JP3984616B2 - 新規ポリエステル系プラスチック分解酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

発明の属する技術分野
本発明は、新規ポリエステル系プラスチック分解酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素もしくは該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法またはモノマーの回収方法に関する。

従来の技術
近年地球環境保護の観点から、持続可能な循環型社会システムの構築が最重要課題とされている。このような社会情勢の中、プラスチック廃棄物の再資源化技術の開発にも大きな力が注がれている。プラスチック廃棄物の再資源化技術は、物理的方法（サーマルリサイクル、マテリアルリサイクル）と化学的方法（ケミカルリサイクル）の２つに大別される。

ケミカルリサイクルは近年急速に普及しつつある生分解性プラスチックの処理方法としても有効である。しかし、生分解性プラスチックは今後全プラスチック生産量の半分近くを占めるともいわれているが、生分解性プラスチックのケミカルリサイクルを考えた場合、酸やアルカリなどの一般的な化学分解ではモノマーも混合物で得られてしまい、これを精製するには多くのプロセスを必要とし、コストの面できわめて不利である。

この問題点を解決するため、プラスチックのケミカルリサイクルに酵素を用いた新プロセスが提案されている。酵素を用いることによるメリットとしては、反応が常温常圧で行えるため、エネルギーコストがかからず、環境汚染の原因となる有機溶媒も必要としない点も重要ではあるが、酵素の持つ基質特異性が最も優れた点であると考えている。

酵素を用いたリサイクルを確立するためには、高い基質特異性を持った、強力なプラスチック分解酵素の存在が大前提となる。特にプラスチック廃棄物は実際にはチップやブロックのような固体で排出されるため、特に固体を分解する酵素が重要である。

生分解性プラスチックは市販のリパーゼ等によっても分解されるが、その分解性は極めて低く、常識外の大量の酵素が必要となる。一方、これまで報告されている生分解性プラスチック分解菌のほとんどは、エマルジョンは分解可能であるが、フィルムやペレット状の固体を直接分解できない（非特許文献１）。
Kim, D. Y., and Rhee, Y. H.: Biodegradation of microbial and synthetic polyesters by fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol., 61,300-308 (2003).

これまでに知られているポリエステル系の固体プラスチック分解酵素としては、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を分解する酵素、ＰＨＡデポリメラーゼが挙げられる。ＰＨＡは微生物の生産する天然ポリエステルであり、これを分解してエネルギー生産を行う代謝系が存在するのは当然である。しかし、その反面本酵素はＰＨＡ以外の他のポリエステル系プラスチックに対する反応性はほとんど無い。

非天然型のプラスチック分解菌由来のものとしては、エステル系ポリウレタンの分解酵素が知られている。本酵素はComamonas acidovorans由来で、エステル系固体ポリウレタンのエステル結合を切断し、水溶性モノマーを生成する（非特許文献２、特許文献１）。
Akutsu, Y., Nakajima-Kambe, T., Nomura, N., and Nakahara, T.: Purification and properties of a polyester polyurethane-degrading enzyme from Comamonas acidovorans TB-35. Appl. Environ. Microbiol., 64, 62-67 (1998) 特開平09-224664 ポリウレタンエステラーゼの精製方法及びエステル系ポリウレタンの分解方法 (出願人：スズキ自動車、発明者：中島敏明他)

ポリ乳酸では放線菌Amycolatopsis sp. K104-1株由来の分解酵素が報告されているが、フィルムの分解には４８時間以上かかる上、ＰＢＳＡの分解は検討されていない(非特許文献３)。また、Peanibacillus amylolyticus TB-13株由来のポリ乳酸分解酵素(非特許文献４、特許文献２)はポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート(ＰＢＳＡ)を分解可能であるが、その分解もあまり高くなく、エマルジョンの分解にとどまっている。
Nakamura K, Tomita T, Abe N, and Kamio Y.: Purification and characterization of an extracellular poly(L-lactic acid) depolymerase from a soil isolate, Amycolatopsis sp. strain K104-1.Appl. Environ. Microbiol.. 67, 345-353 (2001) Akutsu-Shigeno, Y., Teeraphatpornchai, T., Teamtisong, T., Nomura, N., Uchiyama, H., Nakahara, T., and Nakajima-Kambe, T.:Cloning and sequencing of a poly(DL-lactic acid) depolymerase gene from Peanibacillus amylolyticus strain TB-13 and its functional expression in Escherichia coliAppl. Environ.Microbiol., ６９, 2498-2504 (2003) 特開2004-166540 新規なプラスチック分解酵素および該酵素をコードする遺伝子(出願人：科学技術振興機構、発明者：中島敏明他)

