JP4298165B2 - 生体適合材料の製造のための微生物株およびプロセス - Google Patents
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Description
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
優先権は、１９９８年３月３０日に出願された、米国仮出願番号第６０／０７９，９３８号に対して請求される。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的に、細胞内タンパク質、ポリヒドロキシアルカノエート材料、および細胞外ポリサッカリドのようなポリマーの増強した産生および回収率のための、遺伝的に操作された細菌系の分野にある。
【０００３】
微生物発酵は、抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ポリマー（例えば、ポリヒドロキシアルカノエート）、およびポリサッカリドを含む、大量の薬学的産物および産業的産物の製造に使用される（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＭａｖｉｔｕｎａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ １９９１））。より高度に精製された産物の生産性および回収率の増加は、収益性を増加するための開発の主な領域である。多くのこれらの産物に関して、産業の傾向は一般的に、生産性を増加するための、より高い細胞密度の発酵を指向している。１００ｇ／Ｌを越える細胞密度が慣用的に達成される。細胞バイオマスからの、（またはいくつかの場合においては培地からの）産物の回収率を増加することによる発酵プロセスの費用全体の減少が、生産性を増加する別の手段である。
【０００４】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、産業的および生物医学的適用の広い範囲で、再生可能な供給源から産生される、生分解性および生体適合性の熱可塑性材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８〜４４（１９９６））。多くの細菌株および発酵プロセスは、例えば、以下に記載されるように、ＰＨＡの産生について記載されている：ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２：２７〜５８（１９９５）；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１４２〜５０（１９９５）；Ｄｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５〜９９（１９９５）。特定の細菌株を使用するＰＨＡ産生方法は、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，４７７，６５４号、Ｂｙｒｏｍの同第５，３６４，７７８号、およびＳｅｎｉｏｒらの同第５，２６６、４７０号（炭水化物からのＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を使用する）；Ａｋｉｙａｍａらの米国特許第５，３４６，８１７号（脂肪酸上で増殖するＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ株を使用する）；Ｐｏｗｅｌｌらの米国特許第４，３３６，３３４号（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍを使用する）；Ｇｒｏｌｅａｕらの米国特許第５，３０２，５２５号および同第５，４３４，０６２号（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓを使用する）；Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９２，８６０号（脂肪酸上で増殖するＡｅｒｏｍｏｎａｓ株を使用する）；Ｐａｇｅらの米国特許第５，０５９，５３６号および同第５，０９６，８１９号（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを使用する）；Ｌａｆｆｅｒｔｙの米国特許第４，７８６，５９８号（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓを使用する）；Ｗｉｔｈｏｌｔらの米国特許第５，３４４，７６９号およびＳｈｉｏｔａｎｉらの同第５，２９０，９１０号、ＰＣＴ ＷＯ９２／１８５５３およびＰＣＴ ＷＯ９２／２１７０８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａを使用する）；Ｐｅｏｐｌｅｓらの米国特許第５，２４５，０２３号、Ｄｅｎｎｉｓの同第５，３３４，５２０号、Ｄｅｎｎｉｓらの同第５，３７１，００２号、Ｄｅｎｎｉｓの同第５，５１２，４５６号、Ｄｅｎｎｉｓらの同第５，５１８，９０７号、ならびにＰｅｏｐｌｅｓらの同第５，６６３，０６３号（トランスジェニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを使用する）。
【０００５】
ＰＨＡは、分散した顆粒の封入体（これは、天然においてアモルファスであるが、水に不溶性である）として微生物細胞の内側に蓄積する。発酵後の細胞からのＰＨＡの回収は、以下を含む任意のいくつかの方法によって達成され得る：（１）溶媒抽出；（２）次亜塩素酸塩、過酸化水素またはオゾン処理を使用する全ての非ＰＨＡバイオマスの化学的破壊；ならびに（３）細胞破壊、酵素処理、および洗浄を含む緩和なプロセス化。後者のプロセスの場合、アモルファス状態においてＰＨＡ顆粒を保持すること、および洗浄した顆粒懸濁液をラテックスとして使用することが可能である。水性プロセスを使用して細胞からＰＨＡラテックスを得るために、ＰＨＡ含有細胞を溶解することが必要である。溶解物の粘稠性を低減するための試みがなされている。例えば、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，９１０，１４５号は、細菌性バイオマスからのＰＨＡの抽出のための水性プロセスを記載する。このプロセスは、溶解物の粘稠性を低減するために１５０℃での熱処理工程を用いる。ＰＣＴ ＷＯ９４／２４３０２およびＰＣＴ ＷＯ９４／１０２８９は、粘稠性を低減するための手段として、核酸を分解するための過酸化水素処理の使用を教示する。粘稠性を低減し、そしてさらにプロセス化を増強するための細胞溶解物へのヌクレアーゼの添加もまた、一般に公知である。しかし、このアプローチは、あまりにも高価であり、高い細胞密度の発酵を含む商品発酵産物のために使用できない。
【０００６】
発酵プロセスは、酵素および他の生物活性タンパク質の製造のために、広範に使用される。多くの場合において、回収率は、核酸を分解するために粗細胞溶解物へヌクレアーゼを添加することによって改善され得る。有利には、このアプローチはまた、完全にＤＮＡを分解し、これは、抗生物質耐性マーカーまたは他の遺伝的エレメントの潜在的な展開を効果的に排除する。しかし、ＰＨＡの場合におけるように、外因性ヌクレアーゼ添加のプロセスは、高価である。
【０００７】
微生物のポリサッカリドは、多くの異なる微生物の発酵によって産生される（Ｄｅｌｅｓｔ，Ｐ．１９８９、３０１〜３１３頁、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｓｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ５、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｏ．、Ｗｅｄｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、キサンタンガムの産生のために商業的に使用され（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＢｒａｄｓｈａｗ、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：３１９〜７１（１９８４））、そして遺伝子操作技術に供されている（ＨａｓｓｌｅｒおよびＤｏｈｅｒｔｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１８２〜８７（１９９０））。この発酵および類似の発酵の間、培地の粘稠性は、細胞外ポリサッカリドが産生されるので、劇的に増加する。発酵槽中で良好に混合することに従って、および発酵槽中で良好に混合することを達成するために、撹拌機は、さらなるエネルギーを必要とする。得られた増加した剪断は、培地へ核酸を放出するいくつかの細胞溶解物を生じ得る。この核酸は、取り除くことが困難であり、そしてクロマトグラフィー、結晶化、沈澱、遠心分離、および濾過のような分離プロセスの効率を低減する有意な産物の質の問題（特に生物医学の適用におけるポリサッカリドの使用における）を提示する。
【０００８】
従って、本発明の目的は、発酵プロセスを使用して産物および回収の改善した方法（特にポリヒドロキシアルカノエート、ポリサッカリド、ならびに他の細胞内成分および細胞外成分の高い細胞密度を使用する方法）を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、発酵プロセスの使用のための改良された微生物株、特に細胞溶解物または高い細胞密度を生じる、すなわち高い粘稠性を生じる株を提供することである。
【００１０】
（発明の要旨）
ＤＮＡ構築物およびこれらのＤＮＡ構築物を使用して構築した遺伝的に操作された微生物株を、開発した。この微生物株は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに特異的な異種ヌクレアーゼ酵素もしくは改変した同種ヌクレアーゼ酵素を産生する。異種ヌクレアーゼは、別の生物から獲得され得、変異した同じ株において酵素活性または同種ヌクレアーゼを増加するために操作され得、次いで、増強した活性を有するヌクレアーゼを発現する細菌を選択するためのヌクレアーゼ活性についてのアッセイを使用して選択され得る。これらの株は、ペリプラズムまたは増殖培地中へポリマーの回収率を増強するために有効な量のヌクレアーゼを分泌し、そして特に、高い細胞密度の発酵プロセスにおける使用に適している。例示的なポリマーとしては、細胞内タンパク質（例えば、酵素、増殖因子、およびサイトカイン）；ポリヒドロキシアルカノエート；ならびにポリサッカリド（例えば、キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン（ｚｏｏｇｌａｎ）、ヒアルロン酸、および微生物セルロースが挙げられる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
発酵プロセスおよび発酵プロセスの間にヌクレアーゼを分泌する株を用いることによる微生物発酵産物の回収プロセスを改善する方法が示されている。ここで、このヌクレアーゼ自体は所望の発酵産物ではない。この方法において有用なヌクレアーゼを分泌する株を遺伝子操作する方法を開示する。１つの実施態様において、適切なヌクレアーゼを発現しない株は、遺伝子操作されて、所望のプロセス改善を得るに十分な活性を有する異種ヌクレアーゼを発現する。第２の実施態様において、ヌクレアーゼを発現するが、所望のプロセス改善を得るには不十分な活性でヌクレアーゼを発現する株を遺伝的に改変して、その株から単離されたヌクレアーゼ遺伝子および本明細書中に記載の方法を使用して、十分なヌクレアーゼを発現させる。第３の実施態様において、異種または同種のヌクレアーゼ遺伝子から適切なヌクレアーゼを発現する株を変異させ、そして変異体は、所望のプロセス改善を得るために選択された十分なレベルのヌクレアーゼを発現する。
【００１２】
（定義）
用語「増強」とは、発酵の間に細胞溶解によって放出される核酸が、粘稠性が増加することを防ぐ量でヌクレアーゼによって分解される、改善した発酵プロセスをいう。粘稠性の増加は、発泡、不十分な混合、および混合に必要なより大きなエネルギーを生じ得る。用語、増強される（増強された）とはまた、改善された回収プロセスをいい、ここで、所望の産物が細胞内で生成され、そして回収のために細胞溶解が必要であるプロセスにおいて、発酵の間に細胞溶解によって放出された核酸が、粘稠性の増加を防ぐ量で細胞溶解工程の後に分解され、そして遠心濾過、沈澱などを包含し得る回収工程を容易にする。
【００１３】
語句「異種ヌクレアーゼ遺伝子」とは、改善される株以外の宿主から単離されたヌクレアーゼ遺伝子をいう。
【００１４】
語句「同種ヌクレアーゼ遺伝子」とは、改善される宿主から単離されたヌクレアーゼ遺伝子をいう。この遺伝子は、さらに改変されて、ヌクレアーゼの活性が改善され得る。
【００１５】
（ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼをコードする遺伝子）
