala Leu Phe Leu Ala Gln Thr Val Ala
1
5 10 15
ggt
ctg acg gct gcc caa tgg cgc agc caa tcg atc tac ttc ctc atg
96
Gly
Leu Thr Ala Ala Gln Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Met
20 25 30
act
gat cgg ttt ggt cga acc gac aag tcc gtg act gcc cca tgc aac
144
Thr
Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Lys Ser Val Thr Ala Pro Cys Asn
35 40 45
aca aat gac cga gtaagttctc cccccttttt cgcgtcgggg ggtggttcaa 196
Thr Asn Asp Arg 50
aacttttgtc gtctgtggta ctgattgaat tctccaag gta tac tgt ggt gga act 252
Val Tyr Cys Gly Gly Thr 55
tgg caa ggc att atc aat caa gtgagatgca tccgcagccc atggataagg 303
Trp Gln Gly Ile Ile Asn Gln 60 65
taaacaatct aggttctgac gtagcttcaa g ttg gat tac atc caa gga atg 355
Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met 70
gga ttt act gcg att tgg atc act cca gtc aca gag cag ctc cct caa 403
Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Thr Pro Val Thr Glu Gln Leu Pro Gln 75 80 85
gat act ggg gac ggt gaa gca tac cac gga tat tgg caa cag gaa at 450
Asp Thr Gly Asp Gly Glu Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Glu Ile 90 95 100
gtatatgcat cttccaactt cgccccaaat cctctctgac aaggcgatac ag a tac 506
Tyr
105
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aat gtc aac aac aac tac ggc act gct gcc gat ctc aag gct ctt tcg 554
Asn Val Asn Asn Asn Tyr Gly Thr Ala Ala Asp Leu Lys Ala Leu Ser 110 115 120
caa gcc ctt cac agt cgt gga atg tac ctc atg gtt gat gtt gtc gcg 602
Gln Ala Leu His Ser Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala 125 130 135
aac cac atg gtgacttggc tctctctacg ggtgaaaacg agcaggcttc 651
Asn His Met 140
taactttttc ggtctccag ggc tac gcg ggg gcc gga aac acc gtc gac tac 703

Gly Tyr Ala Gly Ala Gly Asn Thr Val Asp Tyr 145 150
agt
gtg ttc aag cca ttc agc tcc tct tcg tac ttc cac ccg tat tgt
751
Ser
Val Phe Lys Pro Phe Ser Ser Ser Ser Tyr Phe His Pro Tyr Cys
155 160 165
ttg
atc agc gat tac tca aat cag aca aat gtc gag gac tgt tgg ctt
799
Leu
Ile Ser Asp Tyr Ser Asn Gln Thr Asn Val Glu Asp Cys Trp
Leu
170 175 180
ggg
gac acc acc gtc tca ctc ccc gat ctt gat acc act ctt tct tcc
847
Gly
Asp Thr Thr Val Ser Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Leu Ser Ser
185 190 195
gtg
cag acg atc tgg tat aat tgg gtc agt gac cta gtt tca aac tat
895
Val
Gln Thr Ile Trp Tyr Asn Trp Val Ser Asp Leu Val Ser Asn Tyr
200
205 210 215
tcc
a gtgagtatga cctgaaaaga ggccgtgaat tcattcagca aagcctgaca
949
Ser
ttctgtaact ag tc gac ggt ctt cgg atc gat act gtc aag cac gtt caa 999

Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln 220 225
aag tca ttc tgg cct ggc tat cag agt gct gct ggt gtc tac tgt gtt 1047

