JPH09191887A

JPH09191887A - 生分解性ポリマーのデポリメラーゼ及びその製造方法

Info

Publication number: JPH09191887A
Application number: JP8301671A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Kato; 暢夫加藤; Keiko Kita; 恵子喜多; Ko Ishimaru; 香石丸
Original assignee: KDK Corp; Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 1997-07-29

Abstract

(57)【要約】【課題】生分解性ポリマーの分解酵素を提供する。【解決手段】配列番号３に記載のアミノ酸配列若しく
は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１以上のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を有し、生
分解性ポリマーの加水分解を触媒する酵素活性を有する
デポリメラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ組換え技術
による生分解性ポリマーの加水分解を触媒する酵素であ
るデポリメラーゼに関し、より詳しくは、アルカリジェ
ネス属(Alcaligenes)由来のデポリメラーゼの酵素及び
該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベ
クター、該発現ベクターにより形質転換された微生物、
該形質転換体を培養することによる組換えデポリメラー
ゼの製造、そのようにして得られる組換えデポリメラー
ゼ、該組換えデポリメラーゼを用いる生分解性プラスチ
ックの効率的な分解方法に関する。本発明の酵素は、特
に、生分解性ポリマーとして３−ヒドロキシ酪酸（以下
３ＨＢと略記する）を単位とするポリヒドロキシアルカ
ノエート（以下、ＰＨＡと略記する）の加水分解に適す
る。

【０００２】

【従来技術】近年、ポリヒドロキシアルカノエート（Ｐ
ＨＡ）をはじめ生分解性（生物分解性）プラスチック製
品は、投棄後、土中や海中に存在する微生物により自然
に分解され得る素材として、注目を集めており、コスト
ダウンのために、様々な改良が試みられている。例え
ば、微生物による分解を促進するために生分解性プラス
チック素材に微生物培地成分を配合する方法（特開昭４
−１６８１５０)、生分解性プラスチック素材にリパー
ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ乳酸脱水素酵素などの加水
分解酵素を添加する方法（特開平４−１６８１４９号公
報)、生分解性プラスチック素材形成品を製造する際に
配合する無機及び／又は有機フィーラーの配合量と平均
体積を特定範囲に調節し、成形品使用中の生分解及び崩
壊を制御する方法（特開平４−１４６９５３号公報）等
が提案されている。

【０００３】しかしながら、生分解能を持つ微生物や、
その酵素に関する開発は遅れており、実用化の例もな
い。ＰＨＢ及び代表的なＰＨＡ（ポリ３ヒドロキシブチ
レート／ポリ４ヒドロキシブチレート及び３ヒドロキシ
ブチレート／３ヒドロキシバリレート）は以下の構造式
で示される。

【化１】式中、Ｘ、Ｙは１以上の任意の整数を表す。本出願人
は、様々な微生物産生酵素をスクリーニングし、アルカ
リジェネス(Alcalige nes)属の菌がＰＨＡに特異的に反
応する酵素であるデポリメラーゼを産生することを見出
し、それを精製して諸性質を明らかにした（Applied An
d Environmental Microbiology, May 1995, P. 1727-17
30）。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】しかしながら、微生物を培養
し、培養物からデポリメラーゼを抽出、精製して製造す
る方法は、多くの労力と時間を必要とし、非効率的であ
る。また、該培養物には、デポリメラーゼ以外にアルカ
リジェネス属の菌株固有のタンパク質等夾雑物が混入し
ており、デポリメラーゼ活性に悪影響を及ぼす物質が混
在する可能性も否定できず、デポリメラーゼを用いた測
定は、信頼性が十分に確保できない恐れがある。従っ
て、アルカリジェネス属の菌に由来する不純物を伴わな
いデポリメラーゼを効率よく製造する方法の開発が求め
られていた。そのためには、アルカリジェネス属由来の
デポリメラーゼをコードするＤＮＡをクローニングし、
該ＤＮＡを含有する適当な発現ベクターを構築し、該発
現ベクターで宿主細胞を形質転換させ、効率よくデポリ
メラーゼを得ることが必要である。また、該デポリメラ
ーゼは、その生化学的諸性質より、新規のデポリメラー
ゼであると考えられたので、クローニングする必要があ
った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、アルカリジェネス・フェカリスＡＥ
１２２株(Alcalige nes faecalis AE122)由来のデポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡのクローニングを行った。つ
づいて、該ＤＮＡを含有する発現ベクターを構築し、該
発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転
換体を培養することにより、生分解性ポリマーに対する
デポリメラーゼ活性を有する組換えデポリメラーゼを製
造することに成功した。本発明のデポリメラーゼをコー
ドするＤＮＡ及び推定のアミノ酸配列を配列表の配列番
号３、及び図９、１０に示す。本発明によりデポリメラ
ーゼをコードするＤＮＡがクローニングされたので、そ
れに基づき、通常の遺伝子組換え技術を用いて、アミノ
酸の付加、欠失、挿入、置換等により、デポリメラーゼ
活性を保持している誘導体を得ることは当業者にとって
容易である。故に、そのような常套手段で得られるデポ
リメラーゼの活性な誘導体も本発明の範囲に包含される
ものである。