本明細書中に記載の方法において使用するために適切であるヌクレアーゼおよびヌクレアーゼをコードする遺伝子は、多くの供給源から得られ得る。本明細書中で使用される場合「異種」ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸から発現され、ここで、このヌクレアーゼは、ポリマー生成および／または回収を増強するように挿入される生物以外の生物から得られ、またはここで、この生物は、増強したヌクレアーゼ活性について変異され、そしてスクリーニングされる。増強したヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼの量またはヌクレアーゼの比活性または基質特異性が増加される場合に得られ得る。
【００１６】
ヌクレアーゼは、広範囲の微生物によって分泌され、そして対応する遺伝子のいくつかがクローニングされ、そして特徴づけられた。ヌクレアーゼ遺伝子の供給源としては、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１９４９５）、Ａｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６４７０６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６４８０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２３９７３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６７６７８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５５８１８）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３０４７１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ０００８３３）、および、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６７５８４）が挙げられる。
【００１７】
好ましくは、ヌクレアーゼは、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の両方を切断する。このヌクレアーゼは、好ましくは、広い温度範囲および広いｐＨ範囲にわたって活性である。このヌクレアーゼはまた、好ましくは、プロセシング添加剤（例えば、塩、界面活性剤、および安定化剤）の存在に寛容性である。細胞溶解およびこのヌクレアーゼが核酸を分解するインキュベーション期間後に、このヌクレアーゼは、例えば、プロテアーゼ消化、クロマトグラフィー、濾過または遠心分離によって容易に取り出し可能であることが好ましい。
【００１８】
例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌヌクレアーゼ［（デオキシ）リボヌクレエート（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｔｅ）−３’−ヌクレオチドヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．４．７］は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれかを加水分解して、３’−ホスホモノヌクレオチドおよびホスホジヌクレオチドを生成する。この酵素は約ｐＨ０．１〜１０の間で安定であり、最大活性は、０．１〜１００ｍＭ Ｃａ2+イオンの存在下で約ｐＨ９〜１０である。この酵素をコードする遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから単離され、そして特徴づけられた（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｇｅｎｅ ２２：１８１−８９（１９８３））。そしてこの遺伝子は、多くの異種細菌において機能的に発現される（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｇｅｎｅ ２２：１８１−８９（１９８３）；Ｍｅｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３５０８−１４（１９８７）；Ｌｉｅｂｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：１８５４−６１（１９９２）；ＬｅＬｏｉｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５１３５−３９（１９９６））。
【００１９】
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来の細胞外ヌクレアーゼは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥTM（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を含む、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓおよびその提携会社）として市販の組換え系において生成される。この酵素をコードする遺伝子もまた、特徴づけられた（Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６０：３７４６−５１（１９９４））。
【００２０】
（微生物株を操作する方法）
一旦選択されたヌクレアーゼ酵素をコードするヌクレアーゼ遺伝子が単離され、そして特徴づけられると、この生物がペリプラズムまたは増殖培地へヌクレアーゼを分泌するように微生物株へ組み込まれる。
【００２１】
好ましい実施態様において、短鎖長ＰＨＡの生成のための微生物株（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｅ．ｃｏｌｉ）または中間鎖長ＰＨＡの生成のための微生物株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＢＸ９７８およびＰ．ｐｕｔｉｄａ）は、ヌクレアーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ遺伝子）をＰＨＡ生成株の染色体に組み込むことによって生成される。例えば、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ヌクレアーゼをコードするｎｕｃ遺伝子を認識するオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応を用いる増殖によってＳ．ａｕｒｅｕｓから単離され得る。ＰＣＲ後に、増幅されたＤＮＡはＰＣＲクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）へクローニングされ得る。ヌクレアーゼ遺伝子挿入物を含むプラスミドは、ＤＮＡｓｅ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）を使用するヌクレアーゼの発現のために同定され、そして分析され得る。
【００２２】
いくつかの手段は、ヌクレアーゼ遺伝子の発現のために選択されたＰＨＡ生成株へヌクレアーゼ遺伝子を移入するために利用可能である。例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａへの移入のために、遺伝子はＲａｌｓｔｏｎｉａプロモーターの制御下におかれ得、そして広い宿主範囲のクローニングベクター（例えば、ｐＬＡＦＲ３）へ挿入され得る。Ｒａｌｓｔｏｎｉａにおける発現を達成するためのプロモーターおよび方法は、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８９）ならびにＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６２，１５２９８−１５３０３（１９８９）において見出され得る。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＺｏｏｇｌｏｅａのような属に由来する細菌は、広い宿主範囲のクローニングベクターを用いる類似のアプローチに従い得る。
【００２３】
あるいは、発現カセットは、適切な宿主の染色体に組み込まれ得、そして発現され得るように、ヌクレアーゼについて操作され得る。適切な発現カセットは、例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０）に記載される。ヌクレアーゼ遺伝子およびマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性を与える遺伝子）は、ベクター（例えば、ｐＵＴおよびｐＬＯＦシリーズ）におけるトランスポザーゼの認識配列の間にクローニングされる（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０））。ｐＵＴプラスミドが使用される場合、転写調節配列は、トランスポザーゼの認識配列の間に供給される必要はないが、ｐＬＯＦシリーズでは、これらの調節配列は、トランスポザーゼの認識配列の間の領域内に存在するべきである。ｐＵＴおよびｐＬＯＦプラスミドは、λ ｐｉｒリゾゲンの存在のために、このプラスミドを複製させるＥ．ｃｏｌｉ株中でのみ維持され得る。ヌクレアーゼ−マーカー構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ λ ｐｉｒ株の接合またはプラスミドＤＮＡを用いる形質転換もしくはエレクトロポレーションによって細菌細胞へ導入される。λ ｐｉｒの非存在下では、このプラスミドは細胞から喪失される。特定の頻度で、トランスポザーゼ認識配列に囲まれ、そしてトランスポザーゼ認識配列を含むＤＮＡフラグメントは、染色体に移入される。この事象が生じる細胞は、接合体、形質転換またはエレクトロポレーション混合物を構築物によって耐性が付与される抗生物質を含有する固体増殖培地にプレートすることによる選択によって単離され得る。次いで、この培地上で増殖する細胞のコロニーを、インビボまたはインビトロでのヌクレアーゼ活性についてスクリーニングする。インビボ活性は、１Ｎ ＨＣｌまたはメチルグリーン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）を用いる可視化を用いてＤＮａｓｅ試験寒天プレート上で推定ヌクレアーゼプロデューサーをプレートすることによって試験され得る。インビトロ活性は、高分子量ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）でクロロホルム処理した細胞の培養培地または水性上清をインキュベートし、次いで、ｐＨ緩衝化アガロースゲル上でのＤＮＡの分離によって決定され得る。
【００２４】
これらの操作された細胞株の利用性は、野生型およびヌクレアーゼ成分を使用する発酵および下流プロセスの結果を比較することによって容易に評価される。
【００２５】
（操作された株を使用する方法）
操作された株は、薬学的および産業製品（抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン類、ポリヒドロキシアルカノエート、およびポリサッカリドを含む）の製造において利用される種々の微生物発酵で使用され得る（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＭａｖｉｔｕｎａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ １９９１））。好ましい実施態様において、発酵プロセスは、１００ｇ／Ｌを超える細胞密度を含む。この株は、産物が細胞溶解で回収されなければならないプロセスにおいて特に有用であり、そしてクロマトグラフィー、結晶化、沈澱、遠心分離、および／または濾過分離プロセスを必要とするプロセスにおいては、よりさらに有用である。
【００２６】
好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および株は、（例えば、ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２：２７−５８（１９９５）；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１４２−５０（１９９５）；Ｄｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５−９９（１９９５）；Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，４７７，６５４号、Ｂｙｒｏｍの米国特許第５，３６４，７７８号、Ｓｅｎｉｏｒらの米国特許第５，２６６，４７０号、Ａｋｉｙａｍａらの米国特許第５，３４６，８１７号、Ｐｏｗｅｌｌらの米国特許第４，３３６，３３４号、Ｇｒｏｌｅａｕらの米国特許第５，３０２，５２５号および同第５，４３４，０６２号、Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９２，８６０号、Ｐａｇｅらの米国特許第５，０５９，５３６号および同第５，０９６，８１９号、Ｌａｆｆｅｒｔｙの米国特許第４，７８６，５９８号、Ｗｉｔｈｏｌｔらの米国特許第５，３４４，７６９号、ならびにＳｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９０，９１０号、Ｐｅｏｐｌｅｓらの米国特許第５，２４５，０２３号、Ｄｅｎｎｉｓの米国特許第５，３３４，５２０号、Ｄｅｎｎｉｓらの米国特許第５，３７１，００２号、Ｄｅｎｎｉｓの米国特許第５，５１２，４５６号、Ｄｅｎｎｉｓらの米国特許第５，５１８，９０７号、ならびにＰｅｐｌｅｓらの米国特許第５，６６３，０６３号に記載されるような）ＰＨＡの生成についての発酵プロセスにおいて使用される。
