JPS62228279A - Dna配列、プラスミド及びリパ−ゼを生産する方法 - Google Patents

Dna配列、プラスミド及びリパ−ゼを生産する方法

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JPS62228279A
JPS62228279A JP7230786A JP7230786A JPS62228279A JP S62228279 A JPS62228279 A JP S62228279A JP 7230786 A JP7230786 A JP 7230786A JP 7230786 A JP7230786 A JP 7230786A JP S62228279 A JPS62228279 A JP S62228279A
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JP
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lipase
dna sequence
plasmid
dna
pseudomonas
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JP7230786A
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Wataru Kugimiya
渉 釘宮
Yasuo Otani
泰生 大谷
Yukio Hashimoto
征雄 橋本
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Fuji Oil Co Ltd
Original Assignee
Fuji Oil Co Ltd
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明はリパーゼをコードするDNA配列、プラスミド
及びリパーゼを生産する方法に関する。
更に詳しくは、−Δ−Gly−X−Ser−Y−Gly
−B−(但し、A、X、Y、Bはアミノ酸を表す)のア
ミノ酸配列に対応するDNA配列を含むリパーゼをコー
ドするDNA配列、プラスミド及びリパーゼを生産する
方法に関する。
(従来技術) 今までにアミノ酸配列が報告されているリバーセハ、動
物のリパーゼとして■豚の膵臓のリパーゼ及び■ラット
の舌下線のリパーゼがあり、微生物のリパーゼは■5L
aphtlococcus hyicusのリパーゼが
報告されているのみで、その他の微生物のリパーゼは知
られていない。
リパーゼのなかには8、トリグリセライドをアトランダ
ムに水解するリパーゼと1,3位を特異的に氷解する所
謂1.3位特異性リパーゼが知られている。かかる1、
3位特異性リパーゼはカビ(例えばリゾプス属等)に多
く、細菌ではシェードモナス(Pseudomonas
 ) 171のうち、シュードモナス・フラジ(Pse
udomonas fragi )が報告されている。
(^1ford et al J、 of Lipid
 Res、 5 390  ’64又、リパーゼの性質
から比較的高温域で活性を有する所謂耐熱性リパーゼが
知られている。例えば、シュードモナス(Pseudo
monas )属−リゾプス(Rhizopus) I
s、バチルス(Bacillus)属に多り、バチルス
・ステアロサーモフィルス(Bacillus sLe
arothermophilus )等が知られている
本発明のようなリパーゼをコードするDNA配列、これ
らのDNA配列を有するプラスミド及びこれらのプラス
ミドを用いたリパーゼの生産方法は知られていない。
(発明の目的) 本発明者等は、リパーゼをコードするDNA配列、プラ
スミド及びリパーゼの生産方法を目的とした。具体的例
としては、シュードモナス屈の一つであるシュードモナ
ス°フラジ(Pseudomonasfragi )の
有する1、3位特異性リパーゼ遺伝子をクローニングし
、リパーゼをコードするDNA配列を決定すること、そ
の他バチルス屈の一つであるバチルス・ステアロサーモ
フィルス(Bacillusstearothermo
philus)の有する耐熱性リパーゼ遺伝子をクロー
ニングし、リパーゼをコードするDNA配列を決定する
こと、かかるDNA配列を有するプラスミドを得ること
、これらのプラスミドを用いてリパーゼを生産すること
をを目的とした。