【０００６】従って、本発明は、配列番号３に記載のア
ミノ酸配列若しくは該配列に１以上のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加された配列を有し、生分解性ポリマー
の加水分解を触媒する酵素活性を有するデポリメラーゼ
を提供するものである。本発明のデポリメラーゼの特性
を以下に例示する。（１）生分解性ポリマーの加水分解反応を触媒する酵素
活性を有し；（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル濾過により、分子量約
９５kＤaのモノマー酵素とされ、；（３）そのＮ末端に配列表の配列番号１で示されるアミ
ノ酸配列を、また、内部領域に配列番号２で示されるア
ミノ酸配列を有する。

【０００７】本発明のデポリメラーゼは、塩水の存在
下、生分解性ポリマーの加水分解を触媒する活性を有す
る。そのような生分解性ポリマーとしては、ＰＨＢを成
分とするＰＨＡが好ましい。なお、本発明のデポリメラ
ーゼは、種々のＰＨＡにも反応性を示すことから、本発
明のデポリメラーゼを、特にＰＨＡデポリメラーゼとも
称する場合もある。本発明はまた、上記デポリメラーゼ
をコードするＤＮＡを提供するものである。該ＤＮＡ
は、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。本発明
のＤＮＡは、１つの実施態様として、番号３記載の塩基
配列又はその部分配列で示すことができる。本発明はま
た、配列番号３に記載の塩基配列において１以上の塩基
が欠失、置換若しくは付加された配列を有し、生分解性
ポリマーの加水分解を触媒する酵素活性を有するデポリ
メラーゼをコードするＤＮＡをも包含する。さらに、本
発明は該ＤＮＡを含有する発現ベクターを提供するもの
である。本発明はまた、該発現ベクターによって形質転
換された宿主細胞を提供するものである。さらに、本発
明は、このようにして得られた形質転換体を培地に培養
し、培養物からデポリメラーゼを回収することを特徴と
するデポリメラーゼの製造法を提供するものである。さ
らに、本発明は、生分解性ポリマーであるＰＨＡを加水
分解するために、デポリメラーゼとＰＨＡとを、塩水の
存在下で接触させることを特徴とする該試料中の生分解
性ポリマーの分解方法を提供するものである。

【０００８】本明細書中、培養物の「処理物」とは培養物
から得られる物質であって、より高い加水分解活性を有
する様に、当該技術分野で通常の方法により処理された
物質を指す。（１）生細胞：ろ過又は遠心分離等の通常の方法で培養
物から分離された細胞。（２）乾燥細胞：(１)の生細胞を凍結乾燥又は真空乾燥
したもの。（３）細胞抽出物：(１)又は(２)の細胞を通常の方法
（例えば有機溶媒中での自己溶菌、アルミナや海砂と混
合しての摩砕、又は超音波処理）して得られる。（４）酵素溶液：細胞抽出物を常法通り精製するか部分
精製することにより得られる。（５）精製酵素：（４）に記載の酵素溶液をさらに精製
し、不純物を含まないもの。（６）酵素活性を有するフラグメント；精製酵素等を適
当な方法で断片化処理することにより得られるペプチド
フラグメント。（７）固定化細胞又は酵素：細胞又は酵素を通常の方法
で固定化（例えばポリアクリルアミド、ガラスビーズ、
イオン交換樹脂等に固定化)したもの。尚、ＰＨＡと反応させるデポリメラーゼは完全に精製さ
れていなくとも良く、上記の（１）〜（７）のいずれか
であっても良い。培地に分泌される場合は、培養物その
もの及びそれから精製される酵素（溶液、凍結乾燥品、
断片化したフラグメント等）及び固定化酵素が培養物又
は処理物の例として挙げられる。また、「酵素活性を有
するフラグメント」は、（６）に記載のごとく、デポリ
メラーゼ活性を有し、本発明の目的に有用なペプチドフ
ラグメントを指す。そのようなフラグメントは、例え
ば、上記（５）の精製酵素を、適当な方法で断片化処理
することにより得ることができ、培養物の処理物の１つ
である。なお、本明細書で、単にデポリメラーゼという
ときにも、上記の培養物の処理物の１つを表す場合があ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のデポリメラーゼをコード
するＤＮＡのクローニングは、当該技術分野で既知の方
法に従って行うことができる。まず、Ａ．faecalis AE1
22の培養物からデポリメラーゼを精製し、それよりＮ末
端アミノ酸配列を決定した。次いで精製デポリメラーゼ
を限定分解することにより得られたペプチド断片より、
部分アミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列に基づいて
オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。決定された
Ｎ−末端アミノ酸配列を配列表の配列番号１及び図１
に、内部領域のアミノ酸配列を配列番号２及び図１に示
す。また、オリゴヌクレオチドプライマー１及び２のヌ
クレオチド配列を配列番号４及び５に示す。これら配列
番号１及び２のペプチド断片と、プライマー１及び２と
の関係は図１に示す通りである。ゲノムＤＮＡを鋳型と
し、これらのプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ
チェーン反応）を行ったところ、約１.５ｋｂのＰＣＲ
断片が得られた。次に、該断片をプローブにサザンハイ
ブリダイゼーションを行って、全配列を含む約６.２ｋ
ｂｐのＫｐｎＩ断片を得た。さらに、この断片をｐＵＣ
１９にサブクローニングして、コロニーハイブリダイゼ
ーションを行った。その結果、１０個の陽性コロニーが
得られた。これらのコロニーからプラスミドを抽出し、
塩基配列を決定したところ、そのうちの１株はＰＨＡデ
ポリメラーゼのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）に相
当する塩基配列を持つプラスミドｐＰＤ１８１を保有す
るクローンであることが分かった［大腸菌形質転換体
（Ｅ．coli ＪＭ１０９／ｐＰＤ１８１)]。

