RU2232818C1 - Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis - Google Patents
Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2232818C1 RU2232818C1 RU2002129866/13A RU2002129866A RU2232818C1 RU 2232818 C1 RU2232818 C1 RU 2232818C1 RU 2002129866/13 A RU2002129866/13 A RU 2002129866/13A RU 2002129866 A RU2002129866 A RU 2002129866A RU 2232818 C1 RU2232818 C1 RU 2232818C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- chromosomal dna
- bacterial cells
- isolation
- yersinia pestis
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток. Культуру клеток yersinia pestis выращивают на твердой питательной среде, инактивируют хлороформом и смывают с поверхности среды. В полученную суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубируют при температуре +37°С в течение 1 часа. Затем ДНК очищают от клеточного детрита и проводят ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием. Способ позволяет получить высокоочищенную хромосомную ДНК возбудителя чумы в препаративном количестве и с длительным сроком хранения.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генно-инженерных работах для создания новых профилактических и диагностических препаратов, получения биологически активных веществ.
Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании лизоцима, додецил сульфат натрия, в качестве индукторов лизиса клеточной стенки с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом (Marmur J.A. Procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms// J. Mol. Biol. - 1961. - Vol. 3. - P.208-218).
Данный метод трудоемок в исполнении и не позволяет разделять плазмидную и хромосомную ДНК, применяются токсичные материалы.
Известен способ выделения плазмидной ДНК (Birnboim С.С., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA// Nucleic. Acid. Res. – 1979 - V. 7 - P.1513), заключающийся в лизисе клеток с применением лизоцима, додецил сульфат натрия, NaOH, концентрирование ДНК производят с использованием ПЭГ - 6000, с последующим помещением супернатанта в ледяную баню на 1,5 ч и его центрифугированием. Выделение плазмидной ДНК осуществляют центрифугированием при 40000 об/мин в течение 48 ч.
Однако данный метод авторы рекомендуют лишь для выделения плазмидной ДНК.
Известен метод выделения ДНК, основанный на использовании для лизиса многокомпонентных буферных растворов (Авторское свидетельство СССР №1439124, МКИ С 12 N 15/00). При осуществлении данного способа выращенную на двух флаконах культуру помещают между двумя слоями лизирующей смеси, имеющей состав: бридж-58 1%, дезоксихолат натрия 0,5%, додецил сульфат натрия 0,1%, ЭДТА 10 мМ, лизоцим 5 мг/мл, бромистый этидий 0,5 мг/мл, трис 50 мМ. Содержимое выдерживают при комнатной температуре в течение 3 ч. Этим достигается лизис, при котором ДНК освобождается из клетки и отделяется от прочих продуктов деструкции последующим ультрацентрифугированием при 40000 об/мин и температуре 10°С в течение 40 ч в градиенте плотности хлористого цезия. После чего отобранную ДНК освобождают по общепринятой методике от бромистого этидия (Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. - М.: Мир, 1984. - 480 С.).
Однако процесс лизиса происходит с использованием многокомпонентной лизирующей смеси и одномоментная загрузка всех компонентов не способствуют глубокому лизису, так как контакт бактерий с лизирующим раствором происходит на границе их раздела, что увеличивает время подготовки к выделению ДНК.
Известен метод выделения плазмидной ДНК с помощью саркозила (Федотов Э.Ф., Куличенко А.Н., Попов Ю.А. Быстрый метод получения очищенной плазмидной ДНК чумного микроба. // Лабораторная диагностика и генетика вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Труды противочумных учреждений СССР. Саратов, 1990, С.95-98). Метод основан на использовании лизоцима и саркозила как основного лизирующего агента в течение 30 мин при +50°С и центрифугировании лизата при 80 000 об/мин в течение 5 ч. ДНК собирают, экстрагируют бромистый этидий изоамиловым спиртом и переосаждают этанолом.
Однако саркозил не обладает литическим действием в отношении клеток ряда штаммов возбудителя чумы и других энтеробактерий, выделяется небольшое количество ДНК. Способ пригоден для работы только с авирулентными штаммами бактерий, так как отсутствует этап инактивации культуры и необходимо применение лизоцима, что делает процесс лизиса клеток более трудоемким.
