JPS62228279A - Ｄｎａ配列、プラスミド及びリパ−ゼを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリパーゼをコードするＤＮＡ配列、プラスミド
及びリパーゼを生産する方法に関する。

更に詳しくは、−Δ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｙ
−Ｂ−（但し、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｂはアミノ酸を表す）のア
ミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を含むリパーゼをコー
ドするＤＮＡ配列、プラスミド及びリパーゼを生産する
方法に関する。

（従来技術） 今までにアミノ酸配列が報告されているリバーセハ、動
物のリパーゼとして■豚の膵臓のリパーゼ及び■ラット
の舌下線のリパーゼがあり、微生物のリパーゼは■５Ｌ
ａｐｈｔｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｙｉｃｕｓのリパーゼが
報告されているのみで、その他の微生物のリパーゼは知
られていない。

リパーゼのなかには８、トリグリセライドをアトランダ
ムに水解するリパーゼと１，３位を特異的に氷解する所
謂１．３位特異性リパーゼが知られている。かかる１、
３位特異性リパーゼはカビ（例えばリゾプス属等）に多
く、細菌ではシェードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　）　１７１のうち、シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ　）が報告されている。

（＾１ｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ　Ｊ、　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ
　Ｒｅｓ、　５　３９０　　’６４又、リパーゼの性質
から比較的高温域で活性を有する所謂耐熱性リパーゼが
知られている。例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　）属−リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）　Ｉ
ｓ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に多り、バチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓＬｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）等が知られている
。

本発明のようなリパーゼをコードするＤＮＡ配列、これ
らのＤＮＡ配列を有するプラスミド及びこれらのプラス
ミドを用いたリパーゼの生産方法は知られていない。

（発明の目的） 本発明者等は、リパーゼをコードするＤＮＡ配列、プラ
スミド及びリパーゼの生産方法を目的とした。具体的例
としては、シュードモナス屈の一つであるシュードモナ
ス°フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａｇｉ　）の
有する１、３位特異性リパーゼ遺伝子をクローニングし
、リパーゼをコードするＤＮＡ配列を決定すること、そ
の他バチルス屈の一つであるバチルス・ステアロサーモ
フィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）の有する耐熱性リパーゼ遺伝子をクロー
ニングし、リパーゼをコードするＤＮＡ配列を決定する
こと、かかるＤＮＡ配列を有するプラスミドを得ること
、これらのプラスミドを用いてリパーゼを生産すること
をを目的とした。

（発明の構成） 本発明者等は前記目的を達成すべく鋭意研究の結果、シ
ュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｒａ
ｇｉ　）の有する１、３位特異性リパーゼをコードする
ＤＮＡ配列を含むプラスミドのクローニング、リパーゼ
をコードするＤＮＡ配列の決定、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）の有する耐熱性リパーゼをコードす
るＤＮＡ配列を含むプラスミドのクローニング、リパー
ゼをコードするＤＮＡ配列の決定及び大腸菌、バクテリ
ア等を用いたリパーゼの生産に成功し、既知のリパーゼ
と比較検討するなかで、本発明のリパーゼに共通するア
ミノ酸配列及びこれに対応する塩基配列を見出し、本発
明を完成するに到った。即ち、本発明はリパーゼをコー
ドするＤＮＡ配列、リパーゼをコードするＤＮＡ配列を
有するプラスミド及びかかるプラスミドを用いてリパー
ゼを生産する方法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

■まず、（ａｌ　ＩＪパーゼの遺伝情報を担う染色体Ｄ
ＮＡを得る。

本発明の目的とするリパーゼの遺伝情報を有する細菌が
好ましく、例えばランダムリパーゼや１゜３位特異性リ
パーゼを有する菌、例えば、Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ属：　Ｒ
ｈ１ｚｏｐｕｓ　ｄｅｌｅｍａｒ、　Ｒｈ１ｚｏｐｕｓ
　ｎ１ｖｅｕＳ　等、　Ｍｕｃｏｒ　　属　：　　Ｍｕ
ｃｏｒ　　ｍ１ｅｈｅｉ１　八ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　
　［、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属等のカビ類、Ｃａｎｄ
　ｉｄａ属等の酵母類−、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍ
等のバクテリア類等が好ましく、好適にはシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）属が適当であり、例え
ば、１．３位特異性リパーゼを有するシュードモナス・
フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ　）を用
いることができる。又、耐熱性リパーゼを有する菌が好
ましく、好適にはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｕｓ
が適当であり、例えばバチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐ
ｈｉｌｕｓ　）を用いることができる。