【００１０】プラスミドｐＰＤ１８１を導入した大腸
菌、E.col i ＪＭ１０９／ｐＰＤ１８１は、通産省工業
技術院生命工学技術研究所に寄託されている（受託日：
１９９５年１０月１８日；受託番号：ＦＥＲＭＰ−１
５２４４）。次いで、得られたクローンの塩基配列を決
定しアミノ酸配列を推定した。これを配列番号３及び図
９、１０に示す。既述のごとく、本発明の目的には、配
列番号３及び図９、１０に示したアミノ酸配列を完全に
有するデポリメラーゼのみならず、所望の酵素活性を有
するそのフラグメントも同様に有用である。

【００１１】本発明の、大腸菌宿主内で複製可能なデポ
リメラーゼ発現ベクターｐＰＤ１８１は、lacプロモー
ターとＳＤ配列、並びにアンピシリン耐性を付与するＤ
ＮＡ配列を含有しているが、該デポリメラーゼをコード
するＤＮＡを、他の適当な発現ベクターのプロモーター
の下流に挿入することにより、他の宿主内でも発現可能
なデポリメラーゼ発現ベクターを構築することができ
る。よって、上記の発現ベクター及び宿主細胞は、本発
明のデポリメラーゼをコードするＤＮＡの発現に適した
多くのベクター及び宿主細胞の１例にすぎず、当業者な
らば、当該技術分野での常法に従い、任意の宿主細胞内
で機能的なデポリメラーゼ発現ベクターを構築すること
ができる。プロモーターは既知のものから適宜選択する
か、あるいは新たに調製したものでもよい。このよう
に、本発明の発現ベクターは本明細書記載の例示のプラ
スミドに限定されず、通常の技術を用いて修飾(例え
ば、プロモーターを交換する)することによって、異な
る種類の微生物、また他の細胞内で機能的であり、及び
／又はデポリメラーゼを高レベルに産生させることがで
きる発現ベクターを構築することができる。

【００１２】本発明のデポリメラーゼをコードするＤＮ
Ａを担持する発現ベクターで形質転換するために用いら
れる宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細
胞のいずれでもよく、さらには一般的に利用されている
高等生物の細胞でもよい。宿主細胞としては、微生物
［原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生
物（例えば酵母）］、動物細胞又は培養植物細胞が挙げ
られる。微生物の好ましい例は、原核生物、特にEscher
ichia属に属する菌株(例えば、Ｅ.coli等）、酵母、特
にＳa ccharomyces属に属する株（例えば、Ｓ.cerevisia
e)やＣandida属に属する株（例えば、Ｃ.boidinii）で
ある。好ましい動物細胞株は例えば、マウスＬ９２９細
胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などであ
る。

【００１３】宿主細胞として細菌、特に大腸菌を使用す
るのに適した、発現ベクターは既知であり、例えば、ｌ
ａｃプロモーターやｔａｃプロモーター等の慣用のプロ
モーターを有するものを挙げることができる。酵母での
デポリメラーゼの発現のための発現ベクターとしては、
ＧＡＬプロモーターやＡＯＤプロモーター等のプロモー
ターを含有するものが好ましい。又、哺乳動物細胞での
デポリメラーゼ発現のための発現ベクターとしては、Ｓ
Ｖ４０プロモーター等のプロモーターを有するものが挙
げられる。しかしながら、操作及び入手の容易さを考慮
して、宿主細胞としては原核性宿主が好ましく、特に大
腸菌が好ましい。原核性宿主−ベクター系については、
多くの成書（例えばＭolecular Ｃloning：A LABOLATOR
Y MANUAL, Ｃold ＳpringＨarbor Ｌaboratory Ｐres
s）があり、当該技術分野で既知であるが、以下に簡単
に説明する。

【００１４】例えば、デポリメラーゼをコードするＤＮ
Ａを大腸菌で発現させるには、大腸菌を用いた形質転換
に適するプラスミドのプロモーターの下流に該ＤＮＡを
挿入する。後述する実施例では、大腸菌での１つの態様
の発現が記載されているが、他の態様での発現は、例え
ば、E.coli ＪＭ１０９／ｐＰＤ１８１に挿入されてい
るデポリメラーゼをコードするＤＮＡを適当な酵素（例
えば制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオ
チドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼな
ど）で処理することによりデポリメラーゼの酵素活性を
コードするＤＮＡ断片を得、これを適当なベクターに組
み込むことにより様々な宿主でデポリメラーゼ活性を有
するペプチドを発現させることができ、これらのデポリ
メラーゼも本発明の範囲に含まれる。

【００１５】発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は
既知であり、Ｍolecular Ｃloning：A LABOLATORY MANU
AL, Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐressに記載
の方法で行うことができる。例えば、原核性宿主の場合
は、コンピテントセル作製法、真核性宿主の場合は、コ
ンピテントセル作製法、哺乳動物細胞の場合はトランス
フェクション法、エレクトロポレーション法により行う
ことができる。次いで、得られた形質転換体を適当な培
地に培養する。培地は、炭素源（例えばグルコース、メ
タノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機ま
た有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸等）を
含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例
えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタ
ミン類（例えばビタミンＢ₁）、抗生物質（例えばアン
ピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等)）を加
えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が
適当である。

