KR910001807B1

KR910001807B1 - 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법

Info

Publication number: KR910001807B1
Application number: KR8204582A
Authority: KR
Inventors: 도모유끼 사꼬; 사에꼬 사와끼; 도시조오 사꾸라이; 마사히꼬 무다이; 이사무 곤도오
Original assignee: 마쓰조노 히사미; 가부시기가이샤 야구루도 혼샤
Priority date: 1981-10-16
Filing date: 1982-10-12
Publication date: 1991-03-26
Also published as: DK164001C; DK460182A; EP0077664A3; JPS5867181A; EP0077664B1; CA1206109A; DE3280175D1; EP0077664A2; US4532211A; KR840002029A; JPH0478276B2; DK164001B

Abstract

내용 없음.

Description

스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법

본 발명은 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법에 관한 것이다. 스태필로키나아제(이하, SAK라고 기술함)라 함은, 스태필로콕커스.아우레우스(이하, S.아우레우스라고 기술함)가 생산하는 섬유소 용해효소로서, 혈액속의 플라즈미노오겐을 플라즈민으로 바꾸어놓을 수 있는 기능을 갖고 있다.

이 플라즈민이 피브린에 작용하여 이를 용해하는 것이다. 같은 작용의 기능을 갖고 있는 것으로 인체의뇨속에 존재하는 우로키나아제라거나, 연쇄구군이 생산하는 스트렙토키나아제가 알려져 있으나, 이들은 어느 것이나 혈액응고방지제, 혈전치료제등의 이른바 선용제(線溶劑)로서 의료에 제공할 수 있는 것이다. 그 때문에 이들 물질의 생산방법과 추출, 정제방법이 여러 가지로 검토되고 있다. SAK의 생산에 관하여는 이제까지 SAK 생산능은 S.아우레우스를 숙주로 하는 용원(溶原)파아지의 용원화에 따라 숙주에 부여되는(이것을 돈원변환이라 함) 형질이라는 것이 알려져 있으며, 종래에는 S.아우레우스중에서 SAK 생산능이 있는 그루(株)를 선택하던가, 그렇지 않으면 SAK를 용원변환하는 파아지로 SAK를 생산하지 못하는 S 아우레우스 그루를 용원화하여 그들 그루를 배양함에 따라 그 배양액에서 SAK를 채취하는 방법이 널리 실시되고있다.

그러나, S.아우레우스는 강한 병원성이 있는 세균이며, 그 취급에 있어서 극히 신중한 배려가 필요하기 때문에 그와 같은 방법은 본래 공업적인 SAK의 생산방법으로는 적당하지 않을뿐더러 SAK의 수득량을 높이기 위하여는 장시간의 배양이 필요하기 때문에 그런 의미에서도 공업적 방법으로는 적성 (適性)이 결여하고 있다 할 것이다.

본 발명자등은 안정성, 효율성이라는 면에서, SAK를 공업적으로 생산할 수 있는 적절한 방법에 대하여 꾸준히 연구하고, SAK 생산정보를 보유한 유전자가 파아지 DNA 위에 존재한다는 사실을 규명하고, S.아우레우스의 용원파아지 DNA의 단편(斷片)을 벡터 (매개자)에 실어 대장균에 도입시키는 방법을 성공적으로 이룩하였다.

본 발명은 그와 같은 성과에 따른 것이며, 따라서 본 발명은 SAK 생산유전자를 함유하는 새로운 대장균으로 변환시키고 그 대장균의 배양에 의한 SAK 제조법을 제공하는 것이다.

다음에 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 관한 새로운 대장균은 하기 (1)- (6)의 공정에 따라 변환시킬 수 있다.

(1) DNA 공여체(供與體)인 S.아우레우스의 용원파아지 DNA를 제한효소로 절단한다.

(2) SAK 생산 유전정보가 있는 DNA 단편을 드러낸다(이 공정은 생략할 수도 있다).

(3) 벡터 DNA를 제한효소로 개열(開裂)하게 한다.

(4) 벡터 DNA의 개열부위에 (1) 또는 (2)에서 얻은 DNA 단편을 삽입한다.

(5) 이 재조합(recombinent) DNA를 숙주인 대장균에 도입한다.