Lys Ser Phe Trp Pro Gly Tyr Gln Ser Ala Ala Gly Val Tyr Cys Val

230 235 240 245
gga gag gtc ttc agt ggt gat ccg gct tac act tgc cct tat caa aac
1095
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Gly Glu Val Phe Ser Gly Asp Pro Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn 250 255 260
tac ctt gat ggg gtt ttg aat tat cca at gtaagccgca tctcatcaat 1144
Tyr Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile 265 270
tcgctggata caatctgacc agacgcag c tat tac caa tta ctc ggc gca ttt 1197
Tyr Tyr Gln Leu Leu Gly Ala Phe 275
aaa tca
acc agt gga agc atc agc agc ctt tac aac atg atc aac tct
1245 Lys Ser
Thr Ser Gly Ser Ile Ser Ser Leu Tyr Asn Met Ile Asn Ser
280
285 290 295
gtt gcg 1293
tcc gac tgt gct gac cca acc ctg ctg ggt aac ttt att gaa
Val Ala
Ser Asp Cys Ala Asp Pro Thr Leu Leu Gly Asn Phe Ile Glu
300 305 310
aac cat
gat aac cca cgc ttt gct tc gtaagttggg atttttgcct
1339 Asn His
Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser
315
tgcgtgtctg aactgagctc atccgcaaaa tgaag g tac aca agc gac tac tcg 1393
Tyr Thr Ser Asp Tyr Ser 325
caa gcg 1441
aaa aat gtc atc tcg ttc att ttc ttg tct gat ggc att ccg
Gln Ala
Lys Asn Val Ile Ser Phe Ile Phe Leu Ser Asp Gly Ile Pro
330 335 340
atc gtc 1489
tat gcc gga cag gaa cag cac tac agt ggc ggt aac gac cct
Ile Val
Tyr Ala Gly Gln Glu Gln His Tyr Ser Gly Gly Asn Asp Pro
345 350 355
gct aac 1537
cgt gaa gcg act tgg ctt tcc gga tac tca aag aac gct caa
Ala Asn
Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr Ser Lys Asn Ala Gln
360
365 370
ctg tac 1585
caa cac att gct tcg acg aac aaa atc cgc agt ctt gcg att
Leu Tyr
Gln His Ile Ala Ser Thr Asn Lys Ile Arg Ser Leu Ala Ile
375
380 385 390
tca aag
gat gcc aac tac atc act tcc aag gtgtgtgaat g gagtgcaac
1635 Ser Lys
Asp Ala Asn Tyr Ile Thr Ser Lys
395 400
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ttctcttttc ttgcaaagag aaaataaagg gctggaaaaa gctaatttga cggacatag 1694
aac
aat gct ttc tac act gac agt aac acc atc gcc atg aag aaa gga
1742
Asn
Asn
Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Lys Lys Gly
405 410 415
tcc
tcc
gga tcg cag gtc gtg aca gtt ctc tca aac cgt ggc tcg tca
1790
Ser
Ser
Gly Ser Gln Val Val Thr Val Leu Ser Asn Arg Gly
Ser
Ser
420 425 430
ggt 1838
agc tcg tac act ttg agt ctc agc ggc agc ggc tat gcg gct ggc
Gly
Ser Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Ala Ala
Gly
435 440 445
acc
aag ctg gtg gaa atg tac acc tgc acc gct gtt acc gtt gat tcg
1886
Thr
Lys Leu Val Glu Met Tyr Thr Cys Thr Ala Val Thr Val Asp Ser
450 455 460
aat 1934
ggc aac atc gca gtt tcc atg acc tct ggg ctg cct cga gtg ttt
Asn
Gly Asn Ile Ala Val Ser Met Thr Ser Gly Leu Pro Arg Val Phe
465
470 475 480
atg 1982
ctg gcc tcc tct gca tgc tct ctt tgc agt tcc gcg tgc tcc gca
Met
Leu Ala Ser Ser Ala Cys Ser Leu Cys Ser Ser Ala Cys Ser Ala
485 490 495
act
gca acc acg ctc aag act acg acc gct acg gcg acc agc tgc acc
2030 Thr
Ala Thr Thr Leu Lys Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ser Cys Thr
500 505 510
caa
gcc acc gct ctg cct gtt ctg ttt aaa gat aca gtg acc act tct
2078 Gln
Ala Thr Ala Leu Pro Val Leu Phe Lys Asp Thr Val Thr Thr Ser
515 520 525
tac
ggt cag agc gtc tat ctc gcc ggc tcg atc agt cag ctc ggt aac
2126
Tyr
Gly Gln Ser Val Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asn
530 535 540
tgg 2174
aac gcc gct aat gct gtt gcg ttg tcc gct gat aag tac aca tca
Trp
Asn Ala Ala Asn Ala Val Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser
545
550 555 560
tcc
aat ccc tta tgg tac gca act gtg acg ctg ccc gtg gga act tcg
2222
Ser
Asn Pro Leu Trp Tyr Ala Thr Val Thr Leu Pro Val Gly Thr
Ser
ttc cag 2270 tac aag ttc atc aaa aag acg agc ggc tct ggc tcg gtc act
5
Phe Gln Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Thr Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr
580 585 590
tgg gag 2318 agc gac ccc aac cgg tcg tac aca gtc ccc acc gga tgc gtg
10
Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Thr Gly Cys Val
595 600 605
ggc tct 2354 acg gcc act gtc act gct acg tgg agg tag
15
Gly Ser Thr Ala Thr Val Thr Ala Thr Trp Arg
610 615
<210> 4
20
<211> 619
<212> PRT
<213> Penicilli ium o axalicum
<4 0 0> 4
25
Met Lys Phe Leu Gly Leu Ala Ala Leu Phe Leu Ala Gln Thr Val Ala
1 5 10 15
30
Gly Leu Thr Ala Ala Gln Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Met
20 25 30
Thr Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Lys Ser Val Thr Ala Pro Cys Asn
35
35 40 45
Thr Asn Asp Arg Val Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly Ile Ile Asn
50 55 60
40
Gln Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Thr
65 70 75 80
45
Pro Val Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Gly Asp Gly Glu Ala Tyr
85 90 95
50
His Gly Tyr Trp Gln Gln Glu Ile Tyr Asn Val Asn Asn Asn Tyr Gly
100 105 110
Thr Ala Ala Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Ala Leu His Ser Arg Gly
55
115 120 125
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly Tyr Ala Gly 130 135 140

