JP2596544B2 - 高温で活性なｄ―ヒダントイナーゼを含有する大腸菌の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高温で活性なＤ−ヒダントイナーゼを含有
する中温菌微生物を製法する方法、ならびにこの菌をヒ
ダントイナーゼの製造に又はD,L−ヒダントインの分割
に使用することに関する。より詳細には、本発明はＤ−
ヒダントインを分解する高温菌微生物であるグラム陰性
耐熱細菌CBS303.80からDNAを分離して断片に破断し、得
られたDNA断片をクローニングベクターと結合し、この
組み換えクローニングベクターを中温菌微生物としての
大腸菌中に組み込み、かつこの酵素活性ヒダントイナー
ゼを発現する大腸菌を抗体スクリーニングにより選別す
ることを特徴とする、高温で活性なＤ−ヒダントイナー
ゼを含有する大腸菌の製法である。

ジヒドロピリミジナーゼ（EC3.5.2.2）は、ラセミ体
のヒダントインを分割して対応するＤ−Ｎ−及びＬ−Ｎ
−カルバモイル−α−アミノ酸にする場合に触媒作用を
する。Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸は、半合成
のペニシリン及びセフアロスポリンを製造するための重
要な中間体である。

高温菌微生物から得られるジヒドロピリミジナーゼは
DEOS3031151号明細書に記載されており、これはD,L−ヒ
ダントインを立体選択的にＤ−Ｎ−カルバモイル−α−
アミノ酸に分割し、その際酵素が活性である高い転位温
度（40〜90℃）によつて、分離されなかつたＬ−ヒダン
トインは後から自然にラセミ化する。ヒダントインに対
する特殊性によつてＤ−ヒダントイナーゼとも呼ばれる
このジヒドロピリミジナーゼは、胞子非形成性のグラム
陰性高温菌微生物又は高温細菌の発酵によつて得られ、
そして場合により固定化したのち、洗剤による粗分解液
としてD,L−ヒダントインの分割に用いられる。しかし
使用される高温菌微生物はわずかな細胞密度に生長する
にすぎない。またＤ−ヒダントイナーゼの含量は、微生
物の全蛋白のわずかな千分率に達するにすぎない。

発酵収率を向上するためには、原則として二つの方法
が可能である。

1.化学的又は物理的方法による突然変異誘発によつて明
らかに高い酵素収率を与えるように微生物を変化させる
ことを試みることができる。しかし著しく改良された微
生物によるこの試みは、大きい費用を要し、しかも結果
が不確実である。

2.酵素生成に責任のある遺伝子を微生物から単離し、こ
れを本来の供与微生物又は他の微生物（それはこの遺伝
子に対して受容者として働き、次の代に安定に遺伝し、
その能力を保持することができる）に移植したのち、高
い酵素生成に導くように変えることを試みることができ
る。

酵素生成活性を高めそして酵素を安定化するため、目
的とする変化を、遺伝子と結びつくDNA連鎖の領域で又
は遺伝子自体の領域で行うこともできる。

最後に細胞の酵素生成を、各細胞において酵素生成に
責任のある同一遺伝子の数を増加することにより増強す
ることもできる。

多数の遺伝子移植が成果をあげているが（米国特許42
37224号、EPOS41313号、DEOS3138096号、同3238554号及
びJ.Biochem.Tokyo89巻667頁1981年参照）、特定の場合
に遺伝子移植が希望する結果に導くことを予測できな
い。

本発明は、Ｄ−ヒダントインを分解する高温菌微生物
からDNAを分離して断片に破断し、得られたDNA断片をク
ローニングベクトルと結合し、この組み換えクローニン
グベクトルを中温菌微生物中に組み込み、酵素活性ヒダ
ントイナーゼを発現するこの微生物を選別することを特
徴とする、高温で活性なＤ−ヒダントイナーゼを含有す
る中温菌微生物の製法である。

さらに本発明は、この高温菌微生物から得られるＤ−
ヒダントイナーゼコード化DNA連鎖及びこの連鎖を含有
するクローニングベクトル、ならびにこのクローニング
ベクトルを含有する中温菌微生物及びそれを好熱性Ｄ−
ヒダントイナーゼの製造に又はD,L−モダントインの分
割に使用することに関する。

遺伝子操作により得られるＤ−ヒダントインを分割し
うる中温菌微生物を製造するためには、Ｄ−ヒダントイ
ンを分割しうる高温菌微生物から出発する。その微生物
の例は、テルムス・スペツク及びバチルス属の好熱性の
ものである。これは栄養素の多い水性生物生息地域から
の土含有又は水性の試料を短時間約100℃に加熱し、培
地中で約60℃で保温し、次いでＤ−ヒダントイナーゼ活
性を選別することにより得られる（DEOS3031151号参
照）。その２種の菌株が寄託されている（CBS303.80及
びCBS363.80）。

この微生物から、細胞壁を例えばリゾチームのような
酵素及び／又は洗剤を用いて分解することによりDNAい
わゆるスペンダーDNA（ドナーDNA）が単離され、こうし
て得られた分解液からフエノール含有溶液を用いて蛋白
の主量を沈殿させ、次いで残りの蛋白を酵素分解及びそ
れに続く透析により除去する。こうして得られた溶液か
ら、平衡勾配遠心分離及びそれに続く透析によりスペン
ダーDNAが純粋に得られる。

Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子を単離し又は濃化するた
めには、スペンダーDNAを断片にせねばならない。これ
は物理的に剪断力を作用させ、あるいは化学的に酵素分
解することによつて行われる。

物理的切断は、例えばDNAの超音波処理、ホモジナイ
ザー中の高速撹拌、細いカニユーレによる圧搾又は凍結
と解凍の繰り返しにより行われる（J.Mol.Biol.77巻１
頁1973年参照）。

スペンダーDNAの酵素による切断は、例えば２本鎖の
切断が優先的に生ずる条件下で統計的に分解するDNAア
ーゼを用いて行われる（J.Biol.Chem242巻4409頁1968年
参照）。

続いて切断されたスペンダーDNAを、リンカー（連結
体）又はアダブターの連鎖を接合することにより、ベク
トルDNA中に組込みうる形にせねばならない。スペンダ
ーDNA及びベクトルDNAは、両者を相互に相補的な基質を
用いて延長しそしてカツプリングさせることにより、相
互に結合することもできる。

制限エンドヌクレアーゼの種類にのみ左右される特定
のヌクレオチド連鎖をDNA断片の末端で遊離化する制限
エンドヌクレアーゼによるスペンダーDNAの分解は、特
に好ましい。プラスミドpBR322又はpBR327（Gene2巻95
頁1977年及び同９巻287頁1980年参照）又はそれから誘
導されたプラスミド例えばpHC79（同書11巻291頁1980年
参照）をベクトルDNAとして使用する場合は、制限エン
ドヌクレアーゼとしては特にEndoR.BamH1、EndoR.Hind
III、EndoR.EcoR I又はEndoR.Pst Iがあげられる（酵素
の記号は多くは形式名を略して（EndoR）として略記さ
れる）。これは前記のプラスミドを１回だけ切断して、
スペンダーDNA断片を特に容易に調節しうる手段で組み
込みうる線状ベクトルDNAにする。分割されたDNAの同族
の末端連鎖を遊離化する特定の制限エンドヌクレアーゼ
の組合せも用いられる。例えばスペンダーDNAを、多く
の認められた場所で切断するEndoR.Sau3Aを用いて断片
化することができる。続いてこの断片を、EndoR.BamH1
により切断されたベクトルDNA中に、DNAリガーゼ〔EC6.
5.1.1〕の作用により組み込むことができる。スペンダ
ーDNAの断片化を、低濃度の多くの位置で切断する制限
エンドヌクレアーゼを用いて行うと、準統計的に生成し
たDNA断片が得られ、その場合断片の大きさは、酵素濃
度及びその作用期間に依存する。こうして次のようなDN
A断片をクローン化することもできる。すなわちクロー
ン化しうるDNA断片は、その特殊な基質配列の理由か
ら、ほとんど切断しない前記の制限エンドヌクレアーゼ
に対して識別位置を有しないか又は求められる遺伝子に
充分近接しない識別位置を有するものである。

スペンダーDNAの断片は直線化されたベクトルDNA中に
導入される。これは場合によりT4を感染させた大腸菌細
胞から得られたDNAリガーゼを用いて行われる。この導
入のためには共因子（NAD⁺又はATP）が必要である。