Наиболее близким техническим решением является способ выделения плазмидной ДНК (Фурсов В.В., Попов Ю.А. Простой и эффективный метод обнаружения и выделения плазмид из клеток чумного микроба. //Микробиология, генетика и иммунология чумы и холеры. Труды противочумных учреждений СССР, Саратов, 1983, С.31-34).
Выращенную на жидкой питательной среде культуру осаждают центрифугированием, отмывают трис-сахарозой, затем полученный осадок суспендируют в указанном растворе с последовательным добавлением компонентов лизирующего раствора, включающего лизоцим, ЭДТА, тритон Х-100 и инкубируют при +4°С в течение 16 ч, детрит осаждают центрифугированием в течение 1 ч при 20000 об/мин. Затем осуществляют очистку ДНК от компонентов клетки и выделяют плазмидную ДНК в градиенте плотности хлористого цезия с добавлением этидиума бромида, с последующим отбором ДНК и освобождением от этидиума бромида.
В описанном способе выделения ДНК используют многокомпонентный лизирующий раствор, что делает этот процесс трудоемким, длительным, дорогостоящим, а также отсутствует этап инактивации культуры, что не позволяет работать с вирулентными штаммами патогенных микроорганизмов.
Изобретение решает задачу выделения хромосомной ДНК высокой степени очистки из бактериальных клеток вирулентных штаммов.
Сущность изобретения заключается в том, что культуру, выращенную на твердой питательной среде, инактивируют хлороформом, смывают с поверхности среды и в суспензию клеток добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1%, затем инкубируют при температуре +37°С в течение 1 ч, детрит осаждают центрифугированием в течение 30 мин при 28000 g.
Предлагаемый способ выделения хромосомной ДНК осуществляют следующим образом: культуру бактериальных клеток, выращенную во флаконе с 75 мл скошенного агара Хоттингера (рН 7,2), инактивируют хлороформом. Затем культуру смывают 5% раствором сахарозы в TES буфере, добавляют лизирующее вещество тритон Х-100 до концентрации 1% и инкубируют в течение 1 ч при +37°С. Осаждение детрита осуществляют центрифугированием при 28000 g в течение 30 мин. В супернатант добавляют NaCl и этанол, после инкубации ДНК осаждают центрифугированием при 15000 g в течение 30 мин, суспендируют в TES-буфере и добавляют хлористый цезий и бромистый этидий. Белки из раствора удаляют центрифугированием при 28000 g в течение 40 мин. Жидкую фазу, содержащую ДНК, центрифугируют при 250000 g в течение 20 часов с последующим отбором хромосомной ДНК. Отобранную ДНК по общепринятой методике освобождают от бромистого этидия.
Заявляемый способ подробно описан в примерах.
Пример 1. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма Yersinia pestis 358/12.
Клетки исследуемого штамма Y. pestis высевают бактериальной петлей №2 на чашку с плотной агаровой cредой LB (рН 7,2) или агара Хоттингера (рН 7,2) и выращивают при температуре 28°С. После 24-48 ч инкубации культуральную массу бактерий петлей №2 высевают во флакон с 75 мл скошенного агара LB (рН 7,2) или агара Хоттингера (рН 7,2). Спустя 24-48 ч инкубации при температуре 28°С во флакон добавляют 0,5 мл хлороформа и дополнительно инкубируют 45-60 мин при комнатной температуре для инактивации культуры. Культуру смывают 5-ю мл 5%-ного раствора сахарозы в TES (состав TES-буфера: трис(гидроксиметиламинометан) 5 мМ, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,5 мМ, NaCl 5 мМ, рН 8,0) с использованием стеклянного шпателя, переносят пастеровской пипеткой в герметично закрывающиеся центрифужные стаканы ротора Beckman JA-20 (V=40 мл) центрифуги Beckman J2-21, добавляют тритон Х-100 до концентрации 1% и лизируют в течение 1 ч при температуре +37°С.
