JPH04293487A - ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 - Google Patents
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法Info
- Publication number
- JPH04293487A JPH04293487A JP2406885A JP40688590A JPH04293487A JP H04293487 A JPH04293487 A JP H04293487A JP 2406885 A JP2406885 A JP 2406885A JP 40688590 A JP40688590 A JP 40688590A JP H04293487 A JPH04293487 A JP H04293487A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysis
- cells
- expression
- poly
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920000739 poly(3-hydroxycarboxylic acid) polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract description 12
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 241000702315 Escherichia virus phiX174 Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 20
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 3
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 38
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 abstract description 3
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 abstract 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 210000004395 cytoplasmic granule Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、３−ヒドロキシカルボ
ン酸のホモ−および／またはコポリマーを、天然または
キメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌を引き起こすことにより
、当該ポリマーを含むグラム陰性菌の細胞から遊離する
方法に関する。
ン酸のホモ−および／またはコポリマーを、天然または
キメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌を引き起こすことにより
、当該ポリマーを含むグラム陰性菌の細胞から遊離する
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】３−ヒドロキシカルボン酸のホモ−およ
び／またはコポリマーとは、グラム陰性菌例えばアルカ
リゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ），アチオロジウ
ム（Ａｔｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ），シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ），リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ ），スピリリウム（Ｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）に
より生産され貯蔵され得るものを意味する。特に、これ
らは、３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）のおよび３−ヒド
ロキシ吉草酸（ＰＨＶ）のホモ−および／またはコポリ
マーである。 しかしながら、これらの細菌は、別のポリ（３−ヒドロ
キシカルボン酸）をも貯蔵し得る。ＰＨＢおよびＰＨＶ
の生産および貯蔵方法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第０，０１５，６６９号、ヨーロッパ特許公開第０，０
４６，３４４号およびヨーロッパ特許公開第０，０５２
，４５９号に記載されている。
び／またはコポリマーとは、グラム陰性菌例えばアルカ
リゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ），アチオロジウ
ム（Ａｔｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ），シュードモナス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ），リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ ），スピリリウム（Ｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）に
より生産され貯蔵され得るものを意味する。特に、これ
らは、３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）のおよび３−ヒド
ロキシ吉草酸（ＰＨＶ）のホモ−および／またはコポリ
マーである。 しかしながら、これらの細菌は、別のポリ（３−ヒドロ
キシカルボン酸）をも貯蔵し得る。ＰＨＢおよびＰＨＶ
の生産および貯蔵方法は、例えば、ヨーロッパ特許公開
第０，０１５，６６９号、ヨーロッパ特許公開第０，０