ベクトルDNAとしては、プラスミド、コスミド又はバ
クテリオフアージからのDNAが適する。最初の導入工程
のためには線状化コスミド又はバクテリオフアージλの
DNAを使用することが好ましく、それ以後の導入工程の
ためにはプラスミドが好ましい。なぜならばコスミド又
はバクテリオフアージλDNAは、プラスミドDNAよりもは
るかに大きいDNA断片をクローン化しうるからである。
コスミド−又はバクテリオフアージ−ベクトル中でクロ
ーン化されうるDNA断片の最大の大きさは、約50〜23Kb
である（1Kbは二本鎖DNAの1000塩基対に相当する）。こ
れによつてＤ−ヒダントイナーゼの発現について試験さ
れねばならない独立のクローンの数が少なく保たれる。
例えばコスミドベクトル中に組み込まれた断片の大きさ
が40Kbである場合、微生物の全DNAは約350の独立クロー
ン中で99％の確立で得られるのに対し、プラスミドクロ
ーニングのための代表的な大きさの範囲である6Kbの場
合は、試験すべきクローンの数は約2300に上昇する。

しかし求めるコード化DNA連鎖が発見されたのちは、
まず必然的に同時にクローン化される隣接の希望しない
DNA連鎖を、できるだけ高い安定性を得るために除去せ
ねばならない。このために最適には（しばしば必要な処
理でもあるが）DNAを制限酵素消化物の形でプラスミド
中に導入し、そしてDNAの大きさを小さくすることによ
つて結合を容易にすることが適する。

こうして得られた雑種ベクトルを適当な宿主細胞に導
入する。それは特定の遺伝学的標識を有する大腸菌細
胞、特に制限／修飾系の欠損を有するもの（r^-m^-）、組
み換え欠損を有するもの（recA^-）及び場合により熱に
不安定なλ抑制体（c I857）を有するものである。特に
好適な宿主細胞はE.coli HB101、NF1、W6（λrex）及び
N4830である。

遺伝子クローニングの成功の証明はこの段階では、そ
の遺伝子のための特殊な検定試薬を入手しうるか否かに
決定的に依存する。一般にこれは核酸又はその断片であ
つて、これは供与細胞から単離されるか、あるいは先に
クローン化された当該遺伝子の一部であるか又はそれと
隣接する連鎖であるか、あるいは蛋白生成物の一部アミ
ノ酸連鎖について化学的に合成されたもの（それに対し
て特定の遺伝子がコード化される）である。最後に、外
来の受容者細胞中で遺伝子により特定される蛋白生成物
を生産する遺伝子の能力も利用でき、この場合は生成蛋
白の証明のために抗体を利用する必要があり、あるいは
生成した蛋白を場合により酵素活性により検定すること
ができる。いずれの場合にも、求める遺伝子（Ａ）がシ
グナル連鎖を有することが必要で、これは受容者細胞中
で転写のプロモーターもしくはターミネーター又はリボ
ソーム結合位置として機能しうる（これらの概念の定義
についてはバイオテクノロジー・メイド・シムプル、エ
イ・グロツサリー・オブ・リコムビナントDNA・アンド
・ハイブリドーマ・テクノロジー、PJBパプリケーシヨ
ンズ18−20Hill Rise,Richmond,Surrey,TW106UA,UK,198
3参照）。この見地から酵素試験によるスクリーニング
の費用により制限されるが、大きいDNA断片について最
初のクローニングを行うことが有利である。そのために
はコスミドベクトル又はフアージベクトル中でのクロー
ニングが役立つ。

得られた遺伝子（Ａ）の発現をさらに改善するため、
前記のシグナル連鎖を他の遺伝子（Ｂ）によつて与える
こともできる。他の遺伝子（Ｂ）は、例えばMS2−レプ
リカーゼの分節の同等のDNA及びバクテリオフアージλ
のcro遺伝子断片である（Gene15巻81頁1981年及びEMBO
J.1巻1217頁1982年参照）。

しかしまずコスミドからの遺伝子を少さいプラスミド
に導入することも好ましい。そのためには特に遺伝子
（Ａ）を含むコスミドDNAを単離し、DNAアーゼを用いて
数回の処理に分けて異なる時間に切断する。この処理物
を一緒にして電気泳動法又はクロマトグラフイにより、
大きさに応じて分画する。完全な遺伝子の大きさに相当
する分子量範囲のDNA分画を単離して精製する。こうし
て得られたDNAを、線状化された少なくとも１個の耐性
標識を有するプラスミドDNAと結合する。この結合混合
物を細菌細胞中に形質転換する。こうして得られた細胞
を、使用したプラスミドが宿主細胞に耐性を媒介する物
質を含む媒体中でクローン化する。このヒダントイナー
ゼを生成するクローンを単離する。

このクローンは次の発現最適化に用いられる。そのた
めにはまずその中に含まれるプラスミドを既知方法によ
り単離し、そして線状化する。得られた線状DNAを、分
子の末端から順次に作用するDNAアーゼを用いて消化
し、最後にDNAリンカーを付着させることにより再度環
化させる。この方法の最初の線状化は、遺伝子の上流及
び下流の希望しないDNA連鎖を第二工程で順次に作用す
るDNAアーゼにより除去することを可能にする制限酵素
を用いて行われる。

結合により再環化されたプラスミドは、続いて細菌に
移入されてクローン化される。Ｄ−ヒダントイナーゼを
発現するクローンは、Ｄ−ヒダントイナーゼコード化連
鎖の外側にある最初のDNAができるだけ少なく含まれる
ように選ばれる。このためには、なるべく少ない最初の
DNAを５′−末端と酵素切断位置との間に含むクローン
を、なるべく少ないDNAを３′−末端と酵素切断位置と
の間に含むものと結合することが好ましい。結合生成物
は常法により増殖され、単離され、そしてＤ−ヒダント
イナーゼ遺伝子が酵素により切り出される。この遺伝子
は適当なプラスミド（これは強いプロモーター及ぶ高活
性のリボソーム結合位置を有する）の中に組み込まれ
る。その例はpPCLC24−誘導体、pEX31又はプラスミドpC
L547である（例えば前記両文献参照）。

得られたプラスミドを続いて細菌に移入する。前記の
プラスミドのプロモーターはλ−リプレツサーCIにより
規制されるので、この形質転換のためには、熱不安定な
リプレツサーに導く変異したCI−遺伝子を有する大腸菌
株を使用すべきである。その細胞の中でプロモーターは
高められた温度で感作される。プラスミド含有細菌は、
Ｄ−ヒダントイナーゼ酵素活性により最終的に選ばれ
る。

遺伝子のクローン化は、特定のポリクロナール抗体を
用いてＤ−ヒダントイナーゼ蛋白を生産することによ
り、ならびにその酵素活性により証明される。

高温菌微生物から単離されたＤ−ヒダントイナーゼ遺
伝子は、以外にもそのための外来シグナル連鎖を利用す
る必要なしに、中温菌大腸菌受容細胞の中で発現する。
CBS303.80株のクローン化DNA連鎖は、一緒にクローン化
された３′−遺伝子中心部のDNA連鎖の部分削除後にお
ける構成の種々の段階で不安定であることが知られ、そ
して詳細な限定分析及び連鎖分析によつて、生成した突
然変異株から選別しなければならない。しかしCBS303.8
0のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子の翻訳停止シグナルの
下流25〜125のヌクレオチド及び開始シグナル（５′−
遺伝子近位）の上流約250のヌクレオチドの３′−連鎖
の残留長さにおいて、遺伝子はなお安定である。両方の
Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子のための発現が最終的に最
適化されると、他の遺伝子（pEX構成中のMS2レプリカー
ゼ断片、pCL構成中のcro遺伝子断片、実施例1.8及び実
施例2.6参照）との連結が試みられたが、実際上融合蛋
白が検出できたのは一つの場合のみであつた。この融合
蛋白は同様にＤ−ヒダントイナーゼ活性を有する。他の
すべての場合には天然の長さのＤ−ヒダントイナーゼが
見出される。意外にもこの構成における酵素の合成は熱
により誘導できる。これは細胞集団について出発株（CB
S303.80）の４〜40培も高い酵素活性に導く。

下記実施例には、近縁でない２種のＤ−ヒダントイナ
ーゼ遺伝子の効果のあるクローニングが記載され、両遺
伝子はアミノ末端の最初の19個のアミノ酸においてのみ
制限された相同性（52％）を有する（次式参照）。