一方、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート（ＰＢＳＡ）については、分解菌は数多く報告されており、カビについては一部酵素が精製されているが、細菌では酵素の精製例はない。ＰＢＳＡ分解酵素、および遺伝子のクローニングに関しては、Acidovolax delafieldii BS-3株で報告されているが(特許文献３、非特許文献５)、その分解性は弱く、エマルジョンのみでフィルムの分解はできない。
特開平11-225755 生分解性ポリマー分解酵素及びその製造方法（出願人：三菱化学、発明者：中島敏明他） Uchida, H., Y. Shigeno-Akutsu, N. Nomura, T. Nakahara, and Nakajima-Kambe, T.: Cloning and Sequence Analysis of Poly(tetramethylene succinate) Depolymerase from Acidovorax delafieldii Strain BS-3. J. Biosci. Bioeng., 93, 245-247 (2002)

以上のように、フィルム状またはペレット状のプラスチックを分解できる微生物に関する報告は限られており、さらにその酵素についてはあまり知られていない。酵素を用いたリサイクルを確立するためには、固体状プラスチックを迅速に分解できる酵素の提供が強く望まれている。
発明が解決しようとする課題
本発明は、固体状プラスチックを分解することができる新規ポリエステル系プラスチック分解酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素もしくは該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法またはモノマーの回収方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段
本発明はプラスチック、特に固体状で分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する、平成１７年１月２０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領されたレプトスリックス（Leptothrix）属菌ＴＢ−７１株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２０４）が生産する、プラスチック分解能を有する酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを組み込んだ宿主にプラスチック分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。尚、レプトスリックス属に属する微生物がプラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。一方、プラスチック分解活性を有するレプトスリックス属菌について、同一出願人による「発明の名称：新規ポリエステル系プラスチック分解菌」の同日特許出願に記載されている。

更に本発明は、該酵素もしくは該酵素を発現する宿主を用いるプラスチックの分解方法またはモノマーの回収方法である。
本発明の酵素は、プラスチック、特に固体状で分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する。より具体的には、本発明の酵素は、例えばレプトスリックス属菌に由来する、新規なプラスチック分解酵素である。

発明の実施の形態
酵素
本発明の酵素は２８３のアミノ酸から構成され、分子量２９８１２．５８のポリペプチドであり、配列番号２のアミノ酸番号１−２８３で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、配列番号３に記載されている塩基配列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。

尚、配列番号３のオープンリーディングフレームはシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号２のＮ末端２４番目のアミノ酸と２５番目のアミノ酸の間である。

本発明のアミノ酸配列には、配列番号２に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の微生物に由来する対応するアミノ酸相同配列も本発明に包含される。また、配列番号３のヌクレオチド配列がコードするいかなるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。

配列番号２に示すポリペプチドのアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドも、同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのペプチドも、本発明の酵素に含まれる。また、その様なポリペプチドと配列番号２に示すアミノ酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリペプチドも、固体状プラスチック分解反応を触媒するという特徴を有する限り、本発明の範囲に含まれる。

本酵素が分解できる固体状プラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものである。制限的でない例としては、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、およびポリカプロラクトンが挙げられる。尚、本酵素は固体状プラスチックを分解できるが、プラスチックが液状やゲル状などであっても分解することができる。ここで、「固体状」とは、フィルムおよびペレット状などの固体形状のことをいう。

ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートとは、ポリブチレンサクシネート合成において原料にアジピン酸を加えることにより調製される高分子をいう。融点は90℃ぐらいにまで下がるが、柔軟性が向上する。包装材や苗のポット、ゴミ袋などに利用されている。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの数平均分子量は、特に制限はない。

ポリエチレンサクシネートとは、ポリブチレンサクシネートのブタンジオールをエチレングリコールに代えたものをいう。機械物性はポリエチレンやポリプロピレンと同等、融点は１００℃と低めであるが、酸素を通しにくいため食品フィルムへの応用が期待されている。本発明の分解方法において適用し得るポリエチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はない。

ポリカプロラクトンとは、ε-カプロラクトンの開環重合により合成され、かなり低い温度でも軟らかい熱可塑性ポリエステルである。本発明の分解方法において適用し得るポリカプロラクトンの数平均分子量は、特に制限はない。