【００２７】
別の好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および株は、非常に純粋なＰＨＡラテックスの生成において使用され、これは、多くの適用を有し得る。これらの適用の例は、ＰＣＴ ＷＯ９１／１３２０７（ＰＨＡ ｌａｔｅｘ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏａｔｉｎｇ ｐａｐｅｒ）；ＧＢ２ ２９２ ６４８ Ａ（ＰＨＡ ｌａｔｅｘ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）；ＰＣＴ ＷＯ ９６／００２６３（ＰＨＡ ｌａｔｅｘ ａｓ ｆｏｏｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｃｈｅｅｓｅ，ｃｏａｔｉｎｇｓ）；ＰＣＴ ＷＯ９２／０９２１１ならびにＹａｌｐａｎｉの米国特許第５，２２９，１５８号（ＰＨＡ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｄａｉｒｙ ｃｒｅａｍ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）；ＰＣＴ ＷＯ／９２／０９２１０ならびにＹａｌｐａｎｉの米国特許第５，２２５，２２７（ＰＨＡｓ ａｓ ｆｌａｖｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｆｏｏｄｓ）；およびＰＣＴ ＷＯ９６／１７３６９（ＰＨＡｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｈｏｄｅ ｒａｙ ｔｕｂｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）に記載される。水性プロセスに使用する細胞からＰＨＡラテックスを得るために、ＰＨＡ含有細胞を溶解することが一般に必要である。微生物細胞を溶解する方法は周知であり、そして物理的均質化処理、超音波処理、酵素処理および界面活性剤処理、ならびに凍結／融解サイクルが挙げられる。
【００２８】
別の好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および操作された株は、ポリサッカリドの生成に有用である。微生物ポリサッカリドは、多くの異なる微生物の発酵により生成され得る。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、キサンタンガムの生成のために商業的に使用され（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＢｒａｄｓｈａｗ、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：３１９−７１（１９８４））、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ株は、ジェランガムを生成するために使用される（Ｋａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．４３：１０８６−９１（１９８２））。他の例としては、食品産業において広範に使用されるアルギネート（主に、褐藻類由来）が挙げられる（Ｗｅｌｌｓ、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＳａｎｆｏｒｄおよびＬａｓｋｉｎ編）第２９９頁（ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ １９７７））。アルギネートはまた、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ株の発酵によって生成され得る（Ｃｈｅｎら、Ａｐｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．４９：５４３−４６（１９８５））。ヒアルロン酸は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉを使用する生物医学的適用について生じるポリマーの別の例である（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙおよびｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６９−７５（１９９４））。
【００２９】
本明細書中に記載の方法および系は、Ｐｏｌｌｏｃｋ、米国特許第５，３５４，６７１号およびＭｕｒｏｆｕｓｈｉら、米国特許第５，７０５，３６８号、およびＨｏｍｍａら、米国特許第５，６７９，５５６号によって記載されるキサンタンガムの回収に対して、細胞溶解アプローチと合わせて使用される場合、特に有利であり得る。開示された方法を実施するために適切なＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、Ｂａｕｅｒら、米国特許第４，４００，４６７号およびＰｏｌｌｏｃｋら、米国特許第５，４７２，８７０号に記載される。
【００３０】
多くの他の微生物株を使用してポリサッカリドを産生し、そして本明細書に開示される方法に従うようにする。遺伝子操作技術は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第２０４巻、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、現在、これらの全ての微生物について利用可能である。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒによるセルロースの産生は、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔらによって米国特許第５，８２１，１０９号に開示され、そして遺伝子操作したＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒについては、Ｔｏｎｏｕｃｈｉらによって米国特許第５，７９２，６３０号に開示される。Ｚｏｏｇｌｏｅａによるエキソポリサッカリド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の産生およびこの微生物の遺伝子操作は、Ｅａｓｓｏｎらによって米国特許第４，９４８，７３３号および同第５，０９１，３７６号に記載される。ジェランガムとして公知の微生物のポリサッカリドは、「スフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）」として公知の構造的に関連するエキソポリサッカリドのファミリーの１つのメンバーである（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｔ．Ｊ．１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１９３９−１９４５，Ｐｏｌｌｏｃｋらの米国特許第５，８５４，０３４号およびその中の参考文献）。ジェランガムは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ菌株番号ＡＴＣＣ３１４６１）によって、米国特許第４，３２６，０５２号；同第４，３７７，６３６号；同第４，３８５，１２６号および同第４，５０３，０８４号に記載される過程によって産生される。この株および増強したジェランガム産生特性を有する変異誘導株は、Ｆｉａｌｈｏら，１９９１ Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：８５−８７およびＰｏｌｌｏｃｋらの米国特許第５，８５４，０３４号によって記載されるように、遺伝的に操作され得る。例えば、ＰＨＢの蓄積を欠損するこの株の変異株はまた、開示される本方法を実行するために使用され得、そして菌株番号ＡＴＣＣ５３９６７として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ヒアルロン酸は、例えば、Ｅｌｌｗｏｏｄらの米国特許第５，５６３，０５１号に記載されるようにＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｕｓ細菌により産生される。
【００３１】
本明細書に記載される組成物および調製方法、ならびにそれらの使用は、以下の限定的ではない実施例によって、さらに記載される。
【００３２】
（実施例１：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ遺伝子の単離）
プラスミドｐＮｕｃ１は、Ｌｉｅｂｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：１８５４−６１（１９９２）に記載されている。小球菌ヌクレアーゼをコードするｎｕｃ遺伝子の配列は決定されており（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｇｅｎｅ ２２：１８１−８９（１９８３））、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１７８５でアクセス可能である。ｎｕｃ遺伝子は、精製したプラスミドｐＮｕｃ１、および以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅され：
【００３３】
【化１】
ＰＣＲの条件は以下を使用した：１０ｎｇのｐＮｕｃ１ ＤＮＡおよび５００ｎＭの各プライマーを、４５μｌのＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と混合して、そして増幅した（９５℃で２分、次いで、９５℃で３０秒、５５℃で４５秒、７２℃で４５秒を３０サイクル、そして最後に、６８℃で７分の伸張工程）。ＰＣＲでの増幅に続いて、ヌクレアーゼ遺伝子（配列番号３）フラグメントを含む０．６５Ｋｂを、アガロースゲル電気泳動により精製し、そしてｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結してｐＣＲ２．１−ｎｕｃを得た。このプラスミドの挿入物を、ＤＮＡ配列決定により、Ｓｈｏｒｔｌｅ（Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９９３，Ｇｅｎｅ ２２：１８１−１８９）によって報告されたＤＮＡの対応する領域と同一であるか確認した。
【００３４】
（実施例２：ヌクレアーゼを発現するトランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２株の構築）
ｎｕｃ遺伝子を、プラスミドｐＣＲ２．１−ｎｕｃから、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃ６５Ｉを使用して切り出し、そしてｐＵＣ１８ＮｏｔＩの対応する部位に挿入してｐＵＣ１８−ｎｕｃＩを得た。プラスミドｐＢＧＳ１８（Ｓｐｒａｔｔら，１９８６，Ｇｅｎｅ ４１：３３７−３４２；ＡＴＣＣ受託番号３７４３７）に由来する、プロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を、以下のプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得：
【００３５】
【化２】
そして、０．９Ｋｂフラグメント（配列番号６）をｐＵＣ１８Ｎｏｔ（Ｈｅｒｒｅｒｏら，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６５６７）のＥｃｌ１３６ＩＩ部位に挿入してｐＭＮＸ−ｋａｎを得た。このプロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃ６５１での消化によって切り出し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて平滑末端化し、そしてｐＵＣ１８ｎｕｃ−１のＳｍａＩ部位に挿入した。
【００３６】
得られたプラスミドであるｐＭＮＸ−ｎｕｃを、ＳｍａＩで直線化し、そしてｐＭＮＸ−ｋａｎに由来する、プロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を含む平滑末端化したＥｃｏＲＩ／Ａｃｃ６５Ｉフラグメントと連結した。組換えｐＭＮＸ−ｎｕｃ−ｋａｎプラスミドを、ｌａｃプロモーターに由来するｎｕｃ−ｋａｎオペロンの発現によって与えられるそれらのカナマイシン耐性に基づいて単離した。続いて、このｎｕｃ−ｋａｎオペロンをＮｏｔＩフラグメントとして切り出し、そしてｐＵＴｋａｎの対応する部位に挿入した。続いて、プラスミドｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎを使用して、プロモーターを有さないｎｕｃ−ｋａｎオペロンを無作為にＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２の染色体に組み込んだ。プラスミドの接合を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸｎｕｃ−ｋａｎ］を使用して達成した。