各Ｄ−ヒダントイナーゼのアミノ酸相同性 実施例１ 1.1DNAの単離 カステンホルツ培地200ml〔１中にバザール培地10m
l（水889ml、FeCl₃・6H₂O33.4mg、MgSO₄・7H₂O20.48m
g、NaCl0.8g、KNO₃10.3g、NaNO₃68.9g、チトリブレツク
スIII10g、CaSO₄・2H₂O759g）、痕跡元素溶液（１中
に濃硫酸0.5ml、MnCl₂・4H₂O2.69g、ZnSO₄・7H₂O0.72
g、H₃BO₃0.5g、CuCl78ml、Na₂MoO₄・2H₂O28.75mg、CoSO
₄・7H₂O94.94mgを含有）、酵母エキス2.5g、バクトトリ
プトン2.5g、Na₃PO₄・12H₂O0.258gを含有〕に、新たに
一夜培養した非胞子形成性のグラム陰性高温細菌CBS30
3.80の細胞10mlを接種し、60℃で24時間振とうする。こ
の細菌培養物を4000〜8000gで20分間遠心分離し、沈殿
を溶液Ａ（50mMトリス−HCl、pH8、しよ糖10％）の200m
lに懸濁し、再度遠心分離したのち、溶液Ａの16mlに再
度懸濁する。これに混合しながらニワトリ蛋白−リゾチ
ーム溶液（溶液Ａ中に5mg/ml）3.2mlを添加し、室温で1
5分間保温したのち、0.5M EDTA溶液（pH8.0）4mlを添加
し、さらに室温で５分後によく混和しながら、溶液Ｂ
（トリス−HCl50mM、pH8、EDTA10mM、0.5％トリトン×1
00）20mlをピペツトで滴加する。次いで直ちに10％ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液2.6mlを添加し、混合したのち
粘稠な細胞溶解物を60℃で10分間保持する。5M過塩素酸
ナトリウム溶液5mlを添加したのち、細胞溶解液をフエ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコール〔0.1Mト
リス−HCl、pH7.4、0.05M NaCl、10mM EDTA及び0.01％
β−ヒドロキシキノリンにより平衡化したフエノール25
容量部、クロロホルム25容量部、イソアミルアルコール
１容量部〕50mlと共に、40℃で30分間振とうする。この
乳化液を10分間4000gで遠心分離する。分離した上層
を、前記と同様にフエノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコールを用いて２回、続いて同量のクロロホルム
を用いて抽出する。上の水層を50mMトリス−HCl、50mM
NaCl、5mM EDTAの溶液４（pH8）に対して４℃で16時
間透析し、0.15M NaCl、50mMトリス−HCl、5mM EDTA（p
H8）の塩濃度となし、DNAアーゼ不含のRNAアーゼを用い
て（最終濃度0.1mg/ml）37℃で30分間保温する。この混
合物を前記と同様に、フエノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコールを用いて１回、そしてクロロホルムを
用いて２回抽出する。

得られた水溶液（DNA含量30μg/ml）5mlを、四硼酸ナ
トリウムを用いて最終濃度を10mMとなし、固形塩化セシ
ウム（約1.36g/ml DNA溶液）を用いて屈折率を1.400に
する（約1.36g/mlのDNA溶液）。140000gで限外遠心分離
したのち（48時間、20℃）、遠心管内容物を管底の穿刺
により滴下させて分画する。DNA含有分画は紫外線吸収
測定（260nm）により同定され、溶液Ｃ（2mMトリス−HC
l、2mM NaCl、0.1mM EDTA、pH8）の４に対し４℃で16
時間透析する。

1.2コスミドベクトルpHC79における「シヨツトガン」ク
ローニング 1.1により得られたDNA各20μｇを、100mMトリス−HC
l、pH7.5、50mM NaCl及び10mM MgCl₂の溶液0.2mlに溶解
し、2.0U BamH1を用いて各10分、20分及び30分分解す
る。反応混合物を一緒にし、フエノールで処理して蛋白
を除去し、−70℃でエタノール（塩濃度:0.3M酢酸ナト
リウム、pH5）2.5容量部を加えて10分間エタノール沈殿
を行うことによりDNAを濃縮する。100mMトリス−HCl、p
H7.5、50mM NaCl、10mM MgCl₂、6mM DTTの溶液中で1.5U
のBamH1/μg DNAを用いて消化を行うことによりコスミ
ドpHC79（Gene11巻291頁1980年の第２図）を線状化し、
脱蛋白し、そしてエタノール沈殿により濃縮する。CBS3
03.80からのBamH1で一部分解したDNA7μｇならびにコス
ミドpHC79のBamH1で分解したDNA0.1μｇを、20mMトリス
−HCl、pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、0.6mM ATP、100
μg/ml牛血清アルブミンの中で、800μg/mlのDNA濃度で
0.1UのT4−DNAリガーゼを用いて12℃で２時間結合す
る。結合混合物を試験管内でλフアージ粒子中にパツケ
ージングし（Methods Enzym.68巻281、299頁1979年）、
大腸菌HB101の感染（J.Mol.Biol.41巻459頁1969年）に
使用する。感染した細胞をLB/Amp寒天（Ｌ−Broth:1％
バクトトリプトン、0.5％Difco酵母抽出物、0.5％NaC
l、10μg/mlチアミン、１％Difco寒天、100μg/mlアム
ピシリン）の上にすじ状に着ける。

1.3D−ヒダントイナーゼの抗体の製造 ｉ）純粋なＤ−ヒダントイナーゼの製造 Ｄ−ヒダントインを分割するCBS303.80株の乾燥生物
体500gを蒸留水5000mlに懸濁し、ガラス球ミル（球の大
きさ0.35〜0.4mm）の中で氷冷しながら200ml/分のポン
プ速度で砕解する。次いで20％ポリミンＰ水溶液を最終
濃度が0.4％になるまで添加し、3000gで15分間遠心分離
したのち、上澄液を蒸留水で電気伝導度が2mSiになるま
で希釈し、ホワツトマンDE−52セルロースイオン交換体
230gと共に22℃で90分間撹拌する。結合酵素を0.1Mボラ
ツクス−HCl、0.2M NaCl、pH8.5を用いて溶出し、脱塩
し、そしてDEAE A−50セフアデツクスカラム上で50mMボ
ラツクス−HCl pH8.5中で0.1Mから0.2M NaClの勾配にお
いて分画する。溶出物を20mMボラツクス−HCl、pH8.5に
対し透析したのち、酵素製品をAcA44ウルトロゲルカラ
ム（LKB）上で脱塩し、硫酸アンモニウムで0.5Mにした
のち、オクチルセフアロースCL4B（フアルマシア）上の
疎水性クロマトグラフイにより更に分画する。主ピーク
は、等電点電気泳動及びSDS−ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動による分析によると純粋である。収率は10％
である。

得られたＤ−ヒダントイナーゼ溶液を0.1Mボラツクス
−HCl、0.1Mくえん酸ナトリウム、pH8.5に対し透析し、
結晶皿上に置く。この溶液を密閉室中で0.5Mくえん酸ナ
トリウム溶液、pH7.0（これは４日後に0.8Mくえん酸ナ
トリウム溶液、pH7.0で置き換える）の上で濃縮する。
８日後にＤ−ヒダントイナーゼ活性を有する大きい蛋白
結晶が生ずる。

CBS303.80株から得られたＤ−ヒダントイナーゼのア
ミノ末端の、内部トリプトペプチドの及びカルボキシル
末端のアミノ酸連鎖を、エドマン分解による自動連結に
より測定する（Methods Enzym.27巻942頁1973年）。蛋
白については次の部分連鎖が知られる（J.Biol.Chem.24
3巻3557頁1968年）。

PLLIKNGEIITADSRYKADIYAEGXTIT（Ｒ）Ｉ（GQNLEAP） Ｎ−末端。

TGPEWHEPS（RPXAV） KGTIAVGSDADLVVY TQHVNNDYNGFEGF ▲NFF^Ｇ _Ｌ▼。

ii）抗体の採取 ３匹のウサギに、ｉ）により得られた完全なフロイン
ドのアジユバント（Difco）中の酵素製品の0.9％NaCl溶
液を各500μｇに注射し、半量の酵素を６週及び10週後
に注入する。10週後に得られた抗血清100μは、Ｄ−
ヒダントイナーゼ120μｇと結合している。ウサギ抗血
清のIgG分画は、蛋白Ａ−セフアロース上のクロマトグ
ラフイにより得られる。

1.4D−ヒダントイナーゼを生産する細胞クローンの同定 特定の抗原を生産する大腸菌コロニー（感度約1pg、G
ene6巻23頁1979年）は免疫学的に同定することができ
る。この分析の個々の操作は、PVCシートをＤ−ヒダン
トイナーゼに対する抗体で予備含浸し、すべての遊離結
合位置を予備免疫血清により飽和し、分解コロニーとの
接触によりインプリントし、そしてＤ−ヒダントイナー
ゼに対する放射性標識抗体と結合することである。放射
性抗体は先にＤ−ヒダントイナーゼ又はその部分連鎖が
シート上に吸着されている位置だけと結合する。レント
ゲンフイルムを用いるシートの自動放射線透過写真術に
より、Ｄ−ヒダントイナーゼ又はこの酵素の部分連鎖を
合成するクローン（単数又は複数）が同定される。

