KR20220162226A - 탄수화물결합모듈66과 레반을 이용한 재조합 단백질의 가용성 발현 및 정제를 위한 신규 융합 태그 시스템 및 이의 활용 - Google Patents

탄수화물결합모듈66과 레반을 이용한 재조합 단백질의 가용성 발현 및 정제를 위한 신규 융합 태그 시스템 및 이의 활용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66)을 목적 단백질과 융합하여 발현함으로써 목적 단백질의 가용성 발현을 향상시키고 CBM66과 레반의 결합능을 이용하여 목적 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 탄수화물결합모듈66과 융합하여 재조합 단백질을 발현하면 난발현성 단백질의 경우에도 우수한 수준으로 가용성으로 발현할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 레반을 이용하여 효과적으로 정제할 수 있다.

Description

탄수화물결합모듈66과 레반을 이용한 재조합 단백질의 가용성 발현 및 정제를 위한 신규 융합 태그 시스템 및 이의 활용{A novel fusion tag system promising soluble expression and purification in Escherichia coli using CBM66 and levan, and their applications}
본 발명은 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66)을 목적 단백질과 융합하여 발현함으로써 목적 단백질의 가용성 발현을 향상시키고 CBM66과 레반의 결합능을 이용하여 목적 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
대장균(Escherichia coli)은 생명공학분야에서 가장 널리 사용되는 미생물 중 하나이며, 그 중에서도 유전공학 기술을 이용한 재조합 단백질의 생산에 가장 보편적으로 응용되는 균주이다. 하지만 목적하는 재조합 단백질이 과량으로 생산될 경우, 세포 내에서 서로 엉겨서 생물학적 활성을 잃는 형태인 봉입체(inclusion body)로 생산되는 현상이 빈번하게 관찰되기도 한다. 봉입체로 발현된 단백질의 활성을 회복하기 위해서는 많은 시간과 비용이 소요되는 재접힘(refolding)과정이 필수적이기 때문에 재조합 단백질의 대량 생산에는 적합하지 않다.
융합 태그(fusion tag) 기술은 봉입체를 포함한 난발현성 단백질의 가용성 발현을 향상시키는 가장 대표적인 수단이다. 융합 태그에 특이적으로 결합하는 리간드를 이용하여 몇몇 융합 태그는 단백질의 가용성 발현과 정제를 위한 목적으로 사용되고 있으며, 현재까지 수십 종의 펩티드(peptide) 및 단백질 그룹이 난발현성 단백질의 가용성 발현 증가와 정제를 위한 융합 태그로서 개발 및 사용되고 있다. 그 중에서도 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)과 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST)는 대표적인 융합 태그로 널리 이용되고 있다(DYSON et al. BMC biotechnology, 2004, 4.1: 32). 하지만 모든 단백질에 적용가능한 융합 태그는 존재하지 않기 때문에, 새로운 융합 태그를 지속적으로 개발해 재조합 단백질 발현에 적용할 필요가 있다.
한편, 탄수화물결합모듈(Carbohydrate binding modules, CBMs)은 표적 탄수화물에 대해 반응하는 효소(carbohydrate-active enzymes, CAZymes)의 탄수화물 친화성 부위이다. CBM은 목적 탄수화물과의 결합방식에 따라 Type A, B, C로 나뉘게 되는데 Type A는 CBM1, 2, 5, 10 등이 속하고 이들의 방향족 아미노산 잔기가 평평한 구조를 형성하여 셀룰로오스나 키틴의 결정구조에 결합하는 특성을 갖는다. Type B는 CBM6, 13, 20, 36, 60 등이 속하고 구조체 내 갈라진 틈이 존재하여 다당체가 이에 끼어들어가는 방식으로 결합하는 특징을 갖는다. 마지막 Type C는 CBM66외에도 9, 13, 32, 47, 67 family 등이 속하고 표적 다당체 말단의 짧은 당류를 인식하는 주머니 구조를 형성하여 결합한다.
이러한 탄수화물 친화적 특성을 사용하여, CBM은 여러 재조합 단백질의 생산과 정제 및 고정화에 사용되어 왔다. 대표적으로 클로스트리디움 균주(Clostridium sp.) 유래의 CBM3을 결합시켜 인간 열충격 단백질(human heat-shock protein), 항균 펩티드(antimicrobial peptide), 단백질 A(protein A) 등의 다양한 목적 단백질들이 대장균에서 가용성 발현으로 생산되었으며, CBM 결합 탄수화물인 셀룰로오스(cellulose)를 이용하여 정제되었다. 다른 예로, CBM2-셀룰로오스(CBM2-cellulose) 시스템은 대장균부터 효모, 동물세포주까지 다양한 발현숙주(expression host)에 적용가능함이 확인되었다. 추가로, 목적 단백질과 결합된 CBM1, CBM9, CBM21, CBM30은 각각 셀룰로오스를 이용하여 정제가 가능함이 확인되었다(SHPIGEL et al. Protein expression and purification, 1998, 14.2: 185-191).
CBM66은 고쵸균(Bacillus subtilis)의 레반분해효소(exo-levanse)의 카르복시 말단 영역으로, 그 구조와 역할이 등온적정열량측정법(isothermaml titration calorimetry)과 친화성-겔 전기영동법(affinity-gel electrophoresis)을 통해 밝혀졌으며, 특히 CBM66은 과당중합체(fructose polymer) 중 하나인 레반(levan)에 대한 높은 친화성을 갖는 것이 지난 2012년 미과학회보에 보고되었다(CUSKIN et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109.51: 20889-20894).