(6) (5)에 따라 SAK 생산능을 갖게된 대장균을 선택 분리한다.

상기한 DNA 공여체의 용원파아지는 SAK 생산능을 가지고 있는 S.아우레우스 용원그루에서 분리된 용원파아지이고, 또한 그 파아지가 용원변환능을 갖고 있는 파아지라면 모두 사용할 수 있다.

그 예로서는, 42D. L42E. 77(문헌 : Mason, R.E. and Allen, W.E. (1975) Can. J Microbiol, 21,1113-1116), Pψl, Pψ2, Tψ-42D, Pψ-406(문헌: Kondo. 1. and Fujise, k (1977) Infect. Immun.18, 226-272) Rψ19, SψC (문헌 . 곤도오 이사무찌등(1980) 도꾜 지께이까이 의과대학 잡지 95, 1203-1206 등이 있다. 용원파아지 DNA의 조제(調製)에 사용되는 수단은 상용수단(賞用手段)에 따른다.

즉, 용원파아지를 그 숙주군인 S. 아우레우스에 감염시켜서 이 감염군을 배양한다(이 방법은 예컨데 문헌 : Blair, J.E. and Williams, R E.O (1961) Bullm W.H.O. 24, 771-784에 기재되어 있다). 이에 따라서 파아지는 배지속에 나오므로(균은 용균(溶菌)한다), 이 파지를 적당한 방법 (예컨데, 염화세습 평형밀도 구배원심법 (平衡密度勾配遠心法), 문헌 : Rosenblum, E.D. and Tyrone, S. (1964) J. Bacteriol, 88, 1737-1742)으로 모으고, 이 파아지로부터 다시금 공지의 방법 (예를 들면 퍼놀추출법등)에 따라 파아지 DNA를 추출할 수 있다.

용원파아지 DNA에 적당한 제한효소에 의한 절단은 다음과 같이 하여 실시한다.

파아지 DNA에 적당한 제한효소를 첨가하여 적당한 반응조건에서 반응을 함에 따라 파아지 DNA는 첨가된 제한효소에 따라 여러가지 단편으로 절단된다.

이 파아지 DNA의 절단에 사용할 수 있는 제한효소는, 1) 파아지 DNA을 절단할 수 있는 것이며, 또한 2) SAK 생산에 관한 유전정보를 담당하는 DNA 부분을 절단하지 않는것이 아니면 안된다.

여기에 적용하는 제한효소로서는, Hind III, PstI, AccI, ClaI, AvaII, EcoRI, HpaI, HpaII, HindII,SstI, BstEII, SstII, XhoI, BclI, BglII, PvuII, XorII, KpnI, SmaI, XbaI 등이 있다.

다음에, 파아지 DNA를 제한효소로 절단한 절단무리속에서 SAK 생산정보를 포함하는 DNA 단편을 각종 공지의 방법 (예컨데, 아가로우즈겔 전기영동법)에 따라 분리한다.

그러기 위하여는 파아지 DNA의 단편 무리중에서 어느단편이 SAK 생산정보를 가지고 있는지를 사전에 판정하여 두지 않으면 아니된다. 이 판정방법에 대하여는 나중에 설명한다.

상기한 DNA 단편의 분리조작은 경우에 따라 생략할 수도 있다.

한편, 벡터 DNA의 개열은, 벡터 DNA에 적당한 제한효소를 첨가하고 적당한 반응조건하에서 반응을 실시함으로서 벡터 DNA를 개열하게 할 수 있다.

벡터 DNA로서는 공지의 것을 사용할 수 있다. 그러는 것으로는 예컨데 Co1El, pMB9, pSC101, p15A 및 그 유도체(예컨데 pBR322, pACYC184 등)라거나 λ파아지로 연유하는 샤론벡터등이 있다.

다음에 벡터 DNA의 개 열부위에 상술한 DNA 단편을 삽입하여 안정시킬 수 있으나, 그 수단자체는 통상적인 방법에 의한 것이며, 사용한 파아지 DNA의 종류, 벡터 DNA의 종류 및 제한효소의 종류에 따라서 적당한 반응조건을 선택할 수 있다.