【００１６】形質転換体の培養は、通常、pＨ６.０〜
８.０、好ましくはpＨ７.０、２５〜４０℃、好ましく
は３０〜３７℃で８〜４８時間行えばよい。生産された
デポリメラーゼが培養液中に存在しているときは、培養
物を濾過又は遠心分離する。精製は、回収した培養液上
清から、天然又は合成のタンパク質の精製、単離に用い
られる常法（例えば透析、ゲル濾過、対応する抗デポリ
メラーゼモノクロナール抗体を用いてのアフィニティカ
ラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラ
ムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー
等）を用いて行うことができる。生産されたデポリメラ
ーゼが培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中に存
在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、そ
れらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音波及び
／又はリゾチーム処理によって、破壊して、デブリス
（細胞破砕物）を得る。このデブリスを適当な水溶液
（例えば緩衝液）に溶解させ、常法によって、デポリメ
ラーゼを精製することができる。

【００１７】大腸菌中で生産されたデポリメラーゼを再
生（リフォールディング）する必要があるときは、これ
を常法によって行なうことができる。本発明方法で得ら
れる形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養物
はデポリメラーゼ活性を示すが、このものを上記のごと
く当業者既知の通常の方法でさらに処理して酵素溶液等
の処理物を調製することができる。また、所望により精
製してもよい。例えば、培養物を遠心して上清を回収
し、各種クロマトグラフィー等に用いれば精製酵素標品
が得られる。

【００１８】上記の培養物、その処理物（精製酵素標品
及び酵素活性を有するフラグメントを含む）は、デポリ
メラーゼ酵素活性を有し、生分解性ポリマー、特にＰＨ
Ｂを成分とするＰＨＡからなる生分解性プラスチックの
分解に適しており、環境保護に有用である。本発明によ
りデポリメラーゼをコードするＤＮＡがクローニングさ
れたので、それに基づき、通常の遺伝子組換え技術を用
いて、アミノ酸の付加、欠失、挿入、置換等により、デ
ポリメラーゼ活性を保持している誘導体を得ることは当
業者にとって容易である。故に、そのような常套手段で
得られるデポリメラーゼの活性な誘導体も本発明の範囲
に包含されるものである。

【００１９】既述のごとく、本発明の形質転換体を培養
して得られる培養物及びその処理物は、例えば前記の構
造式で示されるＰＨＡの加水分解反応の触媒活性を有す
る。しかしながら、本発明のデポリメラーゼの使用は前
記の構造式で示されるＰＨＡに限定されるものではな
く、既存の又は将来開発される、任意の生分解性ポリマ
ーの加水分解に有用である。

【００２０】本発明方法に従って生分解性ポリマーを分
解するには、本発明のデポリメラーゼで加水分解される
生分解性ポリマーを含有する試料、例えば、プラスチッ
ク成形品と、本発明のデポリメラーゼを発現する形質転
換体の培養物又はその処理物を塩水中で接触させる。培
養物又はその処理物は水又は緩衝液中懸濁液(溶液)とし
て用いる。pＨ、温度及び反応時間等の反応条件は特に
限定されるものでなく、同様の酵素反応に通常用いられ
る条件から適宜選択するとよい。しかしながら、好まし
くはpＨ７.０〜１１.０、より好ましくはpＨ約１０.０
であり、反応温度は３０〜７０℃、好ましくは４５〜６
５℃、より好ましくは約５５℃である。反応系には、少
なくとも２５％、好ましくは７５％の塩水が必要であ
る。塩水の代わりに人工海水（ＮａＣｌ２.３％、Ｎ
ａ₂ＳＯ₄ ０.４％、ＮａＨＣＯ₃０.０２％、ＫＣｌ
０.０７％、ＫＢｒ０.０１％、ＭｇＣｌ₂ ０.５％、
ＣａＣｌ₂ ０.１％、ＳｒＣｌ₂ ０.００２％、Ｈ₃Ｂ
Ｏ₃ ０.００３％）を添加してもよい。

【００２１】本発明の生分解性ポリマーの分解方法に用
いる酵素は、適当な固体支持体に固定化することができ
る。酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法により行
うことができる。例えば、担体結合法、架橋化法、包括
法、複合法等によって行う。担体としては、高分子ゲ
ル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン酸、カラ
ゲーナン、などがある。結合は共有結合、イオン結合、
物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者既知の方
法で行う。このようにして得られた固定化酵素は、プラ
スチック廃棄物の処理に有用である。

【００２２】

【実施例】次下に実施例を挙げて本発明を詳しく説明す
るが、これらは本発明を制限するものではない。以下の
実施例において用いたプラスミド類、様々な制限酵素や
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、その他の酵素類は、市販品から入
手し、供給者の指示に従って使用した。また、ＤＮＡの
クローニング、各プラスミドの構築、宿主の形質転換、
形質転換体の培養及び培養物からの酵素の回収は、当業
者既知の方法、あるいは文献記載の方法に準じて行なっ
た。また、酵素活性は以下の力価の測定法に従って測定
した。