이에, 본 발명자들은 난발현성 목적 단백질을 가용성으로 발현하고 이를 정제할 수 있는 기술을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, CBM66 태그가 부착된 형태의 재조합 벡터를 제작하고, 상기 벡터에 난발현성 목적 단백질을 조합하여 대장균 내로 형질전환시킨 결과 해당 균주가 CBM66 태그가 부착된 난발현성 목적 단백질(CBM66 융합 단백질)을 가용성 발현함을 확인하였다. 뿐만 아니라, 레반 수지에 융합 단백질을 결합시켜 고수율로 난발현성 목적 단백질을 정제할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66)을 코딩하는 유전자; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 재조합 단백질 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 벡터를 포함하는, 형질전환 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 탄수화물결합모듈66이 결합된 목적 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 목적 단백질 정제방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명은 하나의 양태로서 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66)을 코딩하는 유전자; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 재조합 단백질 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, “탄수화물결합모듈(carbohydrate binding module, CBM)”은 표적 탄수화물에 대해 반응하는 효소(carbohydrate-active enzymes, CAZymes)의 탄수화물 친화성 부위를 의미한다. CBM은 이러한 탄수화물 친화적 특성으로 인해 여러 재조합 단백질의 생산과 정제 및 고정화에 사용되어 왔다.
본 발명에서 용어, “탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module66, CBM66)”은 고쵸균(Bacillus subtilis)의 레반분해효소(exo-levanse)의 카르복시 말단 영역을 의미한다. 상기 CBM66은 과당중합체 중 하나인 레반(levan)에 대한 높은 친화성을 갖는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CBM66은 미생물 유래일 수 있고, 구체적으로 고초균(Bacillus subtilis) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 CBM66은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
또한, 상기 CBM66은 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 발명의 CBM66에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 발명의 CBM66의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CBM66은 단백질의 가용성 발현을 증대시키고 정제를 용이하게하는 태그로써 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “레반 (levan)”은 프럭토스(과당, C6H12O6)의 폴리머를 의미한다. 상기 레반은 프럭토스 고리들 간에 베타-(2->6) 결합을 가진 다당류로서, 이때 번호는 연결되는 프럭토스 고리에서의 탄소 원자를 나타내며, 베타는 입체화학적인 관계를 나타낸다. 또한, 레반은 D-프럭토푸라노시드 단량체 단위들 간의 지배적인 글리코시드 결합이 베타-(2->6)인 프럭탄을 의미하기도 하며, 레불로산, 폴리프럭토산, 플로프럭토스 및 폴리 에불란으로도 지칭된다. 상기 레반은 일반적으로 미생물에 의해 만들어지며, 식물에서는 고분자량 형태로는 생성되지 않으나, 분자량이 100,000 달톤 미만인 일부 저분자량 레반은 생성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 레반은 CBM66 태그를 정제하는데 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 벡터로부터 발현되는 재조합 단백질은 CBM66 태그 및 상기 태그가 부착된 목적 단백질을 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 재조합 융합 단백질, CBM66 융합 단백질, CBM66 태그가 부착된 단백질, CBM66 태그가 부착된 재조합 단백질 등으로 명명할 수 있다.
상기 목적 단백질은 본 발명의 CBM66 태그를 이용하여 가용성 발현시키고자 하는 단백질이라면 특별히 제한되지 않으나, 구체적으로 난발현성 단백질일 수 있다. 상기 난발현성 단백질의 예로는 표피성장인자(Epidermal growth factor), 혈관내피세포 성장인자(Vascular endothelial growth factor), 노긴(Noggin), 골형성단백질 7(bone morphogenetic protein 7), 리파아제 B(lipase B), 알콜탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 PET(polyethylene terephthalate) 가수분해효소 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
즉, 본 발명은 난발현성 단백질에 CBM66 태그를 부착시켜 단백질의 가용성 발현을 증대시키고, CBM66과 높은 친화성을 나타내는 레반을 이용하여 고수율로 정제하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CBM66 및 목적 단백질은 링커(linker)로 서로 연결된 것일 수 있다.
상기 링커를 코딩하는 염기서열은 충분한 길이여야 한다. 구체적으로, 본 발명의 링커를 코딩하는 염기서열은 20 bp 이상의 길이, 예컨대 30 또는 40 bp 이상의 길이를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 링커를 코딩하는 염기서열은 선형 벡터와 최소 80 % 정도 상동성을 가지며, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 %의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 (G4S)2, 즉, GGGGSGGGGS(서열번호 19)로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 링커는 프로테아제(protease) 인식 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 프로테아제 인식 서열은 CBM66와 목적 단백질 간의 접합 부위에서 절단을 일으켜, 목적 단백질만을 고수율로 정제할 수 있다.