더우기, 벡터의 복제능(複製能)을 손상하지 않는한 상기한 파아지 DNA 단편을 삽입하는 방향 및 부위(部位)는 문제할 것 없다

이어 새로운 형질 DNA를 숙주인 대장균에 도입시킬 수 있으나 숙주인 대장균으로서는 대장균에 특이한 제한 수식계 (修飾系)중에서 제한능을 결손한 대장균 그루는 모두 사용할 수 있지만, SAK 생산 유전정보를 담당하는 DNA를 삽입하여 일단 수식(修飾)을 받은 플라즈미드는 제한능이 있는 대장균 그루에 대하여도 사용할 수 있다. 숙주인 대장균은 사용한 벡터의 종류에 따라서 한정되는 경우가 있다.

사용한 대장균 원주(原株)중의^r-k 라고 하는 것은 제한능을 결손한 그루를, 또한^m-k라고 하는 것은 수식능을 가지지 않은 그루를 뜻한다.

도입하는 수단자체는 공지의 방법 (예를 들면, Cameron 씨 등의 방법 : 문헌 Cameron, J. R.etal(1975)proc. Natl. Acad. SCi. U.S.A. 72 3416-3420)을 이용할 수 있다.

전술한 (2)의 공정을 실시하였을 경우에 있어서도 용원파아지의 SAK 생산 유전정보를 담당하는 DNA단편을 삽입하지 않는 경우가 있으며, 또 (2)의 공정을 생략하였을 경우에는 삽입하지 않는 경우 이외에도 SAK 생산능에 관한 것이 아닌 DNA 단편을 삽입하는 경우가 있다. 그 때문에 DNA 생산능을 가지게된 대장균을 선택 분리하는 것이 필요하다.

이 대장균을 신택 분리하려면, S.아우레우스에 대하여 사용되고 있는 공지의 방법 (예를 들면, 문헌 : Kondo, I and Fujise, K. (1977) Infect. Immun. 18, 226-272)을 사용할 수 있다.

즉, 이 방법에 따라 가열혈장(加熱血奬) 한천배양기를 작성하고 그위에 시험균을 스폿한 다음 일정기간 배양함에 따라 피브린 분해능을 관찰할 수 있다.

피브린 분해능을 가지고 있는 것은 집낙(集落)의 주변을 녹여서 투명한 조운(帶)이 만들어지므로 이 균만을 들어낼 수 있다.

그리하여 SAK 생산능이 있는 대장균을 분리하지만, SAK 생산능이 있는 대장균으로부터의 SAK 생산유전정보를 담당하는 DNA의 해석은 다음과 같이 하여 실시한다

즉, SAK 생산능이 있는 대장균에서 재조합 플라즈미드 또는 재조합 파아지를 들어내어 파아지 DNA의절단 및 벡터 DNA의 개열에 사용한 제한효소로서 이 재조합 플라즈미드 또는 재조합 파아지를 절단한다.이 절단된 DNA 단편의 분자량(즉, DNA로서의 길이)를 공지방법 (예칸데 아가로우즈겔 전기영동등)에 따라 측정함으로서 SAK 생산 유전정보를 담당하는 DNA 단편의 파아지 DNA 위에서의 위치를 알 수 있다.

해석 (解析)실험의 일예를 들면 다음과 같다.

실험예 : 파아지 DNA로서 SC를 사용하였을 경우, 1) 제한효소 PstI을 사용하여 절단하였을때 15.8kb, 2) 제한효소 HindIII을 사용하여 절단하였을때 4.9kb, 3) 제한효소 Hindlll 및 Avall을 사용하여 절단하였을때 2.Okb, 4) 제한효소 Avail 및 Accl을 사용하여 절단하였을때 1.3kb 부분에 SAK 생산 유전정보가 존재한다는 것을 판명하였다.

위에서 설명한 바와 같이 하여 얻을 수 있는 SAK 생산능이 있는 대장균은 그 균학적 성질은 본래의 대장균과 비교하여 볼때, SAK 생산능을 갖고 있는 사실 이외에 다른 것이 없다. 그 일반적인 균학적 성질은 후면의 별표와 같다(후기하는 실시 예에서 얻은 것을 예시).

