JP2023546501A - 新規エステラーゼ及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規エステラーゼ、より特定すると配列番号１のエステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有するエステラーゼ変異体、並びにプラスチック製品などのポリエステル含有物質を分解するためのその使用に関する。本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタラート及びポリエチレンテレフタラート含有物質を分解するのに特に適している。

Description

本発明は、新規エステラーゼ、より特定すると親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有するエステラーゼに関する。本発明はまた、プラスチック製品などのポリエステル含有物質を分解するための該新規エステラーゼの使用にも関する。本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタラート、及びポリエチレンテレフタラート含有物質を分解するのに特に適している。

背景
エステラーゼは、ポリエステルを含む、多種多様なポリマーの加水分解を触媒することができる。この状況において、エステラーゼは、食器洗い及び洗濯の用途のための洗剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の解毒における又は織物産業におけるポリエステル生地の処理のための生体触媒としてなどの、多くの産業用途において有望な効果を示した。ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用は、特に興味深い。実際に、ＰＥＴは、多くの技術的分野において、例えば衣類、カーペットの製造において、又は包装用若しくは自動車用プラスチックの製造のための熱硬化性樹脂の形態で使用され、よって埋立地におけるＰＥＴの蓄積は、ますます増えつつあるエコロジー問題となっている。

ポリエステル、特にＰＥＴの酵素的分解は、プラスチック廃棄物の蓄積を減少させるための興味深い解決策と考えられる。実際に、酵素は、ポリエステル含有物質、より特定するとプラスチック製品から、モノマーレベルさえまでの加水分解を加速し得る。さらに、加水分解物（すなわち、モノマー及びオリゴマー）は、新規ポリマーの合成のための材料としてリサイクルすることができる。

この状況において、いくつかのエステラーゼが、ポリエステルのための分解酵素候補として同定され、このようなエステラーゼのいくつかの変異体が開発されている。エステラーゼの中でも、クチナーゼ（これはクチンヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．１．７４）としても知られている）が特に興味深い。クチナーゼは、様々な真菌（P.E. Kolattukudy、"Lipases"、Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman、Elsevier 1984、471-504）、細菌、及び植物の花粉から同定されている。近年、メタゲノミクスアプローチにより、追加のエステラーゼが同定された。

しかしながら、より効率的に、そしてそれにより、より競合的にポリエステル分解プロセスを提供するために、すでに既知であるエステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有するエステラーゼが依然として必要である。

発明の要約
本発明は、親エステラーゼすなわち野生型エステラーゼと比較して、増加した活性及び／又は増加した熱安定性を示し、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有する、新規エステラーゼを提供する。この野生型エステラーゼは、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースでＥ５ＢＢＱ３として参照され、かつポリエステル分解活性を有すると記載された、エステラーゼに相当する。本発明のエステラーゼは、プラスチック製品、より特定するとＰＥＴ含有プラスチック製品を分解するためのプロセスにおいて特に有用である。

これに関して、本発明の目的は、（ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、そして（ｉｉ）Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された位置における少なくとも１つの置換を有し、ここでの位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参考にして番号が付され、（ｉｉｉ）ポリエステル分解活性を有する、エステラーゼを提供することである。好ましくは、該エステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性及び／又は増加した分解活性を示す。

好ましくは、前記エステラーゼは、Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、より好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ及びＮ２１２Ｄ、より好ましくは少なくともＦ２０９Ｉから選択された少なくとも１つの置換を含む。

本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼをコードしている核酸を提供することである。本発明はまた、該核酸を含んでいる発現カセット又は発現ベクター、及び該核酸、発現カセット又はベクターを含んでいる宿主細胞に関する。

本発明はまた、本発明のエステラーゼ、本発明の宿主細胞、又はその抽出物を含んでいる、組成物を提供する。

本発明のさらなる目的は、
（ａ）エステラーゼをコードしている核酸を発現するのに適した条件下で、本発明に記載の宿主細胞を培養する工程；及び場合により
（ｂ）細胞培養液から該エステラーゼを回収する工程
を含む、本発明のエステラーゼを産生する方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、
（ａ）ポリエステルを、本発明に記載のエステラーゼ、又は本発明に記載の宿主細胞、又は本発明に記載の組成物と接触させる工程；及び場合により
（ｂ）モノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程
を含む、ポリエステルを分解する方法を提供することである。

特に、本発明は、ＰＥＴを、少なくとも１つの本発明のエステラーゼと接触させる工程、並びに場合によりＰＥＴのモノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程を含む、ＰＥＴを分解する方法を提供する。

本発明はまた、ＰＥＴ又はＰＥＴ含有プラスチック製品を分解するための、本発明のエステラーゼの使用に関する。

本発明はまた、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又は組成物が含まれている、ポリエステル含有物質にも関する。

本発明はまた、本発明に記載のエステラーゼ若しくは宿主細胞を含んでいる洗剤組成物、又は本発明のエステラーゼを含んでいる組成物にも関する。

発明の詳細な説明
定義
本開示は、以下の定義を参照することによって最善に理解されるであろう。

本明細書における「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」という用語は、アミノ酸鎖を形成しているアミノ酸の数に関係なく、ペプチド結合によって連結された該アミノ酸鎖を指す。アミノ酸は本明細書において、以下の命名法に従って、それらの一文字又は三文字コードによって示される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。