【００３７】
トランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ株を、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／クロラムフェニコールプレート上で選択した。１２，０００の無作為な組み込み体のうち、１５００のコロニーをＤＮＡｓｅ寒天プレートにレプリカプレーティングして、ヌクレアーゼを発現しているクローンを選択した。培養上清中および株のペリプラズム中のヌクレアーゼレベルのインビトロ分析のために、ヌクレアーゼを発現している３５のクローンを選択した。この目的のために、細胞を遠心沈殿し、そして分泌されたヌクレアーゼを含む上清を回収した。続いて、この細胞ペレットを新鮮な培地中に再懸濁し、そして５００μｌの懸濁液に１００μｌのクロロホルムを添加して、ペリプラズムのヌクレアーゼを放出させた。続いて、細胞片を遠心沈殿した。ＤＮＡゲル電気泳動を、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（０．０２Ｕ）で処理したサンプル、ヌクレアーゼが組み込まれた株の培養上清で処置したサンプル、およびＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２の上清で処理したサンプルを用いて行った。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２由来の染色体ＤＮＡ上の９の異なるＰ．ｐｕｔｉｄａ ｎｕｃ組み込み体の分泌画分およびペリプラズム画分に、ヌクレアーゼ活性が存在した。続いて、細胞片を遠心分離によって除去した。
【００３８】
ヌクレアーゼの存在を、清澄化した上清のアリコートを、４μｇのＰ．ｐｕｔｉｄａ染色体ＤＮＡと共に３７℃で１時間インキュベートすることによって決定した。コントロールとして、染色体ＤＮＡを、市販されているＢＥＮＺＯＮＡＳＥTM（ポシティブコントロールとして０．０２ユニット、またはネガティブコントロールとしてヌクレアーゼ無し）と共にインキュベートした。消化に続いて、このサンプルを、アガロースゲル電気泳動により分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。この試験を使用して、異なるレベルで、および細胞外領域でもしくはペリプラズム空間でまたはその両方でヌクレアーゼ活性を発現する株を容易に同定した。
【００３９】
これらの株を、ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９１８〜ＭＢＸ９２６と呼ぶ。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９２４は、ヌクレアーゼをペリプラズムおよび細胞外培地の両方に分泌し、そして２３Ｓ ｒＲＮＡコード遺伝子に組み込まれたｎｕｃ−ｋａｎオペロンを有する。
【００４０】
（実施例３：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ４０１２４株の構築）
トランスジェニックＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ４０１２４株を、その宿主株をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＰＣＴ／１％グルコース／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）／カナマイシンプレート上で接合した後に選択した。１０の無作為コロニーを、ＰＣＴ／１％グルコース／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）／カナマイシン液体培地中に接種し、そして３０℃で２０時間増殖させた。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ＭＢＸ９１７培養物のみが活性なヌクレアーゼを産生し、このヌクレアーゼは、トランスジェニック株のペリプラズムに局在した。
【００４１】
（実施例４：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８株の構築）
トランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８株を、その宿主株をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＥ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレート上で接合した後に選択し、続いて、適切な抗生物質を含むＤＮＡｓｅ寒天プレート上にレプリカプレーティングした。全部で５０のヌクレアーゼポシティブのコロニーを、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレートにレプリカプレーティングした。続いて、９の単離株（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７９〜９８７）を、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）液体培地中で増殖させた。全てのクローンが、ヌクレアーゼ活性をペリプラズムに分泌した。ＭＢＸ９８４は、最高レベルのヌクレアーゼ活性を分泌した。９つ全ての株を、増殖特性およびＰＨＡ蓄積について、５０ｍｌのＥ２／１０ｍＭオクタン酸液体培地中で試験した。結果を以下の表１に示す。細胞は、炭素供給源として、１０ｍＭオクタン酸を含むＥ２培地上で増殖させた。ＭＢＸ９８５は、野生型株の増殖能力およびＰＨＡ蓄積活性を保持した。
【００４２】
【表１】
（実施例５：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４７株の構築）
トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４７株を、その宿主株をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＥ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレート上で接合した後に選択し、続いて、適切な抗生物質を含むＤＮＡｓｅ寒天プレート上にレプリカプレーティングした。全部で７５のヌクレアーゼポシティブのコロニーを、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／０．５％コーンスティープ酒／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレートにレプリカプレーティングした。続いて、９つの単離株を、Ｒ１０／２％グルコース／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）液体培地中で増殖させた。４つの単離株（ＭＢＸ９８８〜９９１）において、ヌクレアーゼ遺伝子が、染色体に首尾良く組み込まれていた。この異なるトランスジェニック株におけるヌクレアーゼ活性を分析した。ＤＮＡゲル電気泳動を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４７のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ１０培地上で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ９８８のペリプラズム画分で処理したサンプル、ＬＢ培地上で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ９８８のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ＭＢＸ９１７のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ４０１２４のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＢＸ９８５のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＢＸ９７８のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９２４のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２のペリプラズム画分で処理したサンプル、および分子量マーカーを用いて行った。
【００４３】
ヌクレアーゼ活性を、異なるトランスジェニック株において、実施例２に記載される染色体ＤＮＡ消化およびゲル電気泳動アッセイを使用して分析した。
【００４４】
これらの操作した株を、ＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子を導入することによってさらに改変した（米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，３３４，５２０号；同第５，３７１，００２号；同第５，５１２，４５６号；同第５，５１８，９０７号；および同第５，６６３，０６３号に記載される）。
【００４５】
（実施例６：ＰＨＡ顆粒懸濁物のＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８からの単離およびヌクレアーゼを発現する誘導株）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８およびＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９８５を、炭素供給源としてオクタン酸を含む２０Ｌの流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）中で細胞密度が２００ｇ／Ｌになるまで増殖させた。発酵に続いて、それぞれの培養物に１ｍＭ ＣａＣｌ2を補充して、そして水酸化アンモニウムを用いてｐＨ８．５に調整した。次いで、この培養物を、高圧ホモジナイザーを使用して圧力を８，０００ｐｓｉから２０，０００ｐｓｉまで変化させる操作をして溶解した。溶解物の各サンプルを室温で１時間インキュベートし、次いで、この粘稠性を２０℃でＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶＦ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（スピンドル番号１、６０ｒｐｍ）を使用して決定した。野生型株およびヌクレアーゼ発現株のサンプルに加えて、市販のヌクレアーゼ（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥTM，１０μＬ／Ｌ培養物）を補充した野生型の培養物から溶解物を調製した。粘稠性決定についての結果を表２に示し、そしてこの結果は、ヌクレアーゼ遺伝子の組み込みが、ＭＢＸ９８５における場合、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を添加した野生型株で得られた粘稠性と類似するレベルまでの溶解物の粘稠性の低減を生じることを示す。
【００４６】
【表２】
【配列表】
（関連出願に対する相互参照）
優先権は、１９９８年３月３０日に出願された、米国仮出願番号第６０／０７９，９３８号に対して請求される。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的に、細胞内タンパク質、ポリヒドロキシアルカノエート材料、および細胞外ポリサッカリドのようなポリマーの増強した産生および回収率のための、遺伝的に操作された細菌系の分野にある。
【０００３】
微生物発酵は、抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ポリマー（例えば、ポリヒドロキシアルカノエート）、およびポリサッカリドを含む、大量の薬学的産物および産業的産物の製造に使用される（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＭａｖｉｔｕｎａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ １９９１））。より高度に精製された産物の生産性および回収率の増加は、収益性を増加するための開発の主な領域である。多くのこれらの産物に関して、産業の傾向は一般的に、生産性を増加するための、より高い細胞密度の発酵を指向している。１００ｇ／Ｌを越える細胞密度が慣用的に達成される。細胞バイオマスからの、（またはいくつかの場合においては培地からの）産物の回収率を増加することによる発酵プロセスの費用全体の減少が、生産性を増加する別の手段である。