４６，３４４号およびヨーロッパ特許公開第０，０５２
，４５９号に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】Ｓｌａｔｅｒら， Ｊ
． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７０，４４３１および次
頁 （１９８８） から、細胞内でのＰＨＢの生産の原
因である酵素が、ＰＨＢを生産しない細菌細胞中に、例
えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中に
クローニングされ得、そして適当なプラスミドを用いて
発現され得、この場合において、次にクローン化酵素が
細胞内でＰＨＢ合成を引き起こすことが知られている。
． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７０，４４３１および次
頁 （１９８８） から、細胞内でのＰＨＢの生産の原
因である酵素が、ＰＨＢを生産しない細菌細胞中に、例
えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中に
クローニングされ得、そして適当なプラスミドを用いて
発現され得、この場合において、次にクローン化酵素が
細胞内でＰＨＢ合成を引き起こすことが知られている。
【０００４】微生物の細胞からポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）を遊離することは、当該ポリマーが容易に溶
解する抽出剤を用いて乾燥細胞から当該ポリマーを抽出
することにより引き起こされ得る。このような方法は、
例えば、ヨーロッパ特許公開第１５，１２３号に記載さ
れている。これは必然的に、先ず細胞を破壊し従って適
切な抽出剤に浸透性にすることを伴う。これらの方法の
欠点は、抽出剤により細胞からポリマーを溶解すること
のみならずある細胞成分、特に脂質が溶解し、次いでこ
れらの不純物をポリマーから分離する必要があることで
ある。
ルボン酸）を遊離することは、当該ポリマーが容易に溶
解する抽出剤を用いて乾燥細胞から当該ポリマーを抽出
することにより引き起こされ得る。このような方法は、
例えば、ヨーロッパ特許公開第１５，１２３号に記載さ
れている。これは必然的に、先ず細胞を破壊し従って適
切な抽出剤に浸透性にすることを伴う。これらの方法の
欠点は、抽出剤により細胞からポリマーを溶解すること
のみならずある細胞成分、特に脂質が溶解し、次いでこ
れらの不純物をポリマーから分離する必要があることで
ある。
【０００５】ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）を湿っ
た細胞から遊離する一つの可能性は、ヨーロッパ特許公
開第１４５，２２３号に記載されている。これは、細胞
材料を酵素的におよび／または界面活性物質を用いて溶
解させ、その際当該ポリマーは溶解しないままであるこ
とを伴う。細胞材料の溶解は、この場合、数段階で行わ
れ、そしてそれでも溶解は不完全でありかつ溶解しない
細胞成分がポリマー中に残る。
た細胞から遊離する一つの可能性は、ヨーロッパ特許公
開第１４５，２２３号に記載されている。これは、細胞
材料を酵素的におよび／または界面活性物質を用いて溶
解させ、その際当該ポリマーは溶解しないままであるこ
とを伴う。細胞材料の溶解は、この場合、数段階で行わ
れ、そしてそれでも溶解は不完全でありかつ溶解しない
細胞成分がポリマー中に残る。
【０００６】グラム陰性菌を、クローン化溶菌遺伝子の
発現により破壊することも同様に知られている。例えば
、ドイツ特許公開第３，７１５，８４０号は、大腸菌（
Ｅ． ｃｏｌｉ ）細胞を、温度誘発プロモータにより
制御されるキメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌することを記
載しており、この場合、細胞は約３０〜７０分以内に溶
菌される。
発現により破壊することも同様に知られている。例えば
、ドイツ特許公開第３，７１５，８４０号は、大腸菌（
Ｅ． ｃｏｌｉ ）細胞を、温度誘発プロモータにより
制御されるキメラ溶菌遺伝子を用いて溶菌することを記
載しており、この場合、細胞は約３０〜７０分以内に溶
菌される。
【０００７】Ｗｉｔｔｅ， Ｌｕｂｉｔｚ， Ｅｕｒ．
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０， ３９３及び次頁
（１９８９） は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）を、バ
クテリオファージ溶菌遺伝子Ｅを用いて溶菌することを
研究しそして、溶菌の際に直径約３０〜１００ｎｍの小
さいトランスメンブラン溶菌トンネルの形成があり、当
該トンネルを通って細胞内容物が周囲の媒質中に拡散し
得ることを見出した。細胞は約３０〜６０分以内に溶菌
される。このトンネルは非常に小さいので、その大きさ
が細胞のほぼ全容積を満たすポリマーを遊離するために
当該方法を用いることは大規模では時間を消費しすぎる
。
Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０， ３９３及び次頁
（１９８９） は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）を、バ
クテリオファージ溶菌遺伝子Ｅを用いて溶菌することを
研究しそして、溶菌の際に直径約３０〜１００ｎｍの小
さいトランスメンブラン溶菌トンネルの形成があり、当
該トンネルを通って細胞内容物が周囲の媒質中に拡散し
得ることを見出した。細胞は約３０〜６０分以内に溶菌
される。このトンネルは非常に小さいので、その大きさ
が細胞のほぼ全容積を満たすポリマーを遊離するために
当該方法を用いることは大規模では時間を消費しすぎる
。
【０００８】本発明者は、今や、驚くべきことに小さい
トンネルではなくて、その直径が細胞のほぼ全横断面か
らなる開口部の形成があり、細胞エンベロープはその原
形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細胞内に残