Осаждение детрита осуществляют при 28000 g (12000 об/мин) в течение 30 мин. Супернатант отбирают, переносят в центрифужные стаканы ротора Beckman JA-14 (V=250 мл) центрифуги Beckman J2 - 21, добавляют навеску NaCl до конечной концентрации 1 М и два с половиной объема 96° этилового спирта (или один объем 2-изопропанола). Инкубируют в течение ночи при температуре +4°С. После инкубации содержимое центрифугируют при 15000g (10000 об/мин) в течение 30 мин. Осадок суспендируют в TES и переносят в центрифужные стаканы ротора Beckman JA-20 с добавлением навески хлористого цезия (1,1 мг/мл) и 1/10 объема бромистого этидия (5 мг/мл). Флотацию белков производят при 28000 g (10000 об/мин) в течение 40 мин.
Жидкую фазу переносят в пробирки для ультрацентрифугирования ротора Beckman 70,1 Ti (3,5 мл) центрифуги Beckman TL 100 и центрифугируют при 250000 g (60000 об/мин) в течение 20 ч при температуре +4°С. Отбор верхней полосы осуществляют при длинноволновом ультрафиолетовом свете (300-350 нм) в центрифужные пробирки ротора Beckman JA-21 (10 мл) центрифуги Beckman J2-21 стандартным способом через иглу (Маниатис Т. с соавт., 1984). После отбора содержимое разводят 1:1 TES и смешивают с одним объемом 2-изопропанола, оставляют в ночь при температуре -20°С. Последующее центрифугирование проводят при 25000 g (10000 об/мин) в течение 15 мин. Растворение осадка ДНК и переосаждение с этанолом осуществляют по стандартной методике (Маниатис Т. с соавт., 1984).
Количество хромосомной ДНК, выделенной из культуры штамма Y. pestis 358/12, выращенного на 75 мл скошенного агара, составляет до 130 мкг.
Пример 2. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма Yersinia pseudotuberculosis 414.
Выращивание культуры и выделение ДНК проводят в тех же условиях, что и в примере 1. Выход ДНК из одинакового количества биомассы соответствует примеру 1 и составляет 130 мкг.
Пример 3. Выделение хромосомной ДНК из клеток штамма Escherichia coli НВ 101 (pBR322).
Культуру выращивают при температуре +37°С. Выделение ДНК проводят аналогично примеру 1. Выход ДНК составляет 195 мкг, что в 1,5 раза больше, чем в примере 1, так как количество получаемой биомассы клеток Escherichia coli больше.
Использование в качестве лизирующего вещества тритона Х-100 позволяет обойтись без литических ферментов, тем самым сокращается число операций с клеточным лизатом. Это способствует уменьшению возможности гидродинамического повреждения нуклеиновых кислот, а оптимально подобранные температурные условия и концентрация лизирующего вещества обеспечивают мягкий и полный лизис клеток бактерий. Предлагаемый для осаждения клеточного дебриса режим центрифугирования 28000 g в течение 30 мин обеспечивает осветление лизата при сокращении времени данной операции.
Следует отметить эффективность заявляемого способа, заключающегося в сокращении времени выделения хромосомной ДНК, увеличении выхода конечного продукта, а также его экономичность, достигаемая за счет использования однокомпонентного лизирующего раствора, позволяющего эффективно осуществлять лизис клеток. Из культуры, выращенной на 75 мл скошенного агара, выход целевого продукта составляет от 130 мкг до 195 мкг для различных микроорганизмов.
Предлагаемый способ выделения позволяет при соблюдении санитарных правил СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности" получать хромосомную ДНК высокого уровня очистки, пригодную для создания новых профилактических и диагностических препаратов, получения биологически активных веществ из клеток как авирулентных, так и вирулентных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной природы.
Таким образом, разработан эффективный, более экономичный способ выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток, позволяющий работать с патогенными микроорганизмами, получать высокоочищенную хромосомную ДНК, пригодную для создания новых профилактических и диагностических препаратов, получения биологически активных веществ.