【０００４】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、産業的および生物医学的適用の広い範囲で、再生可能な供給源から産生される、生分解性および生体適合性の熱可塑性材料である（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｅｏｐｌｅｓ、ＣＨＥＭＴＥＣＨ ２６：３８〜４４（１９９６））。多くの細菌株および発酵プロセスは、例えば、以下に記載されるように、ＰＨＡの産生について記載されている：ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２：２７〜５８（１９９５）；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１４２〜５０（１９９５）；Ｄｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５〜９９（１９９５）。特定の細菌株を使用するＰＨＡ産生方法は、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，４７７，６５４号、Ｂｙｒｏｍの同第５，３６４，７７８号、およびＳｅｎｉｏｒらの同第５，２６６、４７０号（炭水化物からのＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（以前は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を使用する）；Ａｋｉｙａｍａらの米国特許第５，３４６，８１７号（脂肪酸上で増殖するＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ株を使用する）；Ｐｏｗｅｌｌらの米国特許第４，３３６，３３４号（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍを使用する）；Ｇｒｏｌｅａｕらの米国特許第５，３０２，５２５号および同第５，４３４，０６２号（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓを使用する）；Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９２，８６０号（脂肪酸上で増殖するＡｅｒｏｍｏｎａｓ株を使用する）；Ｐａｇｅらの米国特許第５，０５９，５３６号および同第５，０９６，８１９号（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉを使用する）；Ｌａｆｆｅｒｔｙの米国特許第４，７８６，５９８号（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓを使用する）；Ｗｉｔｈｏｌｔらの米国特許第５，３４４，７６９号およびＳｈｉｏｔａｎｉらの同第５，２９０，９１０号、ＰＣＴ ＷＯ９２／１８５５３およびＰＣＴ ＷＯ９２／２１７０８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａを使用する）；Ｐｅｏｐｌｅｓらの米国特許第５，２４５，０２３号、Ｄｅｎｎｉｓの同第５，３３４，５２０号、Ｄｅｎｎｉｓらの同第５，３７１，００２号、Ｄｅｎｎｉｓの同第５，５１２，４５６号、Ｄｅｎｎｉｓらの同第５，５１８，９０７号、ならびにＰｅｏｐｌｅｓらの同第５，６６３，０６３号（トランスジェニックＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを使用する）。
【０００５】
ＰＨＡは、分散した顆粒の封入体（これは、天然においてアモルファスであるが、水に不溶性である）として微生物細胞の内側に蓄積する。発酵後の細胞からのＰＨＡの回収は、以下を含む任意のいくつかの方法によって達成され得る：（１）溶媒抽出；（２）次亜塩素酸塩、過酸化水素またはオゾン処理を使用する全ての非ＰＨＡバイオマスの化学的破壊；ならびに（３）細胞破壊、酵素処理、および洗浄を含む緩和なプロセス化。後者のプロセスの場合、アモルファス状態においてＰＨＡ顆粒を保持すること、および洗浄した顆粒懸濁液をラテックスとして使用することが可能である。水性プロセスを使用して細胞からＰＨＡラテックスを得るために、ＰＨＡ含有細胞を溶解することが必要である。溶解物の粘稠性を低減するための試みがなされている。例えば、Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，９１０，１４５号は、細菌性バイオマスからのＰＨＡの抽出のための水性プロセスを記載する。このプロセスは、溶解物の粘稠性を低減するために１５０℃での熱処理工程を用いる。ＰＣＴ ＷＯ９４／２４３０２およびＰＣＴ ＷＯ９４／１０２８９は、粘稠性を低減するための手段として、核酸を分解するための過酸化水素処理の使用を教示する。粘稠性を低減し、そしてさらにプロセス化を増強するための細胞溶解物へのヌクレアーゼの添加もまた、一般に公知である。しかし、このアプローチは、あまりにも高価であり、高い細胞密度の発酵を含む商品発酵産物のために使用できない。
【０００６】
発酵プロセスは、酵素および他の生物活性タンパク質の製造のために、広範に使用される。多くの場合において、回収率は、核酸を分解するために粗細胞溶解物へヌクレアーゼを添加することによって改善され得る。有利には、このアプローチはまた、完全にＤＮＡを分解し、これは、抗生物質耐性マーカーまたは他の遺伝的エレメントの潜在的な展開を効果的に排除する。しかし、ＰＨＡの場合におけるように、外因性ヌクレアーゼ添加のプロセスは、高価である。
【０００７】
微生物のポリサッカリドは、多くの異なる微生物の発酵によって産生される（Ｄｅｌｅｓｔ，Ｐ．１９８９、３０１〜３１３頁、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎ Ｇｕｍｓ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｓｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ５、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｏ．、Ｗｅｄｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．Ａ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、キサンタンガムの産生のために商業的に使用され（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＢｒａｄｓｈａｗ、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：３１９〜７１（１９８４））、そして遺伝子操作技術に供されている（ＨａｓｓｌｅｒおよびＤｏｈｅｒｔｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１８２〜８７（１９９０））。この発酵および類似の発酵の間、培地の粘稠性は、細胞外ポリサッカリドが産生されるので、劇的に増加する。発酵槽中で良好に混合することに従って、および発酵槽中で良好に混合することを達成するために、撹拌機は、さらなるエネルギーを必要とする。得られた増加した剪断は、培地へ核酸を放出するいくつかの細胞溶解物を生じ得る。この核酸は、取り除くことが困難であり、そしてクロマトグラフィー、結晶化、沈澱、遠心分離、および濾過のような分離プロセスの効率を低減する有意な産物の質の問題（特に生物医学の適用におけるポリサッカリドの使用における）を提示する。
【０００８】
従って、本発明の目的は、発酵プロセスを使用して産物および回収の改善した方法（特にポリヒドロキシアルカノエート、ポリサッカリド、ならびに他の細胞内成分および細胞外成分の高い細胞密度を使用する方法）を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、発酵プロセスの使用のための改良された微生物株、特に細胞溶解物または高い細胞密度を生じる、すなわち高い粘稠性を生じる株を提供することである。
【００１０】
（発明の要旨）
ＤＮＡ構築物およびこれらのＤＮＡ構築物を使用して構築した遺伝的に操作された微生物株を、開発した。この微生物株は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡに特異的な異種ヌクレアーゼ酵素もしくは改変した同種ヌクレアーゼ酵素を産生する。異種ヌクレアーゼは、別の生物から獲得され得、変異した同じ株において酵素活性または同種ヌクレアーゼを増加するために操作され得、次いで、増強した活性を有するヌクレアーゼを発現する細菌を選択するためのヌクレアーゼ活性についてのアッセイを使用して選択され得る。これらの株は、ペリプラズムまたは増殖培地中へポリマーの回収率を増強するために有効な量のヌクレアーゼを分泌し、そして特に、高い細胞密度の発酵プロセスにおける使用に適している。例示的なポリマーとしては、細胞内タンパク質（例えば、酵素、増殖因子、およびサイトカイン）；ポリヒドロキシアルカノエート；ならびにポリサッカリド（例えば、キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン（ｚｏｏｇｌａｎ）、ヒアルロン酸、および微生物セルロースが挙げられる。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
発酵プロセスおよび発酵プロセスの間にヌクレアーゼを分泌する株を用いることによる微生物発酵産物の回収プロセスを改善する方法が示されている。ここで、このヌクレアーゼ自体は所望の発酵産物ではない。この方法において有用なヌクレアーゼを分泌する株を遺伝子操作する方法を開示する。１つの実施態様において、適切なヌクレアーゼを発現しない株は、遺伝子操作されて、所望のプロセス改善を得るに十分な活性を有する異種ヌクレアーゼを発現する。第２の実施態様において、ヌクレアーゼを発現するが、所望のプロセス改善を得るには不十分な活性でヌクレアーゼを発現する株を遺伝的に改変して、その株から単離されたヌクレアーゼ遺伝子および本明細書中に記載の方法を使用して、十分なヌクレアーゼを発現させる。第３の実施態様において、異種または同種のヌクレアーゼ遺伝子から適切なヌクレアーゼを発現する株を変異させ、そして変異体は、所望のプロセス改善を得るために選択された十分なレベルのヌクレアーゼを発現する。
【００１２】
（定義）
用語「増強」とは、発酵の間に細胞溶解によって放出される核酸が、粘稠性が増加することを防ぐ量でヌクレアーゼによって分解される、改善した発酵プロセスをいう。粘稠性の増加は、発泡、不十分な混合、および混合に必要なより大きなエネルギーを生じ得る。用語、増強される（増強された）とはまた、改善された回収プロセスをいい、ここで、所望の産物が細胞内で生成され、そして回収のために細胞溶解が必要であるプロセスにおいて、発酵の間に細胞溶解によって放出された核酸が、粘稠性の増加を防ぐ量で細胞溶解工程の後に分解され、そして遠心濾過、沈澱などを包含し得る回収工程を容易にする。
【００１３】
語句「異種ヌクレアーゼ遺伝子」とは、改善される株以外の宿主から単離されたヌクレアーゼ遺伝子をいう。
【００１４】
語句「同種ヌクレアーゼ遺伝子」とは、改善される宿主から単離されたヌクレアーゼ遺伝子をいう。この遺伝子は、さらに改変されて、ヌクレアーゼの活性が改善され得る。
【００１５】
（ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼをコードする遺伝子）
本明細書中に記載の方法において使用するために適切であるヌクレアーゼおよびヌクレアーゼをコードする遺伝子は、多くの供給源から得られ得る。本明細書中で使用される場合「異種」ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸から発現され、ここで、このヌクレアーゼは、ポリマー生成および／または回収を増強するように挿入される生物以外の生物から得られ、またはここで、この生物は、増強したヌクレアーゼ活性について変異され、そしてスクリーニングされる。増強したヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼの量またはヌクレアーゼの比活性または基質特異性が増加される場合に得られ得る。
【００１６】
ヌクレアーゼは、広範囲の微生物によって分泌され、そして対応する遺伝子のいくつかがクローニングされ、そして特徴づけられた。ヌクレアーゼ遺伝子の供給源としては、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１９４９５）、Ａｎａｂａｅｎａ ＰＣＣ７１２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６４７０６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６６４８０）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２３９７３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６７６７８）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５５８１８）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３０４７１）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ０００８３３）、および、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６７５８４）が挙げられる。