일례로서, 본 발명의 링커를 코딩하는 유전자는 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 프로테아제 인식 서열의 예로는 효모 kex2p 또는 kex2p-유사 프로테아제 인식 서열[예컨대, Lys-Arg(서열번호 9), Arg-Arg(서열번호 10), 또는 Leu-Asp-Lys-Arg(서열번호 11)를 포함하는 아미노산 서열], 포유동물 퓨린(purine) 인식 서열[Arg-X-X-Arg(서열번호 12)를 포함하는 아미노산 서열], Factor-Xa 인식서열[Ile-Glu-Gly-Arg(서열번호 13)를 포함하는 아미노산 서열], 엔테로키나제(enterokinase, EK) 인식서열[Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 14))을 포함하는 아미노산 서열], 서브틸리신(Subtilisin) 인식서열[Ala-Ala-His-Tyr(서열번호 15)를 포함하는 아미노산 서열], 담배식각바이러스(Tobacco etch virus, TEV) 유래 프로테아제 인식서열[Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(서열번호 16)를 포함하는 아미노산 서열], 유비퀴틴 프로테아제 인식서열[Arg-Gly-Gly(서열번호 17)를 포함하는 아미노산 서열] 또는 트롬빈(thrombin) 인식 서열[Arg-Gly-Pro-Arg(서열번호 18)를 포함하는 아미노산 서열]을 코딩할 수 있다.
본 발명의 링커를 코딩하는 염기서열을 CBM66를 코딩하는 염기서열에 부가하는 것은 일반적인 DNA 기술, 예컨대 PCR, 제한효소를 이용한 절단, 연결 및 상동재조합(homologous recombination) 등으로 수행할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 CBM66를 코딩하는 핵산 서열은 원형 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 CBM66 태그 발현 벡터의 카르복시 말단에는 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현을 확인하거나 단백질 정제 시 사용될 수 있는 히스티딘 태그(6xHIS)가 포함되어 있고, 탄수화물결합모듈66(CBM66) 태그와 히스티틴 태그 사이에 링커(서열번호 19), 프로테아제(protease) 중 하나인 엔테로키나아제(enterokinase) 인식 서열(서열번호 14) 및 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)를 포함하도록 구성된 것일 수 있다(도 1).
본 발명의 벡터에서 발현되는 목적 단백질은 탄수화물결합모듈66에 의해 발현량이 증가할 수 있다.
본 발명의 벡터에서 발현되는 목적 단백질은 탄수화물결합모듈66에 의해 가용성 발현이 증가할 수 있다.
본 발명에서 용어, “가용성(solubility) 발현”이란, 목적 단백질이 생물학적 활성을 갖는 상태로 발현시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 난발현성 단백질 유전자를 가용성 발현할 수 있는, CBM66 태그를 포함하는 발현 벡터(pCBM66)를 이용하여 재조합 단백질의 가용성 발현을 확인한 결과, 대조군 재조합 벡터로부터 발현된 난발현성 단백질 7종[인간 유래 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF), 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF), 노긴(Noggin, NOG), 골형성단백질 7(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 캔디다 안타크티카(Candida antarctica) 유래의 리파아제 B(CALB), 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알콜탈수소효소(Alcohol dehydrogenase, ADH), 이디오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis) 유래의 PET(polyethylene terephthalate) 가수분해효소(PETase)]은 모두 불용성 발현되거나 발현이 거의 되지 않는 것에 비해, pCBM66에서 발현되어 CBM66 태그가 부착된 재조합 단백질 7 종은 모두 가용성 발현이 월등하게 향상된 것을 확인하였으며(도 2), 특히 미생물 유래 효소인 CALB와 ADH, PETase는 CBM66 태그를 부착한 결과 가용성 발현량이 각각 5.6배, 2.7배, 4.2배 증가함을 확인하였다(도 3).
또한, 다른 일 구현예에서, CBM66 태그가 부착된 PETase의 가용성 발현 효율은 78%, 가용성 발현량은 약 350 mg/L로 나타나, 상용화 융합 태그인 MBP 태그와 GST 태그가 부착된 PETase에 비해 3.5배 이상 가용성 발현되었음을 확인하였다(도 5).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 CBM66을 코딩하는 유전자; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 재조합 단백질을 코딩하는 염기서열, 즉, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티를 이루는 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다.
본 발명의 CBM66을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 일 예로, 본 발명의 CBM66을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 서열을 가지거나, 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 필수적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 CBM66를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, CBM66의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 CBM66을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pET-21b, pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pMAL, pGX4 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 벡터에는 목적 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 조절용 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 상기 벡터는 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합 인자로서, 상기 탄수화물결합모듈66(CBM66)태그를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 고초균 유래 CBM66를 코딩하는 발현 벡터로, pET-21b 벡터에 NdeI과 XhoI 제한 효소를 처리하고 CBM66 태그를 연결하여 CBM66 태그를 포함하는 pCBM66을 제작하였다(도 1).
또한, 본 발명의 CBM66을 코딩하는 유전자; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트의 형태로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, “발현 카세트”는 세포 내에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지니는 핵산 구조물이다. 이는 자연적으로 발생되거나 합성된 핵산 구조로서, 일반적으로 발현 카세트는 전사되는 핵산과 프로모터를 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 발현 카세트는 CBM66을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 구체적으로 CBM66의 발현을 유도하는 CBM66 발현 카세트일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 벡터를 포함하는, 형질전환 미생물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 형질전환 미생물은 당업계에 널리 알려져 있는 미생물이라면 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 벡터의 도입 효율과 발현 효율이 높은 미생물을 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모 등일 수 있다. 구체적으로 상기 형질전환 미생물은 박테리아일 수 있고, 보다 구체적으로 대장균 (Escherichia coli) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 탄수화물결합모듈66이 결합된 목적 단백질의 생산방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 a) 본 발명의 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 b) 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양액으로부터 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 a) 단계는 본 발명의 형질전환 미생물을 배양하는 것일 수 있다.