り、水性媒質中でポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆
粒の完全な分離が可能である、ポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）顆粒を、当該顆粒を含むグラム陰性菌の細胞
から、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の
発現により遊離する方法を見出すことができた。
トンネルではなくて、その直径が細胞のほぼ全横断面か
らなる開口部の形成があり、細胞エンベロープはその原
形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細胞内に残
り、水性媒質中でポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆
粒の完全な分離が可能である、ポリ（３−ヒドロキシカ
ルボン酸）顆粒を、当該顆粒を含むグラム陰性菌の細胞
から、クローン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の
発現により遊離する方法を見出すことができた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、従って、溶菌
遺伝子発現の誘導前に、二重荷重カチオンのイオン強度
を０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの間に上昇させ、溶菌遺
伝子の発現を、温度の上昇により引き起こし、細胞を回
収し、そして未だ湿った細胞を水または緩衝液中に再懸
濁し、その結果ポリマー顆粒が自然溶菌により遊離され
ることを特徴とする、クローン化された天然またはキメ
ラ溶菌遺伝子の発現によりポリ（３−ヒドロキシカルボ
ン酸）顆粒を含むグラム陰性菌の細胞からポリ（３−ヒ
ドロキシカルボン酸）顆粒を遊離する方法に関する。
遺伝子発現の誘導前に、二重荷重カチオンのイオン強度
を０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌの間に上昇させ、溶菌遺
伝子の発現を、温度の上昇により引き起こし、細胞を回
収し、そして未だ湿った細胞を水または緩衝液中に再懸
濁し、その結果ポリマー顆粒が自然溶菌により遊離され
ることを特徴とする、クローン化された天然またはキメ
ラ溶菌遺伝子の発現によりポリ（３−ヒドロキシカルボ
ン酸）顆粒を含むグラム陰性菌の細胞からポリ（３−ヒ
ドロキシカルボン酸）顆粒を遊離する方法に関する。
【００１０】当該方法を実施するため、ポリ（３−ヒド
ロキシカルボン酸）を生産するグラム陰性菌に、適当な
クローン化溶菌遺伝子の発現による溶菌のために、生体
プログラムを組み込む。溶菌遺伝子は、天然溶菌遺伝子
、例えばバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の溶菌遺伝
子Ｅまたはキメラ溶菌遺伝子であり得る。例えばプラス
ミドｐＳＨ２（第１図）またはｐＡＷ１３上のバクテリ
オファージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅが
好ましくは使用される。プラスミドｐＡＷ１３の製造の
ため、λｐＬプロモーターの制御下に遺伝子Ｅを含む、
プラスミドｐＳＢ１２からのＰｓＨ／ＢａｍＨＩフラグ
メント（Ｂｌａｓｉら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ． １３１， （１９８５）， １１０７及び
次頁） をｐＡＣＹＣ１７７のＰｓＨ／ＢａｍＨＩ開裂
部位に挿入する。得られるプラスミドを次いでＰｓｔＩ
で切断し、その後ｂｌａ遺伝子の破壊のためにＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理する。この方法において得られる
プラスミドｐＡＷ１３は、λｐＬプロモーターの制御下
に溶菌遺伝子Ｅを運ぶ。ポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）を生産するそして溶菌のために生体プログラムを組
み込まれ得るグラム陰性菌の例は、アルカリゲネス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ），アルチオロジウム（Ａｌｔ
ｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ ）， シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）， リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ ）， スピリリウム（Ｓｐｉｒｉｌｌｉｕ
ｍ） および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）であり、その中にＰＨＢ／ＰＨＶ−生産酵素をクロ
ーニングする。
ロキシカルボン酸）を生産するグラム陰性菌に、適当な
クローン化溶菌遺伝子の発現による溶菌のために、生体
プログラムを組み込む。溶菌遺伝子は、天然溶菌遺伝子
、例えばバクテリオファージＰｈｉＸ１７４の溶菌遺伝
子Ｅまたはキメラ溶菌遺伝子であり得る。例えばプラス
ミドｐＳＨ２（第１図）またはｐＡＷ１３上のバクテリ
オファージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅが
好ましくは使用される。プラスミドｐＡＷ１３の製造の
ため、λｐＬプロモーターの制御下に遺伝子Ｅを含む、
プラスミドｐＳＢ１２からのＰｓＨ／ＢａｍＨＩフラグ
メント（Ｂｌａｓｉら， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ． １３１， （１９８５）， １１０７及び
次頁） をｐＡＣＹＣ１７７のＰｓＨ／ＢａｍＨＩ開裂
部位に挿入する。得られるプラスミドを次いでＰｓｔＩ
で切断し、その後ｂｌａ遺伝子の破壊のためにＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで処理する。この方法において得られる