遺伝子
次に本発明の酵素をコードする遺伝子は、配列番号３のオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば配列表の配列番号３に示す、塩基番号１−８４９で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。

本発明のポリヌクレオチドは、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。かくして、本発明のプラスチック分解酵素をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は縮重により変化することができる。

本発明には、配列番号３に示したヌクレオチド配列、配列番号３に示したヌクレオチド配列の相補配列に高度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．５Ｍ ＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ausubel,F.M. et al.編,1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.I,Green Publishing Associates社,およびJohn Wily & Sons社,ニューヨーク，p.2.10.3）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号３に示したヌクレオチド配列の相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ausubel,et al.,1989,前掲）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。

遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行うことにより、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異ポリヌクレオチドを含むものである。即ち、配列表の配列番号３に示すポリヌクレオチドの一部が挿入、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、配列番号３に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換されたポリヌクレオチドである。また、その様なポリヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリヌクレオチドも、固体状プラスチックを分解する能力を有するという特徴を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。

酵素の生産方法
本発明の酵素は、レプトスリックス属に属し、固体状プラスチック分解能を有する微生物を培養し、該微生物中の酵素を分離・精製することにより、あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主を培養し、該宿主から酵素を分離・精製することにより、生産することができる。

レプトスリックス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物は、公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。具体的には、代表例として、平成１７年１月２０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領されたレプトスリックス属菌ＴＢ−７１株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２０４）が挙げられる。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌を生理食塩水で適宜希釈し、乳化したＰＢＳＡを重層したＮＢ平板培地に塗布し、３０℃にて培養を行い、コロニー周辺にクリアゾーンを形成する菌を取得することにより行うことができる。必要であれば二次スクリーニングとして、ＮＢ液体培地入り試験管にＰＢＳＡペレットを添加し、上記スクリーニングで得られた候補菌株を植菌し、培養前と培養後のＰＢＳＡの重量差の生じたサンプルから得られた菌株を候補菌株とする。

レプトスリックス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、レプトスリックス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、ＮＢ培地が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。

本発明の酵素を、遺伝子組換え細胞により生産する方法は以下の通りである。まず、ポリヌクレオチド分子を宿主細胞に導入して組換え体を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれたポリヌクレオチド分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え細胞を形成させる。トランスフェクトするための適当な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物または動物細胞を含む。本発明で使用される好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、例えば大腸菌、レプトスリックス属菌、枯草菌、酵母等を含めた、本発明の酵素の発現に適した何れの微生物細胞も含む。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、本発明の酵素を含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。

レプトスリックス属に属し固体状プラスチック分解能を有する微生物、あるいは本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞からの本発明の酵素の分離・精製は、通常細胞からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、遺伝子組換えによる酵素の生産では、組み換え型酵素のC末端にHis−tagを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、組み換え型酵素はC末端にHis−tagを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。

プラスチック分解方法およびモノマーの回収方法
更に、本発明は、本酵素により、もしくは該酵素を発現する微生物を利用したプラスチック、特に固体状であり分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する方法およびモノマーの回収方法を提供する。つまり、本発明のプラスチックを分解する方法は、酵素のプラスチックを分解する作用を利用するもの、該酵素を発現する微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは該酵素を発現する微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。

プラスチック由来のモノマーの回収は、上記分解プロセスの後に分解により生じたモノマーを回収することにより実施することができる。
あるいは、本発明の酵素を発現する微生物菌体を常法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、該酵素を発現する微生物菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。

本発明の酵素を、該酵素を含有する錠剤等として利用に供することもできる。酵素の粗酵素液、粗酵素粉末、または精製酵素の他に、通常酵素錠剤等に用いられる他の成分、例えば安定化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、増量剤、結合剤等を適宜配合してもよい。また、剤型も特に限定されず、用途に応じて散財、顆粒剤、錠剤等の剤型を選択すればよい。

本発明の方法に用いる酵素は、レプトスリックス属菌ＴＢ−７１株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０２０４）から調製される酵素に限定されるわけではなく、組換えＤＮＡ技術によって創製された微生物、例えば発現ベクターに接続された該酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主、例えば大腸菌、レプトスリックス属菌、枯草菌、酵母等により生産された酵素を使用することも可能である。

組換えＤＮＡ技術による微生物の創製は、当該分野において通常用いられている方法により行うことができる。例えば、プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系の構築は、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるpET systemを用いて構築することができる。