(発明の構成) 本発明者等は前記目的を達成すべく鋭意研究の結果、シ
ュードモナス・フラジ(Pseudomonasfra
gi )の有する1、3位特異性リパーゼをコードする
DNA配列を含むプラスミドのクローニング、リパーゼ
をコードするDNA配列の決定、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス(Bacillusstearother
mophilus)の有する耐熱性リパーゼをコードす
るDNA配列を含むプラスミドのクローニング、リパー
ゼをコードするDNA配列の決定及び大腸菌、バクテリ
ア等を用いたリパーゼの生産に成功し、既知のリパーゼ
と比較検討するなかで、本発明のリパーゼに共通するア
ミノ酸配列及びこれに対応する塩基配列を見出し、本発
明を完成するに到った。即ち、本発明はリパーゼをコー
ドするDNA配列、リパーゼをコードするDNA配列を
有するプラスミド及びかかるプラスミドを用いてリパー
ゼを生産する方法である。
以下、本発明の詳細な説明する。
■まず、(al IJパーゼの遺伝情報を担う染色体D
NAを得る。
本発明の目的とするリパーゼの遺伝情報を有する細菌が
好ましく、例えばランダムリパーゼや1゜3位特異性リ
パーゼを有する菌、例えば、Rh1zopus属: R
h1zopus delemar、 Rh1zopus
 n1veuS 等、 Mucor  属 :  Mu
cor  m1ehei1 八spergillus 
 [、Penicillium属等のカビ類、Cand
 ida属等の酵母類−、Pseudomonas m
等のバクテリア類等が好ましく、好適にはシュードモナ
ス(Pseudomonas )属が適当であり、例え
ば、1.3位特異性リパーゼを有するシュードモナス・
フラジ(Pseudomonas fragi )を用
いることができる。又、耐熱性リパーゼを有する菌が好
ましく、好適にはバチルス(Bacillus) Us
が適当であり、例えばバチルス・ステアロサーモフィル
ス(Bacillus stearothermo−p
hilus )を用いることができる。
その他のリパーゼ生産菌を用いることは自由である。
リパーゼの遺伝情報を担う染色体DNAは、Marmu
r等の方法(Journal of Mo1ecula
r Biology3.208−218 ’61) 、
これを改良したColemanに等の方法(Journ
al of Bacteriology 153 (2
1905−915’83)等公知の方法を利用して調製
することができる。
(b)調製された染色体DNAをAlu  1.5au
3八、Taq l 、 flap [、、flap I
I、flaeII[、l1indll1等の公知の制限
酵素の1 、fffl又は2種以上を用いて部分分解若
しくは完全骨IWすることができる。
(C)部分分解されたDNAは、蔗糖密度勾配超遠心法
、アガロース電気泳動法等の公知の方法を用いて部分精
製することができる。(「昆虫のバイオテクノロジー」
三宅端等mp122432)  (講談社0部分精製し
たDNAをベクターDNAに挿入することができる。
(a)ベクターDNAは、宿主内で複製でき、既知の制
限酵素切断部位を持ち、栄養要求性、薬剤耐性、温度感
受性といった有用マーカーを持つ公知のベクターを利用
することができ、例えば、pUC9、pUC8、pUc
19、pUc18、pI3R322、pTB90、pU
I3110等を利用することができる。
(b) ベクターDNAをBam H1、EcoR1、
1lindl[I等の制限酵素で切断し、前記部分精製
したDNAをリガーゼ(DNA連結酵素)等を用い、公
知の方法を利用して連結し、部分精製したDNAをベク
ターDNAに挿入し、組換え体プラスミドを得ることが
できる。
■かかる組換え体プラスミドを用いて大腸菌(例えば、
E、Co11 : J、M、83等)、枯草菌(例えば
、Bacillus stearothermophi
lus等)、シュードモナス屈の菌(例えば、Pseu
dmonas fragi等)等の形質転換をすること
ができる。
又、形質転換は塩化カルシウム法、プロトプラスト法等
の公知の方法を利用することができる。
形質転換した菌は常法により培養して増殖させることが
できる。(「昆虫のバイオテクノロジー」三宅端等編p
??−86)  (講談社)■形質転換した菌から、リ
パーゼ遺伝子を含む菌を選択分離することができる。