プラスミドｐＡＷ１３は、λｐＬプロモーターの制御下
に溶菌遺伝子Ｅを運ぶ。ポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）を生産するそして溶菌のために生体プログラムを組
み込まれ得るグラム陰性菌の例は、アルカリゲネス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ），アルチオロジウム（Ａｌｔ
ｈｉｏｒｈｏｄｉｕｍ ）， シュードモナス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）， リゾビウム（Ｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍ ）， スピリリウム（Ｓｐｉｒｉｌｌｉｕ
ｍ） および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）であり、その中にＰＨＢ／ＰＨＶ−生産酵素をクロ
ーニングする。
【００１１】細菌細胞を、慣用の方法で、発酵する、即
ちポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の生産に適した基
質上に、例えばエネルギー源として炭水化物を用いて、
使用する細菌により約２８〜３７℃の温度で培養する。 この点について、温度うぃ溶菌遺伝子の温度感性プロモ
ーターが発酵の間に溶菌を引き起こさないように十分に
低く保つことに注意すべきである。
ちポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の生産に適した基
質上に、例えばエネルギー源として炭水化物を用いて、
使用する細菌により約２８〜３７℃の温度で培養する。 この点について、温度うぃ溶菌遺伝子の温度感性プロモ
ーターが発酵の間に溶菌を引き起こさないように十分に
低く保つことに注意すべきである。
【００１２】次いで、二重荷重カチオン濃度を、例えば
ＭｇＳＯ４ 、ＣａＣＯ３ 等を添加することによって
、約０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１
〜０．３ｍｏｌ／ｌに増加する。溶菌は、温度を約４２
℃に上昇させることによって引き起こされ、その始まり
は二重荷重カチオンの高イオン強度によってなお妨げら
れる。細胞は穏やかな遠心分離により回収され、そして
湿った細胞材料は次いで水または水性の緩衝液中に再懸
濁され、その際細胞は自然に破壊しそして細胞質内容物
およびその中に含まれるポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）顆粒は数分以内に遊離される。水は、蒸留水、脱イ
オン水または水道水であり得る。使用され得る水性の緩
衝液は０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌ
、０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＫＨ２ ／Ｋ２ Ｈ
ＰＯ４ 緩衝液等である。
ＭｇＳＯ４ 、ＣａＣＯ３ 等を添加することによって
、約０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは約０．１
〜０．３ｍｏｌ／ｌに増加する。溶菌は、温度を約４２
℃に上昇させることによって引き起こされ、その始まり
は二重荷重カチオンの高イオン強度によってなお妨げら
れる。細胞は穏やかな遠心分離により回収され、そして
湿った細胞材料は次いで水または水性の緩衝液中に再懸
濁され、その際細胞は自然に破壊しそして細胞質内容物
およびその中に含まれるポリ（３−ヒドロキシカルボン
酸）顆粒は数分以内に遊離される。水は、蒸留水、脱イ
オン水または水道水であり得る。使用され得る水性の緩
衝液は０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌ
、０．００１〜０．０１ｍｏｌ／ｌＫＨ２ ／Ｋ２ Ｈ
ＰＯ４ 緩衝液等である。
【００１３】遊離されたポリマー顆粒、細胞質内容物お
よび空の細胞エンベロープは、適当な分離方法によって
、例えば密度勾配遠心分離によって分離され得る。
よび空の細胞エンベロープは、適当な分離方法によって
、例えば密度勾配遠心分離によって分離され得る。
【００１４】
【実施例】例１
クローニングベクターｐＳＨ２の構築（第１図）プラス
ミドｐＳＨ１（Ｓ． Ｈａｉｓｔ， ＰｈｉＸ１７４
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｉｏｎｓ， ｄｉｐｌｏｍａ ｔｈｅｓｉｓ， Ｍｕｎ
ｉｃｈ １９８９） を酵素ＦｓｐＩで適当な制限緩衝
液中で切断すると、平滑断面を持つ５６９７ｂｐおよび
１９６９ｂｐフラグメントを生じる。２つのフラグメン
トをゲル電気泳動によって分離しそして「Ｇｅｎｅ Ｃ
ｌｅａｎ」（Ｂｉｏ １０１Ｉｎｃ． により供給され
る）を用いて精製する。
ミドｐＳＨ１（Ｓ． Ｈａｉｓｔ， ＰｈｉＸ１７４
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｉｏｎｓ， ｄｉｐｌｏｍａ ｔｈｅｓｉｓ， Ｍｕｎ
ｉｃｈ １９８９） を酵素ＦｓｐＩで適当な制限緩衝
液中で切断すると、平滑断面を持つ５６９７ｂｐおよび
１９６９ｂｐフラグメントを生じる。２つのフラグメン
トをゲル電気泳動によって分離しそして「Ｇｅｎｅ Ｃ
ｌｅａｎ」（Ｂｉｏ １０１Ｉｎｃ． により供給され
る）を用いて精製する。
【００１５】プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐＳ
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより供給される）を
、平滑断面を形成する制限酵素ＳｓｐＩおよび５’−突
出断面を形成するＡｆｌＩＩＩを用いて適当な制限緩衝
液中で切断すると、１６９７ｂｐ、７１２ｂｐおよび５
５５ｂｐの３つのフラグメントを生じる。７１２ｂｐフ