본 발명에 따라 상기한 바와 같이 하여 얻은 새로운 대장균을 사용하여, 그 대장균을 배양하고 배양균체에 축적한 SAK를 채취하므로서 공업적인 SAK의 제조법을 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 SAK의 제조법은 상기한 바와 같이 하여 얻은 SAK 생산능이 있는 대장균을 통상적인 방법으로 배양하여 집균(集菌)한 다음 공지의 방법 (예를 들면, 문헌 Talmadge, K. etal(1980) ProcmNatl. Acad. Sei U.S.A. 77, 3369-3373)으로 페리플라즘의 분획(分劃)을 취득하여 실시할 수 있는 것으로, 이 페리플라즘의 분획에 SAK 활성의 대부분을 회수할 수 있다.

이 방법은 종래에 S.아우레우스로 실시하고 있는 배양 상청(上淸)을 모으는 방법과는 달라서 새롭고도 유효한 방법이다. SAK를 페리플라즘에서 채취하는 방법은 SAK를 대장균에 따라 생산시키므로서 비로소 가능하게 되었던 것이며, 본 발명 방법의 하나의 특징적 잇점을 이루는 것이다. 이렇게 하여 얻은 SAK 정제는 통상의 단백질의 정제, 예를 들면, 염석(鹽析), 겔여과, 흡착 크로마토그라피등의 방법에 따라 실시할 수 있다.

상기한 바와 같은 본 발명 방법으로 대장균을 사용하여 SAK를 생산하는 것이 가능하게 되었으나, 이와같이 대장균에 SAK를 생산하게 함에 따라서 종래의 기술인 S.아우레우스에 의한 경우와 달라서 안전상, 증식속도, 대량배양(대량생산)등의 놀랄만한 잇점을 가져오게 하였다. 뿐만 아니라 대장균의 경우에는 SAK가 페리플라즘에 축적하므로 종래법에 따라 S.아우레우스를 사용하여 상청획분(上淸劃分)으로부터 취득하는 경우에 비하여 100배 이상되는 고농도의 것을 얻을 수 있어서 세포전체를 파쇄(破碎)하여 추출하는 방법에 비하여 공잡(共雜)하는 단백질이 적으므로 그 분리정제가 용이하게 이루어질 수 있다고 하는 격별한 잇점이 있다.

상기의 페리플라즘에 축적하는 현상은 예컨데 나중에 개재하는 실시예 1에 따라 대장균, 에세리히어. 콜리K 12 C6OO^r-k^m-k(pSAK 361)를 200m1의 L-발효액에서 37℃로 5시간 배양하였을때의 SAK 활성의 분포와 그 비율을 예시하면 다음표와 같으며, 이 경우 SAK의 약 60%가 페리플라즘 분할조각에 존재하는 것을 알 수 있다.

본 발명의 실시예를 들면 다음과 같다.

[실시예 1]

본 실시예는 DNA 공여체로서 SψC를 벡터 DNA로서 pBR 322를 제한효소로서 Hind Ⅲ를 숙주인 대장균 원주로서 에세리히어. 콜리 k 12 C 600^r-k^m-k 또는 에세리히어.콜리 k 12 WA 802^r-k^m+k를 사용하여 실시한 예이다.

a) SψC DNA의 조제와 절단

문헌(Blair, J. E. and Williame, R. E.O. (1961) Bull. W.H.0. 24, 771-784)의 방법에 따라서 파아지 SψC를 증식하고 얻은 파아지액 1ℓ에 대하여 5M-NaCl 100m1를 첨가한 다음 다시 30%(w/w) 폴리에틸렌글리코올 300ml을 첨가하고 잘 교반하여 0℃에서 수시간 방치하였다. 그후 10,000r.p.m으로 15분간 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제, RD-20Ⅲ형 냉각원심기 No. 10로터 사용하여 침전을 모아서 이것을 20m1완충액(10mM Tris-HCl, 10mM MgSO₄, 5mM CaCl₂, 0.01% 젤라틴 : pH 7.4)에 녹이고 여기에DNase 및 RNase를 각기 최종농도로 lμg/ml가 되도록 첨가한 다음 37℃에서 20분간 반응시켰다.