リパーゼを生産する菌株の分離にトリブチリン寒天培地
を用いることが簡便である。(Berner、 D几、
 and llammond、E、G、 Lipids
、5,588 ’70 )■形質転換した菌のなかから
トリブチリン培地においてクリアーゾーンを形成(ハロ
ー形成)する菌株を分離ずれぼりパーゼ遺伝子を含む菌
を選択分離することができる。
この菌からアルカリ法、SDS法等の公知の方法を用い
てリパーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAを得ることが
できる。
第3図にシュードモナス・フラジのリパーゼをコードす
るDNA配列を有するプラスミドpKK−0を各種制限
酵素により分解し、アガロースゲル電気泳動法を用いた
測定に基づいて作成した制限酵素切断地図を一例として
示す。
第4図にバチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼ
をコードするDNA配列を有するプラスミドpB11−
7を各種制限酵素により分解し、アガロースゲル電気泳
動法を用いた測定に基づいて作成した制限酵素切断地図
を一例として示す。
0次に、リパーゼ遺伝子を含むプラスミドDNAをさら
に短いDNA断片に限定することができる。
゛即ち、リパーゼ遺伝子を含むプラスミドDNA(pK
K−0、pBll−7等)を各種の制限酵素を用いて切
断し、切断されたDNA断片をプラスミドベクターにサ
ブクローニングして大腸菌等を形質転換させ、前記トリ
ブチリン培地におけるクリアーゾーン形成(ハロー形成
)大腸菌等を選択し、そのプラスミドを得ることができ
る。
第5図にpKK−0のll1ndlI[、Sma l、
Ba1l、EcoRlの各種制限酵素による切断DNA
断片を挿入したプラスミドを有する大腸菌のトリブチリ
ン寒天培地におけるクリアーゾーン形成(ハロー形成)
の有無の一例を示す。第5図よりシュードモナス・フラ
ジ(Pseudmonas  fragi )のリパー
ゼのDNA配列が1lind m−Ba11間の約1.
0kbのDNA領域(pHB−1,0)に存在すること
が示唆される。
又、第6図にpBll−7のl1indI[I、Sal
 I % Pstl。
Acc Iの各種制限酵素による切断DNA断片を挿入
したプラスミドを有する大腸菌のトリブチリン寒天培地
におけるクリアーゾーン形成(ハロー形成)の有無の一
例を示す。第6図よりバチルス・ステアロサーモフィル
ス(Bacillus stearo−thermop
hilus)のリパーゼのDNA配列がSal 1−A
cc 1間の約1.7kbのDNA領域(pSA−1>
に存在することが示唆される。
■次に、リパーゼのDNA配列が存在するDNA領域の
塩基配列を公知の方法(例えば、Sanger等による
dideoxy法: Sanger、F、et at 
r’roc、Natl、Acad、Sci、USA 7
4.5463 ’77等の方法)を用いて決定すること
ができる。
例えば、前記pHB−1,0の塩基配列の内、プロモー
タ一部を除いたDNA配列及びこれに対応するアミノ酸
配列を示すと第1図のようになる。即ち、第1図のオー
プンリーディングフレームより、シュードモナス°フラ
ジ(Pseudomonas fragi )の1.3
位特異性リパーゼをコードするDNA配列は、135の
アミノ酸に相当する配列からなることがわかる。
又、例えば、前記pSA−1の塩基配列の内、プロモー
タ一部を除いたDNA配列及びこれに対応するアミノ酸
配列を示すと第2図のようになる。即ち、第2図のオー
プンリーディングフレームより、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス(Bacilluss tearo th
ermoph i lus )の耐熱性リパーゼをコー
ドするDNA配列は、247のアミノ酸に相当する配列
からなることがわかる。
以上の結果、及び公知のリパーゼの塩基配列及びこれに
対応するアミノ酸配列の比較結果から、Setがリパー
ゼの活性中心であることが文献(B。
B、A、660 148−150 1981)から推察
され、このSetを中心にしたアミノ酸配列を整理する
と、次の表−1のようになる。
(以下余白) 表−1 PIG   −−Val−11e−Gly−11is−
Ser−Leu−Gly−Set−−RAT  −−T
yr−Val−Gly−His−Ser−Gln−Gl