1.2より得られたクローン（約2000）をつまようじを
用いて寒天板からミクロ滴定板の穴に移し、37℃で16時
間振動し、ミクロ滴定板の型内でLB/Amp板上のニトロセ
ルロースフイルター（BA85、シユライヘル・アンド・シ
ユル）上に移す。約2mmの大きさのコロニーに、コロニ
ーにつき10mM MgSO₄の中で、2.5〜５×10⁵のλvir nin5
フアージ（ザ・バクテリオフアージ・ラムダ、ハーシエ
イら、コールド・スプリング・ハーバー1971年259、62
8、226以下、565−588頁参照）を感染させ、37℃に４時
間保温する。次いで細胞分解を完結するため飽和クロロ
ホルム雰囲気に10分間さらす。次いでCBS303.80D−ヒダ
ントイナーゼ抗体のIgG分画を用いて処理されたPVCシー
トを、気泡が無いようにして分解コロニー上に置き、４
℃に一夜保温する。このシートは、0.2M NaHCO₃、pH9.2
の中で60μg/ml IgGで20℃で２分間含浸し、各20mlの冷
洗浄緩衝液（PBS緩衝液、0.5％ウサギ血清、v/v、0.1％
牛血清アルブミン、w/v）で２回洗浄したものである。
このシートを取り出して細胞の残りを注意して除去し、
洗浄緩衝液2.5ml及び８×10⁶のcpm¹²⁵Iの標識抗Ｄ−ヒ
ダントイナーゼCBS303.80IgGの中で４℃に４時間保温す
る。CBS303.80D−ヒダントイナーゼに対する抗体のIgG
分画（抗Ｄ−ヒダントイナーゼCBS303.80IgG）の標識
は、クロラミンＴを用いて行われ、すなわち50mM燐酸ナ
トリウム、pH7.5中のIgG20μ及びNa¹²⁵I（アマーシヤ
ムーブフラー、100m Ci/ml、13〜17mCi/μｇ）５μｍ
を、クロラミンT10μ（50mM燐酸ナトリウム中5mg/m
l、pH7.5）と共に20秒間保温したのち、10μNa₂S₂O₅
（50mM燐酸ナトリウム中12mg/ml、pH7.5）、100μKI
（10mg/ml）及び１％牛血清アルブミンを添加し、セフ
アデツクスG50（フアルマシア社製）上で脱塩する。
液を保温したのち４℃の洗浄緩衝液各100ml中で５分ず
つ２回、そして４℃の水中で５分ずつ２回振動する。乾
燥したシートを強化シート及びコダツクXAR5レントゲン
フイルムと共に一夜−70℃で露光する。

1.5クローンにより生産されるＤ−ヒダントイナーゼの
検定 前記の免疫学的検定（ブルーム−ギルバート、アフイ
ニテイ・クロマトグラフイ、プリンシプルズ・アンド・
メソツズ、フアルマシア・フアイン・ケミカルズ1979年
12頁以下及び92頁参照）により陽性と同定された細胞ク
ローンを、酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼの発現につい
て試験する。そのため培養物50mlを、アンピシリン100
μg/mlを含むＬ−ブロス中で、37℃で16〜24時間振とう
したのち、4000〜6000gで10分間遠心分離する。沈殿を
溶液A50mlに再懸濁し、遠心分離し、溶液A130ml中に移
し、ニワトリ卵白−リゾチーム溶液20μ（トリス−HC
l25mM中10mg/ml、pH8）と共に室温で20分間保温する。
次いで0.25M EDTA溶液330μ（pH8）を添加し、５分後
に激しく混合しながら溶液B1.67mlを添加する。透明分
解液を４℃で１時間高速遠心分離し、上澄を70℃で２分
間加熱し、沈殿を４℃及び4000gで10分間分離する。上
澄2mlに、0.4Mボラツクス−HCl（pH8.5）0.5ml、1M MgC
l₂0.1ml及び0.1Mボラツクス−HCl中の５％メチルチオエ
チルヒダントイン溶液0.625ml（pH8.5）を添加する。60
℃で30分間振とうしたのち（D,L−メチルチオエチルヒ
ダントインをＮ−カルバモイル−Ｄ−メチオニンに変換
させるため）、1.5mlを取り出し、8000gで５分間遠心分
離し、上澄1.2mlに1/10濃燐酸0.168mlを添加する。沈殿
を8000gで１分間遠心分離し、上澄を粒子不含に過
し、高速液体クロマトグラフイによりＮ−カルバモイル
−メチオニン含量を分析する。この条件下で行われるD,
L−メチルチオエチルヒダントインのＮ−カルバモイル
−Ｄ−メチオニンへの自然転位を、大腸菌HB101（pHC7
9）からの同量の蛋白抽出物の存在下に測定する。その
分解物がD,L−メチルチオエチルヒダントインのＮ−カ
ルバモイル−Ｄ−メチオニンへの少なくとも２倍の転位
を示すクローンを、陽性と評価する。

1.6D−ヒダントイナーゼ遺伝子のサブクローニング Ｄ−ヒダントイナーゼを生産するクローンの一つ（Ba
m7B10:構造は第１図に示される）の組み換えプラスミド
−DNAを、既知方法（モレキユラー・クローニング・エ
ー・ラボラトリー・マニユアル、コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー1982年86頁以下参照）により
単離する。プラスミドDNAの試料２μｇを120μg/mlの濃
度で、DNA1μｇにつき0.5UのSau3Aを用いて10分、20分
ならびに30分間分解する。反応混合物を一緒にし、2mM
のEDTA及び0.5μg/mlのエチジウムブロミドを含有する5
0mMトリス−アセテート緩衝液（pH7.8）中で、0.8％ソ
フトアガロースゲル上での電気泳動により分画する。２
〜4Kbの大きさのDNAを含有するゲルセグメントを、紫外
線ランプを用いてDNAの大きさ標準と比較することによ
り同定し、分離し、そして同容量の溶液Ｄ（0.1Mトリス
−HCl、10mM EDTA、0.2M NaCl、pH7.4）と共に65℃で５
分間溶融する。同容量の37℃に加温されたフエノール水
溶液を用いて乳化液となし（1:1の溶液D/水により平衡
化）そして遠心分離したのち、上澄をクロロホルムを用
いて２回抽出し、エタノール沈殿により濃縮する。プラ
スミドpBR327（Gene9巻289頁1980年）１μｇを1.5U/μg
DNAのBamH1を用いて90分間線状化し、子牛腸ホスフア
ターゼ（CIP）を用いて脱ホスホリン化する（前記のモ
レキユラー・クローニング、エー・ラボラトリー・マニ
ユアル133頁参照）。フエノール抽出により脱蛋白され
たこのプラスミドDNA0.5μｇを、Bam7B10の２〜4Kb分画
１μｇと結合する（同書146頁、245頁以下、286頁以下
参照）。この結合混合物を用いてCaCl₂処理された（Gen
e6巻23頁1979年参照）大腸菌HB101細胞（J.Mol.Biol.41
巻459頁1969年参照）を形質転換する。抗生物質不含の
培地（Ｌ−ブロス:1％バクトートリプトン、0.5％酵母
エキスデイフコ、0.5％NaCl、10μg/mlチアミン）の中
で90分間培養したのち、細胞をLB/Amp板の上に載せる。
得られたクローンを、前記と同様に（ブルームーギルバ
ート試験）、Ｄ−ヒダントイナーゼ上に生成したヒダン
トインの陽性を証明することにより試験する。３クロー
ンは酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼを生成している。そ
れらの一つB6（第１図参照）は、連結ののち発現の最適
化に用いられる。

1.7ベクトルB6中のCBS303.80D−ヒダントイナーゼ遺伝
子の連結 ベクトルB6中にクローン化されているCBS303.80DNA断
片は、制限エンドヌクレアーゼBamH1、Cla I、EcoR I、
Hind III、Pst I、Pvu II、SaL I、Kpn I、Ppa I、Sal
I及びXba Iのための切断位置を有しない。クローン化DN
A断片中の特異的なHind II位置は、BamH1リンカー
（５′−pCCGGATCCGG−３′）を部分的にHind IIで切断
されたプラスミドB6（第２図参照）に組み込むことによ
り、BamH1位置に変えられる。得られたプラスミドの一
つ（pB6A、第３図参照）はもはやＤ−ヒダントイナーゼ
を発現しない。それゆえBamH1リンカーの組み込みは遺
伝子の領域内で行われる必要がある。この理由から５′
−³²P標識によれば、連結はBamH1切断位置から両側へ起
こつている（Methods Enzym.68巻281、299頁1979年参
照）。キナーゼ処理ののちEcoR Iによる第二の切断が行
われ、２個の連結されるべき断片は低温溶融アガロース
上で精製される。得られる連鎖データから、Ｄ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子の位置及び方向が知られる。BamH1の
下流225個のヌクレオチドの後にストツプコードンが存
在する。解読機構を正確に指定することは可能である。
なぜならば連結した断片は10個のアミノ酸残基を介して
連結したトリプト断片と正確に相関するからである（NN
DYNGFEGF;実施例1.3（ｉ）参照）。重複欠失突然変異株
（Nucl.Acids Res.11巻4077頁1983年）によつて、Ｄ−
ヒダントイナーゼ遺伝子の連結が行われる。

