JP2009207424A - ポリヒドロキシアルカン酸の分解方法、並びに微生物製剤及び酵素製剤 - Google Patents
ポリヒドロキシアルカン酸の分解方法、並びに微生物製剤及び酵素製剤 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のハイブリッド型共重合ポリエステル（ＰＨＢＨ）を含むポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を、高温下で効率よく分解する方法、コンポストに投入して使用可能な微生物製剤、及び酵素製剤を提供する。
【解決手段】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物や、これから単離した特定のアミノ酸配列からなる酵素やその変異体、又は、これらを産生する形質転換体の存在下、５５〜８０℃の範囲でポリヒドロキシアルカン酸を分解する方法。ＰＨＡ分解用微生物製剤又は酵素製剤は、前記微生物、又は前記酵素又はその変異体を含む。
【選択図】なし
【解決手段】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物や、これから単離した特定のアミノ酸配列からなる酵素やその変異体、又は、これらを産生する形質転換体の存在下、５５〜８０℃の範囲でポリヒドロキシアルカン酸を分解する方法。ＰＨＡ分解用微生物製剤又は酵素製剤は、前記微生物、又は前記酵素又はその変異体を含む。
【選択図】なし
Description
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸（以下ＰＨＡと略す）の分解方法、並びに、その分解に使用される微生物製剤及び酵素製剤に関する。より詳しくは、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸から成るＰＨＡを効率よく分解するサーモビフィダ属（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）細菌や、当該細菌より単離されたＰＨＡを分解する耐熱性酵素等を用いたＰＨＡ分解方法、微生物製剤、酵素製剤に関する。
近年、学校給食、レストランなどから出される廃棄物を、農業に有効な製品として再利用する方法として堆肥化が推進されている。土壌改良材として用いられた堆肥は、土壌の有機物の含有量、水分と栄養分を保持する力が増すため、化学肥料の投入量を減らし、植物の病気を抑えるという望ましい効果を持つ。このように堆肥を農業に用いることにより、廃棄物処理の問題を低投入型の持続可能な農業に転換することが可能となる。
しかしながら、廃棄物を堆肥化し農業用途に利用するためには、その中に含まれるプラスチック廃棄物を分別除去する必要があり、このような分別除去には多大な労力を要することから、堆肥化処理の大きな課題となっている。
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。３−ヒドロキシアルカン酸のホモポリマーあるいはコポリマーであるこれらのポリエステル（ＰＨＡ）は熱可塑性高分子であり、堆肥化や自然環境中で微生物によって分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。このためこのような生分解性プラスチックは環境中で利用される農業用資材、使用後の回収・再利用が困難な食品容器、包装材料、衛生用品、ゴミ袋などへの幅広い応用を目指して開発が進められている。特に食品容器や包装材料などは、堆肥化処理のための分別除去の必要がないため、大きな期待が寄せられている。
しかし、現在のプラスチック使用量を考慮すると、自然界や堆肥化施設に存在する微生物による分解を待っているだけでは処理しきれなくなることが予想される。そこでＰＨＡを分解する微生物を探索して、これを利用して積極的にＰＨＡを分解する方法が検討されている。
ＰＨＡはｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡ（以下ＰＨＡSCLと略す；３ ｔｏ ５Ｃ−ａｔｏｍｓ）とｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ ＰＨＡ（以下ＰＨＡMCLと略す；６ ｔｏ １４Ｃ−ａｔｏｍｓ）に分類されている。ＰＨＡを分解する菌株は細菌やカビに広く分布し、ＰＨＡSCLやＰＨＡMCLを分解する微生物が多数分離されている（非特許文献１）。ほとんどの細菌はＰＨＡSCLまたはＰＨＡMCLを特異的に分解する。また、両タイプのＰＨＡを分解できる微生物としてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓが見いだされているが、それぞれのタイプのＰＨＡに対応する２種類以上の分解酵素を持つために分解可能であることが分かっている（非特許文献２、非特許文献３)。
環境中でのＰＨＡの分解は主として菌株が生産するデポリメラーゼによって行われるが、デポリメラーゼには菌体外に分泌されるタイプ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）と菌体内に蓄積するタイプ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に分類される。このうち前者が環境中でのＰＨＡ分解に主に寄与している。これらの菌株より種々のデポリメラーゼが精製され、これらのデポリメラーゼの基質特異性はＰＨＡSCLまたはＰＨＡMCLのいずれかに特異的であることが明らかになった（非特許文献１、非特許文献２）。
ＰＨＡSCLの一種である３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと略す）を分解する微生物として、土壌より分離したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物が分離され、本菌株がＰＨＢを分解する酵素であるデポリメラーゼ（Ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を産生することが見出された（特許文献１）。この微生物並びに同酵素を利用することでＰＨＢの効率の良い分解が可能となった。また、デポリメラーゼ遺伝子のクローニングと遺伝子組換え技術を応用した高効率なデポリメラーゼの生産も行なわれている（特許文献２）。また、耐熱性のＰＨＢ分解微生物として、Ｓｃｈｌｅｇｅｌｅｌｌａ属やＣａｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物が報告されており、これらの酵素の至適温度は７５〜８０℃と報告されている（非特許文献５、非特許文献６）。
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下３ＨＨと略す）の共重合ポリエステル（以下ＰＨＢＨと略す）およびその製造方法について研究がなされている。
しかしながら、ＰＨＡSCLとＰＨＡMCLのハイブリッド型であるＰＨＢＨの分解酵素に関する研究はほとんど行なわれていない。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓの生産するＰＨＢ分解酵素が３ＨＢと３ＨＨの結合を加水分解できないことが知られている（非特許文献１）一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｎ１８−２５−９株の生産するＰＨＢ分解酵素、同株より単離されたＰＨＢ酵素遺伝子並びにＰＨＢ酵素遺伝子発現ベクターにより形質転換された当該形質転換体を培養することによりＰＨＢＨを分解する酵素があることが知られている（特許文献３、非特許文献４）。前記株は生育条件温度が２０〜４５℃の範囲にある。
したがって、広範な用途に対して応用が期待されているＰＨＢＨを分解する微生物並びに酵素が望まれていたが、工業用に使用される微生物並びに酵素は、物理的、化学的に高い安定性が要求されるので、特に好熱性微生物並びに耐熱性酵素が望まれる。これは好熱性微生物の持つ耐熱性酵素が、高い安定性により低コストで長時間使用可能なこと、高温下で反応を行うので雑菌汚染がなく、安定した反応を行うことができること、酵素の保存が容易で、特別な施設が必要ないことなどの性質を持つこと等の理由による。さらに、好熱性微生物や耐熱性酵素は、７０℃付近まで温度が上昇する堆肥（コンポスト）中での使用も可能になる。ところが、現在までＰＨＢＨを分解する好熱性微生物並びに耐熱性酵素の報告例は皆無であった。
特開平７−１５５１８０号公報
特開平９−１９１８８７号公報
特開２００６−２３８８０１号公報
Ｊｅｎｄｒｏｓｓｅｋ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２，ｖｏｌ５６，４０３．