y−Trp−−Sta   −−Phe−11e−Gl
y−11is−Set−Met−Gly−Gly−−P
se  −−Leu41e−Gly−His−Ser−
Gln−Gly−Ala−−Bac   −−Val−
^1a−Gly−Le+r−Ser−Leu−Gly−
Gly−(但し、PIGは豚の膵臓のリパーゼ、RAT
はラットの舌下線のリパーゼ、StaはS taph 
i 1ococcushyicusのリパーゼ、Pse
はPseudomonas fragiのリパーゼ、B
acはBacillus stearothermop
hilusのリパーゼの活性中心のアミノ酸配列を表す
、)表−1より(−A−Gly−X−Ser−Y−Gl
y−8−)  (但し、A、X、Y、Bはアミノ酸を表
す)のアミノ酸配列に対応するDNA配列がリパーゼに
共通のDNA配列であることがわかる。以上の結果より
、本発明は、Aが1ieu又はAla 、 XがII 
i s又はLeu 、 YがGin又はLeu s若し
くはBがAla又はGlyであるようなアミノ酸配列に
対応する塩基配列を含むリパーゼをコードするDNA配
列及びかかるDNA配列を有するプラスミドである。例
えば、AがIleu、Xが1113.、YがGin、及
びBがAlaのときシュードモナス・フラジのリパーゼ
をコードするDNA配列とすることができ、AがAla
 、 XがLeu 、 YがLeu及びBがGlyのと
きバチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼをコー
ドするDNA配列とすることができる。
次に、本発明のDNAプラスミドを用いてリパーゼを生
産することができる。
例えば、シュードモナス・フラジ(Pseudoa+o
nasfragi)のリパーゼの場合、前記pKK−0
、pKK−1゜1又はpHB−1,0プラスミドベクタ
ーを有する菌を公知の培地を用いて培養し、培養液上澄
よりリパーゼを分離・精製したり、或いは菌体を超音波
等の手段を用いて破壊しリパーゼを抽出・分離・精製し
て得ることができる。バチルス・ステアロサーモフィル
ス(Bacillus stearothermoph
ilus )の場合も同様である。
(実施例) 以下実施例により本発明の実施態様を説明する。
実施例1 (111Jパーゼの遺伝情報を担う染色体DNAの調製
と切断 シュードモナス・フラジ(Pseudoo+onas 
fragi) IPo 3458株からMarn+ur
等の方法(Journal ofMolecular 
Biology 3.208−218 ’61 )を改
良したCo1en+an K等の方法(Journal
 of [lacteriology153 (219
05−915’83 ’)を用いて染色体DNAを調製
した。
この結果、OD26(10)0 D280 =1.8程
度のかなり純粋な染色体DNAを調製することができた
制限酵素5au3 Aを用いて、常法により前記DNA
を部分分解し、10%−40%蔗糖密糖蜜配遠心分離を
おこなって2〜6 kb画分のDNAを調製した。
(「昆虫のバイオテクノロジー」三宅端等mp122−
132)  (講談社)の方法を用いた。
(2)ベクターDNAの調製と切断 アンピシリン耐性を有する多コピー性プラスミドp U
 C9(Vieina、J and Messing、
J、 Gene 19+259  (’82 > のプ
ラスミドDNAを常法(Molecular Clon
ing ed、 Maniatis et al p9
2−94Cold Spring l1arber L
aboratory 11.s、八、)に従ってjgI
製し、制限酵素Bao+ H1で切断し、ベクターDN
Aを調製した。
(3)染色体DNAのベクターDNAへの挿入前記(1
)で得た染色体DNAと(2)で得たベクターDNAを
常法によりT−4DNAリガーゼを用いて  ・連結さ
せた。
(4)組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換IE
、Co11 JM83をKushner S、R,の方
法(GeneticEngineering ed、H
,Il、 [1oyer and S、N1cosia
p17 Elsevier/North−Hollan
d、Amsterdam )により処理し、(3)で得
たりガーゼ反応物を加え、アンピシリン(5eug/糟
1)、5−ブロモ−4−クロロ−3−クンドリル−/?