ｉ）リンカーのキナーゼ処理 BamH1リンカー（５′−CCGGATCCGG−３′）及びHind
IIIリンカー（５′−GCAAGCTTGC−３′）を、250pMolの
量の反応混合物20μとして、60mMトリス−HCl、pH7.
5、10mM MgCl₂、15mM DTT、1mMスペルミン、100μＭのA
TP、8UのT4ポリヌクレオチドチドキナーゼ（PLバイオケ
ミカルズ）中で、37℃で30分間に５′−ホスホリル化型
に変えられる。混合物を続いて凍結し、そしてアリクオ
ートを直接に結合に使用する（下記参照）。

ii）部分的にHind IIにより切断されたプラスミドB6へ
のBamH1リンカーの組み込み 既知方法により単離されたプラスミドB6の４μｇを、
1UのHind II（ベーリンガー社製）を用いても37℃で10
分間消化する。フエノール抽出及びエタノール沈殿によ
る濃縮ののち、プラスミドの遊離末端に対し約50倍過剰
のリンカーを含有する混合物50μ中でBamH1リンカー
の組み込みが行われる。（100pMolリンカー、 Hind IIにより部分切断、66mMトリス−HCl、pH7.5、6.6
mM MgCl₂、10mM DTT、0.4mM ATP、5UのT4DNA−リガー
ゼ;14時間、15℃）。フエノール抽出及びエタノール沈
殿ののち、結合DNAの40μ中での10UのBamH1による完
全な消化が行われる。反応混合物を１％アガロースゲル
（低溶融アガロース、ビオラツド）の上で分画する。線
状プラスミドを溶融ゲルセグメントのフエノール抽出に
より溶出、DE52（ホワツトマン;0.15M NaCl、10mMトリ
ス−HCl、pH7.5、1mM EDTA中で結合、1M NaCl、10mMト
リス−HCl、pH7.5、1mM EDTAで溶出）により精製したの
ち、エタノール沈殿により濃縮する。収量は約１μｇで
ある。100ngのDNAを20μの結合混合物（66mMトリス−
HCl、pH7.5、6.6mM MgCl₂、10mM DTT、0.4mM ATP;14時
間、15℃）の中で、0.5UのT4DNA−リガーゼを用いて環
化し、CaCl₂処理された大腸菌HB101細胞中にトランスフ
エクシヨンを行う。組み換えクローンを既知方法により
選別する。可能な組み換えプラスミドpB6A、pB6B、pB6C
（第３図参照）を、EcoR I/BamH1により二重消化にかけ
る。プラスミドpB6Aを連結に使用すると（Methods Enzy
m.65巻499頁1980年参照）、BamH1位置から両側に連結が
起こる（第３図参照）。プラスミドpB6Bは、δ５′−及
びδ３′−変異体を生産するための出発プラスミドとし
て役立つ（下記参照）。

iii）B6δ５′−変異体 BamH1により線状化されたpB6B（第３図）の7.5μｇ
を、12mM CACl₂、12mM MgCl₂、600mM NaCl、20mMトリス
−HCl、pH8.0、1mM EDTAの100μ中で2.4UのBal31（BR
L）を用いて25℃で保温する。４分及び５分後に各16μ
を取り出す。試料を直ちにフエノール処理し、そして
一緒にする。９分及び11分後、ならびに14分及び16分後
の２試料を対応して処理する。クロロホルム抽出及びエ
タノール沈殿による濃縮ののち、DNAをコルンベルク−
ポリメラーゼ（Pol I）を用いて、続いてリンカーと接
合するため鈍い末端が生ずるように切断する。このPol
I処理は、120mM K−PO₄、pH6.9、6mM MgCl₂、1mM dAT
P、1mM dTTP、1mM dGTP、1mM dCTP、5mM DTT、1.5μ
α³²PdATP、400Ci/m Mol、10m Ci/ml、10UのDNA−ポリ
メラーゼＩ（ベーリンガー社製）の100μの中で、２
μｇのBal31で処理したDNAを用いて15℃で２時間かけて
行われる。次いで反応混合物を、100mM NaCl、50mMトリ
ス−HCl、pH7.5、5mM EDTAの中で、セフアデツクスG50
（フアルマシア社製）により分画する。排出量のDNAを
0.15M NaCl、50mMトリス−HCl、pH7.5、5mM EDTAの中
で、DE52（ホワツトマン）と結合し、1M NaCl、10mMト
リス−HCl、pH7.5、1mM EDTAを用いて溶出し、エタノー
ルで沈殿させる。続くBamH1リンカーの組み込みを前記
のように30μ中で行う。フエノール抽出及びクロロホ
ルム抽出ならびにエタノール沈殿による濃縮ののち、試
料をBamH1を用いて消化し、既知方法により0.8％低溶融
アガロース（ゲル濃度0.8％）により分画して精製す
る。こうして精製されたDNAを20μの混合物中で0.5U
のT4DNA−リガーゼを用いて再結合する（12時間、12
℃）。各10μの結合混合物をCaCl₂処理した大腸菌HB1
01細胞のトランスフエクシヨンに使用し、得られた組み
換え体を既知方法により選別する。４分及び６分ならび
に９分及び11分のBal31処理から、各15のプラスミドを
単離し、同定する。プラスミドδB65′Ａ、−Ｂ、−
Ｅ、−Ｉ及び−Ｋを、BamH1切断位置から既知方法（Met
hods Enzym.65巻499頁1980年）により前記のように連結
する（EcoR Iによる二次切断、第４図参照）。

iv）B6δ３′−変異体 ５′−変異体の場合と同様にして３′−変異体を生成
する。

出発DNAとしてはSma I（第４図）により線状化された
pB6B（第３図）が用いられる。その10μｇを33μの反
応容積中で、1.4UのBal31と共に前記の緩衝液濃度で保
温する。それぞれ２分及び４分、６分及び８分、10分及
び12分、14分及び16分ならびに18分及び20分ののち、３
μをフエノール処理し、組にして仕上げ処理する。Po
l I修復の後にHind IIIリンカーをプラスミドDNA中に組
み込み、これをHind IIIで消化し再結合したのち、既知
の条件下でHB101細胞中にトランスフエクシヨンを行
う。48の組み換えプラスミドの特性評価ののち（Bal31
で２〜12分間処理）、３′−欠失変異体Ｏ、Ｐ、Ｒ及び
Ｓが得られる。Hind III−切断部の位置は、制限地図及
び連結により定められる。連結はEcoR Iを用いる二次切
断と共にHind IIIの位置から起こる（Methods Enzym.65
巻499頁1980年参照）。

1.7（ii）〜（iv）に記載の工程により得られた連鎖
データをまとめて下記に示す。Ｄ−ヒダントイナーゼ遺
伝子のコード化領域は、ヌクレオチド327からスクレオ
チド1435に広がつている。翻訳の開始を合図する３種の
ヌクレオチド及び翻訳停止信号は、枠により示される。
連鎖内の領域１は250±50ヌクレオチドの長さに相当
し、領域３は90±１のヌクレオチドに相当する。領域２
は連鎖NN又はNNN（Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴ）に相当す
る。これらの領域も枠に囲まれている。

1.8発現の最適化 組み換えプラスミドδB65′Ｅは、Ｄ−ヒダントイナ
ーゼ遺伝子の翻訳開始コードンの上流でかつ先にプラス
ミドpB6b中に存在したSaL I認識位置の下流に、なお約2
50個のCBS303.80DNAのヌクレオチドを含有し、それに隣
接する200〜300のヌクレオチドの削除と共にBamH1切断
位置に置き換えられている（1.7の（iii）参照）。

このプラスミドを用いて形質転換された大腸菌HB101
細胞は、酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼを発現する。同
様にして３′−側面DNA連鎖中に存在するSma I切断位置
から出発して、Sma I切断位置をHind III切断位置に置
き換える（第４図及び1.7の（iv）参照）。その際随伴
するCBS303.80DNA連鎖は、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子
の翻訳停止コードンの後方の25のヌクレオチドまで除去
される（クローンδB63′Ｏ）。プラスミドδB63′から
のHind II断片がプラスミドδB65′Ｅ中に形質転換され
ることによつて、新しいプラスミドが構成され、これは
ヒダントイナーゼ遺伝子の前になお約250の外来DNAのヌ
クレオチドを有し、その遺伝子の停止コードンの後にな
お25の外来DNAのヌクレオチドを有する（δB6EO、第５
図）。別にヒダントイナーゼ遺伝子の前の約250の外来D
NAのヌクレオチドを削除することは、構成されたプラス
ミドδB6EOの中では不可能であることが知られた。これ
は多分ベクトル（pBR327）の自己複製の起点における他
のBal削除が妨害されるためと考えられる。