その他のリパーゼ生産菌を用いることは自由である。

リパーゼの遺伝情報を担う染色体ＤＮＡは、Ｍａｒｍｕ
ｒ等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ３．２０８−２１８　’６１）　、
これを改良したＣｏｌｅｍａｎに等の方法（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１５３　（２
１９０５−９１５’８３）等公知の方法を利用して調製
することができる。

（ｂ）調製された染色体ＤＮＡをＡｌｕ　　１．５ａｕ
３八、Ｔａｑ　ｌ　、　ｆｌａｐ　［、、ｆｌａｐ　Ｉ
Ｉ、ｆｌａｅＩＩ［、ｌ１ｉｎｄｌｌ１等の公知の制限
酵素の１　、ｆｆｆｌ又は２種以上を用いて部分分解若
しくは完全骨ＩＷすることができる。

（Ｃ）部分分解されたＤＮＡは、蔗糖密度勾配超遠心法
、アガロース電気泳動法等の公知の方法を用いて部分精
製することができる。（「昆虫のバイオテクノロジー」
三宅端等ｍｐ１２２４３２）　　（講談社０部分精製し
たＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入することができる。

（ａ）ベクターＤＮＡは、宿主内で複製でき、既知の制
限酵素切断部位を持ち、栄養要求性、薬剤耐性、温度感
受性といった有用マーカーを持つ公知のベクターを利用
することができ、例えば、ｐＵＣ９、ｐＵＣ８、ｐＵｃ
１９、ｐＵｃ１８、ｐＩ３Ｒ３２２、ｐＴＢ９０、ｐＵ
Ｉ３１１０等を利用することができる。

（ｂ）　ベクターＤＮＡをＢａｍ　Ｈ１、ＥｃｏＲ１、
１ｌｉｎｄｌ［Ｉ等の制限酵素で切断し、前記部分精製
したＤＮＡをリガーゼ（ＤＮＡ連結酵素）等を用い、公
知の方法を利用して連結し、部分精製したＤＮＡをベク
ターＤＮＡに挿入し、組換え体プラスミドを得ることが
できる。

■かかる組換え体プラスミドを用いて大腸菌（例えば、
Ｅ、Ｃｏ１１　：　Ｊ、Ｍ、８３等）、枯草菌（例えば
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ等）、シュードモナス屈の菌（例えば、Ｐｓｅｕ
ｄｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ等）等の形質転換をすること
ができる。

又、形質転換は塩化カルシウム法、プロトプラスト法等
の公知の方法を利用することができる。

形質転換した菌は常法により培養して増殖させることが
できる。（「昆虫のバイオテクノロジー」三宅端等編ｐ
？？−８６）　　（講談社）■形質転換した菌から、リ
パーゼ遺伝子を含む菌を選択分離することができる。

リパーゼを生産する菌株の分離にトリブチリン寒天培地
を用いることが簡便である。（Ｂｅｒｎｅｒ、　Ｄ几、
　ａｎｄ　ｌｌａｍｍｏｎｄ、Ｅ、Ｇ、　Ｌｉｐｉｄｓ
、５，５８８　’７０　）■形質転換した菌のなかから
トリブチリン培地においてクリアーゾーンを形成（ハロ
ー形成）する菌株を分離ずれぼりパーゼ遺伝子を含む菌
を選択分離することができる。

この菌からアルカリ法、ＳＤＳ法等の公知の方法を用い
てリパーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを得ることが
できる。