−D−ガラクトシド(X−gal−30μg / ml
)を含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一夜培養し、
白色のコロニーを得た。
([昆虫のバイオテクノロジー」三宅端等WAp77−
86)(講談社)の方法を用いた。
(5)リパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離(a)ト
リブチリン寒天培地の調製 トリブチリンを0.5V/V%とアンピシリン(50μ
g/mg)を寒天培地に加えて、トリブチリン寒天培地
を調製した。
かかるトリブチリン寒天培地をリパーゼ生産菌株のスク
リーニングに用いる為である。(Berner、D、L
、 and llammond、E、G、 Lipid
s、5.588 ’70 )尚、H,Co11 JM8
3はトリブチリン寒天培地で培養してもクリアーゾーン
の形成(ハロー形成)は認められなかった。
又・シュードモナス・フラジ(Pseudomonas
fragi ) IPo 3458株をトリブチリン寒
天培地で培養するとクリアーゾーンの形成(ハロー形成
)が認められた。
(blリパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離前記(4
)で得た白色のコロニー約4(100株を(alのトリ
ブチリン寒天培地にスポットして一夜i養した結果、ク
リアーゾーンを形成(ハロー形成)する菌株一つを得た
この菌株の大腸菌をJM83  (pKK−0)と名付
けた。
プラスミドpKK−0の制限酵素切断地図を第3図に示
す。
(7)プラスミドDNAの解析 pKK−0プラスミドを各種制限酵素により切断し、各
DNA断片をpUC9にサブクローニングして大腸菌を
形質転換させ、前記と同様にしてトリブチリン培地にお
けるクリアーゾーン形成(ハロー形成)の有無を調べた
。pKK−0のシュードモナス・フラジ染色体DNA由
来の内胴nd m−EcoRlのDNA断片を有するプ
ラスミド(pKK−1,1)及び旧ndn[−Ball
のDNA断片を有するプラスミド(pHB−1,0’)
を有する大腸菌にクリアーゾーン形成(ハロー形成)が
認められた。
結果を第5図に示す。リパーゼ遺伝子が旧ndII[−
Ballの約1.OkbのDNA領域に存在することが
示唆された。
(81D N A塩基配列の決定 Sanger等によるdideoxy法(Sanger
、F、et alProc、Na口、Acod、Sci
、USA 74.5463 ’?? )により、pHB
−1,0プラスミドの挿入DNA断片の塩基配列を決定
した。
その結果、第1図に水子ようなオープンリーディングフ
レームの存在を認めた。
又、大腸菌JM83 (1)KK−0)を3%ポリペプ
トン培地(pt16.0 )を用いて37°Cで24時
間培養後、集菌し、1(10mM  トリス塩酸(pH
7,5)−0,2mM硫酸亜鉛緩衝液の115倍量にサ
スペンドし凍結溶解後、超音波破壊・抽出した上澄より
210/m 1のリパーゼ活性を得た。
実施例2 (1)リパーゼの遺伝情報を担う染色体DNAの調製と
切断 バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus
stearothermophilus ) IFo 
12550株から実施例1と同様にして染色体DNAを
調製した。
制限酵素11indnlを用いて、常法により前記DN
Aを完全分解し、染色体DNAを調製した。
(2)ベクターDNAの調製と切断 アンピシリン耐性を有する多コピー性プラスミドpUC
9を実施例1と同様にして調製し、制限酵素11ind
I[Iで切断し、ベクターDNAを調製した。
(3)染色体DNAのベクターDNAへの挿入前記(1
)で得た染色体DNAと(2)で得たベクターDNAを
常法によりT−4DNAリガーゼを用いて連結させた。
(4)組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換E、
Co11 JM83を用い、実施例1と同様にして白色
のコロニーを得た。
(5)リパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離(a)ト
リブチリン寒天培地の調製 実施例1と同様にした。
バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus
stearothermophilus ) IPO1
2550株をトリブチリン寒天培地で培養するとクリア
ーゾーンの形成(ハロー形成)が認められた。
(b) IJパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離前記
(4)で得た白色のコロニー約6(100株を(alの