ラグメントを「Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ」を用いて溶離し
、そして５’−突出断面をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで
満たす。ｐＳＨ１からの５６９７ｂｐフラグメントをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて適当な緩衝液中でこの７１２
ｂｐフラグメントと結合する。
Ｋ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより供給される）を
、平滑断面を形成する制限酵素ＳｓｐＩおよび５’−突
出断面を形成するＡｆｌＩＩＩを用いて適当な制限緩衝
液中で切断すると、１６９７ｂｐ、７１２ｂｐおよび５
５５ｂｐの３つのフラグメントを生じる。７１２ｂｐフ
ラグメントを「Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ」を用いて溶離し
、そして５’−突出断面をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで
満たす。ｐＳＨ１からの５６９７ｂｐフラグメントをＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて適当な緩衝液中でこの７１２
ｂｐフラグメントと結合する。
【００１６】例２：大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＰＣ１
３６３（Ｐｈａｂａｇｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のトランスフ
ォーメーション 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＰＣ１３６３のトランスフ
ォーメーションを既知の方法で、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， ＮｅｗＹｏｒｋ （１９８２）に記載された方法
により行う。
３６３（Ｐｈａｂａｇｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，
Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のトランスフ
ォーメーション 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＰＣ１３６３のトランスフ
ォーメーションを既知の方法で、例えばＭａｎｉａｔｉ
ｓら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， ＮｅｗＹｏｒｋ （１９８２）に記載された方法
により行う。
【００１７】この目的のため、蒸留水（ｐＨ７）１００
０ｍｌ中ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５
ｇからなる栄養培地であるＬｕｒｅａ Ｂｒｏｔｈ ５
ｍｌに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）ＰＣ １３６３ のプ
レ培養菌１ｍｌを接種しそして３７℃で振とうする。細
胞を遠心分離により回収しそして氷中で１５０ｍｍｏｌ
／ｌＫＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２ および１ｍ
ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌからなるトランスフォーメー
ション緩衝液２５ｍｌ中で懸濁する。再開した遠心分離
後、細胞を２ｍｌのトランスフォーメーション緩衝液中
で再懸濁する。このサスペンション０．１ｍｌをプラス
ミドＤＮＡ（ｐＳＨ２（ｐ１５Ａ）およびｐＳＢ２０−
ＰＨＢ（ｐＨＢ１）（Ｓｌａｔｅｒら Ｊ． Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ． １７０， 第４４３１頁及び次頁 （１
９８８））と混合しそして、約１時間後、１．２ｍｌの
Ｌｕｒｅａ ｂｒｏｔｈ を２８℃で添加する。トラン
スフォーマントは、プラスミドの抗生物質抵抗性標識に
従って選択される。
０ｍｌ中ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５
ｇからなる栄養培地であるＬｕｒｅａ Ｂｒｏｔｈ ５
ｍｌに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）ＰＣ １３６３ のプ
レ培養菌１ｍｌを接種しそして３７℃で振とうする。細
胞を遠心分離により回収しそして氷中で１５０ｍｍｏｌ
／ｌＫＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌＭｇＣｌ２ および１ｍ
ｍｏｌ／ｌＴｒｉｓＨＣｌからなるトランスフォーメー
ション緩衝液２５ｍｌ中で懸濁する。再開した遠心分離
後、細胞を２ｍｌのトランスフォーメーション緩衝液中
で再懸濁する。このサスペンション０．１ｍｌをプラス
ミドＤＮＡ（ｐＳＨ２（ｐ１５Ａ）およびｐＳＢ２０−
ＰＨＢ（ｐＨＢ１）（Ｓｌａｔｅｒら Ｊ． Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ． １７０， 第４４３１頁及び次頁 （１
９８８））と混合しそして、約１時間後、１．２ｍｌの
Ｌｕｒｅａ ｂｒｏｔｈ を２８℃で添加する。トラン
スフォーマントは、プラスミドの抗生物質抵抗性標識に
従って選択される。
【００１８】例３：大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）ＰＣ１
３６３の発酵および溶菌（ｐＳＢ２０、ｐＳＨ２）Ｌｕ
ｒｅａ Ｂｒｏｔｈ １０ｍｌに例２と同様にして調製
されたＥ． ｃｏｌｉ のオーバーナイト培養菌（ｏｖ
ｅｒｎｉｇｈｔ ｃｕｌｔｕｒｅ） を接種しそして光
学密度ＯＤ６００ が０．２〜０．９になるまで２８℃