Ｓｃｈｉｒｍｅｒ等，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ５９，１２２０（１９９３）
Ｋｌｉｎｇｂｅｉｌ等，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ１４２，２１５（１９９６）
Ｔａｋａｋｕ等，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ２６４，１５２（２００６）
Ｒｏｍｅｎ等，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１８２（２−３），１５７−６４（２００４）
Ｅｌｂａｎｎａ等，Ａｒｃｈ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１８２（２−３），２１２−２５（２００４）
本発明は、上記現状に鑑み、ハイブリッド型ＰＨＢＨを含むＰＨＡを高温下で効率よく分解する好熱性微生物や、これに由来する耐熱性のデポリメラーゼを使用したＰＨＡ分解方法、並びに、コンポストに投入して使用可能な微生物製剤、及び酵素製剤を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、寒冷稲作地帯である新潟県新潟市秋葉区において１次、２次発酵が行われ、作製された堆肥の抽出液よりＰＨＢＨを分解するサーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）を単離した。また、サーモビフィダ・フスカよりデポリメラーゼ遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を宿主細胞で発現させることにより耐熱性デポリメラーゼを製造し、その活性を確認したところ、至適温度が６５〜７５℃と高く、そのＰＨＢＨ分解活性も非常に優れていることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（７）を提供するものである。
（１）ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解する方法であって、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの存在下、５５〜８０℃の範囲でポリヒドロキシアルカン酸を処理することからなる分解方法。
（ａ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物
（ｂ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｅ）次の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）ポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有する。（２）至適温度が６５〜７５℃のあいだにある。（３）前記酵素活性が１価の金属イオン存在下で向上する。
（ｆ）前記ポリペプチド（ｂ）〜（ｅ）を産生するポリヌクレオチドが導入された形質転換体
（２）ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸及び３−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも１種類から構成される、（１）記載の分解方法。
（ａ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物
（ｂ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｅ）次の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）ポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有する。（２）至適温度が６５〜７５℃のあいだにある。（３）前記酵素活性が１価の金属イオン存在下で向上する。
（ｆ）前記ポリペプチド（ｂ）〜（ｅ）を産生するポリヌクレオチドが導入された形質転換体
（２）ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸及び３−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも１種類から構成される、（１）記載の分解方法。
（３）ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルである、（１）記載の分解方法。
（４）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物を含有する、ポリヒドロキシアルカン酸分解用微生物製剤。
（５）コンポストに投入して用いられる、請求項（４）記載の微生物製剤。
（６）以下の（ｂ）〜（ｅ）のいずれかのポリペプチドを含有する、ポリヒドロキシアルカン酸分解用酵素製剤。
（ｂ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｅ）次の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）ポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有する。（２）至適温度が６５〜７５℃のあいだにある。（３）前記酵素活性が１価の金属イオン存在下で向上する。
（ｂ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｅ）次の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）ポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有する。（２）至適温度が６５〜７５℃のあいだにある。（３）前記酵素活性が１価の金属イオン存在下で向上する。
（７）コンポストに投入して用いられる、（６）記載の酵素製剤。
本発明により、ＰＨＢＨ等のＰＨＡを高温下で効率良く、安価に分解することが可能となり、コンポストにおいてＰＨＢＨ等のＰＨＡを分解することが可能になる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解するために、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物、当該微生物に由来する配列番号３又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる酵素、その変異体、あるいは前記酵素又は変異体を産生する形質転換体の存在下、５５〜８０℃の範囲でポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を処理する。
本発明におけるＰＨＡは以下の一般式で表される。
（式中のＲは炭素数１〜１３のアルキル基を表し、ｍは２以上の整数を表す。ｍ個のＲは同一であってもよいし、異なっていてもよい。）
本発明において、ＰＨＡは、３ＨＢ及び３ＨＨのうち少なくとも１種類から構成されるＰＨＡが好ましく、より好ましくは、下記一般式：
（式中のｍ、ｎは１以上の整数を表す）
で表される、３ＨＢと３ＨＨから構成される共重合ポリエステルである。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物は好熱菌の１種である。好熱菌とは至適生育温度が４５℃以上であり、生育限界温度が５５℃以上の菌をいう。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物は、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドを菌体内に産生した後、シグナルペプチドが切断されて配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドを菌体外に放出する。
配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに代表される本発明によるポリペプチドは、ＰＨＢ、ＰＨＢＨ等を含むＰＨＡを分解する活性を有しており、その至適温度は６５〜７０℃にある。したがって、例えば工業的にＰＨＡを分解する際や、コンポスト中でＰＨＡを分解する際など、例えば５５〜８０℃という高温でＰＨＡ分解を行うにあたって、きわめて有利である。また、本発明で使用するポリペプチドは１価の金属イオンが存在する系においてその分解活性が向上する特性を有する。