本発明の方法で使用する酵素は、必ずしも十分に精製する必要はないが、酵素の精製が望まれるときは、通常蛋白質の精製に用いられる方法、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。一例を示せば、組み換え型酵素のC末端にHis−tagを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出する。組み換え型酵素はC末端にHis−tagを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。

本発明のプラスチックを分解する方法により分解できるプラスチックは、前記した通り、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものである。制限的でない例としては、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、およびポリカプロラクトンが挙げられる。

分解に共されるプラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するプラスチックの投入量は、0.01〜10重量％が望ましい。添加する酵素あるいは微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してプラスチックに対して湿重量として、酵素の場合は0.001重量％以上、微生物の場合は0.1重量％以上が好ましい。また、分解に供するプラスチックは、1種類であっても複数種類であっても良い。

精製酵素あるいは粗精製酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。

本発明の酵素を発現する組換え微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様における培養は、用いる宿主に適した培養条件で行うことができ、それらの条件は当業者に周知である。プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、用いる微生物に適した培地であれば特に制限はないが、炭素源としては、グルコース等、及び該微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無機塩を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。

組換え微生物の有する酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。

本発明において、酵素を発現する増殖中の組換え微生物をプラスチックの分解に利用する場合は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばプラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。

プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。

培地中のプラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。

本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１ ＰＢＳＡ分解酵素の精製
予備検討の結果、本菌株のＰＢＳＡ分解酵素は培養液中に遊離するのではなく菌体表面に付着していることが明らかになったので、酵素精製にあたっては菌体表面のタンパク質を界面活性剤で抽出することとした。

実施例１−１ 菌体からの粗酵素液の抽出
ＴＢ−７１株をＮＢプレートにて３０℃、２日間培養した。３００ｍ容の三角フラスコに５０ｍｌのＮＢ培地を加え、ＴＢ−７１株を１白金耳植菌した。ここに２５ｍｍ径、厚さ０．５ｍｍのＰＢＳＡディスク３００ｍｇを添加し、３０℃、２００ｒｐｍで一日振盪培養を行い前培養とした。その後ＮＢ培地５００ｍｌ（３リットル容三角フラスコ） に５０ｍｌの前培養液を植菌し、ＰＢＳＡディスク３ｇを添加し３０℃、２００ｒｐｍで２日間振盪培養した。

本培養終了後、培養液を８，０００ｒｐｍで５分間遠心し、菌体を得た。０．１Ｍリン酸緩衝液で菌体を洗い再度遠心した後、０．１Ｍリン酸緩衝液１０ｍｌで菌体を懸濁した。そこに等量の０．４％ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ（非イオン性界面活性剤）溶液を加え、氷上で３０分間激しく撹拌して菌体表面に付着したタンパク質を抽出した。その後懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を得た。等量の０．１Ｍリン酸緩衝液を上清に加えた後、４０％飽和となるよう硫安を加え氷上で３０分間撹拌した。遠心して沈殿を除いた後、６０％飽和となるよう硫安を加え同じく撹拌した後、遠心して得られた沈殿を０．１Ｍリン酸緩衝液２ｍｌに溶解し、粗酵素液とした。フローチャートを図１に示す。

実施例１−２ 酵素精製
Ｐｈａｒｍａｃｉａ製ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍを用いて粗酵素液の精製を行った。粗酵素液を脱塩カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製 ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）にて脱塩した後、陰イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製ＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑ：カラム体積１ｍｌ）に供し、素通り画分を回収した。なお、移動相には２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、流速２ｍｌ／ｍｉｎにて行った。ここに８０％飽和となるよう硫安を加え、氷上で３０分間撹拌し、２２，０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。得られた沈殿を２ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、ゲル濾過カラム（Pｈａｒｍａｃｉａ社製Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ ＨＲ１６／５０）に供した。移動相として２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎにて行った。エステラーゼ活性を有する画分を回収し、８０％飽和濃度となるよう硫安を加え、遠心して得られた沈殿を１ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解し、精製酵素標品を得た。

実施例１−３ 酵素活性の測定
ＰＢＳＡ分解活性測定はＰＢＳＡエマルジョン寒天プレートに１０ｍｍ径のペーパーディスクを置き、各溶液を５０μｌ滴下してエマルジョンの分解を観察した。また、これとは別に、エステラーゼ活性の測定には基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートをもちいて、エステル結合の切断によって生じるｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度の増加量で測定する方法を用いた。1分間に1マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを生じさせるのに必要な酵素量を１ｕｎｉｔとした。