상기 배양은 당업계에서 사용되는 미생물 배양 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
또한, 상기 a) 단계는 배양 과정에서 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalctopyranoside)를 이용한 단백질 발현을 유도하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 벡터를 대장균에 형질전환하고, 단일 콜로니를 취해 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 1차 배양을 진행하였다. 그 다음, 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 1차 배양액 일부를 넣어 37℃에서 본 배양을 진행하였다. 본 배양은 세포 배양액이 600 nm에서의 흡광도가 0.4에서 0.6이 될 때까지 배양하고, 흡광도가 상기 조건에 충족되었을 때, IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도하였다. 이후 배양액을 18℃에서 다음날까지 배양하였다.
상기 b) 단계는 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양액으로부터 단백질을 회수하는 것일 수 있다.
상기 회수는 당업계에서 사용되는 단백질 회수 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배양이 완료된 본 배양액을 원심분리하여 세포만 확보한 후, 배양액과 동량의 완충 용액을 섞어서 초음파분쇄기(Sonicator)로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 후 원심분리를 통해 가용성으로 발현된 단백질들은 상등액에서 수득하였다. 불용성 봉입체로 발현된 단백질들은 세포 찌꺼기들과 함께 펠렛(pellet)의 형태로 아래에 가라앉히고, 불용성 단백질을 녹일 수 있는 완충용액을 배양액과 동량 첨가하여 펠렛을 수득하였다. 이를 통해, 가용성 및 불용성으로 발현된 단백질을 회수하였다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 목적 단백질 정제방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 본 발명의 방법으로 생산된 CBM66이 결합된 목적 단백질을, 링커를 절단하는 프로테아제를 처리하여 i) CBM66 및 ii) 목적 단백질로 각각 분리하는 단계; 및 분리된 CBM66을 레반(levan)에 결합시켜 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 방법으로 생산된 CBM66이 결합된 목적 단백질을, 링커를 절단하는 프로테아제를 처리하여 i) CBM66 및 ii) 목적 단백질로 각각 분리하는 단계는, 링커에 포함된 프로테아제 인식 서열에 프로테아제가 결합하여 링커를 절단함으로써 i) CBM66 및 ii) 목적 단백질이 분리되는 것일 수 있다.
상기 프로테아제의 예로는 효모 kex2p 또는 kex2p-유사 프로테아제, 포유동물 퓨린 프로테아제, 엔테로키나제, 서브틸리신, 담배식각바이러스 프로테아제, 유비퀴틴 프로테아제, 트롬빈 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프로테아제는 각 프로테아제 종류마다 처리 조건이 상이할 수 있고, 구체적으로 pH 4.5 내지 7.5, 온도 4℃ 내지 45℃ 조건에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, CBM66 태그가 부착된 PETase에서 융합 태그를 제거하기 위하여 엔테로키나아제(enterokinase, EK) 또는 켁스2 프로테아제(Kex2p)를 처리한 결과, 각 프로테아제에 의한 분리효율은 EK 86%, Kex2p 65%로 확인되었다(도 6).
또한, 상기 분리된 CBM66을 레반(levan)에 결합시켜 선택적으로 제거하는 단계는, CBM66과 레반 사이의 친화도를 이용하여 CBM66만을 선택적으로 정제함으로써 목적 단백질을 정제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 엔테로키나아제 처리 후 CBM66 태그와 PETase가 효율적으로 분리됨을 확인하였으며, 이를 레반 수지에 통과시킨 여액을 정량 분석한 결과 약 89% 정제 효율을 확인하였다(도 7).
뿐만 아니라, 본 발명에 따라 CBM66 태그가 부착되어 가용성 발현이 향상된 단백질은 CBM66 태그가 부착되지 않고 발현된 단백질과 효소 활성에 차이가 없음을 확인하여(도 8 내지 10), 목적 단백질의 가용성 발현을 향상시키고 고수율로 정제 후 효소 활용에 아무런 문제가 없음을 확인하였다.
본 발명에서 제공하는 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66)과 융합하여 재조합 단백질을 발현하면 난발현성 단백질의 경우에도 우수한 수준으로 가용성으로 발현할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 레반을 이용하여 효과적으로 정제할 수 있다.
도 1은 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66)을 코딩하는 유전자를 목적 단백질 클로닝 부위와 함께 T7 프로모터에 연결한 재조합 벡터를 나타낸 모식도이다.
도 2는 대장균 균주에서 CBM66 태그를 이용하여 난발현성 단백질을 발현하여 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3는 대장균 균주에서 CBM66 태그를 이용하여 난발현성 단백질을 발현하여 정량분석한 결과이다.
도 4는 PETase의 가용성발현을 위한 융합 태그로 CBM66과 CBM2, CBM6, CBM10을 비교한 결과이다.
도 5는 종래 상용화 융합 태그인 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP) 태그 및 글루타치온-S-전이효소(Glutathione S-Transferase, GST) 태그의 가용성 발현을 CBM66 태그와 비교한 결과이다.
도 6은 CBM66 태그가 융합된 단백질에서 융합 태그를 제거하기 위해 프로테아제를 처리한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 CBM66 태그를 이용하여 가용성 발현 단백질 정제 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 8은 CBM66 태그가 부착된 EGF(CBM66-EGF)와 부착되지 않은 EGF의 효소 활성을 비교한 결과이다.
도 9는 CBM66 태그가 부착된 PETase(CBM66-PETase)와 부착되지 않은 PETase의 효소 활성을 비교한 결과이다.
도 10은 CBM66 태그가 부착된 ADH(CBM66-ADH)와 부착되지 않은 ADH의 효소 활성을 비교한 결과이다.