第３図にシュードモナス・フラジのリパーゼをコードす
るＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＫＫ−０を各種制限
酵素により分解し、アガロースゲル電気泳動法を用いた
測定に基づいて作成した制限酵素切断地図を一例として
示す。

第４図にバチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼ
をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＢ１１−
７を各種制限酵素により分解し、アガロースゲル電気泳
動法を用いた測定に基づいて作成した制限酵素切断地図
を一例として示す。

０次に、リパーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをさら
に短いＤＮＡ断片に限定することができる。

゛即ち、リパーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＫ
Ｋ−０、ｐＢｌｌ−７等）を各種の制限酵素を用いて切
断し、切断されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターにサ
ブクローニングして大腸菌等を形質転換させ、前記トリ
ブチリン培地におけるクリアーゾーン形成（ハロー形成
）大腸菌等を選択し、そのプラスミドを得ることができ
る。

第５図にｐＫＫ−０のｌｌ１ｎｄｌＩ［、Ｓｍａ　ｌ、
Ｂａ１ｌ、ＥｃｏＲｌの各種制限酵素による切断ＤＮＡ
断片を挿入したプラスミドを有する大腸菌のトリブチリ
ン寒天培地におけるクリアーゾーン形成（ハロー形成）
の有無の一例を示す。第５図よりシュードモナス・フラ
ジ（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　　ｆｒａｇｉ　）のリパー
ゼのＤＮＡ配列が１ｌｉｎｄ　ｍ−Ｂａ１１間の約１．
０ｋｂのＤＮＡ領域（ｐＨＢ−１，０）に存在すること
が示唆される。

又、第６図にｐＢｌｌ−７のｌ１ｉｎｄＩ［Ｉ、Ｓａｌ
　Ｉ　％　Ｐｓｔｌ。

Ａｃｃ　Ｉの各種制限酵素による切断ＤＮＡ断片を挿入
したプラスミドを有する大腸菌のトリブチリン寒天培地
におけるクリアーゾーン形成（ハロー形成）の有無の一
例を示す。第６図よりバチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）のリパーゼのＤＮＡ配列がＳａｌ　１−Ａ
ｃｃ　１間の約１．７ｋｂのＤＮＡ領域（ｐＳＡ−１＞
に存在することが示唆される。

■次に、リパーゼのＤＮＡ配列が存在するＤＮＡ領域の
塩基配列を公知の方法（例えば、Ｓａｎｇｅｒ等による
ｄｉｄｅｏｘｙ法：　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、ｅｔ　ａｔ　
ｒ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７
４．５４６３　’７７等の方法）を用いて決定すること
ができる。

例えば、前記ｐＨＢ−１，０の塩基配列の内、プロモー
タ一部を除いたＤＮＡ配列及びこれに対応するアミノ酸
配列を示すと第１図のようになる。即ち、第１図のオー
プンリーディングフレームより、シュードモナス°フラ
ジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ　）の１．３
位特異性リパーゼをコードするＤＮＡ配列は、１３５の
アミノ酸に相当する配列からなることがわかる。

又、例えば、前記ｐＳＡ−１の塩基配列の内、プロモー
タ一部を除いたＤＮＡ配列及びこれに対応するアミノ酸
配列を示すと第２図のようになる。即ち、第２図のオー
プンリーディングフレームより、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ　ｔｅａｒｏ　ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈ　ｉ　ｌｕｓ　）の耐熱性リパーゼをコー
ドするＤＮＡ配列は、２４７のアミノ酸に相当する配列
からなることがわかる。