반응이 끝난다음 10,000r.p.m에서 10분간 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제, RD-20III형 냉각원심기No. 10로터사용)하고 그 상청을 다시 30,000r.p.m에서 60분간 원심분리 (히다찌 고오끼 주식회사제 55P-73형 분리형 초원심기 RP 50 T-2로터사용)하여 얻은 침전을 상기 완충액 2.5ml에 녹이고 약 1.7g의 염화세습을 첨가한 다음 27,000r.p.m에서 18시간 평형밀도 구배원심분리 (히다찌 고오끼 주식회사제 55P-73형 분리형 초원심기 RPS 50-2로터사용)한다.

이와 같이 하여 얻을 수 있는 파아지의 밴드를 모우고 1ℓ의 상기 완충액에 대하여 투석(透析)한다. 얻은 파이지액 0.5ml에 ,50ℓ의 1.5M NaCl-0.15M 구연산나트륨, 15ℓ의 250mM EDTA(pH 7.0) 및 5ℓ의10% SDS를 첨가하고 37℃에서 5분간 방치한 다음 0.6ml의 0.15M NaCl-15mM 구연산나트륨 용액 포화페놀을 첨가하여 실온에서 조용히 약 10분간 혼합한다.

이것을 3,000r,p.m에서 10분간 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제, RD-20 III형 냉각초원심기 No. 7로터사용)하고 상층(수층(水層))을 모은다.

이 페놀처리를 반복하고 나서 같은 량의 에테르로서 3회 세정을 하고 얻은 수층을 0.15M NaCl-15mM 구연산나트륨-1mM EDTA의 200ml에 대하여 3회 투석한다.

파아지 DNA를 절단하기 위하여 lμg의 DNA에 대하여 3U의 Hind Ⅲ를 첨가하고 10mM Tris-HCl-7mM MgCl₂-7mM β-메르캅토에탄올-50mM NaCl(pH 7.0)의 완충액 20μ1속에서 37℃로 3시간 반응을 하게하여 반응종료시에 1μl의 250mM EDTA(pH 8.0)를 첨가한다.

b) 플라즈미드 pBR 322의 개열

1g의 pBR 322에 대하여 1U의 Hind Ⅲ를 첨가하고 위와 동일한 완충액 20μl속에서 37℃로 3시간 반응시켜 반응종료시에 1μl의 250mM EDTA(pH 8.0)를 첨가한다.

c) 재결합 반응

제한요소로 처리한 DNA 용액 20μl에 5μl의 1.5M 초산나트륨(pH 7.0)을 첨가하고 나아가서 60ul의 95% 에탄올을 첨가차고 -75℃에서 10분간 방치한 다음 12,000r,p.m로 5분간 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제, ItfR-l5A형 소형 냉각원심기 TMA-1로터사용)하여 침전을 모으고 95% 에탄올을 사용하여 재차 세정한다.

이것을 감압 건조시켜 10μ1의 10mM Tris-HCl-1mM EDTA(pH 8.0, TE 완충제)로 용해한다. 결합반응(Ligation)은 50ng pBR 322 DNA(상기 b로 얻은) 1.5μg SψC DNA(상기 a로 얻은) 30mM Tris-HCl- (pH 7.6), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 0.1mM ATP 및 0.1u T4 리가아제를 함유하는 20μl의 반응액속에서 4℃로 48시간 또는 20℃로 수시간 반응시켜 1μl의 0.25M EDTA(pH 8.0)을 첨가하여 반응을 정지한다.

그 다음에 리가아제의 활성을 상실시키기 위하여 65℃로 5분간 가열하고 180μ1의 TE 완충제를 첨가하여 -20℃로 보존한다.

d) 재조합 플라즈미드를 대장균에 도입

각 대장균을 글루로오스를 함유하지 않은 L-발효액(폴리펩톤 10g/ℓ, 효모균 추출물 5g/ℓ NaCl 5g/ℓ)의 10ml에 접종하여 5x10⁸cells/ml에 증식시킨 다음 4℃로 원심집균한다.