「エステラーゼ」という用語は、酵素命名法に従ってＥＣ３．１．１と分類された、エステルから酸とアルコールへの加水分解を触媒する、ヒドロラーゼのクラスに属する酵素を指す。「クチナーゼ」又は「クチンヒドロラーゼ」という用語は、酵素命名法に従ってＥＣ３．１．１．７４と分類された、クチンと水からクチンモノマーの化学生成反応を触媒することができる、エステラーゼを指す。

「野生型タンパク質」又は「親タンパク質」という用語は、天然に見られるような非突然変異型のポリペプチドを指す。今回の場合、親エステラーゼは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有するエステラーゼを指す。

「突然変異体」及び「変異体」という用語は、配列番号１に由来し、かつ、１つ以上（例えば数個）の位置に少なくとも１つの修飾又は改変、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含み、かつポリエステル分解活性を有している、ポリペプチドを指す。該変異体は、当技術分野において周知の様々な技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を改変させるための技術の例としては、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、及び合成オリゴヌクレオチドの構築が挙げられるがこれらに限定されない。したがって、本明細書において使用する特定の位置に関する「修飾」及び「改変」という用語は、この特定の位置におけるアミノ酸が、野生型タンパク質のこの特定の位置のアミノ酸と比較して修飾されていることを意味する。

「置換」は、アミノ酸残基が、別のアミノ酸残基によって置換されていることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０のアミノ残基、稀に天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、６－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルチニン、ノルロイシン、ノルバリン）、及び合成で作られることの多い非天然アミノ酸残基（例えばシクロヘキシル－アラニン）から選択された別のアミノ酸残基による、アミノ酸残基の置換を指す。好ましくは、「置換」という用語は、天然に存在する標準的な２０のアミノ酸残基（Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ及びＴ）から選択された別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を指す。「＋」の記号は、置換の組合せを示す。本文書では、以下の用語が、置換を示すために使用される：Ｌ８２Ａは、親配列の８２番目の位置におけるアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）が、アラニン（Ａ）によって置換されていることを示す。Ａ１２１Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１２１番目の位置のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸の１つによって置換されていることを示す：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）又はメチオニン（Ｍ）。置換は、保存的置換であっても、又は非保存的置換であってもよい。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン及びトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小型アミノ酸（グリシン、アラニン及びセリン）のグループ内である。

特記されない限り、本出願に開示された位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照して番号が付される。

本明細書において使用する「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列間での一致（同一のアミノ酸残基）数（又は比率％として表現される割合）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小限にしつつ、重複及び同一性が最大化するようにアラインさせて、配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、多くの数学的なグローバル又は局所的アラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。同じような長さの配列は好ましくは、完全長にわたり最適に配列をアラインさせる、グローバルアラインメントアルゴリズム（例えばNeedleman及びWunschアルゴリズム；Needleman and Wunsch, 1970）を使用してアラインされるが、実質的に異なる長さの配列は好ましくは、局所的アラインメントアルゴリズム（例えばSmith及びWatermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）又はAltschulアルゴリズム（Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)）を使用してアラインされる。アミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントとは、当技術分野の技能範囲内の様々な方法で、例えば、インターネットウェブサイト上で、例えばhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/で利用可能な公共的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成され得る。当業者は、比較される配列の完全長におよぶ最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書の目的では、アミノ酸配列同一性の数値％は、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作り出す、ペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して発生した数値を指し、ここでの全ての探索パラメーターは、デフォールト値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１１、ギャップエクステンド＝１に設定される。

「ポリマー」は、その構造が、共有化学結合によって連結された複数のモノマー（反復単位）から構成される、化合物又は化合物の混合物を指す。本発明の状況において、ポリマーという用語は、１種類の反復単位（すなわちホモポリマー）又は異なる反復単位の混合物（すなわちコポリマー又はヘテロポリマー）から構成される、天然又は合成のポリマーを含む。本発明によると、「オリゴマー」は、２から約２０個のモノマーを含有している分子を指す。

本発明の状況において、「ポリエステル含有物質」又は「ポリエステル含有製品」は、結晶性、半結晶性又は完全に無定形の、少なくとも１つのポリエステルを含んでいる、プラスチック製品などの製品を指す。特定の実施態様では、ポリエステル含有物質は、少なくとも１つのポリエステル及びおそらく他の物質又は添加物質、例えば可塑剤、鉱物性又は有機性充填剤を含有している、プラスチックシート、チューブ、棒、プロファイル、形状、フィルム、大きな塊などの、少なくとも１つのプラスチック物質から作製された任意の品目を指す。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有物質は、プラスチック製品の作製に適した、溶解状態又は固体状態の、プラスチック化合物又はプラスチック配合物を指す。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有物質は、少なくとも１つのポリエステルを含んでいる、織物、生地又は繊維を指す。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有物質は、少なくとも１つのポリエステルを含んでいる、プラスチック廃棄物又は繊維廃棄物を指す。