【００２３】力価の測定本発明のデポリメラーゼの力価の測定はＰＨＢ顆粒（Ｐ
ＨＢ-granule）の濁度を測定する方法により行った。常
法に従って、水素細菌のAlca ligenes eutrop hus ATCC17
699の菌体内にＰＨＢ（ポリ３ヒドロキシ酪酸）を大量
に蓄積させ、これを菌体内より抽出してＰＨＢ顆粒とし
た。活性測定基質はこのＰＨＢ顆粒５０mgを５０mM Ｔr
is-ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.５）１００mlに、超音波処理
により懸濁したものを用いた。反応は、２５ｍＭＴris
−ＨＣl緩衝液（pＨ７.５）、８０μｇ／ｍｌＰＨＢ顆
粒、５０％海水、ＰＨＡデポリメラーゼを含有する全量
３mlの系で行った。まず、酵素以外の成分を３ｍｌのセ
ル内で混合し、１分間プレインキュベートした。ＰＨＡ
デポリメラーゼの添加で反応を開始し、６５０ｎｍにお
けるＰＨＢ顆粒の減少を、１２０秒間、経時的に測定し
た。予め作成したＰＨＢ顆粒量と６５０ｎｍにおける濁
度の検量線より減少量を求め、これを酵素活性とした。
なお、ＩＵは３０℃で１分間に１μｇのＰＨＢ顆粒を分
解する酵素量と定義した。

【００２４】実施例１ＰＨＡデポリメラーゼ遺伝子の
クローニング１．アルカリジェネス・フェカリスＡＥ１２２株(Alcal
igenes faecalis AE122)由来のＰＨＡデポリメラーゼの
部分アミノ酸配列の決定１） A．faecalis AE122株の培養及びＰＨＡデポリメラ
ーゼの精製・培養及び粗酵素液の調製コハク酸培地［(コハク酸ナトリウム０.４％，ＮＨ₄Ｃ
ｌ０.１％，ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０.０５％，ＦｅＣ
ｌ₃・６Ｈ₂Ｏ０.０１％，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ５Ｘ１
０^-4％，６６ｍＭＫＰＢ（ｐＨ６.８）７５％，人工
海水２５％］を用いて、３０℃で６０時間前培養を行
った。本培養にはＰＨＢ培地［ＰＨＢ（Aldrichi製）
０.２％，ＮＨ₄Ｃｌ０.１％，ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０.０５％，ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ５Ｘ１０^-4％，６６
ｍＭＫＰＢ（ｐＨ６.８）７５％，人工海水２５
％)］を用い、前培養液を添加して３０℃で４８時間振
とう培養した。その後、遠心分離(４℃，９５００rpm，
４０分)して上清を回収し、粗酵素液とした。また、粗
酵素液が５０mM Ｔris−ＨＣｌ緩衝液(pＨ7.5)になるよ
うに１ＭＴris−ＨＣl緩衝液(pＨ8.7)で調整した。

【００２５】・精製調製した粗酵素液に、体積比で１／２０量の５０mM Ｔr
is−ＨＣl（ｐＨ７.５）緩衝液で十分に平衡化したＤＥ
ＡＥ-cellulose樹脂を加え、１５分間撹拌、１０分間静
置を２回繰り返し、バッチ法による吸着をおこなった。
２０分間静置してデカンテーションで上清を取り除き、
５０mM Ｔris−ＨＣl（ｐＨ７.５）緩衝液で洗浄してか
らカラムにつめた。溶出はＮaＣl（０〜１Ｍ）のリニア
グラジエントで行った。

【００２６】集めた活性画分は、４ＭのＮaＣlを含む５
０mM Ｔris−ＨＣｌ緩衝液(pＨ7.5)で平衝化したPhenyl
-Sepharose CL-4Bに用いた。活性画分にも塩濃度が４Ｍ
になるようにＮaＣlを添加した。同緩衝液で洗浄後、塩
濃度とエチレングリコールの直線濃度勾配により溶出さ
せた。活性画分はエチレングリコールを除去するため、
回収後、５０mM Ｔris−ＨＣｌ緩衝液(pＨ7.5)で一晩透
析した。エチレングリコールは該酵素にとって負の要因
となるため完全に除去する必要がある。最後にＤＥＡＥ
−Toyopearlカラムクロマトグラフィーをおこなった。
予め５０mM Ｔris−ＨＣｌ緩衝液(pＨ7.5)で平衝化した
カラムに、透析した活性画分を負荷した。同緩衝液で洗
浄後、ＮaＣlによる塩濃度勾配により目的タンパクを溶
出させた。これらのステップでＰＨＡデポリメラーゼを
培養液上清から回収率１５％で、２２倍に精製した。

【００２７】得られた酵素標品を用いてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル
電気泳動)及びゲル濾過を行い分子量を決定した。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥは７.５％ゲルを用いてデービスの方法に
従った。２０mAの一定電流で２時間泳動後、染色はクマ
シーブリリアントブルーで行った。分子量既知の数種の
タンパク（ミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリ
ラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン）を同様
に泳動し、分子量マーカーを作成した。また、ゲル濾過
はＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０００ＳＷで、展開用緩衝液と
して０.２ＭＮａＣｌを含む７０ｍＭリン酸緩衝液（Ｋ
ＰＢ）を用いて行った。これらの結果より、該酵素は分
子量約９５ｋＤａのモノマー酵素であることがわかっ
た。

【００２８】２）部分アミノ酸配列の決定上記の方法で精製した酵素標品を用いて、該酵素の部分
アミノ酸配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸の配列決定に
は、微量透析やゲル濾過により精製酵素標品を完全に脱
塩したものをサンプルとし、プロテインシークエンサー
に用いた。また、内部アミノ酸配列を解析する際には、
精製タンパクを還元カルボキシメチル化して変性した
後、ブロモシアン、リジルエンドペプチダーゼを連続的
に作用させて断片化を行った。それぞれのペプチド断片
はＣ１８を用いた逆相カラムクロマトグラフィーにより
分取し、プロテインシークエンサーで解析した。その結
果、Ｎ末端からの２９残基（配列１、並びに図１）と５
つの内部領域（配列番号２、並びに図１、及び配列番号
６、７、８、９）のアミノ酸配列が決定された。