이 균을 5ml의 냉각한 50mM CaCl,에 현탁하고 빙수욕속에 5분간 방치하였다가 다시 원심집균(도미세이꼬 주식회사제의 RO-20111형 냉각원심기 No. 4로터로 5,000r,p.m으로 10분간)하여 다시금 067ml의 냉각한 50mM CaCl₂에 현탁하고 빙수욕속에 5분간 방치한다. 이 대장균의 현탁액에 재조합 플라즈미드 DNA용액 (상기 c로 얻은)을 0.33m1 혼합하여 빙수욕속에 5분간 간직한다.

그런 다음 이 반응액을 42℃로 2분간 보존함에 따라 대장균에 재조합 플라즈미드의 도입을 정지한다.

이 현탁액을 그대로, 또는 10배, 100배로 희석하여 암피실린(40μg/ml)을 함유하는 L-발효액 한천배지에 도포하고 37℃로 하룻밤 배양하여 암피실린에 내성으로된 재조합 대장균을 분리한다.

e)SAK 생산능을 갖는 대장균의 선택 분리 인체혈장을 5ml씩 여러개의 시험관에 나누어 따라넣고 56℃로 20분간 가열한 다음 별도로 2% 한천을 녹여서 넣은 보통의 한천배지를 10ml씩 여러개의 용기에 각각주입하여 56℃로 가온하여 둔다.

이 양자를 재빨리 접시위에서 혼합하고 굳어질때까지 방치한다. 이 여러개의 한천배지상에 상기와 같은조작으로 얻은 대장균 시험균액을 스폿하고 37℃에서 배양한다. SAK 생산능이 있는 대장균은 피브린을 분해하여 집낙의 주변을 녹이므로 투명한 조운이 된다

이때 얻은 새로운 대장균의 각각을 숙주인 대장균 원주에 따라서 에세리히어 .콜리 K 12 C600 r-_km-_k(pSAK 361) 및 에세리히어. 콜리 K 12 WA 802 r-_km+_k(pSAK, 361)[KCTC 2467, 한국과학기술원에 1982년 10월 1일자로 기탁됨]라고 이를 붙였다.

f) 대장균 플라즈미드의 해석

상기 e)로 얻은 각 대장균을 암피실린(400g/ml)을 함유하고 글루코오스를 함유하지 않는 L-발효액 400ml로 37℃에서 약 4×10⁸cells/ml까지 증식시켜 배앵액에 클로람페니콜을 150μg/ml로 되도록 첨가하고 나아가서 37℃에서 15시간으로 배양한 다음 원심집균(도미세이꼬 주식회사제의 RD-20 III형 냉각원심기 No. 17로터로 5,000r.p.m으로 10분간)한다.

50ml의 10mM Tris-HCl(pH 8.0)-0.15mM NaCl-l5mM 구연산나트륨으로 균체를 세정하고 3.2ml의 25% 자당-5OmM Tris-HCl(pH 8.0)에 현탁한다.

여기에 1.6ml의 250mM EDTA(pH 8.0), 1ml의 5mg/ml 리소자임, 6ml의 2% Brij 58(KAO-ATLASCo , Ltd)-62.55mM EDTA(disodium salt)-5OmM Tris-HCl(pJ 8.0)를 첨가하고, 30℃에서 15분간 배양한 다음 세포벽을 조용히 용해하며 고속원심분리 (히다찌 고오끼 주식회사제의 55P-73형 분리용 초원심기 RP 55 T로터를 사용하여 4℃에서 30,000r.p.m으로 30분간)하여 균체를 침전시켜 상청을 얻는다.

이것을 에타듐 브로마이드-염화세슘 평형밀도 구배원심 (히다지 고오끼 주식회사제의 55p-73형 분리용초원심기 RPS 50-2로터를 사용하여 4℃에서 36,000r.p.m으로 48시간)에 걸어서 플라즈미드 DNA를 정제한다.