以上の結果、及び公知のリパーゼの塩基配列及びこれに
対応するアミノ酸配列の比較結果から、Ｓｅｔがリパー
ゼの活性中心であることが文献（Ｂ。

Ｂ、Ａ、６６０　１４８−１５０　１９８１）から推察
され、このＳｅｔを中心にしたアミノ酸配列を整理する
と、次の表−１のようになる。

（以下余白） 表−１ ＰＩＧ　　　−−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｙ−１１ｉｓ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｔ−−ＲＡＴ　　−−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ−−Ｓｔａ　　　−−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｇｌ
ｙ−１１ｉｓ−Ｓｅｔ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−−Ｐ
ｓｅ　　−−Ｌｅｕ４１ｅ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−−Ｂａｃ　　　−−Ｖａｌ−
＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅ＋ｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−（但し、ＰＩＧは豚の膵臓のリパーゼ、ＲＡＴ
はラットの舌下線のリパーゼ、ＳｔａはＳ　ｔａｐｈ　
ｉ　１ｏｃｏｃｃｕｓｈｙｉｃｕｓのリパーゼ、Ｐｓｅ
はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉのリパーゼ、Ｂ
ａｃはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓのリパーゼの活性中心のアミノ酸配列を表す
、）表−１より（−Ａ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌ
ｙ−８−）　　（但し、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｂはアミノ酸を表
す）のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列がリパーゼに
共通のＤＮＡ配列であることがわかる。以上の結果より
、本発明は、Ａが１ｉｅｕ又はＡｌａ　、　ＸがＩＩ　
ｉ　ｓ又はＬｅｕ　、　ＹがＧｉｎ又はＬｅｕ　ｓ若し
くはＢがＡｌａ又はＧｌｙであるようなアミノ酸配列に
対応する塩基配列を含むリパーゼをコードするＤＮＡ配
列及びかかるＤＮＡ配列を有するプラスミドである。例
えば、ＡがＩｌｅｕ、Ｘが１１１３．、ＹがＧｉｎ、及
びＢがＡｌａのときシュードモナス・フラジのリパーゼ
をコードするＤＮＡ配列とすることができ、ＡがＡｌａ
　、　ＸがＬｅｕ　、　ＹがＬｅｕ及びＢがＧｌｙのと
きバチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼをコー
ドするＤＮＡ配列とすることができる。

次に、本発明のＤＮＡプラスミドを用いてリパーゼを生
産することができる。

例えば、シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏ
ｎａｓｆｒａｇｉ）のリパーゼの場合、前記ｐＫＫ−０
、ｐＫＫ−１゜１又はｐＨＢ−１，０プラスミドベクタ
ーを有する菌を公知の培地を用いて培養し、培養液上澄
よりリパーゼを分離・精製したり、或いは菌体を超音波
等の手段を用いて破壊しリパーゼを抽出・分離・精製し
て得ることができる。バチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ　）の場合も同様である。

（実施例） 以下実施例により本発明の実施態様を説明する。

実施例１ （１１１Ｊパーゼの遺伝情報を担う染色体ＤＮＡの調製
と切断 シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｏ＋ｏｎａｓ　
ｆｒａｇｉ）　ＩＰｏ　３４５８株からＭａｒｎ＋ｕｒ
等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　３．２０８−２１８　’６１　）を改
良したＣｏ１ｅｎ＋ａｎ　Ｋ等の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　［ｌａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１５３　（２１９
０５−９１５’８３　’）を用いて染色体ＤＮＡを調製
した。

この結果、ＯＤ２６（１０）０　Ｄ２８０　＝１．８程
度のかなり純粋な染色体ＤＮＡを調製することができた
。

制限酵素５ａｕ３　Ａを用いて、常法により前記ＤＮＡ
を部分分解し、１０％−４０％蔗糖密糖蜜配遠心分離を
おこなって２〜６　ｋｂ画分のＤＮＡを調製した。

（「昆虫のバイオテクノロジー」三宅端等ｍｐ１２２−
１３２）　　（講談社）の方法を用いた。

（２）ベクターＤＮＡの調製と切断 アンピシリン耐性を有する多コピー性プラスミドｐ　Ｕ
　Ｃ９（Ｖｉｅｉｎａ、Ｊ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、
Ｊ、　Ｇｅｎｅ　１９＋２５９　　（’８２　＞　のプ
ラスミドＤＮＡを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　ｅｄ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　ｐ９
２−９４Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｅｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　１１．ｓ、八、）に従ってｊｇＩ
製し、制限酵素Ｂａｏ＋　Ｈ１で切断し、ベクターＤＮ
Ａを調製した。