精製ステップ表を以下に示した。精製によって本酵素の比活性は約４倍となり、収率は５６．２％であった。精製標品はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で単一バンドを示した。分子量マーカーを用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルろ過にて分子量の検定を行った結果、本酵素は分子量約２万８千の単量体であると考えられた。

実施例２ PBSA分解酵素の諸性質
実施例２−１ 至適反応条件の検討
至適ｐＨ条件の検討には、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０−６．０）、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０−８．０）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０−１０．０）を用いた。反応は３０℃にて行い、各種ｐＨ下でのエステラーゼ活性を測定した。ただし、ｐ−ニトロフェノールの原子吸光係数がｐＨによって変化するため、測定波長として４０５ｎｍに代えて、変動の最も少ない３４８ｎｍを用いた。至適温度の検討はｐＨ７で行った。温度安定性の検討はｐＨ７で行い、各温度にて３０分酵素をインキュベートした後に、３０℃にて活性を測定した。

各ｐＨにおける活性の変化を図２に示した。本酵素の至適ｐＨは５．５から９．０付近までの広い範囲において、高い活性を保っていた。また、本酵素の至適反応温度の検討結果を図３に示した。本酵素は２５℃から５５℃までの広い範囲で高い活性を有していた。

さらに、本酵素の安定温度に関する検討を行った結果を図４に示した。本酵素は４５℃、３０分間の加熱に対して安定であったが、これ以上の温度では失活が見られた。なお本酵素は４０℃以下であれば、最低でも数日間は活性の低下はほとんど認められなかった。

実施例２−２ 各種ポリエステル系生分解性プラスチックに対する分解活性
ＰＢＳＡとＰＢＳにはそれぞれビオノーレ３０２０， １０２０を用いた。また、ＰＥＳはルナーレＳＥ、ＰＬＡはラクティをそれぞれ用いた。ポリヒドロキシブチレート−ｃｏ−バレエート（ＰＨＢＶ）およびポリカプロラクトン（ＰＣＬ）は和光純薬製の特級品を用いた。各プラスチック０．２ｇをジクロロメタン５ｍｌに溶解し、ペトリ皿に展開し、フィルムを作成した。各フィルム０．３ｍｇを１．７Ｕｎｉｔ／ｍｌの酵素液１ｍｌに加え３０℃にて１時間インキュベートした後、溶液中の全炭素量（ＴＯＣ）を測定した。

本酵素による各種ポリエステル系生分解性プラスチック分解活性を下表に示した。ＰＢＳＡ， ＰＥＣ， ＰＣＬに対して分解が認められ、このうちＰＣＬに対する分解活性が最も高かった。いずれの場合にも、分解は１０分以内にはほとんど終了しており、高い分解活性が確認された。一方、ＰＢＳ， ＰＨＢＶ， ＰＬＡに対しての分解活性は認められなかった。この基質特異性はＴＢ−７１株の培養菌体を用いた場合と一致した。

また、本酵素によるＰＢＳＡ分解産物についての検討を行った。分解終了後の緩衝液をＨＰＬＣに供し、分解産物を分析した。カラムにはＢＩＯ−ＲＡＤ社製ＨＰＸ−８７Ｈを用い、移動相には０．０１Ｎ硫酸を０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で用いた。検出器には示唆屈折率計（島村計器製ＹＲＤ−８８０）を使用した。

分析の結果、コハク酸と１，４−ブタンジオールが検出され、その濃度はＰＢＳＡがすべて分解、モノマー化した場合の理論値と一致した。このことから、本酵素はＰＢＳＡをモノマーにまで完全分解することが明らかになった。

実施例２−３ Ｎ末端アミノ酸配列の決定
精製したＴＢ−７１株由来ＰＢＳＡ分解酵素をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、東レリサーチセンターにＮ末端アミノ酸配列の解析を依頼した。