【００２９】２．ＰＣＲによる部分配列の増幅１）オリゴヌクレオチドプライマーの調製上記１．２）で得たアミノ酸配列から推定される塩基配
列を基に、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）に用い
るためのプライマーを設計した（図１)。Ｎ末端領域及
び内部領域の配列に基づいて、それぞれプライマー１及
び２を合成した。なお、プライマー２は、プライマー１
が付着するペプチド鎖に対する相補鎖として、図１の配
列に基づき、そのＣ末端側から合成された。プライマー
１及び２のヌクレオチド配列を配列番号４及び５に示
す。

【００３０】２）ゲノムＤＮＡの調製上記１に記載のコハク酸培地（５００ml×２)でA．fa ec
alis AE122株を３０℃で６０時間培養し、遠心分離（４
℃、１２,０００rpm、２０min）して得られた生菌体を
用いて、Thomas法によりゲノムＤＮＡを抽出した。

【００３１】３）ＰＣＲによる部分配列の増幅・ＰＣＲ上記２）で調製したゲノムＤＮＡをテンプレートに、
１）で設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラー
ゼチェーン反応）を行った。以下の反応混合液を調製
し、ミネラルオイルを重層した。テンプレート（ＡＥ１２２由来ゲノムＤＮＡ）５００ｎｇプライマー１２００ｐｍｏｌプライマー２２００ｐｍｏｌ１０Ｘ増幅用緩衝液（amplification buffer）１０μｌｄＮＴＰ２００μＭＴaq ポリメラーゼ（宝酒造（株）製）５Ｕ滅菌蒸留水適量合計１００μｌＰＣＲは、変性［９４℃で１分（１サイクル目だけ１０
分間)］、アニーリング（５５℃で２分間）、伸長反応
（７２℃で３分間）からなる一連の処理を３５サイクル
繰り返して行った。・確認泳動ＰＣＲ産物の確認はアガロース電気泳動（ゲル濃度１
％）により行った。その結果、プライマー１と２により
約１.５kbの断片が増幅された（図４）。図２はアガロ
ース電気泳動の結果を示す模写図である。図中レーン１
はλＤＮＡ／HincII(マーカー)、レーン２はプライマー
１、２のＰＣＲ産物である。

【００３２】３．ＰＣＲ増幅断片のサブクローニング上記２．で得た約１.５kbのＰＣＲ産物をアガロースゲ
ルから切り出し、Prep-A-Gene DNA Purification Syste
m（BIO Rad）を用いてＤＮＡ断片を回収した。さらに、
Blunting Kit［宝酒造（株）製］を用いて平滑末端化
し、ＨincＩＩ消化したpＵＣ１１８［宝酒造(株)製］に
挿入した。ライゲーション反応は効率を良くするため
に、１０μlの系で行った。以下にライゲーション反応
液の組成を示す。インサートＤＮＡ４μｇベクターＤＮＡ１μｇ１０Ｘ Ligation buffer １μｌ１０ＸＡＴＰ（１ｍＭＡＴＰ）２μｌ１０ＸＤＤＴ（１０ｍＭＤＴＴ）１μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造（株）製）３５０Ｕ滅菌蒸留水適量合計１０μｌ上記の混合物を１６℃で一晩インキュベートして、コン
ピテントセル作製法により、Ｅ．coli JM109に形質転換
した。アンピシリン５０μg/ml、X-gal ５０μg/ml、Ｉ
ＰＴＧ０.１mＭを含むＬＢアガロースプレートでホワ
イトコロニーを選択した。その結果、約１.５kbのＰＣ
Ｒ断片がpＵＣ１１８のＨincIIサイトに挿入されたプラ
スミドpＫＩＤ１２２を得た（図６）。

【００３３】図５はAlkaline mini-preparation of pla
smid DNA(mini-prep)に従って形質転換体より単離した
プラスミドをＰstＩ，ＥcoＲＩで二重消化して、アガロ
ース電気泳動を行ったものである。レーン１はpＵＣ１
１８、レーン２はpＨＹマーカー、レーン３はpＫＩＤ１
２２の二重消化物である。得られたクローンの塩基配列
をジデオキシ法により決定したところ、ＰＨＡデポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡの一部であることが確認でき
た。

【００３４】４．サザンハイブリダイゼーション上記２．２）で得たゲノムＤＮＡを各種制限酵素で切断
し、アガロースゲル電気泳動で分離し、これをナイロン
膜に転写した。次いで、３．でサブクローニングしたＰ
ＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブとして用
い、サザンハイブリダイゼーションを行った。その結
果、ＫｐｎＩ断片に陽性シグナルを得た。この約６.２k
bのＤＮＡ断片をアガロースから切り出し、ＤＮＡ回収
用フィルター付遠心チューブ（孔径０.２２μｍ、宝酒
造（株）製）を用いて、１０.０００rpm、４℃、１０分
の遠心の後、エタノール沈澱を行うことで精製した。