本発明で使用可能な変異体の一形態は、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなるものであるが、配列同一性の数値として好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、更により好ましくは９９％以上である。
また、本発明で使用可能な変異体の別形態は、配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであるが、前記数個とは、好ましくは５個、より好ましくは３個、特に好ましくは２個である。
これら変異体がＰＨＡ分解酵素活性を有するか否かは、後述の実施例１１の手順と同様に確認できる。本発明で使用する酵素又は変異体は、シグナルペプチドや、その生産時の精製を容易にする観点で導入されるＨｉｓ−Ｔａｇ等のアミノ酸配列等を挿入又は付加されたものであってもよい。
以上の酵素又は変異体を産生する形質転換体の製造方法については後述する。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物は好熱性であり、高温でＰＨＡを効率よく分解できるので、ＰＨＡの分解を目的とした微生物製剤を構成することができる。この微生物製剤はコンポストに投入して使用可能である。本発明のように耐熱性デポリメラーゼを生産する高温菌、好熱菌、超好熱菌を用いると、コンポストへの投入に適した微生物製剤を製造することが可能になる。
また、前述した酵素又は変異体は至適温度が高く、高温でＰＨＡを効率よく分解できるので、ＰＨＡの分解を目的とした酵素製剤を構成することができる。この酵素製剤はコンポストに投入して使用可能である。
これら微生物製剤又は酵素製剤をコンポストに投入することによって、ＰＨＡを原料にして有機肥料を得ることが可能になる。
（ＰＨＡ分解微生物の分離）
本発明の微生物は土壌、堆肥、活性汚泥、河川、海水などの環境中より分離することができる。微生物の分離には種々の方法が知られているが（農芸化学実験書、第２巻）、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物を分離できればどのような分離方法を用いてもよい。一例として、環境から得られた種々のサンプルを滅菌した水や生理的食塩水に懸濁し、菌体懸濁液を作製する。この懸濁液を適当な菌濃度に希釈後、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを唯一または主な炭素源として含有する固体培地上に塗布し、菌株の生育できる温度で培養する。培養温度は微生物が生育できる温度であれば特に制限されない。また、培地中に加えるＰＨＡやＰＨＢＨはどのような形状のものであっても利用できるが、微細な粉末が好適である。加える濃度は特に制限されないが、固体培地が加えたＰＨＡやＰＨＢＨによって白濁する０．０５％〜５％が好適であり、０．１％〜０．５％がより好適である。３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物は、生育してきた菌体コロニーの周囲に同ポリマーを分解したことを示すハローを形成することにより、検出・分離することができる。
本発明の微生物は土壌、堆肥、活性汚泥、河川、海水などの環境中より分離することができる。微生物の分離には種々の方法が知られているが（農芸化学実験書、第２巻）、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物を分離できればどのような分離方法を用いてもよい。一例として、環境から得られた種々のサンプルを滅菌した水や生理的食塩水に懸濁し、菌体懸濁液を作製する。この懸濁液を適当な菌濃度に希釈後、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを唯一または主な炭素源として含有する固体培地上に塗布し、菌株の生育できる温度で培養する。培養温度は微生物が生育できる温度であれば特に制限されない。また、培地中に加えるＰＨＡやＰＨＢＨはどのような形状のものであっても利用できるが、微細な粉末が好適である。加える濃度は特に制限されないが、固体培地が加えたＰＨＡやＰＨＢＨによって白濁する０．０５％〜５％が好適であり、０．１％〜０．５％がより好適である。３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物は、生育してきた菌体コロニーの周囲に同ポリマーを分解したことを示すハローを形成することにより、検出・分離することができる。
また、種々のサンプルより調製した菌体懸濁液を、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを唯一または主な炭素源とする培地中に添加し、培養することにより、当該微生物を濃縮することもできる。その後、前記方法によって当該微生物を分離することができる。
本発明に係る３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物の好適な分離例は次のとおりである。
乳化されたＰＨＢＨを０．３％含有する一般細菌用培地（ＮＢ培地）に堆肥抽出液を塗布し、５５℃で培養した。培養後、菌体コロニーの周りにＰＨＢＨの溶解ゾーンを形成した微生物を分離した。この菌株の同定は菌学的な性質や１６ＳリボゾーマルＤＮＡの配列比較により行なうことができる。本菌株を後者によって同定した結果、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａであることが明らかになり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１と命名した。
生理学的な試験は一般的な方法に従って行った（長谷川武治、微生物の分類と同定、東京大学出版会、１５５−２４５（１９７５）、Ｓｎｅａｔｈ等、Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ２， Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８６）。Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１は、グラム陽性菌、好気性の桿菌、胞子を形成し、生育条件温度は３７〜６５℃であった。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１は、グルコース、フルクトース、スクロース同化することができたが、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、ラフィノースを同化することはできなかった。スターチを加水分解することができた。
（デポリメラーゼ遺伝子のクローニング）
１．デポリメラーゼ遺伝子の探索
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１に近縁な微生物であるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸのゲノムＤＮＡ配列（登録番号ＣＰ００００８８）の中から、申請者らが以前クローニングしたＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｎ１８−２５−９のＰＨＢデポリメラーゼ遺伝子配列（登録番号ＡＢ２５８３８８）にコードされるアミノ酸配列と配列同一性の高い領域をコードする遺伝子配列情報をＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ（ｂｌａｓｔｐ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のプログラムを利用して取り出す。
１．デポリメラーゼ遺伝子の探索
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１に近縁な微生物であるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸのゲノムＤＮＡ配列（登録番号ＣＰ００００８８）の中から、申請者らが以前クローニングしたＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｎ１８−２５−９のＰＨＢデポリメラーゼ遺伝子配列（登録番号ＡＢ２５８３８８）にコードされるアミノ酸配列と配列同一性の高い領域をコードする遺伝子配列情報をＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ（ｂｌａｓｔｐ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のプログラムを利用して取り出す。
２．デポリメラーゼ遺伝子の部分断片増幅