本酵素のＮ末端より１０残基までのアミノ酸配列を以下のように決定した。

実施例３ ショットガンクローニング法による分解酵素遺伝子のクローニング
（ＤＮＡの抽出）
酵素精製の場合と同様の方法で大量培養したＴＢ−７１株より、総ＤＮＡを図５に示すフローチャートに従って抽出した。
（ショットガンクローニング）
得られたＴＢ−７１株染色体全ＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩにより限定分解し、アガロースゲル電気泳動にて約２〜５ｋｂのＤＮＡ断片画分を切り出し、ＢＩＯ１０１社製のＧＥＮＥＣＬＥＡＮゲル抽出キットを用いてＤＮＡを抽出した。得られた断片とＢａｍＨＩで切断し脱リン酸化処理したｐＵＣ１１８とを１４℃、一晩ライゲーションし、エレクトロポレーションにて大腸菌ＤＨ１０Ｂ株を形質転換した。これをエマルジョン化したＰＢＳＡを重層したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布して３７℃にて一晩培養した。培地中のＰＢＳＡエマルジョンが分解されると、コロニーの周辺が透明になるため、それを指標として分解遺伝子を有するクローンを選択した。

約３５，０００株の形質転換体よりエマルジョンのＰＢＳＡが分解されコロニーの周囲にクリアゾーンができている株を１株取得したこの形質転換体からプラスミドを抽出し、ｐＢＳＬ１と名付けた。ｐＢＳＬ１にはＴＢ−７１株由来の２．４ｋｂの遺伝子断片が挿入されていた。各種制限酵素を用いて解析を行った結果、図６のような制限酵素地図が作成された。

次に、ｐＢＳＬ１をＳａｃＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩでそれぞれ切断してサブクローニングし、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。これを、上記と同様にＰＢＳＡを重層した検定培地に塗布し、ＰＢＳＡ分解活性を有する最小領域を決定した。サブクローニングした各断片のＰＢＳ分解活性は図７のような結果となり、ＰＢＳＡ分解酵素遺伝子のＯＲＦ領域が推定された。

実施例４ ｐＢＳＬ１中のＴＢ−７１株由来ＰＢＳＡ分解酵素遺伝子の全塩基配列決定
上図のｐＢＳＬ−Ｓｐｈから、常法によってＤＮＡシークエンサーによる塩基配列を行った。

相同性検索の結果、推定ＯＲＦ領域に１つのＯＲＦが確認された。これをｐｂｓ ＬＡとした。本遺伝子は８４９塩基からなり、２８３のアミノ酸からなる分子量２９８１２．５８のタンパク質をコードしていた。また、ＯＲＦのＮ末端の２４アミノ酸はシグナルペプチドに特有の配列がみとめられ、シグナル切断位置から下流の１０アミノ酸の配列は上記のＴＢ−７１株由来のＰＢＳＡ分解酵素の精製標品由来の配列と完全に一致した。成熟型のタンパク質の分子量は２７１９０．６１であり、これはＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動から求めた精製酵素標品の推定分子量とほぼ一致した。このことから本ＯＲＦがＴＢ−７１株のＰＢＳＡ分解酵素をコードしている遺伝子であると考えられた。また等電点は ８．４２であった。アミノ酸配列およびＤＮＡ配列をぞれぞれ図８および図９に示した。

得られたアミノ酸配列を元に国立遺伝学研究所のＤＤＢＪ遺伝子データベースに対して ＢＬＡＳＴにて相同性検索を行った。その結果、本酵素（遺伝子）は既知のいかなる遺伝子ともアミノ酸レベルで相同性を示さない、新規な酵素遺伝子であることがわかった。

実施例５ 大腸菌発現ベクターへのＰＢＳＡ分解酵素遺伝子の組込みと酵素の大量発現
グナル配列部分を含むPBSA分解酵素遺伝子（ｐｂｓＬＡ）配列の前後１５０ｂｐほどの箇所を相補するプライマーを設計した。その際フォワードの末端部分にはＮｄｅＩ、リバ
ースの末端部分にはＸｈｏＩサイトを付加した。これを用いてＰＣＲによりｐｂｓＬＡを
増幅し、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩで切断した大腸菌発現ベクター、ｐＥＴ ２１ａ（＋） に
連結した。なお、連結した本遺伝子の下流にはその後の精製を簡便にするために、６×Ｈｉｓ−Ｔａｇが付加されている。これを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、３０℃にて一晩培養した。得られた形質転換体を大量培養し、酵素精製に用いた。

本実験に使用した大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ ２１ａ （＋） ）はＩＰＴＧを添加することによって発現量が増大する。しかし本酵素の場合はＩＰＴＧを添加することによって逆に酵素活性が低下した。これはＩＰＴＧの添加により発現量が増大したタンパクが封入体を形成し、失活したものと考えられた。また、本酵素活性は菌体外、ペリプラズムいずれにもほとんど分泌されず、菌体内に蓄積していた。