（３）染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの挿入前記（１
）で得た染色体ＤＮＡと（２）で得たベクターＤＮＡを
常法によりＴ−４ＤＮＡリガーゼを用いて　　・連結さ
せた。

（４）組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換ＩＥ
、Ｃｏ１１　ＪＭ８３をＫｕｓｈｎｅｒ　Ｓ、Ｒ，の方
法（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｅｄ、Ｈ
，Ｉｌ、　［１ｏｙｅｒ　ａｎｄ　Ｓ、Ｎ１ｃｏｓｉａ
ｐ１７　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎ
ｄ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　）により処理し、（３）で得
たりガーゼ反応物を加え、アンピシリン（５ｅｕｇ／糟
１）、５−ブロモ−４−クロロ−３−クンドリル−／？
−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ−３０μｇ　／　ｍｌ
）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一夜培養し、
白色のコロニーを得た。

（［昆虫のバイオテクノロジー」三宅端等ＷＡｐ７７−
８６）（講談社）の方法を用いた。

（５）リパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離（ａ）ト
リブチリン寒天培地の調製 トリブチリンを０．５Ｖ／Ｖ％とアンピシリン（５０μ
ｇ／ｍｇ）を寒天培地に加えて、トリブチリン寒天培地
を調製した。

かかるトリブチリン寒天培地をリパーゼ生産菌株のスク
リーニングに用いる為である。（Ｂｅｒｎｅｒ、Ｄ、Ｌ
、　ａｎｄ　ｌｌａｍｍｏｎｄ、Ｅ、Ｇ、　Ｌｉｐｉｄ
ｓ、５．５８８　’７０　）尚、Ｈ，Ｃｏ１１　ＪＭ８
３はトリブチリン寒天培地で培養してもクリアーゾーン
の形成（ハロー形成）は認められなかった。

又・シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｒａｇｉ　）　ＩＰｏ　３４５８株をトリブチリン寒
天培地で培養するとクリアーゾーンの形成（ハロー形成
）が認められた。

（ｂｌリパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離前記（４
）で得た白色のコロニー約４（１００株を（ａｌのトリ
ブチリン寒天培地にスポットして一夜ｉ養した結果、ク
リアーゾーンを形成（ハロー形成）する菌株一つを得た
。

この菌株の大腸菌をＪＭ８３　　（ｐＫＫ−０）と名付
けた。

プラスミドｐＫＫ−０の制限酵素切断地図を第３図に示
す。

（７）プラスミドＤＮＡの解析 ｐＫＫ−０プラスミドを各種制限酵素により切断し、各
ＤＮＡ断片をｐＵＣ９にサブクローニングして大腸菌を
形質転換させ、前記と同様にしてトリブチリン培地にお
けるクリアーゾーン形成（ハロー形成）の有無を調べた
。ｐＫＫ−０のシュードモナス・フラジ染色体ＤＮＡ由
来の内胴ｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲｌのＤＮＡ断片を有するプ
ラスミド（ｐＫＫ−１，１）及び旧ｎｄｎ［−Ｂａｌｌ
のＤＮＡ断片を有するプラスミド（ｐＨＢ−１，０’）
を有する大腸菌にクリアーゾーン形成（ハロー形成）が
認められた。

結果を第５図に示す。リパーゼ遺伝子が旧ｎｄＩＩ［−
Ｂａｌｌの約１．ＯｋｂのＤＮＡ領域に存在することが
示唆された。

（８１Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列の決定 Ｓａｎｇｅｒ等によるｄｉｄｅｏｘｙ法（Ｓａｎｇｅｒ
、Ｆ、ｅｔ　ａｌＰｒｏｃ、Ｎａ口、Ａｃｏｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　７４．５４６３　’？？　）により、ｐＨＢ
−１，０プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定
した。