이것을 b)와 마찬가지 방법으로 Hind Ⅲ로 절단하여 SAK 유전자를 가진 단편의 길이를 1% 아가로우즈를 사용한 아가로우즈 전기영동법으로 측정하였던바 4 9kb임을 판명하였다.

g) 4.9kb 단편의 분리

100μg의 SψC DNA를 0.2ml의 반응액 (10mM Tris-HCl(pH 7.6)-7mM MgCl₂-7mMβ-메르캅토에탄올-50mM NaCl-100u Hind Ⅲ를 함유)속에 37℃에서 20시간 반응함에 따라 절단하고 이것을 1% 아가로우즈를 사용하여 아가로우즈겔 전기영동에 건다. 에타듐브로마이드에 따라서 DNA를 염색하여 목적하는 4.9kb의 DNA 단편의 어떤 부분만을 겔에서 잘라낸다. 잘라낸 겔단편을 전기영동법에 따라 투석 튜우브속으로 녹아나오게 한다. 녹아나온 DNA 용액은 TE 완충제로 포화한 페놀을 사용하여 처리하며 수층을 다시금 에테르로 처치한 다음 에탄을 침전법에 따라 DNA를 모우고 벡터 DNA와의 재결합반응에 제공할 수 있다.

h) SAK의 생산·추출·정제

위에서 얻은 SAK 생산능을 가지고 있는 대장균을 L-발효액(폴리펩톤 1%, 효모균 추출물 0.5%, NaCl 0.5%, 글루코오스 0.1%, pH 7.0) 50ml에 접종하여 하룻밤 37℃으로 진탕에서 배양한다.

이 균액을 동일한 발효액 5ml로 접종하여 37℃에서 12시간 진탕으로 배양하고 원심하여 집균(도미세이꼬 주식회사제의 RD-20Ⅲ형 냉각원심기 No. 17로터를 사용하여 5,000r.p.m으로 10분간)한다. 이 균체를 100mM Tris-HCl-20% 자당(pH 8.0) 200ml에 현탁하고 재차 원심하여 집균(도미세이꼬 주식회사제의 RD-20Ⅲ형 냉각원심기 No. 17로터를 사용하여 5,000r.p.m으로 10분간)한다.

이것을 45ml의 100mM Tris-HCl-20%의 자당(pH 8.0)에 현탁하고 5ml의 리소자임용액 (5mg/ml) 리소자임-2OmM EDTA, pH 8.0)을 첨가하여 빙수욕중에 1시간 방치한다.

이것을 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제의 RD-20 III형 냉각원심기 No. 4로터를 사용하여 5,000r.p.m으로 20분간)하여, 상청을 모은 다음 여기에 80% 포화상태가 되도록 황산암모늄을 첨가하고 4℃에서 하룻밤 방치한다. 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제의 RD-20 III형 냉각원심기 No. 4로터를 사용하여 10,000r.p.m으로 10분간)하여 침전을 모으고 10mM Tris-HCl-(pH 7.5) 10ml에 녹여서 같은 완충제에 대하여 투석 한다.

이것을 세라덱스 Q-75 겔 크로마토그라피에 걸어서 10mM Tris-HCl(pH 7.5)를 사용하여 녹아나오게하여 SAK 활성의 분할조각을 모으고 10mM Tris-HCl(pH 7.5)으로 평형화한 CM-셀룰로오즈 대롱에 흡착시켜 0-0.5M NaCl의 직선농도구배로 녹아나오게 한 다음 0.3-0.32몰의 NaCl에 따라 녹아나오게 되는 SAK 활성의 획분을 모은다

[실시예 2]

본 실시예는 DNA 공여체로서 SψC를, SψC 절단용 제한효소로서 Hind Ⅲ와 PstI을 벡터 DNA로서 pBR.322를, pER 322 절단용 제한효소로서 EcoRIk와 PstI를 대장균 원주로서 에세리히어. 콜리 K 12 C6OO r-_km-_k또는 에세리히어. 콜리 K 12 WA 802 r-_km-_k를 실시한 예이다.