トリブチリン寒天培地にスポットして一夜培養した結果
、クリアーゾーンを形成(ハロー形成)する菌株一つを
得た。
この菌株の大腸菌をJM83  (pBll−7”)と
名付けた。
プラスミドpIl11−7の制限酵素切断地図を第4図
に示す。
(7)プラスミドDNAの解析 pBll−7プラスミドを各種制限酵素により切断し、
各DNA断片をpUC9にサブクローニングして大腸菌
を形質転換させ、前記と同様にしてトリブチリン培地に
おけるクリアーゾーン形成(ハロー形成)の有無を調べ
た。pBII−7のバチルス・ステアロサーモフィルス
染色体DNA由来の内胴ndI[l−3al  IのD
NA断片を有するプラスミド(pH5−6)を有する大
腸菌、Sal I−Acc 1のDNA断片を有するプ
ラスミド(pHA−1)を有する大腸菌、その他第6図
に示すプラスミドを有する大腸菌にクリアーゾーン形成
(ハロー形成)が認められた。
結果を第6図に示す。リパーゼ遺伝子がSal 1−A
cclの約1.7kbのDNA領域に存在することが示
唆された。
(81D N A塩基配列の決定 実施例1と同様にしてpHs−6プラスミドの挿入DN
A断片の塩基配列を決定した。
その結果、第2図に示すようなオープンリーディングフ
レームの存在を認めた。
又、大腸菌JM83 (pHs−6)を3%ポリペプト
ン培地(pH6,0)を用いて37℃で24時間培養後
、集菌し、1(10mM l−リス塩酸(pH7,5)
  0.2mM硫酸亜鉛緩衝液を培養液の115倍量に
サスペンドし凍結溶解後、超音波破壊・抽出した上澄よ
り0.511J/ml!のリパーゼ活性を得た。
実施例3 (1)ハロー欠損株のtWI製 前述トリブチリン寒天培地でハローを形成するバチルス
・ステアロサーモフィルス(Bacillusstea
rothermophilus) C021株を、ニト
ロソグアニジン処理しくJ、of Bacteriol
ogy 154 (21831−837”83 ) 、
0.2%(v/v)トリブチリン寒天培地にてハローを
形成しない変異株NL−1を得た。(2)プラスミドベ
クターの調製 実施例2と同様にして得たプラスミドpHs−6を制限
酵素Sma  Iを用いて切断し、旧ndI[[リンカ
−を付け、l1indl[制限酵素で切断し、両側に旧
ndnl切断部位をもつプラスミドpH5−6−1を得
た。  (Molecular Cloning ed
、Maniatis et al p392−393C
old  Spring  l1arber  Lab
oratory  ロ、S、A、)一方、バチルス・ス
テアロサーモフィルス(Bacillus stear
othermophilus )のプラスミドp’rB
90を11indll[制限酵素で切断し、前記pH5
−6−1の11ind m D N A断片を常法によ
り連結させプラスミドを得た。
(3)ハロー欠損株の形質転換 前記(1)のハロー欠損株に前記(2)のプラスミドを
導入し、ハロー欠損株を形質転換した。(プロトプラス
ト法: J、of Bacteriology 149
.(3)、 824−830゛82) かかる形質転換したバチルス・ステアロサーモフィルス
(Bacillus stearothermophi
lus )をテトラサイクリン(5μg/mjりを含む
0.2%(V/V)I−リプチリン寒天培地で培養しハ
ローを形成を認めた。
(効果) 以上詳述したように、本発明によりリパーゼをコードす
るDNA配列及びプラスミドが可能になり、遺伝子工学
的にリパーゼの生産等が可能になったものである。例え
ば、1.3位特異性リパーゼ、耐熱性リパーゼ等の産業
的に有用なリパーゼをコードするDNA配列、かかるD
NA配列を有するプラスミド、かかるプラスミドの利用
による遺伝子工学的1.3位特異性リパーゼ、耐熱性リ
パーゼ等の生産が可能になったものであり、産業の発達
に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
第1図はシュードモナス・フラジのリパーゼをコードす
るDNA配列及び対応するアミノ酸配列を示す図面であ
る。 (式中Aはデオキシアデニル基を、Gはデオキシグアニ
ル基を、Cはデオキシアデニル基を、Tはチミジル基を
表す。) 第2図はバチルス・ステアロサーモフィラスのリパーゼ
をコードするDNA配列及び対応するアミノ酸配列を示
す図面である。 (式中^はデオキシアデニル基を、Gはデオキシグアニ
ル基を、Cはデオキシシチジル基を、Tはチミジル基を
表す。) 第3図はシュードモナス・フラジのリパーゼをコードす
るDNA配列を有するプラスミドpKK−0(4,7k
b )の制限酵素切断地図を示す図面である。 第4図はバチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼ
をコードするDNA配列を有するプラスミドpBII−
7(10,2kb)の制限酵素切断地図を示す図面であ
る。 第5図はρKK−0(4,7kb ) 、pKK−0,
9(3,6kb) 、pss−t、e  (4,3kb
 ’) 、pKK−1,1(3,8kb )、pHl1
−1.0  (3,7kb ) 、ptls−0,4(
3,1kb )の各挿入DNA断片とトリブチリン培地
におけるクリアゾーンの形成の有無(ハロー形成5Il
alo+はハロー形成有り、1lalo−はハロー形成
無し)を示す図面である。 第6図はpBII−7(10,2kb) 、pH1l−
1、ptls−6、pHP−5、pEP−4、pSA−
1(4,4kb)の各挿入DNA断片とトリブチリン培
地におけるクリアゾーンの形成の有無(ハロー形成s 
Halo+はハロー形成有り、1lalo−はハロー形
成無し)を示す図面である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)リパーゼをコードするDNA配列。 (2)−−A−Gly−X−Ser−Y−Gly−B−
    −のアミノ酸配列に対応するDNA配列を含む特許請求
    の範囲第(1)項記載のDNA配列。 (但し、A、X、Y、Bはアミノ酸を表す)(3)Aが
    Ileu又はAla、XがHis又はLeu、YがGl
    n又はLeu、若しくはBがAla又はGlyである特
    許請求の範囲第(1)項又は第(2)項記載のDNA配
    列。 (4)シュードモナス(Pseudomonas)属の
    リパーゼをコードする特許請求の範囲第(1)から第(
    3)項のいずれかに記載のDNA配列。 (5)シュードモナス(Pseudomonas)属が
    シュードモナス・フラジ(Pseudomonas f
    ragi)である特許請求の範囲第(4)項記載のDN
    A配列。 (6)AがIleu、XがHis、YがGln、及びB
    がAlaである特許請求の範囲第(4)項又は第(5)
    項記載のDNA配列。 (7)バチルス(Bacillus)属のリパーゼをコ
    ードする特許請求の範囲第(1)から第(3)項のいず
    れかに記載のDNA配列。 (8)バチルス(Bacillus)属がバチルス・ス
    テアロサーモフィルス(Bacillus stear
    othermo−philus)である特許請求の範囲
    第(7)項記載のDNA配列。 (9)AがAla、XがLeu、YがLeu及びBがG
    lyである特許請求の範囲第(8)項記載のDNA配列
    。 (10)リパーゼをコードするDNA配列を有するプラ
    スミド。 (11)−−A−Gly−X−Ser−Y−Gly−B
    −−のアミノ酸配列に対応するDNA配列を有する特許
    請求の範囲第(10)項記載のプラスミド。 (但し、A、X、Y、Bはアミノ酸を表す)(12)A
    がIleu又はAla、XがHis又はLeu、YがG
    ln又はLeu、若しくはBがAla又はGlyである
    特許請求の範囲第(10)項又は第(11)項記載のプ
    ラスミド。 (13)シュードモナス(Pseudomonas)属
    のリパーゼをコードするDNA配列を有する特許請求の
    範囲第(10)項乃至第(12)項のいずれかに記載の
    プラスミド。 (14)シュードモナス(Pseudomonas)属
    がシュードモナス・フラジ(Pseudomonas 
    fragi)である特許請求の範囲第(13)項記載の
    プラスミド。 (15)AがIleu、XがHis、YがGln、及び
    BがAlaである特許請求の範囲第(13)項又は第(
    14)項記載のプラスミド。 (16)バチルス(Bacillus)属のリパーゼを
    コードする特許請求の範囲第(10)乃至第(12)項
    のいずれかに記載のプラスミド。 (17)バチルス(Bacillus)属がバチルス・
    ステアロサーモフィルス(Bacillus stea
    rothermo−philus)である特許請求の範
    囲第(16)項記載のプラスミド。 (18)AがAla、XがLeu、YがLeu及びBが
    Glyである特許請求の範囲第(17)項記載のプラス
    ミド。 (19)リパーゼをコードするDNA配列を有するプラ
    スミドを用いてリパーゼを生産する方法。 (20)リパーゼをコードするDNA配列を有するプラ
    スミドが特許請求の範囲第(11)項から第(18)項
    のいずれかに記載のプラスミドである特許請求の範囲第
    (19)項記載のリパーゼを生産する方法。
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