次に、菌体を大量調製して超音波で破砕後遺伝子産物（組み換え型ＰＢＳＡ分解酵素）の精製を試みた。菌体破砕液を遠心して細胞片を除いた後、硫安を３０％飽和となるように添加した。これを遠心して上清を回収し、ここにさらに硫安を５０％飽和となるように加えて遠心、沈殿を２０ｍＭ リン酸バッファーに溶かした後に、ファルマシア社製Ｈｉ Ｔｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（Ｎｉ）を用いて精製した。

精製した組み換え型酵素を用いてＰＢＳＡフィルムの分解実験を行った。試験方法は前述の方法と同様に行った。その結果本酵素はＰＢＳＡフィルムを１０分以内に完全分解し、その活性はＴＢ−７１株から精製したＰＢＳＡ分解酵素とほぼ等しかった。

発明の効果
本酵素は広ｐＨ範囲において高い活性を維持する上、４０℃以下では数日間に渡って失活はほとんど無いことから、モノマーリサイクルの酵素としての利用に向いている。また、基質特異性が厳密であり、反応するプラスチックと反応しないプラスチックがはっきりしている点もプラスチック混合物からの選択的モノマー化に適している。さらに、本酵素をコードする遺伝子はこれまで知られているいかなる遺伝子も優位な相同性を持たない全く新規な遺伝子であり、その構造と機能の解明を行うことにより、有機合成等の更なる応用分野への利用が期待される。

図１は、粗酵素液調製フローチャートを示す。 図２は、ＴＢ−７１株由来ＰＢＳＡ分解酵素の至適ｐＨを調べた結果を示す。 図３は、ＴＢ−７１株由来ＰＢＳＡ分解酵素の至適温度を調べた結果を示す。 図４は、ＴＢ−７１株由来ＰＢＳＡ分解酵素の温度安定性（３０分間）を調べた結果を示す。 図５は、ＴＢ−７１株染色体全ＤＮＡの抽出方法を示す。 図６は、pBSL1の制限酵素地図を示す。 図７は、サブクローニング断片のＰＢＳ分解活性と推定ORF領域を示す。 図８は、ＰＢＳＡ分解酵素遺伝子産物（ＰｂｓＬＡ）の全アミノ酸配列を示す。 図は、ＰＢＳＡ分解酵素遺伝子（ｐｂｓＬＡ）の全塩基配列を示す。

Claims (8)

1. （ａ）酵素が配列番号２に示すアミノ酸配列、または
   （ｂ）前記アミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有する配列を含む、
   固体状ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、またはポリカプロラクトンの分解活性を有する酵素。
2. 配列番号２に示すアミノ酸配列のＮ末端の２４アミノ酸残基が欠失した配列、または該配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有する配列を含む、固体状ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、またはポリカプロラクトンの分解活性を有する酵素。
3. （ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド：
   （ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のＮ末端の２４アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｄ）固体状ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、またはポリカプロラクトンの分解活性を有する酵素をコードし（ｃ）の塩基配列と相同性が９０％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
   （ｅ）ストリンジェントな条件下で（ｃ）または（ｄ）の塩基配列にハイブリダイズし、かつ固体状ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、またはポリカプロラクトンの分解活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド。
4. 請求項１または２に記載の酵素を生産する方法であって、
   レプトスリックス属の微生物を培養する工程：
   前記微生物からプラスチック分解酵素を分離・精製する工程：
   を含む、前記酵素の生産方法。
5. 請求項１または２に記載の酵素を固体状ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、またはポリカプロラクトンから選択されるプラスチックと接触させる工程を含む、前記プラスチックの分解方法。
6. 請求項１または２に記載の酵素を発現する遺伝子組換え宿主を固体状ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、ポリエチレンサクシネート、またはポリカプロラクトンから選択されるプラスチックと接触させる工程を含む、前記プラスチックの分解方法。
7. 前記宿主が大腸菌である、請求項６記載のプラスチックの分解方法。
8. 遺伝子組換え酵素の生産方法であって、
   （ｉ）請求項１または２に記載の酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを含有する宿主を、該宿主の生育に適した条件下で培養する工程；
   （ｊ）該酵素を該宿主から分離・精製する工程；
   を含む、遺伝子組換え酵素の生産方法。

Images