前記項目１．で検索された配列の遺伝子情報から、デポリメラーゼ遺伝子情報部分のＤＮＡ配列に相補的なプライマーを２種類以上作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりデポリメラーゼ遺伝子を増幅する。
前記項目１．で検索された配列の遺伝子情報から、デポリメラーゼ遺伝子情報部分のＤＮＡ配列に相補的なプライマーを２種類以上作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりデポリメラーゼ遺伝子を増幅する。
３．サブゲノムライブラリーの構築
３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物のＤＮＡの調製は種々の既知の方法が利用できる。一例として、当該微生物の培養液より遠心処理等によって菌体を集め、リゾチームなどの溶菌酵素処理を行なう。次に凍結融解処理を行なったあと、ＳＤＳ溶液を重層し界面を混合することにより溶菌させる。同溶菌液にフェノール・クロロホルム溶液を添加し、蛋白質等の変性処理を行ったあと水層にエタノールを加える。析出するＤＮＡをガラス棒などで巻き取ることによりゲノムＤＮＡを調製することができる。
３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物のＤＮＡの調製は種々の既知の方法が利用できる。一例として、当該微生物の培養液より遠心処理等によって菌体を集め、リゾチームなどの溶菌酵素処理を行なう。次に凍結融解処理を行なったあと、ＳＤＳ溶液を重層し界面を混合することにより溶菌させる。同溶菌液にフェノール・クロロホルム溶液を添加し、蛋白質等の変性処理を行ったあと水層にエタノールを加える。析出するＤＮＡをガラス棒などで巻き取ることによりゲノムＤＮＡを調製することができる。
調製されたゲノムＤＮＡは物理的な切断や種々の制限酵素を用いて切断することができる。切断方法は特に制限されないが、例えば制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離する。ニトロセルロースメンブレンにＤＮＡ断片を転写し、前記項目２．で増幅されたデポリメラーゼ遺伝子と相補的なＤＮＡ断片の長さをサザン解析により知ることができる。
調製されたゲノムＤＮＡは物理的な切断や種々の制限酵素を用いて切断することができる。切断方法は特に制限されないが、例えば制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで切断し、目的長さのＤＮＡ断片を精製することができる。ベクターにはプラスミドやファージなどが利用できるが、特に制限されない。挿入するＤＮＡ断片にあわせて制限酵素で処理することによりサブゲノムライブラリーの構築に用いることができる。例えば制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで切断された３ＫｂのＤＮＡ断片は、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１９などのベクターに挿入することができ、大腸菌に形質転換することによりサブゲノムライブラリーを構築することができる。
４．デポリメラーゼ遺伝子のクローニング
前記項目２．で増幅されたデポリメラーゼ遺伝子と相補的なＤＮＡ断片を持つ大腸菌をサブゲノムライブラリーが導入された大腸菌からコロニーハイブリダイゼーション法により選択することができ、この大腸菌が該当デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンである。或いは、サブゲノムライブラリーを３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを唯一または主な炭素源とした含有する固体培地上に塗布し、菌株の生育できる温度で培養する。宿主がデポリメラーゼを分泌する場合は、宿主よりも大きな同ポリマー溶解ゾーンを形成するコロニーが当該デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンであり、宿主が大腸菌のようにデポリメラーゼを生産しない場合は、同ポリマー溶解ゾーンを形成するコロニーが当該デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンである。
前記項目２．で増幅されたデポリメラーゼ遺伝子と相補的なＤＮＡ断片を持つ大腸菌をサブゲノムライブラリーが導入された大腸菌からコロニーハイブリダイゼーション法により選択することができ、この大腸菌が該当デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンである。或いは、サブゲノムライブラリーを３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを唯一または主な炭素源とした含有する固体培地上に塗布し、菌株の生育できる温度で培養する。宿主がデポリメラーゼを分泌する場合は、宿主よりも大きな同ポリマー溶解ゾーンを形成するコロニーが当該デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンであり、宿主が大腸菌のようにデポリメラーゼを生産しない場合は、同ポリマー溶解ゾーンを形成するコロニーが当該デポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンである。
本発明に係るデポリメラーゼ遺伝子の好適な例として、配列番号１または配列番号２で示されるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１由来のデポリメラーゼ遺伝子を挙げることができる。但し、配列番号１および配列番号２で示されるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、本遺伝子から翻訳されたポリペプチドが３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する活性を有する限り、当該デポリメラーゼ遺伝子に含まれるものとする。ここでストリンジェントな条件とは、例えば塩濃度は２ｘＳＳＣ、温度が６８℃、の条件をいう（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））。
（デポリメラーゼの製造方法）
１．３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物からデポリメラーゼの製造
本菌株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類および有機栄養源を任意に用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、油脂などが利用できる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、精米時に大量に得られる米糠や砂糖の生産時に副生する糖蜜等も培地として用いることもできる。
１．３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する微生物からデポリメラーゼの製造
本菌株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類および有機栄養源を任意に用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、油脂などが利用できる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、精米時に大量に得られる米糠や砂糖の生産時に副生する糖蜜等も培地として用いることもできる。
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよい。培養時間は菌体を効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。このような培養で得られた培養液はデポリメラーゼ溶液または菌体製剤として利用することができる。また、菌体培養液を遠心分離などによって培養液と菌体とにそれぞれ分離して利用することもできる。前者はデポリメラーゼ溶液、後者は菌体製剤として利用できる。また、培養液より種々の方法によって精製されたデポリメラーゼを利用することもできる。
２．デポリメラーゼ遺伝子を用いたデポリメラーゼの製造
クローニングされたデポリメラーゼ遺伝子を宿主で発現させることにより、当該でポリメラーゼを製造することができる。前記デポリメラーゼ遺伝子クローニングで得られた形質転換株は、当該デポリメラーゼを発現している。本形質転換株を、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する菌体製剤として利用することができる。また培養液はデポリメラーゼ溶液として利用することができる。