도 11은 CBM66을 이용한 단백질 발현 및 정제 시스템을 나타낸 모식도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 고초균( Bacillus subtilis ) 유래 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66, CBM66) 태그 발현 벡터 제조
고초균 유래 CBM66 태그를 발현하는 벡터를 제작하기 위하여, 고초균 유전자를 주형으로 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR (98℃ 1분 1회; 98℃ 10초, 58℃ 30초, 72℃ 30초 사이클 30 회; 72℃ 5분 1회)을 수행하여 CBM66 유전자를 증폭 하였다. 증폭된 유전자는 제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 선형으로 만든 pET-21b 벡터와 인퓨전 클로닝(in-fusion cloning kit, Takara) (50℃ 15분) 후에 대장균 DH5α에 형질전환하여, CBM66 태그 발현 벡터(pCBM66)를 수득하였다.
이때, 상기 CBM66 태그 발현 벡터의 카르복시 말단에는 단백질 정제시 사용될 수 있고 웨스턴 블랏으로 단백질 발현을 확인할 수 있는 히스티딘 태그(6xHistidine tag)가 부착되었고, CBM66 태그와 히스티틴 태그(6xHIS) 사이에는 링커(linker)(서열번호 19)와 프로테아제(protease) 중 하나인 엔테로키나아제(enterokinase) 인식 서열(서열번호 14)과 다중 클로닝 부위(multiple cloning site, MCS)가 존재하였다(도 1).
CBM66 태그의 프라이머 뉴클레오티드 서열
CBM66 태그 프라이머 방향 뉴클레오티드 서열 (5' to 3') 서열번호
CBM66 forward AGAAGGAGATATACATATGGGAACGACACCT 3
reverse GTAACGAAGGAGTCTCTCGAGCACCACCAC 4
CBM66-L forward GTAACGAAGGAGTCTGGTGGCGGAGGCAGCGGTGGAGGCGGATCC 5
reverse ATCGTCATCGTCACCGGATCCGCCTCCACCGCTGCCTCCGCCACC 6
CBM66-L-EK forward GGTGGAGGCGGATCCGGTGACGATGACGATAAGNNNNNNNNNNNNNNN 7
reverse NNNNNNNNNNNNNNNTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG 8
실시예 2. 난발현성 단백질의 가용성 발현을 위한 CBM66 태그 발현 재조합 벡터 제작
상기 실시예 1에서 제작한 CBM66 태그 발현 벡터를 이용한 난발현성 단백질의 가용성 발현 효과를 확인하기 위하여, 대장균에서 발현하기 힘든 난발현성 단백질 7 종[인간 유래 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF), 혈관내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF), 노긴(Noggin, NOG), 골형성단백질 7(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 캔디다 안타크티카(Candida antarctica) 유래의 리파아제 B(CALB), 사카로마이시스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알콜탈수소효소(Alcohol dehydrogenase, ADH), 이디오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis) 유래의 PET(polyethylene terephthalate) 가수분해효소(PETase)]을 선발하였다.
구체적으로, 상기 7 종의 단백질을 코딩하는 각 유전자를 PCR (98℃ 1분 1회; 98℃ 10초, 58℃ 30초, 72℃ 1분 사이클 30 회; 72℃ 5분 1회)로 증폭하였다. 증폭된 유전자를 상기 실시예 1에서 제작한 CBM66 태그 발현 벡터에 도입하기 위하여, 상기 CBM66 태그 발현 벡터를 제한효소 BamHI과 XhoI을 이용하여 선형 벡터로 만들고, 증폭된 난발현성 단백질 7 종의 유전자와 인퓨전 클로닝(infusion) (50℃ 15분) 후에 대장균 DH5α 균주에 형질전환하였다. CBM66 태그 발현 벡터가 앰피실린(Ampicillin) 저항 유전자를 보유하고 있으므로, 앰피실린이 포함된 LB 고체 배지에서 형질전환된 균주를 배양하여 선별한 후, 선별된 균주로부터 재조합 벡터를 확보하였다.
또한, CBM66 태그의 가용성 발현 상승 효과를 확인하기 위한 대조군으로, 상기 7 종의 단백질을 코딩하는 각 유전자를 상기 방법과 같이 증폭하였고, pET-21b 벡터를 제한효소 NdeI과 XhoI을 이용하여 선형 벡터로 만들고, 증폭된 유전자를 인퓨전 클로닝하고 상기와 동일한 방법으로 대장균 DH5α 균주에 형질전환하여 균주 선별 후 대조군 재조합 벡터를 확보하였다.
실시예 3. CBM66 태그가 부착된 재조합 단백질의 가용성 발현 확인
실시예 2에서 제작된 재조합 벡터로부터 발현되는, CBM66 태그가 부착된 7 종의 재조합 단백질(CBM66 융합 단백질)의 가용성 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 확보한 CBM66 태그가 부착된 재조합 벡터 7종과 CBM66 태그가 없는 대조군 재조합 벡터 7 종을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하고, 단일 콜로니(single colony)를 취해 앰피실린 100 μg/mL이 첨가된 3 mL의 LB 배지에 접종하여 37℃에서 1차 배양을 진행하였다.