他の削除を行うため、δB6EOからのＤ−ヒダントイナ
ーゼ遺伝子を、BamH1/Hind III断片としてのpBR322中で
常法により再クローン化する。得られたプラスミドpBR
EO（第５図）を続いて前記のように、BamH1により線状
化したのちBal31により短縮する。Bal31消化の終了、T4
DNAポリメラーゼによる末端の修復及びBamH1リンカーの
挿入ののち、そして大腸菌HB101の形質転換ののちに８
個のクローンが選択され、そのプラスミドDNAはBamH1/H
ind II消化ののちに、1.5〜1.3kbの適当な範囲の大きさ
を有するＤ−ヒダントナーゼ遺伝子断片を有する。Ｄ−
ヒダントナーゼ遺伝子はこのプラスミドから、常法によ
りBamH1/Hind III消化によりDNAを単離したのち切り出
され、そしてプラスミドpEX31a、ｂ及びｃに組み込まれ
る。その際受容体プラスミドは、あらかじめ同様にBamH
1及びHind IIIを用いて消化される。プラスミドpEX31a
−ｃはプラスミドpPLC24（Gene15巻81頁1981年）から導
かれ、そして熱誘導可能なλプロモーターplを含有し、
そしてMS2レプリカーゼの97アミノ酸コードンの後に、
ａ−ｃの構成において外来遺伝子とMS2レプリカーゼの
結合すべての３種の解読機構の中で可能にするポリリン
カー領域を有する（第６図参照）。結合生成物は大腸菌
株N4830（PLバイオケミカルズ）に形質転換され、これ
は熱不安定なλレプレツサーC I857のための遺伝子を含
有する。抗アンピシリン性形質転換体は28℃で保温する
ことにより得られる。熱誘導によりＤ−ピダントイナー
ゼを生成するクローンは、第一に免疫学的に検出され
る。

このためには個々のコロニーをミクロ滴定板の丸底く
ぼみの中の150μ LB/Amp培地に接種し、一夜28℃で振
動し、新しい培地（120μ）に1:3の希釈で移し、ミク
ロ滴定板中で振動しながら42℃で３時間保温する。10％
SDS溶液20μを添加したのち、ミクロ滴定板を被覆シ
ートで包み、50℃の水欲上で細菌の分解が完了するまで
１時間保温する。次いで分解液を適当な装置（BRL社の
ハイブリドツト・マニホールド1050MM）によりニトロセ
ルロース板（シユライヘル・アンド・シユール社のBA8
5）上で吸引過し、PBS緩衝液で洗浄したのち、既知方
法（Nucl.Acids Res.11巻4077頁1983年）によりＤ−ヒ
ダントイナーゼ抗体（ウサギ抗血清のIgG分画）の1:150
希釈を用いて、続いて最初の抗体を洗浄除去したのち、
西洋わさびパーオキシダーゼと結合した抗ウサギIgG抗
体を用いて処理し、結合した西洋わさびパーオキシダー
ゼをｏ−ジアニシジン/H₂O₂で着色検出する。この８個
のクローンは、メチルチオエチルヒダントインとの反応
において酵素活性を示し、それと無関係にＤ−ヒダント
イナーゼ遺伝子断片がプラスミドpEX31a−ｃの解読機構
の中にクローン化して含まれる。酵素活性の発現は熱誘
導可能である。クローンIF10、3A8及びII D2は、最高の
酵素活性を示す。それは出発株の値と比較して湿つた微
生物集団について40倍も高い。その培養は次の組成の培
地において行われる。１につき5g酵母エキス、2.5gト
リプトン、10g栄養液、0.258gNa₃PO₄・12H₂O、10mlカス
テンホルツ−バサル培地。細胞を30℃でA₆₀₀＝0.3まで
保温し、45℃に15分間加熱し、そして37℃で５時間培養
する。この細胞は溶液Ａ＋1mMMnCl₂中で遠心分離したの
ち洗浄され、そしてこの緩衝液のままでヒダントインの
転位に用いられる。

プラスミドpEX31a、ｂ及びｃから誘導されたCBS303.8
0D−ヒダントイナーゼを発現する発現ベクトルIF10、3A
8及びII D1において、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子への
ベクトル連鎖の移行を、連結により同定する。この移行
は前記の連鎖データにおいて矢印及び対応する構造の名
称により示される。移行はBamH1リンカーを介して矢印
の基部で起こり、リンカーの連鎖は式中に示さない。

1.9組み換え大腸菌クローンからのＤ−ヒダントイナー
ゼCBS303.80の特性決定 遺伝子工学的に修飾された大腸菌からのＤ−ヒダント
イナーゼの分子特性決定のため、HB101の培養物500ml
を、プラスミドB6と共にLB/Amp中で37℃で16時間振動し
ながら保温し、酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼを採取す
るため1.5の記載と同様に仕上げ処理する。その際使用
する緩衝液の量を10倍に増加する。分解液を４℃で１時
間高速回転遠心分離したのち、上澄をポリミンP0.1％と
なし、70℃に２分間加熱し、低回転で15分間遠心分離す
る。上澄をアミコン圧力セル中で５分の１に濃縮する。
濃厚物の30μを等電点電気泳動用ゲル（pH3.5〜9.5;
アムホラインPAGE板LKB）の上に載せる。CB303.80から
の純粋なＤ−ヒダントイナーゼを、対照として併行して
載せる。等電点電気泳動の終了後、両方の分離帯を3mm
の断片に切断する。このゲルセグメントを直接に、メチ
ルチオエチルヒダントインのＮ−カルバモイルメチオニ
ンへ転位による酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼの試験に
前記のように使用する。大腸菌HB101（B6）及びCBS303.
80からのそれぞれのＤ−ヒダントイナーゼは同じ等電点
を有する。

大腸菌HB101（B6）の培養物４を、前記と同様に仕
上げ処理して透明分解液にする。４℃で60分の高速回転
遠心分離ののち、上澄を0.4％ポリミンＰに調整し、70
℃に２分間加熱したのち15分間中速回転で遠心分離す
る。上澄165mlを、1mlのウサギ−Ｄ−ヒダントイナーゼ
−抗血清を1gのシアン化ブロム活性化されたセフアロー
スに結合させることにより製造された親和性カラムによ
りクロマトグラフイにかける。溶出したＤ−ヒダントイ
ナーゼ５μｇを、トリス−グリシン緩衝液（ネイチヤ−
227巻680頁1970年）中のSDS−ゲル（５％集中ゲル、pH
6.8、10％分離ゲル、pH8.8）により分画する。対照とし
てCBS303.80からの真正のＤ−ヒダントイナーゼを分画
する。蛋白バンドはクーマシー・ブリリアント・ブルー
による着色によつて検知できるようにする。大腸菌及び
CBS303.80からのＤ−ヒダントイナーゼは等速度で移行
する。

実施例２ Lu1220からのヒダントイナーゼ遺伝子のシヨツトガン
−クローニング 2.0高温細菌の単離 ヒダントイナーゼ活性を有する好気性で胞子形成性の
高温細菌を、下記の方法により土壌試料、植物材料（特
に堆肥）及び水試料（好ましくは栄養物質含有水）から
単離する（DEOS 3031151参照）。

１スパーテルの試料を栄養培養液又は塩水（0.85％Na
Cl）に懸濁する。水試料は直接に実験に使用し、試料の
容量は約10mlとする。試料を80℃で10分間加熱すること
により滅菌する。この試料のある量を10倍に希釈し、栄
養寒天上にすじ状に塗布する。栄養寒天を入れたシヤー
レをプラスチツクシートで包み、60℃で１〜４日間保温
する。生成したコロニーを取り出し、寒天倍地に接種を
繰り返して精製する。得られた純粋培養物を、ヒダント
イナーゼ活性のため試験する。

得られた菌株（これはLU1220と呼ばれる）を実施例に
使用する。

2.1DNAの調製 カステンホルツ培地200mlにLU1220のコロニーを接種
し、振とうしながら（160rpm）60℃で190クレツト単位
まで培養する。4000rpm、20分、４℃（ミニフーゲ・ヘ
レウス）で遠心分離したのち、湿つた菌体重量は1.16g
である。遠心分離残渣を25ml150mM NaCl、100mM EDTA、
pH8.0で洗浄し、再度粒状化する。この細胞を150mM NaC
l、100mM EDTA、pH8.0の1.5ml中に移し、リゾチーム液
（シグマ;150mM NaCl、100mM EDTA中10mg/ml、pH8.0）
0.5mlを添加したのち、細胞を37℃で60分間保温する。
次いで25％SDS水溶液1mlを添加し、60℃で10分間保温す
る（細胞の分解）。20℃で5M NaClO₄0.25容量部を添加
し、以下実施例1.1ないし1.2と同様に仕上げ処理する。
次いでDNAを20mMトリス−HCl、pH8.0の150μ中に移
し、CasCl−勾配遠心分離により最終的に精製する。CsC
l溶液（7ml水、0.11ml100mM Na₂B₄O₇、1.36g CsCl、ｎ
＝1.400）を.DNA溶液75μと積層し、TST41ローター
（コントロン超遠心分離機）により20℃で30時間高速で
遠心分離し、２〜15番の0.5ml分画からのDNAを集める。
このDNAを水3ml及びエタノール12mlを添加して０℃で沈
殿させ、80％エタノールで２回洗浄し、2mMトリス−HC
l、pH8.0の100μに溶解する。収量はDNA120μｇであ
る。