クローニングされたデポリメラーゼ遺伝子を宿主で発現させることにより、当該でポリメラーゼを製造することができる。前記デポリメラーゼ遺伝子クローニングで得られた形質転換株は、当該デポリメラーゼを発現している。本形質転換株を、３ＨＢ、３ＨＨの少なくとも１種類から構成されるＰＨＡやＰＨＢＨを分解する菌体製剤として利用することができる。また培養液はデポリメラーゼ溶液として利用することができる。
また、当該遺伝子のより効率的な発現を行なうため、種々の宿主・ベクター系を利用することができる。宿主・ベクター系として細菌、酵母、動物細胞等の系を利用することができるが、効率よく当該遺伝子を発現、製造できれば特に制限されない。クローニングされたデポリメラーゼ遺伝子が当該遺伝の発現に必要なプロモーター、ターミネーターを有し、かつ宿主内で発現できる場合はそのまま利用することができる。また、デポリメラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡに種々のプロモーターおよびターミネーターを接続した発現カセットを作製し、本発現カセットをベクターに組込むことにより当該発現ベクターを構築することができる。
一例として大腸菌を利用する場合、効率よく遺伝子発現を行なうために種々の発現ベクターが構築されている。ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、前２種類の融合プロモーターおよびλファージのプロモーター等の下流に当該遺伝子を接続し、当該遺伝子の下流にターミネーターを接続したデポリメラーゼ発現カセットを構築することができる。ターミネーターにはｒｒｎターミネーターなどが利用されうるが、特に制限されるものではない。これらの発現カセット作製において、当該宿主で機能する分泌シグナルとして機能するＤＮＡ配列を接続することで、デポリメラーゼを菌体外に分泌させることができる。一例として、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１のデポリメラーゼ（配列番号３）は、同配列の１番目のメチオニンから３８番目のアラニンまでが分泌配列として機能することが予測されており、本配列をコードするＤＮＡは種々のデポリメラーゼの分泌に利用することができる。配列番号４は、配列番号３から前記の分泌配列を除去したアミノ酸配列である。
このようにして作製された発現カセットを宿主内で複製、維持されるベクターに導入することによりデポリメラーゼ発現ベクターを構築することができる。作製された発現ベクターを宿主に形質転換し、デポリメラーゼ形質転換株を作製することができる。本形質転換株は、発現カセットに分泌シグナルＤＮＡを含む場合にはデポリメラーゼを菌体外に分泌することができ、同配列を有しない場合には当該デポリメラーゼを菌体内に蓄積することができる。
本形質転換株の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類および有機栄養源を任意に用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、糖蜜、油脂などが利用できる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
培養温度は、その形質転換株が生育可能な温度であればよい。培養時間はデポリメラーゼを効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。このようにしてデポリメラーゼを効率よく製造することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によりその技術範囲を限定されるものではない。
（実施例１）生分解性プラスチック分解菌の単離
３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルＰＨＢＨ（粉末、フィルム）は株式会社カネカより提供された。
３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルＰＨＢＨ（粉末、フィルム）は株式会社カネカより提供された。
寒冷稲作地帯である新潟県新津市において１次、２次発酵した堆肥から得られた抽出液からＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）８ｇ、蒸留水１，０００ｍｌ、寒天（固体培地の場合）１．５％）上でコロニーを形成した微生物をＮＢ培地に０．３％ＰＨＢＨを混合した寒天培地上で５５℃の条件下で培養し、溶解ゾーンを形成する微生物を探索した。その結果、Ｎ５５−１株が得られた。Ｎ５５−１株は炭素源としてＰＨＢを加えた寒天培地においてもポリマー溶解ゾーンを形成した。
（実施例２）分解菌の同定
１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた微生物の同定法により、Ｎ５５−１株の同定を行った。
１６ＳｒＤＮＡ配列を用いた微生物の同定法により、Ｎ５５−１株の同定を行った。
前記株から染色体ＤＮＡを抽出し（実施例３）、ユニバーサルプライマー配列番号５、配列番号６を用いてＰＣＲ法により菌株の１６ＳｒＤＮＡを増幅した。増幅ＤＮＡをＴ−ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニング後、同１６ＳｒＤＮＡの約１４００塩基の配列を決定した。その塩基配列はＤＤＢＪにＮ５５−１（登録番号ＡＢ３７９６６１）として登録されている。
その１６ＳｒＤＮＡ塩基配列をもとに、ＮＣＢＩのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ（ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）,ＲＤＰＩＩのＳｅｑｕｅｎｃｅ ｍａｔｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｓｅｑｍａｔｃｈ／ｓｅｑｍａｔｃｈ＿ｉｎｔｒｏ．ｊｓｐ）のプログラムを利用して配列の比較を行った。その結果、Ｎ５５−１株は両プログラムを利用した解析結果からＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ株（ＣＰ００００８８）と９９．８％の配列同一性を示したことから、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１株と命名した。
（実施例３）染色体ＤＮＡの調製
５０ｍｌの前記ＮＢ培地で一晩培養したＮ５５−１株を集菌し、７．５ｍｌのｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ エチレンジアミン四酢酸 （ｐＨ８．０））に懸濁した。５０ｍｌ容遠心管中で、菌体懸濁液にリゾチームが最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加え、よく溶解し、時々撹拌しながら３７℃で１５分間インキュベートした。粘度が増加し始めたら直ちに−８０℃のフリーザーで凍結した。粘度の増加が３０分たっても見られない場合は、リゾチームをさらに添加した。次に凍結した菌体を６０℃の湯浴にいれたあと、Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ９．０），１％ドデシル硫酸ナトリウム）を７．５ｍｌ加え、滅菌済みのガラス棒で凍結菌体とＳＤＳ溶液の界面を混合させながら溶菌させていった。粘度の増加を確認しながら、試料がほぼ６０℃に達したら１０分間インキュベートし、その後氷冷した。１５ｍｌのフェノール・クロロホルム溶液を加えた後、氷令しながら１５分間強く、振とうした。７５００ｒｐｍ、２０分、４℃の条件で遠心した後、上層の水層を新しい５０ｍｌ容の遠心管に移し、再度フェノール・クロロホルム抽出を行った。−２０℃で冷却しておいたエタノールを３０ｍｌ加え、ガラス棒でかき混ぜながら、沈殿してくるＤＮＡをガラス棒に巻き取った。得られたＤＮＡを１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、適当量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して、染色体ＤＮＡ溶液とした。