その結果、第１図に水子ようなオープンリーディングフ
レームの存在を認めた。

又、大腸菌ＪＭ８３　（１）ＫＫ−０）を３％ポリペプ
トン培地（ｐｔ１６．０　）を用いて３７°Ｃで２４時
間培養後、集菌し、１（１０ｍＭ　　トリス塩酸（ｐＨ
７，５）−０，２ｍＭ硫酸亜鉛緩衝液の１１５倍量にサ
スペンドし凍結溶解後、超音波破壊・抽出した上澄より
２１０／ｍ　１のリパーゼ活性を得た。

実施例２ （１）リパーゼの遺伝情報を担う染色体ＤＮＡの調製と
切断 バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）　ＩＦｏ　
１２５５０株から実施例１と同様にして染色体ＤＮＡを
調製した。

制限酵素１１ｉｎｄｎｌを用いて、常法により前記ＤＮ
Ａを完全分解し、染色体ＤＮＡを調製した。

（２）ベクターＤＮＡの調製と切断 アンピシリン耐性を有する多コピー性プラスミドｐＵＣ
９を実施例１と同様にして調製し、制限酵素１１ｉｎｄ
Ｉ［Ｉで切断し、ベクターＤＮＡを調製した。

（３）染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの挿入前記（１
）で得た染色体ＤＮＡと（２）で得たベクターＤＮＡを
常法によりＴ−４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させた。

（４）組換え体プラスミドによる大腸菌の形質転換Ｅ、
Ｃｏ１１　ＪＭ８３を用い、実施例１と同様にして白色
のコロニーを得た。

（５）リパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離（ａ）ト
リブチリン寒天培地の調製 実施例１と同様にした。

バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）　ＩＰＯ１
２５５０株をトリブチリン寒天培地で培養するとクリア
ーゾーンの形成（ハロー形成）が認められた。

（ｂ）　ＩＪパーゼ遺伝子を含む大腸菌の選択分離前記
（４）で得た白色のコロニー約６（１００株を（ａｌの
トリブチリン寒天培地にスポットして一夜培養した結果
、クリアーゾーンを形成（ハロー形成）する菌株一つを
得た。

この菌株の大腸菌をＪＭ８３　　（ｐＢｌｌ−７”）と
名付けた。

プラスミドｐＩｌ１１−７の制限酵素切断地図を第４図
に示す。

（７）プラスミドＤＮＡの解析 ｐＢｌｌ−７プラスミドを各種制限酵素により切断し、
各ＤＮＡ断片をｐＵＣ９にサブクローニングして大腸菌
を形質転換させ、前記と同様にしてトリブチリン培地に
おけるクリアーゾーン形成（ハロー形成）の有無を調べ
た。ｐＢＩＩ−７のバチルス・ステアロサーモフィルス
染色体ＤＮＡ由来の内胴ｎｄＩ［ｌ−３ａｌ　　ＩのＤ
ＮＡ断片を有するプラスミド（ｐＨ５−６）を有する大
腸菌、Ｓａｌ　Ｉ−Ａｃｃ　１のＤＮＡ断片を有するプ
ラスミド（ｐＨＡ−１）を有する大腸菌、その他第６図
に示すプラスミドを有する大腸菌にクリアーゾーン形成
（ハロー形成）が認められた。

結果を第６図に示す。リパーゼ遺伝子がＳａｌ　１−Ａ
ｃｃｌの約１．７ｋｂのＤＮＡ領域に存在することが示
唆された。

（８１Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列の決定 実施例１と同様にしてｐＨｓ−６プラスミドの挿入ＤＮ
Ａ断片の塩基配列を決定した。

その結果、第２図に示すようなオープンリーディングフ
レームの存在を認めた。

又、大腸菌ＪＭ８３　（ｐＨｓ−６）を３％ポリペプト
ン培地（ｐＨ６，０）を用いて３７℃で２４時間培養後
、集菌し、１（１０ｍＭ　ｌ−リス塩酸（ｐＨ７，５）
　　０．２ｍＭ硫酸亜鉛緩衝液を培養液の１１５倍量に
サスペンドし凍結溶解後、超音波破壊・抽出した上澄よ
り０．５１１Ｊ／ｍｌ！のリパーゼ活性を得た。