【００１７】
好ましくは、ヌクレアーゼは、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の両方を切断する。このヌクレアーゼは、好ましくは、広い温度範囲および広いｐＨ範囲にわたって活性である。このヌクレアーゼはまた、好ましくは、プロセシング添加剤（例えば、塩、界面活性剤、および安定化剤）の存在に寛容性である。細胞溶解およびこのヌクレアーゼが核酸を分解するインキュベーション期間後に、このヌクレアーゼは、例えば、プロテアーゼ消化、クロマトグラフィー、濾過または遠心分離によって容易に取り出し可能であることが好ましい。
【００１８】
例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌヌクレアーゼ［（デオキシ）リボヌクレエート（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｔｅ）−３’−ヌクレオチドヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．４．７］は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれかを加水分解して、３’−ホスホモノヌクレオチドおよびホスホジヌクレオチドを生成する。この酵素は約ｐＨ０．１〜１０の間で安定であり、最大活性は、０．１〜１００ｍＭ Ｃａ2+イオンの存在下で約ｐＨ９〜１０である。この酵素をコードする遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから単離され、そして特徴づけられた（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｇｅｎｅ ２２：１８１−８９（１９８３））。そしてこの遺伝子は、多くの異種細菌において機能的に発現される（Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｇｅｎｅ ２２：１８１−８９（１９８３）；Ｍｅｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：３５０８−１４（１９８７）；Ｌｉｅｂｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：１８５４−６１（１９９２）；ＬｅＬｏｉｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５１３５−３９（１９９６））。
【００１９】
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来の細胞外ヌクレアーゼは、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥTM（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を含む、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓおよびその提携会社）として市販の組換え系において生成される。この酵素をコードする遺伝子もまた、特徴づけられた（Ａｈｒｅｎｈｏｌｔｚら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６０：３７４６−５１（１９９４））。
【００２０】
（微生物株を操作する方法）
一旦選択されたヌクレアーゼ酵素をコードするヌクレアーゼ遺伝子が単離され、そして特徴づけられると、この生物がペリプラズムまたは増殖培地へヌクレアーゼを分泌するように微生物株へ組み込まれる。
【００２１】
好ましい実施態様において、短鎖長ＰＨＡの生成のための微生物株（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｅ．ｃｏｌｉ）または中間鎖長ＰＨＡの生成のための微生物株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＢＸ９７８およびＰ．ｐｕｔｉｄａ）は、ヌクレアーゼ遺伝子（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ遺伝子）をＰＨＡ生成株の染色体に組み込むことによって生成される。例えば、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、ヌクレアーゼをコードするｎｕｃ遺伝子を認識するオリゴヌクレオチドとのポリメラーゼ連鎖反応を用いる増殖によってＳ．ａｕｒｅｕｓから単離され得る。ＰＣＲ後に、増幅されたＤＮＡはＰＣＲクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）へクローニングされ得る。ヌクレアーゼ遺伝子挿入物を含むプラスミドは、ＤＮＡｓｅ寒天プレート（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）を使用するヌクレアーゼの発現のために同定され、そして分析され得る。
【００２２】
いくつかの手段は、ヌクレアーゼ遺伝子の発現のために選択されたＰＨＡ生成株へヌクレアーゼ遺伝子を移入するために利用可能である。例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａへの移入のために、遺伝子はＲａｌｓｔｏｎｉａプロモーターの制御下におかれ得、そして広い宿主範囲のクローニングベクター（例えば、ｐＬＡＦＲ３）へ挿入され得る。Ｒａｌｓｔｏｎｉａにおける発現を達成するためのプロモーターおよび方法は、ＰｅｏｐｌｅｓおよびＳｉｎｓｋｅｙ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８９）ならびにＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６２，１５２９８−１５３０３（１９８９）において見出され得る。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＺｏｏｇｌｏｅａのような属に由来する細菌は、広い宿主範囲のクローニングベクターを用いる類似のアプローチに従い得る。
【００２３】
あるいは、発現カセットは、適切な宿主の染色体に組み込まれ得、そして発現され得るように、ヌクレアーゼについて操作され得る。適切な発現カセットは、例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０）に記載される。ヌクレアーゼ遺伝子およびマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性を与える遺伝子）は、ベクター（例えば、ｐＵＴおよびｐＬＯＦシリーズ）におけるトランスポザーゼの認識配列の間にクローニングされる（Ｈｅｒｒｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６５５７−６７（１９９０））。ｐＵＴプラスミドが使用される場合、転写調節配列は、トランスポザーゼの認識配列の間に供給される必要はないが、ｐＬＯＦシリーズでは、これらの調節配列は、トランスポザーゼの認識配列の間の領域内に存在するべきである。ｐＵＴおよびｐＬＯＦプラスミドは、λ ｐｉｒリゾゲンの存在のために、このプラスミドを複製させるＥ．ｃｏｌｉ株中でのみ維持され得る。ヌクレアーゼ−マーカー構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ λ ｐｉｒ株の接合またはプラスミドＤＮＡを用いる形質転換もしくはエレクトロポレーションによって細菌細胞へ導入される。λ ｐｉｒの非存在下では、このプラスミドは細胞から喪失される。特定の頻度で、トランスポザーゼ認識配列に囲まれ、そしてトランスポザーゼ認識配列を含むＤＮＡフラグメントは、染色体に移入される。この事象が生じる細胞は、接合体、形質転換またはエレクトロポレーション混合物を構築物によって耐性が付与される抗生物質を含有する固体増殖培地にプレートすることによる選択によって単離され得る。次いで、この培地上で増殖する細胞のコロニーを、インビボまたはインビトロでのヌクレアーゼ活性についてスクリーニングする。インビボ活性は、１Ｎ ＨＣｌまたはメチルグリーン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）を用いる可視化を用いてＤＮａｓｅ試験寒天プレート上で推定ヌクレアーゼプロデューサーをプレートすることによって試験され得る。インビトロ活性は、高分子量ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡ）でクロロホルム処理した細胞の培養培地または水性上清をインキュベートし、次いで、ｐＨ緩衝化アガロースゲル上でのＤＮＡの分離によって決定され得る。
【００２４】
これらの操作された細胞株の利用性は、野生型およびヌクレアーゼ成分を使用する発酵および下流プロセスの結果を比較することによって容易に評価される。
【００２５】
（操作された株を使用する方法）
操作された株は、薬学的および産業製品（抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン類、ポリヒドロキシアルカノエート、およびポリサッカリドを含む）の製造において利用される種々の微生物発酵で使用され得る（ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＭａｖｉｔｕｎａ、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ １９９１））。好ましい実施態様において、発酵プロセスは、１００ｇ／Ｌを超える細胞密度を含む。この株は、産物が細胞溶解で回収されなければならないプロセスにおいて特に有用であり、そしてクロマトグラフィー、結晶化、沈澱、遠心分離、および／または濾過分離プロセスを必要とするプロセスにおいては、よりさらに有用である。
【００２６】
好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および株は、（例えば、ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２：２７−５８（１９９５）；Ｐｏｉｒｉｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１４２−５０（１９９５）；Ｄｏｉ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．９８：５８５−９９（１９９５）；Ｈｏｌｍｅｓらの米国特許第４，４７７，６５４号、Ｂｙｒｏｍの米国特許第５，３６４，７７８号、Ｓｅｎｉｏｒらの米国特許第５，２６６，４７０号、Ａｋｉｙａｍａらの米国特許第５，３４６，８１７号、Ｐｏｗｅｌｌらの米国特許第４，３３６，３３４号、Ｇｒｏｌｅａｕらの米国特許第５，３０２，５２５号および同第５，４３４，０６２号、Ｓｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９２，８６０号、Ｐａｇｅらの米国特許第５，０５９，５３６号および同第５，０９６，８１９号、Ｌａｆｆｅｒｔｙの米国特許第４，７８６，５９８号、Ｗｉｔｈｏｌｔらの米国特許第５，３４４，７６９号、ならびにＳｈｉｏｔａｎｉらの米国特許第５，２９０，９１０号、Ｐｅｏｐｌｅｓらの米国特許第５，２４５，０２３号、Ｄｅｎｎｉｓの米国特許第５，３３４，５２０号、Ｄｅｎｎｉｓらの米国特許第５，３７１，００２号、Ｄｅｎｎｉｓの米国特許第５，５１２，４５６号、Ｄｅｎｎｉｓらの米国特許第５，５１８，９０７号、ならびにＰｅｐｌｅｓらの米国特許第５，６６３，０６３号に記載されるような）ＰＨＡの生成についての発酵プロセスにおいて使用される。
【００２７】