그 다음, 앰피실린 100 μg/mL이 첨가된 3 mL의 LB 배지에 1차 배양액 30 μL를 넣어 37℃에서 본 배양을 진행하였다. 본 배양은 세포 배양액이 600 nm에서의 흡광도가 0.4에서 0.6이 될 때까지 배양하고, 흡광도가 상기 조건에 충족되었을 때, 0.1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalctopyranoside)를 이용하여 단백질 발현을 유도하였다. 이후 배양액을 18℃에서 다음날까지 배양하였다.
배양이 완료된 본 배양액을 원심분리하여 세포만 확보한 후, 배양액과 동량의 완충 용액을 섞어서 초음파분쇄기(Sonicator)로 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄 후 원심분리를 통해 가용성으로 발현된 단백질들은 상등액에서 수득하였다. 불용성 봉입체로 발현된 단백질들은 세포 찌꺼기들과 함께 펠렛(pellet)의 형태로 아래에 가라앉히고, 불용성 단백질을 녹일 수 있는 완충용액을 배양액과 동량 첨가하여 펠렛을 수득하였다. 이후 가용성 및 불용성으로 발현된 단백질을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
그 결과, 대조군 재조합 벡터로부터 발현된 난발현성 단백질 7 종은 모두 불용성 발현되거나 발현이 거의 되지 않는 것에 비해, CBM66 태그가 부착된 재조합 단백질 7 종은 모두 가용성 발현이 월등하게 향상된 것을 확인하였다(도 2). 특히, 인간 유래 신호전달 펩티드인 EGF, VEGF 및 NOG의 경우 CBM66과 융합된 경우에서만 SDS-PAGE 상에서 가용성 발현을 관찰할 수 있었으며, 가용성 단백질 발현량은 각각 248, 127, 364 mg/L 수준으로 확인되었다. 다른 인간 유래 펩티드인 BMP7의 경우 CBM66 태그 없이는 주로 불용성 봉입체 형태로 발현이 되지만, CBM66 태그를 부착한 결과 가용성 발현량이 약 296 mg/L이었다. 미생물 유래 효소인 CALB와 ADH, PETase 역시 CBM66 태그를 부착한 결과 가용성 발현량이 각각 5.6배, 2.7배, 4.2배 증가하였다(도 3).
실시예 4. CBM66 태그와 연결된 재조합 단백질의 가용성 발현 확인
CBM66 태그의 가용성 발현 효과를 다른 유형의 CBM과 비교하기 위하여, Type A인 CBM2와 CBM10, Type B인 CBM6을 선정하여 PETase의 가용성발현을 확인하였다. CBM2와 CBM10은 UniprotKB-P10476의 서열정보를 바탕으로, CBM6은 UniprotKB-A0A5E7F444의 서열정보를 바탕으로 합성된 유전자를 이용하여 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 선형 pET-21b 벡터 및 PETase 유전자와 재조합하여 벡터를 제작하였다.
제작한 각 재조합 벡터는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 대장균 내로 도입, 단백질 발현을 실시한 후 SDS-PAGE를 통해 가용성 발현량을 확인하였다.
그 결과, CBM2, 6, 10의 경우는 모두 PETase가 불용성으로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, CBM66 태그와 융합된 PETase만이 가용성으로 발현되는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 5. CBM66 태그에 의한 PETase의 가용성 발현 효과
CBM66 태그의 가용성 발현 효과를 상용화 융합 태그와 비교하기 위하여, 가용성 발현에 널리 사용되는 융합 태그인 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP) 태그와 글루타치온-S-전이효소(Glutathione S-Transferase, GST) 태그를 대조군으로 하여 가용성 발현 효과를 비교하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 MBP 태그 유전자와 GST 태그 유전자를 pMAL 벡터와 pGX4 벡터를 주형으로 하여 PCR 증폭하고, 증폭된 유전자를 제한효소 NdeI과 XhoI으로 처리된 선형 pET-21b 벡터와 재조합하여 pMBP와 pGST 벡터를 확보하였다.
그 다음, 상기 실시예 2의 7 종의 난발현성 단백질 가운데 이디오넬라 사카이엔시스 유래의 PET 가수분해효소(PETase)를 목적 단백질로 선정하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 PETase를 코딩하는 유전자, 제한효소 BamHI과 XhoI으로 처리된 선형 pMBP 및 pGST 벡터를 재조합하여, MBP 태그와 GST 태그가 부착된 재조합 벡터를 확보하였다.
확보한 각 재조합 벡터는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 대장균 내로 도입하여 단백질 발현을 수행하였다. 이때, 단백질 발현 온도에 따른 발현 양상을 비교하기 위하여 발현 온도를 37, 30, 25, 18℃로 설정하여 실험을 수행하였다.
그 결과, 18℃ 온도 조건에서 CBM66 태그가 부착된 PETase의 가용성 발현 효율은 78%, 가용성 발현량은 약 350 mg/L로 나타나, 상용화 융합 태그인 MBP 태그와 GST 태그가 부착된 PETase에 비해 3.5배 이상 가용성 발현되었음을 확인하였다(도 5).
실시예 6. 레반-아가로오스(levan-agarose) 수지를 이용한 CBM66 융합 단백질의 정제
CBM66 태그는 레반과의 결합력을 이용하여 정제가 가능한 바, 레반-아가로오스 수지를 이용하여 CBM66 융합 단백질을 정제하였다.
구체적으로, CBM66 태그가 부착된 이디오넬라 사카이엔시스 유래의 PETase를 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 생산하고, 1차 단백질 정제를 진행하였다. 1차 단백질 정제는 PETase 카복시 말단에 있는 6x 히스티딘 태그를 사용해 Ni-NTA 수지로 수행하였다.