で培養する。次いで２ｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４ 溶液を
、最終濃度が０．２ｍｏｌ／ｌになるまで添加しそして
当該混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。次
いで温度を４２℃に上昇させそして３０分後、細胞を遠
心分離により（７０００ｒｐｍ、５分）４℃で回収し、
そして細胞材料を１０ｍｌの蒸留水中で再懸濁する。溶
菌は懸濁の間に１０分以内に起こる。
３６３の発酵および溶菌（ｐＳＢ２０、ｐＳＨ２）Ｌｕ
ｒｅａ Ｂｒｏｔｈ １０ｍｌに例２と同様にして調製
されたＥ． ｃｏｌｉ のオーバーナイト培養菌（ｏｖ
ｅｒｎｉｇｈｔ ｃｕｌｔｕｒｅ） を接種しそして光
学密度ＯＤ６００ が０．２〜０．９になるまで２８℃
で培養する。次いで２ｍｏｌ／ｌのＭｇＳＯ４ 溶液を
、最終濃度が０．２ｍｏｌ／ｌになるまで添加しそして
当該混合物を２８℃で３０分間インキュベートする。次
いで温度を４２℃に上昇させそして３０分後、細胞を遠
心分離により（７０００ｒｐｍ、５分）４℃で回収し、
そして細胞材料を１０ｍｌの蒸留水中で再懸濁する。溶
菌は懸濁の間に１０分以内に起こる。
【００１９】蔗糖を溶菌した細胞混合物に５５％の最終
濃度まで添加し、次いでそれを３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ
中５０、４５および４０％濃度の蔗糖溶液の層で覆う。 １６時間の遠心分離（４℃、３７，０００ ｒｐｍ、Ｓ
Ｗ４１Ｔｉ） 後、勾配を分別し、そしてタンパク質含
有量、密度およびＰＨＢ／ＰＨＶ含有量を測定する。１
．２４ｇ／ｍｌ（未溶菌細胞）、１．２２ｇ／ｍｌ（細
胞ゴースト）および１．２０ｇ／ｍｌ（ＰＨＢ／ＰＨＶ
）の密度を有する３つのフラクションが得られる。これ
により６０〜８０％のＰＨＢ／ＰＨＶ顆粒が遊離される
。
濃度まで添加し、次いでそれを３ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ
中５０、４５および４０％濃度の蔗糖溶液の層で覆う。 １６時間の遠心分離（４℃、３７，０００ ｒｐｍ、Ｓ
Ｗ４１Ｔｉ） 後、勾配を分別し、そしてタンパク質含
有量、密度およびＰＨＢ／ＰＨＶ含有量を測定する。１
．２４ｇ／ｍｌ（未溶菌細胞）、１．２２ｇ／ｍｌ（細
胞ゴースト）および１．２０ｇ／ｍｌ（ＰＨＢ／ＰＨＶ
）の密度を有する３つのフラクションが得られる。これ
により６０〜８０％のＰＨＢ／ＰＨＶ顆粒が遊離される
。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、その直径が細胞のほぼ
全横断面からなる開口部が形成され、細胞エンベロープ
はその原形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細
胞内に残るため、グラム陰性菌の細胞から水性媒質中で
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を完全に分離す
ることができる。
全横断面からなる開口部が形成され、細胞エンベロープ
はその原形を保持しそして細胞壁に固定された脂質は細
胞内に残るため、グラム陰性菌の細胞から水性媒質中で
ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を完全に分離す
ることができる。
【図１】第１図は、プラスミドｐＳＨ２の構築を遺伝子
地図を用いて示す図である。
地図を用いて示す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 溶菌遺伝子発現の誘導前に、二重
荷重カチオンのイオン強度を０．０５〜０．５ｍｏｌ／
ｌの間に上昇させ、溶菌遺伝子の発現を、温度の上昇に
より引き起こし、細胞を回収し、そして未だ湿った細胞
を水または緩衝液中に再懸濁し、その結果ポリマー顆粒
が自然溶菌により遊離されることを特徴とする、クロー
ン化された天然またはキメラ溶菌遺伝子の発現によりポ
リ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を含むグラム陰性
菌の細胞からポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）顆粒を
遊離する方法。 - 【請求項２】 使用する溶菌遺伝子がバクテリオファ
ージＰｈｉＸ１７４のクローン化溶菌遺伝子Ｅである、
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 二重荷重カチオンの濃度が０．１〜０
．３ｍｏｌ／ｌの間に上昇される、請求項１記載の方法
。 - 【請求項４】 二重荷重カチオンの濃度が、ＭｇＳＯ
４ またはＣａＣＯ３ の添加によって上昇される、請
求項１記載の方法。 - 【請求項５】 アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ） がグラム陰性菌として使用される、請求項１
記載の方法。 - 【請求項６】 クローン化大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ
）がグラム陰性菌として使用される、請求項１記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT2942/89 | 1989-12-27 | ||
| AT2942/89A AT393134B (de) | 1989-12-27 | 1989-12-27 | Verfahren zur freisetzung von poly-3-hydroxycarbonsaeuren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04293487A true JPH04293487A (ja) | 1992-10-19 |
| JP2641326B2 JP2641326B2 (ja) | 1997-08-13 |
Family