【００３５】５．コロニーハイブリダイゼーション得られたＫpnＩ消化断片を、同じくＫpnＩで消化したp
ＵＣ１９(宝酒造社製：lacプロモーターを有する大腸菌
用発現ベクター)にライゲーション(１６℃、１６時間）
し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌JM10
9株を形質転換した。次いで、３．でサブクローニング
したＰＣＲ断片をジゴキシゲニンで標識してプローブと
して用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。
ライゲーション、形質転換及びコロニーハイブリダイゼ
ーションは、Ｍaniatisらの方法(Molecular Cloning, a
laboratory manual(2nd ed.),pp.1.62-1.104(1989) Sa
mbrook,J.,Fritch,E.and Maniatis,T.(eds)Cold Spring
Harbor Laboratory)に従った。その結果、８００個の
コロニーから１０個の陽性コロニーを得た。得られた陽
性コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列を決定し
た。その結果、ＰＨＡデポリメラーゼのＮ末端アミノ酸
配列（配列番号１）に相当する塩基配列を持つプラスミ
ドpＰＤ１８１を保有するクローンを１株得た（大腸菌
形質転換体(Ｅ．coli JM109/pPD181))。このプラスミド
pＰＤ１８１の制限酵素地図を図７に示す。このクロー
ンの塩基配列を決定し、推定のアミノ酸配列を決定し
た。結果を配列番号３、及び図９及び１０に示す。図９
において、アミノ酸番号１番から上向きの三角の２７番
目まではシグナルペプチドを表す。また、図９、１０に
おける下線は、プロテインシーケンサーにより決定した
Ｎ末端および内部アミノ酸配列を表す。

【００３６】実施例２大腸菌形質転換体(E.colli JM1
09/pPD181)のＰＨＡデポリメラーゼ活性実施例１で形質転換した大腸菌(E．colli JM109/pPD18
1)をＬＢ培地(１％ Bacto-tryptone,０.５％ Bacto-yea
st extract,1%ＮaCl,pＨ7.2)で、温度３７℃で１６時間
培養した。培養後、培養液をＰＨＢ顆粒を含むＭ９寒天
培地（０.６％Ｎa₂ＨＰ０₄，０.３％ＫＨ₂ＰＯ₄，０.０
５％ＮaＣl，０.１％ＮＨ₄Ｃl，１mＭＭgＳＯ₄，０.１m
ＭＣaＣl₂，１mＭチアミン−ＨＣl，０.５％グリセ
ロール，０.１％グルコース，０.２％ＰＨＢ顆粒，１.
５％寒天)に塗布し３７℃で一晩培養した。対照とし
て、同様に培養して得られたプラスミドpＵＣ１９で形
質転換した大腸菌と、コハク酸培地で培養したA．faeca
lis AE122株の培養液を用いた。結果を図８に示す。図
は菌体と、その回りに形成されたハローの状態を示して
いる。ＰＨＡデポリメラーゼを産生する菌の周囲には、
ＰＨＢの分解により透明な領域が形成されるが、図では
黒色を呈している。図中、１は、本発明のプラスミドで
形質転換されていない大腸菌宿主、２は、本発明の形質
転換体、３は、ｐＰＤ１８１中のＰＨＡデポリメラーゼ
遺伝子がｌａｃプロモーターと逆方向に挿入されている
プラスミドで形質転換された大腸菌宿主、４はアルカリ
ジェネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＡＥ１
２２である。図８から明らかなように、pＰＤ１８１は
ＰＨＡデポリメラーゼをコードしているＤＮＡを含有し
ており、該プラスミドで形質転換された大腸菌の形質転
換体は、ＰＨＡデポリメラーゼを産生することがわか
る。このプラスミドpＰＤ１８１を導入した大腸菌E．co
li JM109/pPD181は、通産省工業技術院生命工学技術研
究所に寄託されている（寄託日：1995年10月18日；受託
番号：FERM P-15244)。なお、ｐＰＤ３１０７による形
質転換体もＰＨＡデポリメラーゼ活性を発現しており、
本発明の遺伝子内に大腸菌のＲＮＡポリメラーゼにより
認識されるプロモーター配列の存在が示唆される。

【００３７】実施例３大腸菌形質転換体（Ｅ．coli
ＪＭ１０９／ｐＰＤ１８１）のＰＨＡデポリメラーゼの
精製実施例１で形質転換したＥ．coli ＪＭ１０９（ｐＰＤ
１８１）を３７℃、アンピシリンを含むＬＢ培地で培養
した（５Ｌ）。菌の生育が６００ｎｍの吸収で１.４の
とき、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、
２０時間培養する。その後、１７,０００Ｘｇで１０分
間遠心分離して上清を回収し、精製に用いた。精製方法
は、フェニルセファロースカラムの代わりにブチルセフ
ァロースカラムを用いたことを除いては、実施例１記載
の方法に従った。その結果、培養液上清より収率４５
％、４.７倍に精製でき、５.５ｍｇのＰＨＡデポリメラ
ーゼが得られた。

【００３８】実施例４大腸菌形質転換体（Ｅ．coli
ＪＭ１０９／ｐＰＤ１８１）のＰＨＡデポリメラーゼの
性質実施例３で得られた精製酵素の性質について検討した。
Ｎ末端のアミノ酸解析を行ったところ、Ａ．faecalis
ＡＥ１２２由来のもの（ＧＡＷＱＮＮ）に２残基追加さ
れた配列（ＧＡＧＡＷＱＮＮ）であることが分かった。
しかしながら、比活性はＰＨＢ−granuleを基質として
３７.８kunits／ｍｇ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量
は９５.５ｋＤａでＡ．faecalis ＡＥ１２２由来のもの
と一致した。また阻害剤による影響、塩類要求性、耐熱
性に関しても、Ａ．faecalis ＡＥ１２２由来のものと
同傾向を示した。従って、形質転換体（Ｅ．coli ＪＭ
１０９／ｐＰＤ１８１）より精製されたＰＨＡデポリメ
ラーゼはＡ．faecalis ＡＥ１２２由来のものと同等で
あった。