実施例３ （１）ハロー欠損株のｔＷＩ製 前述トリブチリン寒天培地でハローを形成するバチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　Ｃ０２１株を、ニト
ロソグアニジン処理しくＪ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ　１５４　（２１８３１−８３７”８３　）　、
０．２％（ｖ／ｖ）トリブチリン寒天培地にてハローを
形成しない変異株ＮＬ−１を得た。（２）プラスミドベ
クターの調製 実施例２と同様にして得たプラスミドｐＨｓ−６を制限
酵素Ｓｍａ　　Ｉを用いて切断し、旧ｎｄＩ［［リンカ
−を付け、ｌ１ｉｎｄｌ［制限酵素で切断し、両側に旧
ｎｄｎｌ切断部位をもつプラスミドｐＨ５−６−１を得
た。　　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｅｄ
、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ　ｐ３９２−３９３Ｃ
ｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ｌ１ａｒｂｅｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　ロ、Ｓ、Ａ、）一方、バチルス・ス
テアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）のプラスミドｐ’ｒＢ
９０を１１ｉｎｄｌｌ［制限酵素で切断し、前記ｐＨ５
−６−１の１１ｉｎｄ　ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を常法によ
り連結させプラスミドを得た。

（３）ハロー欠損株の形質転換 前記（１）のハロー欠損株に前記（２）のプラスミドを
導入し、ハロー欠損株を形質転換した。（プロトプラス
ト法：　Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１４９
．（３）、　８２４−８３０゛８２） かかる形質転換したバチルス・ステアロサーモフィルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ　）をテトラサイクリン（５μｇ／ｍｊりを含む
０．２％（Ｖ／Ｖ）Ｉ−リプチリン寒天培地で培養しハ
ローを形成を認めた。