ID=3542776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2406885A Expired - Lifetime JP2641326B2 (ja) | 1989-12-27 | 1990-12-26 | ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5149644A (ja) |
| EP (1) | EP0435028B1 (ja) |
| JP (1) | JP2641326B2 (ja) |
| AT (2) | AT393134B (ja) |
| DE (1) | DE59010176D1 (ja) |
| DK (1) | DK0435028T3 (ja) |
| ES (1) | ES2083417T3 (ja) |
| GR (1) | GR3019235T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103869107A (zh) * | 2012-12-12 | 2014-06-18 | 昆山威典电子有限公司 | 电路板检测治具用开盖机构 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8900827A (nl) * | 1989-04-04 | 1990-11-01 | Rijksuniversiteit | Microbiologische bereiding van polyesters. |
| DE4433134A1 (de) * | 1994-09-16 | 1996-03-21 | Buck Chem Tech Werke | Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxyfettsäuren sowie rekombinanter Bakterienstämme zur Durchführung des Verfahrens |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE383754C (de) * | 1919-12-18 | 1923-10-19 | Siemens Schuckertwerke G M B H | Regulierung fuer elektrisch beheizte Dampfkessel u. dgl., bei denen der Kesselinhalt selbst als Heizwiderstand dient |
| EP0036699B2 (en) * | 1979-02-21 | 1987-09-02 | Imperial Chemical Industries Plc | Extraction of poly-beta-hydroxybutyric acid |
| EP0015699A1 (en) * | 1979-03-02 | 1980-09-17 | Kenco Chemicals (Bolton) Limited | A method and apparatus for manufacturing fire-lighters |
| US4520016A (en) * | 1980-06-17 | 1985-05-28 | Kabigen Ab | Bacteriolytic proteins |
| DE3171017D1 (en) * | 1980-08-19 | 1985-07-25 | Ici Plc | Fermentation process |
| EP0052459B1 (en) * | 1980-11-18 | 1985-12-04 | Imperial Chemical Industries Plc | Beta-hydroxybutyrate polymers |
| DE3376485D1 (en) * | 1982-04-05 | 1988-06-09 | Ici Plc | Process for producing a shaped article of beta-hydroxybutyrate polymer |
| EP0145233B2 (en) * | 1983-11-23 | 1991-11-06 | Imperial Chemical Industries Plc | Separation processfor a 3-hydroxybutyrate polymer |
| JPS61115489A (ja) * | 1984-11-10 | 1986-06-03 | House Food Ind Co Ltd | 溶菌酵素の製造法 |
| EP0288908B1 (en) * | 1987-04-28 | 1992-10-21 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for production of a random copolymer comprising d-(-)-3-hydroxybutyrate units and d-(-)-3-hydroxyvalerate |
| DE3715840A1 (de) * | 1987-05-12 | 1988-12-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Fuer ein lytisch wirksames, chimaeres protein kodierende rekombinante dna und ihre verwendung |
-
1989
- 1989-12-27 AT AT2942/89A patent/AT393134B/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-12-15 DE DE59010176T patent/DE59010176D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-15 EP EP90123287A patent/EP0435028B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-15 DK DK90123287.6T patent/DK0435028T3/da active