그 다음, CBM66 태그가 부착된 PETase에서 융합 태그를 제거하기 위하여 엔테로키나아제(enterokinase, EK)를 pH 7.5, 25℃ 조건에서, 또는 켁스2 프로테아제(Kex2p)를 pH 7.5, 30℃ 조건에서 처리하였다. 각 프로테아제에 의한 분리효율은 EK 처리시 86%, Kex2p 처리시 65%로 확인되었다(도 6).
상기 반응액 중 엔테로키나아제에 반응한 시료는 레반-아가로오스 수지가 충진된 컬럼을 통과시켜 PETase와 CBM66 태그를 분리 정제하였다. 분리 정제된 단백질을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 7과 같이 엔테로키나아제 처리 후 CBM66 태그와 PETase가 효율적으로 분리됨을 확인하였으며, 이를 레반 수지에 통과시킨 여액을 정량 분석한 결과 약 89% 정제 효율을 확인하였다.
실시예 7. CBM66 융합 단백질의 생물학적 활성 비교
7-1. EGF와 CBM66-EGF의 활성 비교
인간 유래의 표피생장인자(EGF)에 CBM66 태그 부착시 단백질의 활성에 차이가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 EGF와 CBM66 태그가 부착된 EGF(CBM66-EGF)의 단백질 발현 및 정제를 수행하였다. EGF의 활성은 인체 유래 각질 세포인 HaCaT 세포주를 이용한 세포증식효과분석법(MTT assay)으로 측정하였다.
구체적으로, HaCaT 세포주를 항생제와 FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양한 뒤, 이를 mL 당 2 X 104개의 세포가 되도록 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 37℃로 설정된 이산화탄소 배양기 내에서 배양한 뒤 1 pg에서 1 μg에 해당하는 EGF와 CBM66-EGF를 첨가한 후 동일한 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 배양체 부피의 1/10에 해당하는 수용성 테트라졸리움 염(대일랩서비스)을 첨가한 뒤 5시간 동안 안치하여 발색 반응을 유도하였다. 발색은 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
그 결과, EGF와 CBM66-EGF 모두 농도 구배에 비례하는 세포증식 효과가 나타났으며, 두 실험군 사이에 유의미한 차이는 확인할 수 없었다(도 8).
7-2. PETase와 CBM66-PETase의 활성 비교
이디오넬라 사카이엔시스 유래의 PET 가수분해효소(PETase)에 CBM66 태그 부착시 단백질의 활성에 차이가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 PETase와 CBM66 태그가 부착된 PETase(CBM66-PETase)의 단백질 발현 및 정제를 수행하였다. PETase의 활성은 기질인 PET 단량체인 BHET(Bis-(2-Hydroxyethyl) terephthalate)를 MHET(Mon-(2-hydroxyethyl) terephthalate)로 분해하는 반응 속도를 확인하여 분석하였다.
구체적으로, 기질로 사용된 BHET(시그마알드리치)는 100% DMSO에 100 mM로 녹여서 사용하였다. BHET는 1 mM, PETase와 CBM66-PETase는 각각 1 μM로 첨가하여 반응시켰다. 반응은 30℃에서 30분 동안 진행하였고, 반응이 종료된 후에 효소의 활성을 제거하기 위하여 85℃에서 15분 동안 반응하여 PETase를 불활성화시켰다. 불활성화를 마친 반응액은 0.2 μm의 필터를 통과시킨 후에 HPLC를 이용하여 분해된 BHET와 생성된 MHET의 양을 확인하였다.
그 결과, PETase와 CBM66-PETase 모두 BHET 분해를 완료하였고, 두 실험군 사이에 유의미한 차이는 확인할 수 없었다(도 9).
7-3. ADH와 CBM66-ADH의 활성비교
사카로마이시스 세레비시에 유래의 알콜탈수소효소(ADH)에 CBM66 태그 부착시 단백질의 활성에 차이가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 ADH와 CBM66 태그가 부착된 ADH(CBM66-ADH)의 단백질 발현 및 정제를 수행하였다. ADH의 활성은 기질인 에탄올로부터 생산된 아세트알데히드의 양을 확인하여 분석하였다.
구체적으로, 기질로 50 mM의 에탄올을 첨가하였으며, ADH는 반응 중에 조효소인 NAD+(시그마알드리치)를 필요로 하므로 25 mM NAD+를 추가로 첨가하였다. ADH와 CBM66-ADH는 각각 1 μM로 첨가하여 반응시켰다. 반응은 30℃에서 2시간 진행하였고, 반응이 종료된 후에 효소의 활성을 제거하기 위해서 1 M 염산을 첨가하여 ADH를 불활성화시켰다. 불활성화를 마친 반응액은 0.2 μm의 필터를 통과한 후에 HPLC를 이용하여 생산된 아세트알데히드의 양을 확인하였다.
그 결과, ADH와 CBM66-ADH 모두 에탄올을 아세트알데히드로 전환하였고, 두 실험군 사이에 유의미한 차이는 확인할 수 없었다(도 10).