【００３９】

【配列表】

【００４０】配列番号：１配列の長さ：２９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ
ＡＥ１２２配列 Gly Ala Trp Gln Asn Asn Leu Ser Leu Gly Gly Phe Asn Lys Val His 1 5 10 15 Leu Tyr Thr Pro Asp Gly Asp Ser Pro Val Gly Asn Gly 20 25 29

【００４１】配列番号：２配列の長さ：２２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Alcaligenes faecalis AE122 配列ＶａｌＡｌａＧｌｙＡｒｇＡｌａＴｙｒＳｅｒＴｈｒＧｌｙ
ＡｓｎＴｙｒＴｙｒＡｌａＰｒｏＡｓｐＴｙｒ１５
１０１５ＰｈｅＡｌａＧｌｎＧｌｙＳｅｒＡｓｐＧｌｕ１６２０２２

【００４２】配列番号：３配列の長さ：２２５４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源生物名：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ
ＡＥ１２２配列

【化２】

【化３】

【００４３】配列番号：４配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 5' GGNGCMTGGCARAAYAAYYT 3'

【００４４】配列番号：５配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 5' RAARTARTCIGGIGCRTARTARTT 3'

【００４５】配列番号：６配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Alcaligenes faecalis AE122

【００４６】配列番号：７配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Alcaligenes faecalis AE122

【００４７】配列番号：８配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Alcaligenes faecalis AE122

【００４８】配列番号：９配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド起源生物名：Alcaligenes faecalis AE122 配列ＡｌａＧｌｙＸｘｘＳｅｒＡｓｐＴｒｐＳｅｒＴｙｒＸｘｘ
ＧｌｎＧｌｙＴｈｒＬｙｓ１５
１０１３

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ．faecalis AE122株から精製したＰＨＡデ
ポリメラーゼのＮ−末端領域及び内部領域のアミノ酸配
列、及びそれらとＰＣＲプライマー１及び２との関係を
示す模式図。

【図２】アルカリジェネス・フェカリスＡＥ１２２
株（Alca ligenes faecal is AE122）由来の精製ＰＨＡ
デポリメラーゼの分子量を、TSK-gel G3000SWを用いる
ゲル濾過により測定した結果を示すグラフ。

【図３】図２と同様のＰＨＡデポリメラーゼのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミド電気泳動）における泳動パターンを示す写真の模写
図。

【図４】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示
す写真の模写図。図中、レーン１はλＤＮＡ／HincII
(マーカー)、レーン２はプライマー１、２のＰＣＲ産物
である。

【図５】約１.５ｋｂのＰＣＲ増幅断片が挿入された
プラスミド（ｐＫＩＤ１２２）で形質転換されたＥ．co
li JM109より単離したプラスミドをＰstＩ，ＥcoＲＩで
二重消化してアガロース電気泳動を行った結果を示す写
真の模写図。図中、レーン１はpＵＣ１１８、レーン２
はpＨＹマーカー、レーン３はpＫＩＤ１２２の二重消化
物である。

【図６】プラスミドｐＫＩＤ１２２の制限酵素地図。

【図７】プラスミドpＰＤ１８１の制限酵素地図。

【図８】プラスミドｐＰＤ１８１で形質転換した大腸
菌(E．co lli JM109/pPD181）、プラスミドpＵＣ１９で
形質転換した大腸菌及びA．faecalis AE122株における
ＰＨＡデポリメラーゼ発現の状態を比較した写真の模写
図。

【図９】プラスミドpＰＤ１８１を保有するクローン
の、Ｎ−末端側１／２に相当する塩基配列及び推定のア
ミノ酸配列を示す模式図。

【図１０】プラスミドpＰＤ１８１を保有するクロー
ンの、Ｃ−末端側１／２に相当する塩基配列及び推定の
アミノ酸配列を示す模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号３に記載のアミノ酸配列若しく
は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１以上のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を有し、生
分解性ポリマーの加水分解を触媒する酵素活性を有する
デポリメラーゼ。
【請求項２】該デポリメラーゼが、アルカリジェネス
属の菌由来である請求項１記載のデポリメラーゼ。
【請求項３】配列番号３に記載の塩基配列若しくは配
列番号３に記載の塩基配列において１以上の塩基が欠
失、置換若しくは付加された配列を有し、生分解性ポリ
マーの加水分解を触媒する酵素活性を有するデポリメラ
ーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列番号４又は５に記載する塩基配列か
らなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ生分解性ポリマーの加水分解を触媒する酵
素活性を有するデポリメラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項５】請求項３又は４記載のＤＮＡを含有する
発現ベクター。
【請求項６】請求項５記載の発現ベクターによって形
質転換された宿主細胞。
【請求項７】原核性宿主である請求項６記載の宿主細
胞。
【請求項８】大腸菌である請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】請求項６〜８記載のいずれかに記載の宿
主細胞を培養し、培養液からデポリメラーゼを回収する
ことを特徴とするデポリメラーゼの製造法。
【請求項１０】請求項６〜８のいずれかに記載の宿主
細胞の培養液又はその処理物によって加水分解され得る
生分解性ポリマーを含有する試料と、請求項６〜８のい
ずれかに記載の宿主細胞の培養液又はその処理物とを、
塩類を含む溶液（塩水）中で接触させることを特徴とす
る、該試料中の生分解性ポリマーの分解方法。