Claims (1)
- Способ выделения хромосомной ДНК из бактериальных клеток возбудителя чумы Yersinia pestis, включающий выращивание культуры, лизис клеток, очистку ДНК от компонентов клетки и ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием с последующим удалением бромистого этидия, отличающийся тем, что культуру, выращенную на твердой питательной среде, инактивируют, смывают и в суспензию клеток добавляют лизирующее вещество Тритон Х-100 до концентрации 1%, затем инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002129866/13A RU2232818C1 (ru) | 2002-11-06 | 2002-11-06 | Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002129866/13A RU2232818C1 (ru) | 2002-11-06 | 2002-11-06 | Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002129866A RU2002129866A (ru) | 2004-06-10 |
RU2232818C1 true RU2232818C1 (ru) | 2004-07-20 |
Family
ID=33413211
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002129866/13A RU2232818C1 (ru) | 2002-11-06 | 2002-11-06 | Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2232818C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2619051C2 (ru) * | 2011-11-25 | 2017-05-11 | Новозимс А/С | Полипептиды с лизоцимной активностью и полинуклеотиды, кодирующие их |
-
2002
- 2002-11-06 RU RU2002129866/13A patent/RU2232818C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Р. ДЕВИС И ДР. Генетика бактерий. - М.: Мир, 1984, с.88. ФУРСОВ В.В. и др. Простой и эффективный метод обнаружения и выделения плазмид из клеток чумного микроба. МИКРОБИЛОГИЯ, ГЕНЕТИКА И ИММУНОЛОГИЯ ЧУМЫ И ХОЛЕРЫ, ТРУДЫ ПРОТИВОЧУМНЫХ УЧРЕЖДЕНИЙ СССР. - Саратов, 1983, с.31-34. * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2619051C2 (ru) * | 2011-11-25 | 2017-05-11 | Новозимс А/С | Полипептиды с лизоцимной активностью и полинуклеотиды, кодирующие их |
US9663775B2 (en) | 2011-11-25 | 2017-05-30 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
US9701952B2 (en) | 2011-11-25 | 2017-07-11 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
US10039300B2 (en) | 2011-11-25 | 2018-08-07 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and compositions comprising it |
US10119130B2 (en) | 2011-11-25 | 2018-11-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and compositions comprising it |
US10829750B2 (en) | 2011-11-25 | 2020-11-10 | Novozymes A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
US10829751B2 (en) | 2011-11-25 | 2020-11-10 | Novozyems A/S | Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Doy et al. | Biological and molecular evidence for the transgenosis of genes from bacteria to plant cells | |
CN107312746B (zh) | 一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法 | |
US4348477A (en) | Method for preparing a recombinant DNA phage | |
Tabares et al. | Anti-protease and immunomodulatory activities of bacteria associated with Caribbean sponges | |
ES2367535T3 (es) | Minicélulas bacterianas purificadas. | |
US4348478A (en) | Method for preparation of a recombinant DNA phage | |
CN111529701A (zh) | 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法 | |
EP2307575A1 (en) | Unprocessed rolling circle amplification product | |
CN1210541A (zh) | 制备提纯的核酸的方法及其应用 | |
KR910001807B1 (ko) | 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법 | |
RU2232818C1 (ru) | Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis | |
Sellers et al. | Further studies of infectious DNA extracted from mycobacteriophages | |
Yan et al. | Modified DMEM xenic culture medium for propagation, isolation and maintenance of Balantioides coli | |
JP7317464B2 (ja) | マイコプラズマの有無の検査方法 | |
Stuy | STUDIES ON THE RADIATION INACTIVATION OF MICROORGANISMS: V. Deoxyribonucleic Acid Metabolism in Ultraviolet-Irradiated Haemophilus influenzae | |
US7935505B2 (en) | Plasmid DNA preparations and methods for producing same | |
Parida et al. | Isolation and identification of pathogenic bacteria from brackish waters of Chilika Lagoon, Odisha, India for pharmaceutical use | |
RU2324740C2 (ru) | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ТОКСИН-КОРЕГУЛИРУЕМЫХ ПИЛЕЙ АДГЕЗИИ И OmpU ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА | |
Reschke et al. | Transformation of Rochalimaea quintana, a member of the family Rickettsiaceae | |
Francki | Possible viroid origin: encapsidated viroidlike RNA | |
SU1439124A1 (ru) | Способ выделени бактериальной ДНК | |
Coelho-Rocha et al. | Main features of DNA-based vectors for use in lactic acid bacteria and update protocols | |
Pennock | Selection of motility mutants | |
Pajunen et al. | Construction and screening of a transposon insertion library of Yersinia enterocolitica (YeO3-R1) | |
Tammisto et al. | Purification of Borrelia burgdorferi Outer Membrane Vesicles |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041107 |