５０ｍｌの前記ＮＢ培地で一晩培養したＮ５５−１株を集菌し、７．５ｍｌのｓａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ エチレンジアミン四酢酸 （ｐＨ８．０））に懸濁した。５０ｍｌ容遠心管中で、菌体懸濁液にリゾチームが最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるように加え、よく溶解し、時々撹拌しながら３７℃で１５分間インキュベートした。粘度が増加し始めたら直ちに−８０℃のフリーザーで凍結した。粘度の増加が３０分たっても見られない場合は、リゾチームをさらに添加した。次に凍結した菌体を６０℃の湯浴にいれたあと、Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ９．０），１％ドデシル硫酸ナトリウム）を７．５ｍｌ加え、滅菌済みのガラス棒で凍結菌体とＳＤＳ溶液の界面を混合させながら溶菌させていった。粘度の増加を確認しながら、試料がほぼ６０℃に達したら１０分間インキュベートし、その後氷冷した。１５ｍｌのフェノール・クロロホルム溶液を加えた後、氷令しながら１５分間強く、振とうした。７５００ｒｐｍ、２０分、４℃の条件で遠心した後、上層の水層を新しい５０ｍｌ容の遠心管に移し、再度フェノール・クロロホルム抽出を行った。−２０℃で冷却しておいたエタノールを３０ｍｌ加え、ガラス棒でかき混ぜながら、沈殿してくるＤＮＡをガラス棒に巻き取った。得られたＤＮＡを１０ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、適当量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解して、染色体ＤＮＡ溶液とした。
（実施例４）デポリメラーゼ遺伝子の検索
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１に近縁な微生物であるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸのゲノムＤＮＡ配列（登録番号ＣＰ００００８８）の中から、発明者らが以前クローニングしたＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｎ１８−２５−９のＰＨＢデポリメラーゼ遺伝子配列（登録番号ＡＢ２５８３８８）にコードされるアミノ酸配列と配列同一性の高い領域をコードする遺伝子配列情報をＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ（ｂｌａｓｔｐ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のプログラムを利用して取り出した。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１に近縁な微生物であるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸのゲノムＤＮＡ配列（登録番号ＣＰ００００８８）の中から、発明者らが以前クローニングしたＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ Ｎ１８−２５−９のＰＨＢデポリメラーゼ遺伝子配列（登録番号ＡＢ２５８３８８）にコードされるアミノ酸配列と配列同一性の高い領域をコードする遺伝子配列情報をＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ（ｂｌａｓｔｐ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のプログラムを利用して取り出した。
（実施例５）デポリメラーゼ遺伝子の部分断片増幅
実施例４で検索された配列の遺伝子情報からデポリメラーゼ遺伝子情報部分のＤＮＡ配列に相補的なプライマー（配列番号７と配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド２種類）を作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりデポリメラーゼ遺伝子の部分断片約６００塩基を増幅した。
実施例４で検索された配列の遺伝子情報からデポリメラーゼ遺伝子情報部分のＤＮＡ配列に相補的なプライマー（配列番号７と配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド２種類）を作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりデポリメラーゼ遺伝子の部分断片約６００塩基を増幅した。
（実施例６）サザン解析によるデポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の同定
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで処理した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＤＮＡ断片を分離した。ニトロセルロースメンブレンにＤＮＡ断片を転写後、実施例５で取得されたデポリメラーゼ遺伝子の部分断片を化学蛍光ラベルし、１２時間ハイブリダイズさせた。ニトロセルロースメンブレンを２ｘＳＳＣで洗浄後、ルミノ・イメージアナライザーで解析した結果、約３ｋｂｐの位置にバンドを確認することができた。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで処理した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、ＤＮＡ断片を分離した。ニトロセルロースメンブレンにＤＮＡ断片を転写後、実施例５で取得されたデポリメラーゼ遺伝子の部分断片を化学蛍光ラベルし、１２時間ハイブリダイズさせた。ニトロセルロースメンブレンを２ｘＳＳＣで洗浄後、ルミノ・イメージアナライザーで解析した結果、約３ｋｂｐの位置にバンドを確認することができた。
（実施例７）サブゲノムライブラリーの作製
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで処理した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動をしてＤＮＡ断片を分画し、約３ｋｂｐに相当する部分を切り出し、ＤＮＡ抽出キットＱＩＡＱＵＩＣＫ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを精製した。その後、抽出・精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで処理したｐＵＣ１９と連結した。それを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、一部を寒天培地にプレーティングしてライブラリーの大きさ、挿入効率を調べた。残りはアンピシリン入りのＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドを抽出すると共に菌体を１５％グリセロール溶液として−８０℃で保存した。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１の染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ，ＰｓｔＩで処理した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動をしてＤＮＡ断片を分画し、約３ｋｂｐに相当する部分を切り出し、ＤＮＡ抽出キットＱＩＡＱＵＩＣＫ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＮＡを精製した。その後、抽出・精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩで処理したｐＵＣ１９と連結した。それを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、一部を寒天培地にプレーティングしてライブラリーの大きさ、挿入効率を調べた。残りはアンピシリン入りのＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドを抽出すると共に菌体を１５％グリセロール溶液として−８０℃で保存した。
（実施例８）デポリメラーゼ遺伝子のクローニング