이를 통해, EGF, PETase 및 ADH 모두 CBM66 태그가 부착된 단백질과 부착되지 않은 단백질 사이에 활성 차이가 거의 없는 것을 확인하였다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명에서 제공하는 탄수화물결합모듈66과 융합하여 재조합 단백질을 발현하면 난발현성 단백질의 경우에도 우수한 수준으로 가용성으로 발현할 수 있으며, 상기 융합 단백질은 레반을 이용하여 효과적으로 정제할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 다른 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A novel fusion tag system promising soluble expression and purification in Escherichia coli using CBM66 and levan, and their applications <130> KPA210651-KR <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 164 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> CBM66 AA <400> 1 Gly Thr Thr Pro Phe Met Ser Asn Met Thr Gly Trp Thr Thr Val Asn 1 5 10 15 Gly Thr Trp Ala Asp Thr Ile Glu Gly Lys Gln Gly Arg Ser Asp Gly 20 25 30 Asp Ser Phe Ile Leu Ser Ser Ala Ser Gly Ser Asp Phe Thr Tyr Glu 35 40 45 Ser Asp Ile Thr Ile Lys Asp Gly Asn Gly Arg Gly Ala Gly Ala Leu 50 55 60 Met Phe Arg Ser Asp Lys Asp Ala Lys Asn Gly Tyr Leu Ala Asn Val 65 70 75 80 Asp Ala Lys His Asp Leu Val Lys Phe Phe Lys Phe Glu Asn Gly Ala 85 90 95 Ala Ser Val Ile Ala Glu Tyr Lys Thr Pro Ile Asp Val Asn Lys Lys 100 105 110 Tyr His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Gly Asp Arg Phe Lys Ile Tyr Leu 115 120 125 Asp Asp Arg Leu Val Ile Asp Ala His Asp Ser Val Phe Ser Glu Gly 130 135 140 Gln Phe Gly Leu Asn Val Trp Asp Ala Thr Ala Val Phe Gln Asn Val 145 150 155 160 Thr Lys Glu Ser <210> 2 <211> 492 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CBM66 NT <400> 2 ggaacgacac cttttatgtc caatatgact ggctggacga ctgtaaatgg cacgtgggca 60 gacacaattg aggggaaaca agggaggtcg gacggcgatt cctttatctt gtcttcagca 120 tccgggtcag acttcactta tgaatctgat atcaccatta aggatggaaa cggaagaggg 180 gcaggagcac taatgtttcg ctctgacaaa gatgccaaaa acggttacct tgccaatgtg 240 gatgcgaagc atgacctagt gaaattcttt aaatttgaga acggtgctgc ttctgtcatt 300 gctgaataca aaacaccgat agacgttaat aaaaagtatc atctgaaaac agaggccgag 360 ggcgatcgct ttaaaatcta tttagatgat cgtcttgtga ttgatgcaca tgattccgta 420 ttttcagaag gccaatttgg cttgaatgtg tgggacgcga ctgctgtctt tcagaatgta 480 acgaaggagt ct 492 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM66_forward <400> 3 agaaggagat atacatatgg gaacgacacc t 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM66_reverse <400> 4 gtaacgaagg agtctctcga gcaccaccac 30 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM66-L_forward <400> 5 gtaacgaagg agtctggtgg cggaggcagc ggtggaggcg gatcc 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM66-L_reverse <400> 6 atcgtcatcg tcaccggatc cgcctccacc gctgcctccg ccacc 45 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM66-L-EK_forward <400> 7 ggtggaggcg gatccggtga cgatgacgat aagnnnnnnn nnnnnnnn 48 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBM66-L-EK_reverse <400> 8 nnnnnnnnnn nnnnntcagt ggtggtggtg gtggtgctcg ag 42 <210> 9 <211> 2 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> kex2p <400> 9 Lys Arg 1 <210> 10 <211> 2 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> kex2p-like 1 <400> 10 Arg Arg 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> kex2p-like 2 <400> 11 Leu Asp Lys Arg 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> purine <400> 12 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Factor-Xa <400> 13 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> enterokinase <400> 14 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Subtilisin <400> 15 Ala Ala His Tyr 1 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> protease from Tobacco etch virus <400> 16 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ubiquitin protease <400> 17 Arg Gly Gly 1 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> thrombin <400> 18 Arg Gly Pro Arg 1 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10

Claims (10)

  1. 탄수화물결합모듈66(carbohydrate binding module 66)을 코딩하는 유전자; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;를 포함하는, 재조합 단백질 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 벡터에서 발현되는 재조합 단백질은 탄수화물결합모듈66에 의해 발현량이 증가하는 것인, 재조합 단백질 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 벡터에서 발현되는 재조합 단백질은 탄수화물결합모듈66에 의해 가용성 발현이 증가하는 것인, 재조합 단백질 발현 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물결합모듈66은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 단백질 발현 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물결합모듈66 및 목적 단백질은 링커로 서로 연결된 것인, 재조합 단백질 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 프로테아제 인식 서열을 포함하는 것인, 재조합 단백질 발현 벡터.
  7. 제1항의 벡터를 포함하는, 형질전환 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환 미생물은 대장균인 것인, 미생물.
  9. a) 제7항의 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및
    b) 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양액으로부터 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는, 탄수화물결합모듈66이 결합된 목적 단백질의 생산방법.
  10. 제9항의 방법으로 생산된 탄수화물결합모듈66이 결합된 목적 단백질을 링커를 절단하는 프로테아제를 처리하여 i) 탄수화물결합모듈66 및 ii) 목적 단백질로 각각 분리하는 단계; 및
    분리된 탄수화물결합모듈66을 레반(levan)에 결합시켜 선택적으로 제거하는 단계;를 포함하는 목적 단백질 정제방법.
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Applied and Environmental Microbiology, 2020, Volume 86, Issue 16, e00787-20. *
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