Ala Gly Asn Thr Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe Ser Ser Ser 145 150 155 160

Ser Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Ser Asp Tyr Ser Asn Gln Thr 165 170 175

Asn Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Thr Thr Val Ser Leu Pro Asp 180 185 190

Leu Asp Thr Thr Leu Ser Ser Val Gln Thr Ile Trp Tyr Asn Trp Val 195 200 205

Ser Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Thr 210 215 220

Val Lys His Val Gln Lys Ser Phe Trp Pro Gly Tyr Gln Ser Ala Ala 225 230 235 240

Gly Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Phe Ser Gly Asp Pro Ala Tyr Thr 245 250 255

Cys Pro Tyr Gln Asn Tyr Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr 260 265 270

Tyr Gln Leu Leu Gly Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser Ile Ser Ser 275 280 285

Leu Tyr Asn Met Ile Asn Ser Val Ala Ser Asp Cys Ala Asp Pro Thr 290 295 300

Leu Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser 305 310 315 320

Tyr Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Ile Ser Phe Ile Phe 325 330 335

Leu Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Gln Glu Gln His Tyr 340 345 350
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55

Ser Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly 355 360 365

Tyr Ser Lys Asn Ala Gln Leu Tyr Gln His Ile Ala Ser Thr Asn Lys 370 375 380

Ile Arg Ser Leu Ala Ile Ser Lys Asp Ala Asn Tyr Ile Thr Ser Lys 385 390 395 400

Asn Asn Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Lys Lys Gly 405 410 415

Ser Ser Gly Ser Gln Val Val Thr Val Leu Ser Asn Arg Gly Ser Ser 420 425 430

Gly Ser Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Gly 435 440 445

Thr Lys Leu Val Glu Met Tyr Thr Cys Thr Ala Val Thr Val Asp Ser 450 455 460

Asn Gly Asn Ile Ala Val Ser Met Thr Ser Gly Leu Pro Arg Val Phe 465 470 475 480

Met Leu Ala Ser Ser Ala Cys Ser Leu Cys Ser Ser Ala Cys Ser Ala 485 490 495

Thr Ala Thr Thr Leu Lys Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ser Cys Thr 500 505 510

Gln Ala Thr Ala Leu Pro Val Leu Phe Lys Asp Thr Val Thr Thr Ser 515 520 525

Tyr Gly Gln Ser Val Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asn 530 535 540

Trp Asn Ala Ala Asn Ala Val Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser 545 550 555 560

Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Ala Thr Val Thr Leu Pro Val Gly Thr Ser 565 570 575
Phe Gln Tyr Lys Phe Ile Lys Lys Thr Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Trp
Glu Ser Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Thr Gly Cys Val
595 600 605
Gly
Ser Thr Ala Thr Val Thr Ala Thr Trp Arg
610 615
<210>
5
<211>
44
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<2 2 0>
<223>
Constructo sintetico
<400>
5
attattcgaa ggatccacca tgttcttcac atcctcggtc tgct 44
<210>
6
<211>
39
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<2 2 0>
<223>
Constructo sintetico
<400>
6
ggtgctgatg gaattcggaa taaccacaca atccgctgc
39
<210>
7
<211>
48
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<2 2 0>
<223>
Constructo sintetico
<400>
7
attattcgaa ggatccacca tgaaattcct tggactagct gctttgtt 48
<210>
8
<211>
39
<212>
ADN
<213>
Secuencia artificial
<2 2 0>
<223>
Constructo sintetico
<400> 8
ggtgctgatg gaattccctc cacgtagcag tgacagtgg 39 5

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Polipeptido aislado con actividad de alfa-amilasa, seleccionado del grupo que consiste en:
    un polipeptido con al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % de identidad de secuencia con amino acidos 21-619 de la SEC ID N.°: 4; donde % identidad se determina utilizando el programa Needle del paquete EMBOSS con una penalizacion por apertura de espacio de 10, una penalizacion por extension de espacio de 0,5, y el EBLOSUM62 por el calculo: (residuos identicos x 100)/(longitud de alineamiento - numero total de espacios en el alineamiento).
  2. 2. Polipeptido, segun la reivindicacion 1, que comprende o consiste en la SEC ID N.°: 4 o aminoacidos 21-619 de la SEC ID N.°: 4.
  3. 3. Polipeptido aislado que comprende un dominio catalftico con al menos 95 % de identidad de secuencia con amino acidos 21 a 493 de la SEC ID N.°: 4.
  4. 4. Polinucleotido aislado que codifica el polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  5. 5. Metodo para producir el polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende:
    (a) cultivo de una celula, que en su forma tipo salvaje produce el polipeptido, bajo condiciones convenientes para la produccion del polipeptido; y
    (b) recuperacion del polipeptido.
  6. 6. Metodo para producir un polipeptido con actividad de alfa-amilasa, que comprende:
    (a) cultivo de una celula huesped recombinante que comprende el polinucleotido, segun la reivindicacion 4, bajo condiciones convenientes para la produccion del polipeptido; y opcionalmente
    (b) recuperacion del polipeptido.
  7. 7. Formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular que comprende el polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  8. 8. Composicion que comprende el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y una enzima seleccionada del grupo que consiste en: una alfa-amilasa fungica EC 3.2.1.1, una beta-amilasa EC 3.2.1.2, una glucoamilasa EC 3.2.1.3, unas pululanasas EC 3.2.1.41, una fitasa EC 3.1.2.28 y una proteasa EC 3.4..
  9. 9. Uso del polipeptido, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, la formulacion de caldo completo o composicion de cultivo celular, segun la reivindicacion 7 o la composicion segun la reivindicacion 8, para la conversion de almidon, modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa, licuefaccion de almidon y/o sacarificacion, lavado textil, desencolado textil, destilacion, produccion de etanol y/o coccion.
  10. 10. Metodo para la conversion de almidon, modificacion de almidon en el papel e industria de pulpa, licuefaccion y/o sacarificacion de almidon, lavado textil, desencolado textil, destilacion, produccion de etanol y/o coccion, donde se anade un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  11. 11. Celula huesped recombinante, que comprende el polinucleotido segun la reivindicacion 4.
  12. 12. Celula huesped recombinante, segun la reivindicacion 11, donde la celula huesped es una celula de levadura.
  13. 13. Celula huesped recombinante, segun la reivindicacion 12, donde la levadura es una Saccharomyce cerevisiae.
ES12836934.5T 2011-09-30 2012-09-29 Polipéptidos con actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos Active ES2632011T3 (es)

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