2.2コスミドーシヨツトガン−クローニング Lu1220DNAを、Sau3Aを用いて部分切断する（20μg DN
A、１又は3UのSau 3Aを使用、37℃で１時間）。0.8％ア
ガロースゲル中の電気泳動により、平均断片大きさ＞20
kbにする。この断片を実施例１と同様に、pHC79のBamH1
認識位置に結合し、試験管内でパツケージングし、大腸
菌HB101を介してコスミド遺伝子バンクにする。1600の
単独コロニーをLB/Amp100μ（ミクロ滴定板上の培養
物）に副本として移す。それぞれ一方の板をグリセリン
培養物（グリセリン20％）として−70℃で貯蔵する。

2.3Lu1220D−ヒダントイナーゼ陽性コスミドクローンの
免疫学的試験による同定 Lu1220からのＤ−ヒダントイナーゼに対してはポリク
ローン化抗体を利用できる（実施例１のCBS303.80に対
するポリクローン化抗体に関する記載と同様にして得ら
れる）。これを用いて実施例１と同様に大腸菌中でそれ
自体のプロモーター活性により生産されるＤ−ヒダント
イナーゼのコロニー特性を検出することができる。その
ためには1500クローンを実施例１と同様に（Proc.Nat.A
cad.Sci.75巻2746頁1978年参照）、Lu1220D−ヒダント
イナーゼ連鎖の発現について試験する。８個のコロニー
は抗Ｄ−ヒダントイナーゼLu1220IgG抗原陽性である。
すべてのクローンを酵素活性について試験する（LB/Am
p、1mM MnCl₂中の150ml培養物）。培養を37℃で約300の
クレツト単位まで行い、細胞を４℃で20分間中速で遠心
分離し（ミニフーゲ・ヘレウス）、粒状物を溶液Ａ（50
mMトリス−HCl、pH8.0、10％しよ糖）、1mM MnCl₂で洗
浄し、溶液A1.3ml、1mM MnCl₂に再懸濁し、溶液Ａ中の
リゾチーム270μ（10mg/ml）を添加し、20℃で20分間
保温する。さらに0.25M EDTA、pH8.0の33μを添加
し、20℃で５分間保温したのち、直ちに1.67mlの溶液Ｂ
を混合し、４℃で１時間高速で遠心分離する。上澄各2m
lに0.5mlのラツクス緩衝液、pH8.15、0.13mlの1M MgCl₂
及び0.5mlの５％メチルチオエチルヒダントインを添加
し、60℃で４時間振とうする。この混合物各1.5mlをエ
ツペンドルフ−ベンチ遠心分離機により５分間遠心分離
する。その上澄1.2mlに1:10希燐酸0.168mlを添加し、無
菌過し、高速液体クロマトグラフイにより分析する。
培養物（C5、第７図参照）は酵素活性Ｄ−ヒダントイナ
ーゼの生産体である。

2.4pBR327中のプラスミドサブクローニング LB/AmpのC5の培養物100mlから、プラスミドDNAを製造
する（実施例１参照）。このC5−DNA10μｇを100μ中
で1.5UのSau3Aを用いて、37℃で１時間切断し、混合物
をそのまま0.8％低溶融アガロース（ビオラード）の上
に載せる。1500〜3000ヌクレオチドの大きさを有するDN
Aをゲルから溶出し、沈殿させ、そして20mMトリス−HC
l、pH8.0、0.1mM EDTAの20μに溶解する。Sau3Aによ
り部分的に切断されたC5−DNA8μ（200ng）を、25μ
中で当モル量をpBR327と結合する（1UのT4DNAリガー
ゼ、NEN、15℃で一夜）。pBR327ベクトルをBamH1で切断
し、そして牛腸ホスフアターゼ（ベーリンガー社製）を
用いてベクトルの自己結合を抑制するため５′−脱ホス
ホリル化する。

結合混合物10μを大腸菌HB101中に形質転換し、こ
の形質転換混合物をLB/Amp板の上に広げる。得られた50
0のコロニーをコスミドクローンについて記載したと同
様にミクロ滴定板に移し、Proc.Nat.Acad.Sci.75巻2746
頁1978年の方法によりＤ−ヒダントイナーゼ抗原を試験
する。４個のクローンが抗原の生産を示す。この４者の
LB/Amp培養物100mlからプラスミドDNAを製造し、各50ml
の試料について前記のようにＤ−ヒダントイナーゼの酵
素試験をする。２種のクローンが酵素活性を示す。これ
らクローン（F2及びB4）のプラスミドは明らかに同一
で、予期しない大きいDNA断片（約8kb）を組み込まれた
形で含有するが、他の２種は1.9kbの長さの組み込まれ
た断片を含有する。

なるべく小さい挿入長さを有するが、酵素活性Ｄ−ヒ
ダントイナーゼを生産しうるクローンを得るために、ク
ローンF2のプラスミドDNAをさらにサブクローニングに
使用する。

F2−DNA10μｇを100μ中で3UのSau3Aを用いて１時
間消化し、0.8％低温溶融アガロース上で前記と同様
に、大きさにより分画する（1500〜3000bp）。断片を前
記と同様にpBR327のBamH1位置に組み込み、HB101中に形
質転換する。650のコロニーが得られ、その23個はブル
ーム−ギルバート試験において抗原陽性に作用し、その
４個は強いシグナルを示し、８個は活性Ｄ−ヒダントイ
ナーゼの生産体である（例えばA59及びE64）。1734bpの
挿入長さを有するA59は最高の生産性を有するクローン
である（第７図）。

発現最適化のためにA59が、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺
伝子の連結分析のためにA59及びE64（第８図）が用いら
れる。

2.5連結 連結は第９図に示す様式により行われる。連結のため
には天然の制限位置のみならず、フリシヤウフらの方法
（Nucl.Acids Res.8巻5541頁1980年参照）によりプロス
ミドA59及びE64に導入された人工的制限位置も用いられ
る。その目的は、片側においてリンカー切断部によつて
制限された（δ５′）削除変異体を得ることにあり、し
たがつて断片の連結は挿入物に完全に重なる連結となる
（第９図、ヒダントイナーゼ遺伝子上の矢印は解読方向
を示し、挿入物の黒色部はコード化領域を示す）。連結
はMethods Enzym.65巻499頁1980年の方法により行われ
る。

DNAアーゼＩ緩衝液（20mMトリス−HCl、pH7.5、1.5mM
MnCl₂、100μg/mlゼラチン）250ml中でプラスミドA59D
NA40μｇを、200pgのDNAアーゼ（ワーシントン母液:50g
グリセリン1ml中の1mg DNAアーゼ、150mM酢酸ナトリウ
ム、pH5.0、1M NaCl、0.5mg/mlゼラチン）を用いて、24
℃で６分間消化し、0.5M EDTA、pH8.0の５μを用いて
反応を停止し、フエノール（緩衝剤により平衡化）250
μを用いて振出し、クロロホルム処理し、エーテルで
抽出し、0.8％低温溶融アガロースゲル上で電気泳動法
により分画する（100/20cm、２時間）。線状プラスミド
の領域を切り出し、DNAを溶出し、DE52−セルロース
（ホワツトマン）上で精製したのち20mMトリス−HCl、p
H7.5、0.1mM EDTAの20μに溶解する（DNA約５μ
ｇ）。DNAの末端は、20℃で30分の保温により5Uのポリ
メラーゼＩクレノウ断片（ベーリンガー社製）を用いて
鋭い（flush）末端にされる。次いで50倍モル過剰のキ
ナーゼ処理したHind IIIリンカ−（５′−GCAAGCTTGC−
３′;P＆Ｌ）を、10UのT4DNAリガーゼ（NEN）の存在下
に25μの結合混合物中で1.5μｇの線状化A59DNA（約
0.8p Mol末端）と結合する。15℃で一夜保温したのち、
リガーゼを65℃で10分間不活性化する。25μのY100緩
衝液（100mM NaCl、10mMトリス−HCl、pH7.5、6mM MgCl
₂、1mg/mlゼラチン、6mMβ−MSH）を添加し、DNAを5Uの
Hind III（ベーリンガー社製）を用いて37℃で１時間消
化する。生成したDNA断片を0.8％低温溶融アガロースゲ
ル上で分画したのち、上限がプラスミドA59の長さと一
致するDNA断片のバンドが生ずる。pBR327のHind III切
断位置の外側のすべてのDNAアーゼＩ切断位置が、小さ
いプラスミド断片の対となる。ゲル上のバンドをかみそ
り刃で切断して細切し、長さによつて選別された一連の
断片分画を別個に再結合できるようにする。