a) 파아지 SψC DNA의 절단

실시예 1의 a) -f)에 기재한 방법으로 SψC DNA에서 Hind Ⅲ으로 절단하였을 경우의 4.9kb 단편을 분리한다. 이 단편의 양단에는 각기 4염기로 형성하는 한개의 사슬부분이 있으므로 이 부분을 1u의 DNA 중합효소와 4종의 디옥시리보누클레오시드-3인산(각 25M)에 따라서 67mM Tris-HCl(pH 8.0), 6.7mM HgCl₂, 6.7mM β-메르캅토에탄올을 함유하는 완충액(20μl)속에서 18℃로 4시간 반응시켜서 2개의 사슬로 하였다. 여기에 5μl의 1.5M 초산나트륨(pH 7.0)와 75μl의 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 10분간 간직한다음 12,000r.p.m로 5분간 원심분리 (도미세이꼬 주식회사제의 MR-l5A형 소형 냉각원심기 TMI-1로터를 사용)하고 침전에 에탄올을 사용하여 세정한다. 이것을 10mM Tris-HCll(pH 7.6)-7mM MgCl₂-7mM β-메르칸토에탄올-50mM NaCl을 함유하는 완충액에 녹이고 0.5u의 Pstl을 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시키므로서 다시금 2개의 단편으로 절단한다. 이것을 재결합반응에 공여한다.

b) 플라즈미드 pBR 322의 개열

lμg의 pBR 322 ENA에 lu의 EcoRI을 첨가하여 실시예 1의 b)와 마찬가지로 반응시켜서 개열한다. 이 개열한 DNA의 양단도 4염기로 되는 한개의 사슬부분이 있으므로 a)의 경우와 마찬가지로 74 DNA 중합효소와 4종의 디옥시리보누클레오시드-3 인산에 따라서 2개의 사슬로 한다.

이것을 다시금 a)에 있어서와 마찬가지로 PstI로 절단하여 재결합반응하여 공여한다.

c) 재결합반응

a), b)로 얻은 DNA 단편과 벡터 DNA를 혼합하고 실시예 1의 c)와 마찬가지로 하여 재결합반응을 하게한다 단, T4 DNA 리가아제는 1u를 사용하였다.

d) 다음에 실시예 1과 마찬가지로 새로운 대장균(에세리히어.콜리어 K 12 C600 r-_km-_k(pSAK-HP2)[KCTC 2468, 한국과학기술원에 1982년 10월 1일자로 기탁] 또는 에세리히어.콜리 K 12 WA 802 r-_km-_k(pSAK-HP2)라고 명명)을 얻어서 플라즈미드 해석을 하였던 결과, 각 대장균은 약 2.5kb의 SψC로연유하는 SAK 생산 유전정보를 담당하는 DNA를 가지고 있었다.

[실시예 3]

본 실시예는 DNA 공여체로서 Pψ1를, 벡터로서 pBR 322를, 제한효소로서 Hind Ⅲ를 대장균 원주로서 에세리히어. 콜리 K 12 C600r-_km-_k을 이용하여 실시한 예이다.

a) 실시예 1과 마찬가지 방법으로 파아지 Pψ1 DNA를 조제하여 Hind III로 절단한다.

b) 재결합반응, 대장균에 도입, 제조합체인 대장균의 선택은 실시예 1과 마찬가지로 실시한다.

c) 이 결과 Pψ1로 연유하는 SAK 생산 유전정보를 담당하는 DNA 영역을 대장균에 도입시킬 수 있었다.

이 새로운 대장균을 에세리히어 콜리 K 12 C600 r-_km-_k(pSAK 601)라고 명명하였다.

별표 : 숙주균 및 SAK 생산능을 부여한 대장균의 균학적 성질

* A는 에세리히어.콜리 K 12 C600 r-_km-_k를 뜻한다.

** B는 에세리히어.콜리 K 12 C600 r-_km-_k(pSAK-HP2)를 뜻한다.

*** C는 에세리히어.콜리 K 12 C600 r-_km-_k(pSAK-361)를 뜻한다.

Claims

스태필로콕커스.아우레우스의 용원파아지 DNA를 절단하여 얻은 스태필로키나아제 생산의 유전정보를 담당하는 DNA를 전체 조직중의 일부로서 삽입하여 안정시킨 벡터를 도입하여 대장균을 변환시키는 방법 .
스태필로콕커스.아우레우스의 용원파아지 DNA를 절단하여 얻은 스태필로키나아제 생산의 유전정보를 담당하는 DNA를 전체 조직중의 일부로서 삽입하여 안정시킨 벡터를 도입시킨 대장균을 배양하여 그 배양균체에 축적한 스태필로키나아제를 채취하는 것을 특징으로 하는 스태필로키나아제의 제조법.