前記サブゲノムライブラリーの構築により、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１より約１，０００クローンより成るサブゲノムライブラリーを作製した。本ライブラリーをＬＢ培地にプレーティングし、一晩培養後、コロニーの一部をニトロセルロースメンブレンに転写した。ニトロセルロースメンブレンに転写されたコロニーをアルカリで処理した後、実施例５で取得されたデポリメラーゼ遺伝子の部分断片を化学蛍光ラベルし、１２時間ハイブリダイズさせた。ニトロセルロースメンブレンを２ｘＳＳＣで洗浄後、ルミノ・イメージアナライザーで解析した結果からデポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンを取得した。本クローンからプラスミドを回収し、デポリメラーゼ遺伝子全領域の塩基配列を決定した。デポリメラーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を２種類のプライマー（配列番号９と配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）を作製し、ＰＣＲ法により増幅した全ＯＲＦ部分を、大腸菌組換え蛋白質発現ベクターｐＱＥ−８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。この形質転換体を培養し、菌体抽出液を調製後、ＰＨＢＨを含有するＮＢ培地またはＰＨＢＨを含有するＬＢ培地に添加したところポリマー溶解ゾーンを形成した。以上の結果から、本ＯＲＦ部分をデポリメラーゼ遺伝子と決定し、この遺伝子をＰｈａＺTfと命名した。
前記サブゲノムライブラリーの構築により、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１より約１，０００クローンより成るサブゲノムライブラリーを作製した。本ライブラリーをＬＢ培地にプレーティングし、一晩培養後、コロニーの一部をニトロセルロースメンブレンに転写した。ニトロセルロースメンブレンに転写されたコロニーをアルカリで処理した後、実施例５で取得されたデポリメラーゼ遺伝子の部分断片を化学蛍光ラベルし、１２時間ハイブリダイズさせた。ニトロセルロースメンブレンを２ｘＳＳＣで洗浄後、ルミノ・イメージアナライザーで解析した結果からデポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンを取得した。本クローンからプラスミドを回収し、デポリメラーゼ遺伝子全領域の塩基配列を決定した。デポリメラーゼ遺伝子のＯＲＦ部分を２種類のプライマー（配列番号９と配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド）を作製し、ＰＣＲ法により増幅した全ＯＲＦ部分を、大腸菌組換え蛋白質発現ベクターｐＱＥ−８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。この形質転換体を培養し、菌体抽出液を調製後、ＰＨＢＨを含有するＮＢ培地またはＰＨＢＨを含有するＬＢ培地に添加したところポリマー溶解ゾーンを形成した。以上の結果から、本ＯＲＦ部分をデポリメラーゼ遺伝子と決定し、この遺伝子をＰｈａＺTfと命名した。
（実施例９）デポリメラーゼ遺伝子の解析
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１のデポリメラーゼ遺伝子のＯＲＦ部分は、１２４２塩基（ＧＣ含量は６９．０％）、４１４アミノ酸からなり、予想分子量は４３．９ＫＤａであった。ＡＴＧ開始コドンの１０塩基上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（ＧＧＡＧＧ）が存在していた。また、予想プロモーター配列−３５（ ＡＴＧＴＴＡ），−１０（ＴＡＧＧＧＴ）が見られた（図１、配列番号１１）。現在まで知られているデポリメラーゼのＮ末端にはシグナルペプチドが付加されているケースが多い。そこでＳｉｇｎａｌＰ ３．０ ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を利用してＰｈａＺTfにおけるシグナルペプチドの存在の有無を解析した。ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮ（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）を利用した解析を行ない、切断部位を予想するＣ ｓｃｏｒｅ、Ｙ ｓｃｏｒｅ、 シグナルペプチドを予想するＳ ｓｃｏｒｅを統合した結果、配列番号３で示したポリペプチドの３８番目のアラニンと３９番目のアラニンの間（ＥＡ−ＡＴ）で切断されることが予想された。また、ＳｉｇｎａｌＰ−ＨＭＮ（ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ）を用いた解析結果によっても、同様の結果が得られた。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１のデポリメラーゼ遺伝子のＯＲＦ部分は、１２４２塩基（ＧＣ含量は６９．０％）、４１４アミノ酸からなり、予想分子量は４３．９ＫＤａであった。ＡＴＧ開始コドンの１０塩基上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（ＧＧＡＧＧ）が存在していた。また、予想プロモーター配列−３５（ ＡＴＧＴＴＡ），−１０（ＴＡＧＧＧＴ）が見られた（図１、配列番号１１）。現在まで知られているデポリメラーゼのＮ末端にはシグナルペプチドが付加されているケースが多い。そこでＳｉｇｎａｌＰ ３．０ ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）を利用してＰｈａＺTfにおけるシグナルペプチドの存在の有無を解析した。ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮ（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）を利用した解析を行ない、切断部位を予想するＣ ｓｃｏｒｅ、Ｙ ｓｃｏｒｅ、 シグナルペプチドを予想するＳ ｓｃｏｒｅを統合した結果、配列番号３で示したポリペプチドの３８番目のアラニンと３９番目のアラニンの間（ＥＡ−ＡＴ）で切断されることが予想された。また、ＳｉｇｎａｌＰ−ＨＭＮ（ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌｓ）を用いた解析結果によっても、同様の結果が得られた。
（実施例１０）組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼの生産及び精製
配列番号２で示したｐｕｔａｔｉｖｅ ｍａｔｕｒｅ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをプライマー（配列番号１０と配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド２種類）を作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ法により増幅し、大腸菌組換え蛋白質高発現ベクターｐＱＥ−８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。このベクターに連結することにより６ｘＨｉｓ配列とデポリメラーゼが融合した組換えデポリメラーゼを生産することができる。組換え蛋白質としてデポリメラーゼを高発現させた大腸菌を遠心により回収後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕機にかけ、大腸菌を破砕後、遠心をすることにより組換えデポリメラーゼを上清に回収した。上清液と６ｘＨｉｓ配列と特異的に結合するニッケルアガロースを混合して、ニッケルアガロースに組換えデポリメラーゼを結合させた後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。組換えデポリメラーゼが結合したニッケルアガロースにＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０％グリセロール）を加えて、組換えデポリメラーゼを溶出させた。精製度を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討した結果、単一なバンドが確認できたことから、高純度の組換えデポリメラーゼを精製することができた（図２）。
配列番号２で示したｐｕｔａｔｉｖｅ ｍａｔｕｒｅ ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅをプライマー（配列番号１０と配列番号１２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド２種類）を作製し、調製されたゲノムＤＮＡをもとにＰＣＲ法により増幅し、大腸菌組換え蛋白質高発現ベクターｐＱＥ−８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。このベクターに連結することにより６ｘＨｉｓ配列とデポリメラーゼが融合した組換えデポリメラーゼを生産することができる。組換え蛋白質としてデポリメラーゼを高発現させた大腸菌を遠心により回収後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕機にかけ、大腸菌を破砕後、遠心をすることにより組換えデポリメラーゼを上清に回収した。上清液と６ｘＨｉｓ配列と特異的に結合するニッケルアガロースを混合して、ニッケルアガロースに組換えデポリメラーゼを結合させた後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。組換えデポリメラーゼが結合したニッケルアガロースにＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、１０％グリセロール）を加えて、組換えデポリメラーゼを溶出させた。精製度を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討した結果、単一なバンドが確認できたことから、高純度の組換えデポリメラーゼを精製することができた（図２）。