分画を既知方法（Nucl.Acids Res.8巻5541頁1980年）
により低温溶融アガロースの存在下に再結合し、大腸菌
BH101に形質転換する（13混合物）。１分画につき平均5
0の形質変換体が得られ、それぞれ２個がそのプラスミ
ドを介して分析される。削除プラスミドを重複すること
により得られたDNA連結は、下記に示すLu1220D−ヒダン
トイナーゼ遺伝子のための全連鎖及び一緒に連結された
周縁連鎖を有する。

Lu1220からのＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子のコード化
領域は、ヌクレオチド391からヌクレオチド1746まで広
がっている。翻訳の開始を標識する３個のヌクレオチド
及び翻訳停止標識は、枠内に示される。

2.6高められた生産性を有するLu1220D−ヒダントイナー
ゼを発現する大腸菌株の製造 連結のため製造されたA59−δ５′−削除変異体の分
画を、境界がATG開始コードンの近くにある多数の他の
削除変異体を製造するために使用する。その場合はHind
IIIリンカーが、開始コードン上方で、52ヌクレオチド
のPvu II一切断位置に隣接する削除変異体の分画から出
発する（切断位置の存在の試験）。この分画に属するコ
ロニーを集め、一緒にプラスミドを製造する。DNA（10
μｇ）をHind IIIで線状化し、100μ中で2.4UのBal31
を用いて25℃で30秒間処理する。反応をフエノールの添
加によつて停止し、このDNAを加工する。100μの反応
混合物中で、DNA末端を鋭い末端にするため、DNAをDNA
ポリメラーゼＩを用いて15℃で２時間保温する（以上の
操作については「モレキユラー・クローニング、エイ・
ラボラトリー・マニユアル、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー1982年108頁、113頁以下、135頁
以下、394頁等参照）。

次いでBamH1リンカー（５′−CCGGATCCGG−３′、Ｐ
＆Ｌ）の付加を、25μ中15℃で一夜行う（1.5μg DN
A、約1p Mol末端、84p Molリンカー、20UのT4DNAリガー
ゼ、NEN）。次いでリガーゼの不活性化を65℃で10分間
行い、そしてDNAをBamH1を用いて消化する。DNAを拡散
帯としての0.8％低温溶融アガロース中で精製し、単離
し、100μ中で結合し、大腸菌HB101中にトランスフエ
クシヨンを行う。全部で1822のコロニーが得られる。96
のコロニーについてDNAを統計的に調べ、BamH1×Pvu II
制限による地図を作成する。14のプラスミドがPvu II/B
amH1−断片（約925bp）を含有し、従つてBamH1リンカー
をATG開始コードンの直接隣りに有し、そしてBamH1リン
カーから連結が開始される。Ａ＋ＧとＣ＋Ｔの反応だけ
が行われる。なぜならばその領域の正確な連結が可能だ
からである。プラスミドp70、p62及びp51は、前記式に
示される位置までBal31により消化される。ベクトル連
鎖とLu1220遺伝子断片の間の結合は、前記式中で矢印及
び対応する構造の名称により示される。結合は矢印の基
部でBamM1リンカーを介して起こる。リンカーの連鎖は
図示されない。最初の２個のヌクレオチドの連結につい
ては不明瞭なので、これらプラスミドを発現ベクトル中
に形質転換する際に３つの可能な解読枠が示される。

発現ベクトルとしては、pEX31a−ｃとpCL547の２種の
系が利用可能である（EMBO J.1巻1217頁1982年参照）。
ベクトルpEX31a−ｃはハイデルベルク大学のシヤラー教
授により利用可能にされ、そしてプラスミドpCL547はハ
イデルベルクのスタンレイン博士により利用可能にされ
ている。

プラスミドpEX31a−ｃはpBR322から誘導され、MS2ポ
リメラーゼ領域と結合するλフアージpLプロモーター領
域を含有する。ポリメラーゼ遺伝子の97アミノ酸コード
ンの後のDNA連鎖は、EcoR I切断位置を介して３個の連
続解読枠中でポリリンカー領域に連結する。プラスミド
p51、p62及びp70のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子連鎖
は、BamH1切断位置に結合する。そのためにpEX31a、ｂ
及びｃ（第６図）のプロモーター含有Pst I−BamH1断片
を対応するp51、p62及びp70の断片で置き換える。これ
らの断片をまず0.8％の低温溶融アガロース中で電気泳
動により分画し、溶出し、沈殿させ、そして７％ポリエ
チレングリコールの存在下に連結し（Nucl.Acids Res.1
1巻7853頁1983年参照）、大腸菌N4830中にトランスフエ
クシヨンを行う。

得られたクローン（pEX51a、ｂ、ｃ、pEX62a、ｂ、ｃ
及びpEX70a、ｂ、c:約150のクローン／混合物）の各解
読枠につき32個を、ミクロ滴定板に載せる。培養物（LB
/Amp倍地100μ中）を28℃で一夜振とうする。この温
度で熱に敏感なλリプレツサーc I857（これは大腸菌N4
830のクロモゾーム中にコード化される）は、ヒダント
イナーゼの有効な抑制を可能にする。次いで酵素生産を
誘導するため、それぞれの10μを新しいミクロ滴定板
に移し、LB/Amp培地100μ中で28℃で５時間振とうす
る。培養物を水浴中で42℃に15分間加熱したのち、保温
器中42℃でさらに３時間振とうする。これら大腸菌を各
20μの20％SDSを用いて分解し、実施例１と同様にLu1
220D−ヒダントイナーゼ抗原の存在を調べる。

Lu1220D−ヒダントイナーゼ抗原の発現の免疫学的試
験によると、プラスミドpEX51及びpEX62の場合は、解読
枠ｂでは陽性、ａ及びｃでは陰性である。プラスミドpE
X70の場合は、すべての解読枠が陽性である。抗原陽性
のミクロ滴定培養物pEX62b、pEX51b及びpEX70a、ｂ及び
ｃのそれぞれの４個の代表について、培養物100ml中で
Ｄ−ヒダントイナーゼ酵素活性を試験する。pEX62b、pE
X70a、pEX70b及びpEX70cだけ活性である。pEX70の構成
を第10図に示す。

発現ベクトルpCL547（EMBO J.1巻1217頁1982年）の場
合は、１個の解読枠のみがＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子
の組み込みに有効である。p70、p62及びp51からのＤ−
ヒダントイナーゼ遺伝子を含有するBamH1/Pst I断片
は、前記のようにcro及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
の間の単位BamH1切断位置と、pBR部分のPst I断片位置
との間に組み込まれる（第11図参照）。大腸菌N4830へ
の形質転換ののち、各場合の４コロニーについて、酵素
活性Ｄ−ヒダントイナーゼの発現を試験する。これらの
構成におけるＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子はλprプロモ
ーター/Cl857リプレツサーの制約下にあるので、Ｄ−ヒ
ダントイナーゼの合成は熱誘導の後で前記のように測定
される。pCL70の構成だけが酵素活性であることが認め
られる。それは熱誘導後の培養混合物において（実施例
1.5参照）、湿つた微生物塊について出発株Lu1220に対
し４倍高い酵素活性である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子のクローニングの
説明図、第２図は部分的にHind IIにより切断されたプ
ラスミドB6の構成図、第３図は実施例1.7（ii）による
プラスミドB6へのBamH1リンカーの組み込みの説明図、
第４図はプラスミドδB6をBamH1切断位置から連結する
態様を示す説明図、第５図は実施例1.8のプラスミドδB
6の発現最適化の態様を示す説明図、第６図はプラスミ
ドpEX31a−ｃが外来遺伝子とMS2レプリカーゼの結合を
可能にするポリリンカー領域を有することを示す説明
図、第７図は他の起源のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子の
クローニングの説明図、第８図は活性酵素生産クローン
A59及びE64の構成を示す説明図、第９図は実施例2.5の
連結を示す説明図、第10図及び第11図はそれぞれプラス
ミドp70から２種のベクトルを用いて得られるクローンp
EX70及びpCL70の構成を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 シユテフアン・マルキノウスキー ドイツ連邦共和国6700ルードウイツヒス ハーフエン・ワイマーレル・シユトラー セ82 (72)発明者 ゲルハルト・シエンク ドイツ連邦共和国6830シユヴエーツイン ゲン・フエルシヤツフエルトシユトラー セ１ (56)参考文献 特開 昭57−58887（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｄ−ヒダントインを分解する高温菌微生物
   であるグラム陰性耐熱細菌CBS303.80からDNAを分離して
   断片に破断し、得られたDNA断片をクローニングベクタ
   ーと結合し、この組み換えクローニングベクターを中温
   菌微生物としての大腸菌中に組み込み、かつこの酵素活
   性ヒダントイナーゼを発現する大腸菌を抗体スクリーニ
   ングにより選別することを特徴とする、高温で活性なＤ
   −ヒダントイナーゼを含有する大腸菌の製法。