- 1990-12-15 ES ES90123287T patent/ES2083417T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-15 AT AT90123287T patent/ATE135046T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-12-26 US US07/633,785 patent/US5149644A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-26 JP JP2406885A patent/JP2641326B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-07 GR GR950402272T patent/GR3019235T3/el unknown
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BIOTECHNOL.LETT=1989 * |
| EUR.J.BIOCHEM=1989 * |
| J.BACTERIOL=1988 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103869107A (zh) * | 2012-12-12 | 2014-06-18 | 昆山威典电子有限公司 | 电路板检测治具用开盖机构 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59010176D1 (de) | 1996-04-11 |
| GR3019235T3 (en) | 1996-06-30 |
| EP0435028A2 (de) | 1991-07-03 |
| EP0435028B1 (de) | 1996-03-06 |
| JP2641326B2 (ja) | 1997-08-13 |
| ATE135046T1 (de) | 1996-03-15 |
| EP0435028A3 (en) | 1991-10-16 |
| ATA294289A (de) | 1991-01-15 |
| DK0435028T3 (da) | 1996-04-01 |
| AT393134B (de) | 1991-08-26 |
| ES2083417T3 (es) | 1996-04-16 |
| US5149644A (en) | 1992-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3079276B2 (ja) | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 | |
| RU1838410C (ru) | Способ получени альфа-амилазы | |
| Steiert et al. | A Gene Coding for a Membrane–Bound Hydrolase is Expressed as a Secreted, Soluble Enzyme in Streptomyces Lividans | |
| JP4298165B2 (ja) | 生体適合材料の製造のための微生物株およびプロセス | |
| CN101463358B (zh) | 一种腈水合酶基因簇及其应用 | |
| JP2596544B2 (ja) | 高温で活性なｄ―ヒダントイナーゼを含有する大腸菌の製法 | |
| FR2559781A1 (fr) | Nouveau vecteur plasmidique hybride de e. coli conferant le pouvoir de faire fermenter le saccharose et son procede de preparation | |
| JPH04293487A (ja) | ポリ（３−ヒドロキシカルボン酸）の遊離方法 | |
| US4376164A (en) | Process for preparing broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| JP4903004B2 (ja) | ロドコッカス属に属する細菌の形質転換方法 | |
| US4418194A (en) | DNA Fragments for forming plasmids | |
| JPS5879996A (ja) | プラスミドｐＡＣ１およびその取得方法 | |
| JP2759209B2 (ja) | キシラナーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａ | |
| JPS62228279A (ja) | Ｄｎａ配列、プラスミド及びリパ−ゼを生産する方法 | |
| JPH0255036B2 (ja) | ||
| Seifert et al. | Continuous reactive extraction of Penicillin G | |
| JPH0556786A (ja) | リパーゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 | |
| DE4003827A1 (de) | Verfahren zur freisetzung von poly-3-hydroxycarbonsaeuren | |
| JPH0458956B2 (ja) | ||
| JPH02312590A (ja) | プラスミドｐＴＹ１ | |
| JPS59159775A (ja) | エシエリチア・コリ | |
| JPS63209589A (ja) | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 | |
| JPS6221515B2 (ja) | ||
| JPH0139755B2 (ja) | ||
| JPS6221510B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19970304 |