別の好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および株は、非常に純粋なＰＨＡラテックスの生成において使用され、これは、多くの適用を有し得る。これらの適用の例は、ＰＣＴ ＷＯ９１／１３２０７（ＰＨＡ ｌａｔｅｘ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏａｔｉｎｇ ｐａｐｅｒ）；ＧＢ２ ２９２ ６４８ Ａ（ＰＨＡ ｌａｔｅｘ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｃｏａｔｉｎｇ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）；ＰＣＴ ＷＯ ９６／００２６３（ＰＨＡ ｌａｔｅｘ ａｓ ｆｏｏｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｃｈｅｅｓｅ，ｃｏａｔｉｎｇｓ）；ＰＣＴ ＷＯ９２／０９２１１ならびにＹａｌｐａｎｉの米国特許第５，２２９，１５８号（ＰＨＡ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｄａｉｒｙ ｃｒｅａｍ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）；ＰＣＴ ＷＯ／９２／０９２１０ならびにＹａｌｐａｎｉの米国特許第５，２２５，２２７（ＰＨＡｓ ａｓ ｆｌａｖｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｆｏｏｄｓ）；およびＰＣＴ ＷＯ９６／１７３６９（ＰＨＡｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｈｏｄｅ ｒａｙ ｔｕｂｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）に記載される。水性プロセスに使用する細胞からＰＨＡラテックスを得るために、ＰＨＡ含有細胞を溶解することが一般に必要である。微生物細胞を溶解する方法は周知であり、そして物理的均質化処理、超音波処理、酵素処理および界面活性剤処理、ならびに凍結／融解サイクルが挙げられる。
【００２８】
別の好ましい実施態様において、本明細書中に記載の方法および操作された株は、ポリサッカリドの生成に有用である。微生物ポリサッカリドは、多くの異なる微生物の発酵により生成され得る。例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、キサンタンガムの生成のために商業的に使用され（ＫｅｎｎｅｄｙおよびＢｒａｄｓｈａｗ、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：３１９−７１（１９８４））、そしてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ株は、ジェランガムを生成するために使用される（Ｋａｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．４３：１０８６−９１（１９８２））。他の例としては、食品産業において広範に使用されるアルギネート（主に、褐藻類由来）が挙げられる（Ｗｅｌｌｓ、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＳａｎｆｏｒｄおよびＬａｓｋｉｎ編）第２９９頁（ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ １９７７））。アルギネートはまた、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ株の発酵によって生成され得る（Ｃｈｅｎら、Ａｐｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．４９：５４３−４６（１９８５））。ヒアルロン酸は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉを使用する生物医学的適用について生じるポリマーの別の例である（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙおよびｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６９−７５（１９９４））。
【００２９】
本明細書中に記載の方法および系は、Ｐｏｌｌｏｃｋ、米国特許第５，３５４，６７１号およびＭｕｒｏｆｕｓｈｉら、米国特許第５，７０５，３６８号、およびＨｏｍｍａら、米国特許第５，６７９，５５６号によって記載されるキサンタンガムの回収に対して、細胞溶解アプローチと合わせて使用される場合、特に有利であり得る。開示された方法を実施するために適切なＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ株は、Ｂａｕｅｒら、米国特許第４，４００，４６７号およびＰｏｌｌｏｃｋら、米国特許第５，４７２，８７０号に記載される。
【００３０】
多くの他の微生物株を使用してポリサッカリドを産生し、そして本明細書に開示される方法に従うようにする。遺伝子操作技術は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第２０４巻、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、現在、これらの全ての微生物について利用可能である。Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒによるセルロースの産生は、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔらによって米国特許第５，８２１，１０９号に開示され、そして遺伝子操作したＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒについては、Ｔｏｎｏｕｃｈｉらによって米国特許第５，７９２，６３０号に開示される。Ｚｏｏｇｌｏｅａによるエキソポリサッカリド（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の産生およびこの微生物の遺伝子操作は、Ｅａｓｓｏｎらによって米国特許第４，９４８，７３３号および同第５，０９１，３７６号に記載される。ジェランガムとして公知の微生物のポリサッカリドは、「スフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）」として公知の構造的に関連するエキソポリサッカリドのファミリーの１つのメンバーである（Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｔ．Ｊ．１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：１９３９−１９４５，Ｐｏｌｌｏｃｋらの米国特許第５，８５４，０３４号およびその中の参考文献）。ジェランガムは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ菌株番号ＡＴＣＣ３１４６１）によって、米国特許第４，３２６，０５２号；同第４，３７７，６３６号；同第４，３８５，１２６号および同第４，５０３，０８４号に記載される過程によって産生される。この株および増強したジェランガム産生特性を有する変異誘導株は、Ｆｉａｌｈｏら，１９９１ Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：８５−８７およびＰｏｌｌｏｃｋらの米国特許第５，８５４，０３４号によって記載されるように、遺伝的に操作され得る。例えば、ＰＨＢの蓄積を欠損するこの株の変異株はまた、開示される本方法を実行するために使用され得、そして菌株番号ＡＴＣＣ５３９６７として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。ヒアルロン酸は、例えば、Ｅｌｌｗｏｏｄらの米国特許第５，５６３，０５１号に記載されるようにＳｔｒｅｐｔｏｃｃｏｕｓ細菌により産生される。
【００３１】
本明細書に記載される組成物および調製方法、ならびにそれらの使用は、以下の限定的ではない実施例によって、さらに記載される。
【００３２】
（実施例１：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ遺伝子の単離）
プラスミドｐＮｕｃ１は、Ｌｉｅｂｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：１８５４−６１（１９９２）に記載されている。小球菌ヌクレアーゼをコードするｎｕｃ遺伝子の配列は決定されており（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｇｅｎｅ ２２：１８１−８９（１９８３））、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１７８５でアクセス可能である。ｎｕｃ遺伝子は、精製したプラスミドｐＮｕｃ１、および以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅され：
【００３３】
【化１】
【００３４】
（実施例２：ヌクレアーゼを発現するトランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２株の構築）
ｎｕｃ遺伝子を、プラスミドｐＣＲ２．１−ｎｕｃから、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃ６５Ｉを使用して切り出し、そしてｐＵＣ１８ＮｏｔＩの対応する部位に挿入してｐＵＣ１８−ｎｕｃＩを得た。プラスミドｐＢＧＳ１８（Ｓｐｒａｔｔら，１９８６，Ｇｅｎｅ ４１：３３７−３４２；ＡＴＣＣ受託番号３７４３７）に由来する、プロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を、以下のプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって得：
【００３５】
【化２】
【００３６】
得られたプラスミドであるｐＭＮＸ−ｎｕｃを、ＳｍａＩで直線化し、そしてｐＭＮＸ−ｋａｎに由来する、プロモーターを有さないカナマイシン遺伝子を含む平滑末端化したＥｃｏＲＩ／Ａｃｃ６５Ｉフラグメントと連結した。組換えｐＭＮＸ−ｎｕｃ−ｋａｎプラスミドを、ｌａｃプロモーターに由来するｎｕｃ−ｋａｎオペロンの発現によって与えられるそれらのカナマイシン耐性に基づいて単離した。続いて、このｎｕｃ−ｋａｎオペロンをＮｏｔＩフラグメントとして切り出し、そしてｐＵＴｋａｎの対応する部位に挿入した。続いて、プラスミドｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎを使用して、プロモーターを有さないｎｕｃ−ｋａｎオペロンを無作為にＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２の染色体に組み込んだ。プラスミドの接合を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸｎｕｃ−ｋａｎ］を使用して達成した。
【００３７】
トランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ株を、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／クロラムフェニコールプレート上で選択した。１２，０００の無作為な組み込み体のうち、１５００のコロニーをＤＮＡｓｅ寒天プレートにレプリカプレーティングして、ヌクレアーゼを発現しているクローンを選択した。培養上清中および株のペリプラズム中のヌクレアーゼレベルのインビトロ分析のために、ヌクレアーゼを発現している３５のクローンを選択した。この目的のために、細胞を遠心沈殿し、そして分泌されたヌクレアーゼを含む上清を回収した。続いて、この細胞ペレットを新鮮な培地中に再懸濁し、そして５００μｌの懸濁液に１００μｌのクロロホルムを添加して、ペリプラズムのヌクレアーゼを放出させた。続いて、細胞片を遠心沈殿した。ＤＮＡゲル電気泳動を、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（０．０２Ｕ）で処理したサンプル、ヌクレアーゼが組み込まれた株の培養上清で処置したサンプル、およびＰ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２の上清で処理したサンプルを用いて行った。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２由来の染色体ＤＮＡ上の９の異なるＰ．ｐｕｔｉｄａ ｎｕｃ組み込み体の分泌画分およびペリプラズム画分に、ヌクレアーゼ活性が存在した。続いて、細胞片を遠心分離によって除去した。
【００３８】
ヌクレアーゼの存在を、清澄化した上清のアリコートを、４μｇのＰ．ｐｕｔｉｄａ染色体ＤＮＡと共に３７℃で１時間インキュベートすることによって決定した。コントロールとして、染色体ＤＮＡを、市販されているＢＥＮＺＯＮＡＳＥTM（ポシティブコントロールとして０．０２ユニット、またはネガティブコントロールとしてヌクレアーゼ無し）と共にインキュベートした。消化に続いて、このサンプルを、アガロースゲル電気泳動により分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。この試験を使用して、異なるレベルで、および細胞外領域でもしくはペリプラズム空間でまたはその両方でヌクレアーゼ活性を発現する株を容易に同定した。
【００３９】
これらの株を、ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９１８〜ＭＢＸ９２６と呼ぶ。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９２４は、ヌクレアーゼをペリプラズムおよび細胞外培地の両方に分泌し、そして２３Ｓ ｒＲＮＡコード遺伝子に組み込まれたｎｕｃ−ｋａｎオペロンを有する。
【００４０】
（実施例３：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ４０１２４株の構築）
トランスジェニックＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ４０１２４株を、その宿主株をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＰＣＴ／１％グルコース／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）／カナマイシンプレート上で接合した後に選択した。１０の無作為コロニーを、ＰＣＴ／１％グルコース／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）／カナマイシン液体培地中に接種し、そして３０℃で２０時間増殖させた。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ＭＢＸ９１７培養物のみが活性なヌクレアーゼを産生し、このヌクレアーゼは、トランスジェニック株のペリプラズムに局在した。
【００４１】
（実施例４：ヌクレアーゼ遺伝子を発現するトランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８株の構築）
トランスジェニックＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８株を、その宿主株をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＥ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレート上で接合した後に選択し、続いて、適切な抗生物質を含むＤＮＡｓｅ寒天プレート上にレプリカプレーティングした。全部で５０のヌクレアーゼポシティブのコロニーを、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレートにレプリカプレーティングした。続いて、９の単離株（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７９〜９８７）を、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）液体培地中で増殖させた。全てのクローンが、ヌクレアーゼ活性をペリプラズムに分泌した。ＭＢＸ９８４は、最高レベルのヌクレアーゼ活性を分泌した。９つ全ての株を、増殖特性およびＰＨＡ蓄積について、５０ｍｌのＥ２／１０ｍＭオクタン酸液体培地中で試験した。結果を以下の表１に示す。細胞は、炭素供給源として、１０ｍＭオクタン酸を含むＥ２培地上で増殖させた。ＭＢＸ９８５は、野生型株の増殖能力およびＰＨＡ蓄積活性を保持した。
【００４２】
【表１】
トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４７株を、その宿主株をＥ．ｃｏｌｉ Ｓ１７−１［ｐＭＵＸ−ｎｕｃ−ｋａｎ］とＥ２／１０ｍＭ オクタン酸／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレート上で接合した後に選択し、続いて、適切な抗生物質を含むＤＮＡｓｅ寒天プレート上にレプリカプレーティングした。全部で７５のヌクレアーゼポシティブのコロニーを、Ｅ２／１０ｍＭ オクタン酸／０．５％コーンスティープ酒／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）プレートにレプリカプレーティングした。続いて、９つの単離株を、Ｒ１０／２％グルコース／カナマイシン／ナリジキシン酸（ｎａｌａｄｉｘｉｃ ａｃｉｄ）液体培地中で増殖させた。４つの単離株（ＭＢＸ９８８〜９９１）において、ヌクレアーゼ遺伝子が、染色体に首尾良く組み込まれていた。この異なるトランスジェニック株におけるヌクレアーゼ活性を分析した。ＤＮＡゲル電気泳動を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ２４７のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ１０培地上で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ９８８のペリプラズム画分で処理したサンプル、ＬＢ培地上で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ ＭＢＸ９８８のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ＭＢＸ９１７のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ ４０１２４のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＢＸ９８５のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＭＢＸ９７８のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９２４のペリプラズム画分で処理したサンプル、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４２のペリプラズム画分で処理したサンプル、および分子量マーカーを用いて行った。
【００４３】
ヌクレアーゼ活性を、異なるトランスジェニック株において、実施例２に記載される染色体ＤＮＡ消化およびゲル電気泳動アッセイを使用して分析した。
【００４４】
これらの操作した株を、ＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子を導入することによってさらに改変した（米国特許第５，２４５，０２３号；同第５，３３４，５２０号；同第５，３７１，００２号；同第５，５１２，４５６号；同第５，５１８，９０７号；および同第５，６６３，０６３号に記載される）。
【００４５】
（実施例６：ＰＨＡ顆粒懸濁物のＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８からの単離およびヌクレアーゼを発現する誘導株）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９７８およびＰ．ｐｕｔｉｄａ ＭＢＸ９８５を、炭素供給源としてオクタン酸を含む２０Ｌの流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）中で細胞密度が２００ｇ／Ｌになるまで増殖させた。発酵に続いて、それぞれの培養物に１ｍＭ ＣａＣｌ2を補充して、そして水酸化アンモニウムを用いてｐＨ８．５に調整した。次いで、この培養物を、高圧ホモジナイザーを使用して圧力を８，０００ｐｓｉから２０，０００ｐｓｉまで変化させる操作をして溶解した。溶解物の各サンプルを室温で１時間インキュベートし、次いで、この粘稠性を２０℃でＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶＦ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（スピンドル番号１、６０ｒｐｍ）を使用して決定した。野生型株およびヌクレアーゼ発現株のサンプルに加えて、市販のヌクレアーゼ（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥTM，１０μＬ／Ｌ培養物）を補充した野生型の培養物から溶解物を調製した。粘稠性決定についての結果を表２に示し、そしてこの結果は、ヌクレアーゼ遺伝子の組み込みが、ＭＢＸ９８５における場合、ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を添加した野生型株で得られた粘稠性と類似するレベルまでの溶解物の粘稠性の低減を生じることを示す。
【００４６】
【表２】
Claims (28)
- 抗生物質、有機酸、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ポリヒドロキシアルカノエート、およびポリサッカリドからなる群から選択される産物の産生のための細菌株であって、
ここで、該細菌株は、異種ヌクレアーゼ遺伝子産物を発現するか、または同種ヌクレアーゼ遺伝子産物を増強するために改変され：
ここで、該細菌株は、該ヌクレアーゼ遺伝子産物の発現および分泌の高いレベルのために選択され、そして
ここで、該ヌクレアーゼ遺伝子産物は、細胞ペリプラズムまたは増殖培地中に、細胞の溶解後放出される核酸を分解するために有効な量において分泌される、
細菌株。 - 少なくとも５０ｇ／ｌの細胞密度まで増殖し得る、請求項１に記載の細菌株。
- 前記細菌株の乾燥細胞重量の少なくとも４０％のレベルまでポリヒドロキシアルカノエートを産生する、請求項２に記載の細菌株。
- 核酸を含まないポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）顆粒懸濁液を製造するための水性プロセスにおける使用のための、請求項２に記載の細菌株。
- キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン、ヒアルロン酸、および微生物セルロースからなる群から選択されるポリサッカリドを作製するためのプロセスにおける使用のための、請求項１に記載の細菌株。
- 前記ヌクレアーゼ遺伝子が、前記細菌株以外の生物から得られる異種遺伝子である、請求項１に記載の細菌株。
- 前記ヌクレアーゼ遺伝子が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａからなる群から選択される宿主株に組み込まれる、請求項１に記載の細菌株。 - 前記ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼ活性を増強するために改変されている同種遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の細菌株。
- 前記細菌株が変異され、そして該変異された細菌がヌクレアーゼ活性の増加する量についてスクリーニングされる、請求項８に記載の細菌株。
- 前記細菌株が、前記産物を産生するか、または該産物の産生を増強するために遺伝的に操作される、請求項１に記載の細菌株。
- 前記細菌株が、異種ヌクレアーゼ遺伝子からのヌクレアーゼ遺伝子産物を発現する、請求項１または１０に記載の細菌株。
- 前記細菌株が、同種ヌクレアーゼ遺伝子からのヌクレアーゼ遺伝子産物を発現する、請求項１または１０に記載の細菌株。
- 前記産物がポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１および１０〜１２のいずれか１項に記載の細菌株。
- 前記産物がタンパク質である、請求項１および１０〜１２のいずれか１項に記載の細菌株。
- 前記タンパク質が酵素である、請求項１４に記載の細菌株。
- 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細菌株を増殖培地に添加する工程を包含する、発酵方法。
- 前記細菌株が、少なくとも５０ｇ／ｌの細胞密度まで増殖する、請求項１６に記載の方法。
- 前記細胞を溶解する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
- 請求項３に記載の細菌株を使用する方法が、核酸を含まないポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）顆粒懸濁液を製造するための水性プロセスを使用する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
- キサンタンガム、アルギネート、ジェランガム、ゾーグラン、ヒアルロン酸、および微生物セルロースからなる群から選択されるポリサッカリドを作製するためのプロセスにおいて使用される、請求項１６に記載の方法。
- 酵素、増殖因子、およびサイトカインからなる群から選択される細胞内タンパク質を作製するためのプロセスにおいて使用される、請求項１６に記載の方法。
- 前記細菌が同種ヌクレアーゼを発現する、請求項１６に記載の方法であって、ヌクレアーゼ活性を増強するために該ヌクレアーゼを遺伝的に操作する工程をさらに包含する、方法。
- 前記産物を産生するか、または該産物の産生を増強するために、前記細菌株を遺伝的に改変する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
- 前記細胞株が、異種ヌクレアーゼ遺伝子からのヌクレアーゼ遺伝子産物を発現する、請求項１６または２３に記載の方法。
- 前記細胞株が、同種ヌクレアーゼ遺伝子からのヌクレアーゼ遺伝子産物を発現する、請求項１６または２３に記載の方法。
- 前記産物がポリヒドロキシアルカノエートである、請求項１６および２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記産物がタンパク質である、請求項１６および２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記タンパク質が酵素である、請求項２７に記載の方法。
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