（効果） 以上詳述したように、本発明によりリパーゼをコードす
るＤＮＡ配列及びプラスミドが可能になり、遺伝子工学
的にリパーゼの生産等が可能になったものである。例え
ば、１．３位特異性リパーゼ、耐熱性リパーゼ等の産業
的に有用なリパーゼをコードするＤＮＡ配列、かかるＤ
ＮＡ配列を有するプラスミド、かかるプラスミドの利用
による遺伝子工学的１．３位特異性リパーゼ、耐熱性リ
パーゼ等の生産が可能になったものであり、産業の発達
に寄与するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス・フラジのリパーゼをコードす
るＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示す図面であ
る。 （式中Ａはデオキシアデニル基を、Ｇはデオキシグアニ
ル基を、Ｃはデオキシアデニル基を、Ｔはチミジル基を
表す。） 第２図はバチルス・ステアロサーモフィラスのリパーゼ
をコードするＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を示
す図面である。 （式中＾はデオキシアデニル基を、Ｇはデオキシグアニ
ル基を、Ｃはデオキシシチジル基を、Ｔはチミジル基を
表す。） 第３図はシュードモナス・フラジのリパーゼをコードす
るＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＫＫ−０（４，７ｋ
ｂ　）の制限酵素切断地図を示す図面である。 第４図はバチルス・ステアロサーモフィルスのリパーゼ
をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドｐＢＩＩ−
７（１０，２ｋｂ）の制限酵素切断地図を示す図面であ
る。 第５図はρＫＫ−０（４，７ｋｂ　）　、ｐＫＫ−０，
９（３，６ｋｂ）　、ｐｓｓ−ｔ、ｅ　　（４，３ｋｂ
　’）　、ｐＫＫ−１，１（３，８ｋｂ　）、ｐＨｌ１
−１．０　　（３，７ｋｂ　）　、ｐｔｌｓ−０，４（
３，１ｋｂ　）の各挿入ＤＮＡ断片とトリブチリン培地
におけるクリアゾーンの形成の有無（ハロー形成５Ｉｌ
ａｌｏ＋はハロー形成有り、１ｌａｌｏ−はハロー形成
無し）を示す図面である。 第６図はｐＢＩＩ−７（１０，２ｋｂ）　、ｐＨ１ｌ−
１、ｐｔｌｓ−６、ｐＨＰ−５、ｐＥＰ−４、ｐＳＡ−
１（４，４ｋｂ）の各挿入ＤＮＡ断片とトリブチリン培
地におけるクリアゾーンの形成の有無（ハロー形成ｓ　
Ｈａｌｏ＋はハロー形成有り、１ｌａｌｏ−はハロー形
成無し）を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リパーゼをコードするＤＮＡ配列。 （２）−−Ａ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｂ−
   −のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を含む特許請求
   の範囲第（１）項記載のＤＮＡ配列。 （但し、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｂはアミノ酸を表す）（３）Ａが
   Ｉｌｅｕ又はＡｌａ、ＸがＨｉｓ又はＬｅｕ、ＹがＧｌ
   ｎ又はＬｅｕ、若しくはＢがＡｌａ又はＧｌｙである特
   許請求の範囲第（１）項又は第（２）項記載のＤＮＡ配
   列。 （４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
   リパーゼをコードする特許請求の範囲第（１）から第（
   ３）項のいずれかに記載のＤＮＡ配列。 （５）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属が
   シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆ
   ｒａｇｉ）である特許請求の範囲第（４）項記載のＤＮ
   Ａ配列。 （６）ＡがＩｌｅｕ、ＸがＨｉｓ、ＹがＧｌｎ、及びＢ
   がＡｌａである特許請求の範囲第（４）項又は第（５）
   項記載のＤＮＡ配列。 （７）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のリパーゼをコ
   ードする特許請求の範囲第（１）から第（３）項のいず
   れかに記載のＤＮＡ配列。 （８）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属がバチルス・ス
   テアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒ
   ｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）である特許請求の範囲
   第（７）項記載のＤＮＡ配列。 （９）ＡがＡｌａ、ＸがＬｅｕ、ＹがＬｅｕ及びＢがＧ
   ｌｙである特許請求の範囲第（８）項記載のＤＮＡ配列
   。 （１０）リパーゼをコードするＤＮＡ配列を有するプラ
   スミド。 （１１）−−Ａ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｂ
   −−のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を有する特許
   請求の範囲第（１０）項記載のプラスミド。 （但し、Ａ、Ｘ、Ｙ、Ｂはアミノ酸を表す）（１２）Ａ
   がＩｌｅｕ又はＡｌａ、ＸがＨｉｓ又はＬｅｕ、ＹがＧ
   ｌｎ又はＬｅｕ、若しくはＢがＡｌａ又はＧｌｙである
   特許請求の範囲第（１０）項又は第（１１）項記載のプ
   ラスミド。 （１３）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
   のリパーゼをコードするＤＮＡ配列を有する特許請求の
   範囲第（１０）項乃至第（１２）項のいずれかに記載の
   プラスミド。 （１４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
   がシュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
   ｆｒａｇｉ）である特許請求の範囲第（１３）項記載の
   プラスミド。 （１５）ＡがＩｌｅｕ、ＸがＨｉｓ、ＹがＧｌｎ、及び
   ＢがＡｌａである特許請求の範囲第（１３）項又は第（
   １４）項記載のプラスミド。 （１６）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のリパーゼを
   コードする特許請求の範囲第（１０）乃至第（１２）項
   のいずれかに記載のプラスミド。 （１７）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属がバチルス・
   ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ
   ｒｏｔｈｅｒｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ）である特許請求の範
   囲第（１６）項記載のプラスミド。 （１８）ＡがＡｌａ、ＸがＬｅｕ、ＹがＬｅｕ及びＢが
   Ｇｌｙである特許請求の範囲第（１７）項記載のプラス
   ミド。 （１９）リパーゼをコードするＤＮＡ配列を有するプラ
   スミドを用いてリパーゼを生産する方法。 （２０）リパーゼをコードするＤＮＡ配列を有するプラ
   スミドが特許請求の範囲第（１１）項から第（１８）項
   のいずれかに記載のプラスミドである特許請求の範囲第
   （１９）項記載のリパーゼを生産する方法。