（実施例１１）組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼの特性解析
実施例１０で精製した組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼの酵素活性を乳化したＰＨＢＨ又はＰＨＢを用いてアッセイを行った。アッセイの反応溶液は、緩衝液として１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ又は１００ｍＭ ＰＩＰＥＳを適応ｐＨ範囲で用い、乳化ＰＨＢＨ或いは乳化ＰＨＢ溶液を混合し、目的の温度に恒温した後に組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼを加え、６５０ｎｍの吸光度の減少を測定した。また、１分間で６５０ｎｍの吸光度を１．０減少させることができる酵素量を１ユニットと定義して活性を求めた。緩衝液のｐＨ、反応温度の条件を変え、組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼアッセイを行い、ＰＨＢＨまたはＰＨＢ分解の至適条件を調べたところ、ＰＨＢＨ分解における至適温度は７０℃、至適ｐＨは９．０で（図３）、ＰＨＢ分解における至適温度は６５℃、至適ｐＨは８．５であった（図４）。これによりＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼが耐熱性酵素であることが明らかとなった。次にＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼに対する金属イオンの影響を調べた結果、１価の金属イオンが存在するときに高活性を示した（図５、図６）。これは、現在まで知られているＰＨＢ分解酵素のほとんどが１価の金属イオンではなく、２価の金属イオン存在下において高活性を示したことと異なる。また２００ｍＭ ＫＣｌ存在下で測定されたＰＨＢＨ分解活性は４，０００Ｕ（図５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ存在下で測定されたＰＨＢ分解活性は３，３８８Ｕを示した（図６）。
実施例１０で精製した組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼの酵素活性を乳化したＰＨＢＨ又はＰＨＢを用いてアッセイを行った。アッセイの反応溶液は、緩衝液として１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ又は１００ｍＭ ＰＩＰＥＳを適応ｐＨ範囲で用い、乳化ＰＨＢＨ或いは乳化ＰＨＢ溶液を混合し、目的の温度に恒温した後に組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼを加え、６５０ｎｍの吸光度の減少を測定した。また、１分間で６５０ｎｍの吸光度を１．０減少させることができる酵素量を１ユニットと定義して活性を求めた。緩衝液のｐＨ、反応温度の条件を変え、組換えＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼアッセイを行い、ＰＨＢＨまたはＰＨＢ分解の至適条件を調べたところ、ＰＨＢＨ分解における至適温度は７０℃、至適ｐＨは９．０で（図３）、ＰＨＢ分解における至適温度は６５℃、至適ｐＨは８．５であった（図４）。これによりＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼが耐熱性酵素であることが明らかとなった。次にＴｈｅｒｍｏｂｉｄｉｄａ ｆｕｓｃａ Ｎ５５−１デポリメラーゼに対する金属イオンの影響を調べた結果、１価の金属イオンが存在するときに高活性を示した（図５、図６）。これは、現在まで知られているＰＨＢ分解酵素のほとんどが１価の金属イオンではなく、２価の金属イオン存在下において高活性を示したことと異なる。また２００ｍＭ ＫＣｌ存在下で測定されたＰＨＢＨ分解活性は４，０００Ｕ（図５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ存在下で測定されたＰＨＢ分解活性は３，３８８Ｕを示した（図６）。
Claims (7)
- ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解する方法であって、
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの存在下、５５〜８０℃の範囲でポリヒドロキシアルカン酸を処理することからなる分解方法。
（ａ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物
（ｂ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｅ）次の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）ポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有する。（２）至適温度が６５〜７５℃のあいだにある。（３）前記酵素活性が１価の金属イオン存在下で向上する。
（ｆ）前記ポリペプチド（ｂ）〜（ｅ）を産生する形質転換体 - ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸及び３−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも１種類から構成される、請求項１記載の分解方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合ポリエステルである、請求項１記載の分解方法。
- Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属の微生物を含有する、ポリヒドロキシアルカン酸分解用微生物製剤。
- コンポストに投入して用いられる、請求項４記載の微生物製剤。
- 以下の（ｂ）〜（ｅ）のいずれかのポリペプチドを含有する、ポリヒドロキシアルカン酸分解用酵素製剤。
（ｂ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｄ）配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有するポリペプチド
（ｅ）次の理化学的性質を有するポリペプチド：（１）ポリヒドロキシアルカン酸を分解する酵素活性を有する。（２）至適温度が６５〜７５℃のあいだにある。（３）前記酵素活性が１価の金属イオン存在下で向上する。 - コンポストに投入して用いられる、請求項６記載の酵素製剤。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013132288A (ja) * | 2011-12-27 | 2013-07-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 細菌、有機物分解用複合菌、有機性廃棄物処理方法、有機肥料、有機肥料製造方法、及び菌床 |
| WO2015122190A1 (ja) * | 2014-02-14 | 2015-08-20 | 株式会社カネカ | ポリヒドロキシアルカン酸の分解方法、並びに微生物製剤 |
Citations (1)
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| JP2006238801A (ja) * | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Kaneka Corp | 新規ポリヒドロキシアルカン酸分解微生物及び分解酵素の製造方法 |
-
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