本明細書において、「ポリエステル（群」」という用語は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルバイドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、及びこれらのポリマーのブレンド／混合物を包含するがこれらに限定されない。

新規エステラーゼ
本発明は、親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有する新規エステラーゼを提供する。より特定すると、本発明者らは、産業プロセスに使用するに特に適した新規酵素を設計した。本発明のエステラーゼは、ポリエステル、より特定するとＰＥＴ、例えばＰＥＴ含有物質、特にＰＥＴ含有プラスチック製品の分解に特に適している。特定の実施態様では、該エステラーゼは、増加した活性及び増加した熱安定性の両方を示す。

それ故、本発明の目的は、親エステラーゼとしても参照される、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有するエステラーゼと比較して、増加した活性を示すエステラーゼを提供することである。

特に、本発明者らは、エステラーゼのＸ線結晶構造（すなわち折り畳まれた３次元構造）内のポリマー基質と接触させることを意図した、配列番号１内の特定のアミノ酸残基を同定し、これはエステラーゼと基質の接触を促進するために有利には修飾されていてもよく、これにより有利には、ポリマーへの吸着増加及び／又はこれによりこのポリマー上での該エステラーゼの活性増加がもたらされる。

本発明の状況において、「増加した活性」又は「増加した分解活性」という用語は、所与の温度で配列番号１のエステラーゼがポリエステルを分解及び／又は同ポリエステル上に吸着する能力と比較して、同温度で、同ポリエステルを該エステラーゼが分解する能力の増加及び／又はポリエステル上に吸着する能力の増加を示す。特に、本発明のエステラーゼは、増加したＰＥＴ分解活性を示す。このような増加は、配列番号１のエステラーゼのＰＥＴ分解活性より少なくとも１０％高い場合があり、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％又はそれ以上高い場合がある。特に、分解活性は、脱重合活性であり、これにより、ポリエステルのモノマー及び／又はオリゴマーがもたらされ、これはさらに回０収及び場合により再使用され得る。

エステラーゼの「分解活性」は、当技術分野においてそれ自体既知である方法に従って、当業者によって評価され得る。例えば、分解活性は、特定のポリマーの脱重合活性速度の測定、寒天プレート中に分散させた固体ポリマー化合物を分解する速度の測定、又はリアクター中のポリマーの脱重合活性速度の測定によって判定され得る。特に、分解活性は、エステラーゼの「特異的分解活性」を測定することによって評価され得る。ＰＥＴに対するエステラーゼの「特異的分解活性」は、初期反応期間中（すなわち、最初の２４時間）、１分あたりに加水分解されたＰＥＴのμmol、又は１時間あたり及びエステラーゼ１mgあたりに生成された等価なＴＡのmgに相当し、加水分解反応曲線の線形部分から決定され、このような曲線は、最初の２４時間中の様々な時点において実施された数回のサンプリングによって設定される。別の例として、「分解活性」は、ポリマー又はポリマー含有プラスチック製品を分解酵素と接触させた場合に、所定の期間の後に、適切な温度、ｐＨ及び緩衝液の条件下で遊離されたオリゴマー及び／又はモノマーの速度及び／又は収量を測定することによって評価され得る。

基質上に酵素が吸着する能力は、当業者によって、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って評価され得る。例えば、基質上に酵素が吸着する能力は、酵素含有溶液から測定され得、ここでの酵素は、事前に、適切な条件下で基質と共にインキュベートされている。

本発明者らはまた、高温で（すなわち改善された熱安定性）、有利には５０℃を上回る、好ましくは６０℃を上回る、より好ましくは６５℃を上回る温度における、対応するエステラーゼの安定性を改善するように有利には修飾されていてもよい、配列番号１内の標的アミノ酸残基を同定した。

それ故、本発明の目的は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するエステラーゼ（すなわち親エステラーゼ）の熱安定性と比較して、増加した熱安定性を示す新規エステラーゼを提供することである。

本発明の状況において、特記されない限り、所与の温度は、該温度＋／－１℃に相当する。

本発明の状況において、「増加した熱安定性」という用語は、配列番号１のエステラーゼと比較して、高温で、特に５０℃から９０℃の温度で、その化学構造及び／又は物理構造の変化に該エステラーゼが耐える能力の増加を示す。特定の実施態様では、該エステラーゼの熱安定性は、５０℃～９０℃、５０℃～８０℃、５０℃～７５℃、５０℃～７０℃、５０℃～６５℃、５５℃～９０℃、５５℃～８０℃、５５℃～７５℃、５５℃～７０℃、５５℃～６５℃、６０℃～９０℃、６０℃～８０℃、６０℃～７５℃、６０℃～７０℃、６０℃～６５℃、６５℃～９０℃、６５℃～８０℃、６５℃～７５℃、６５℃～７０℃の温度で、親エステラーゼの熱安定性と比較して改善されている。特定の実施態様では、該エステラーゼの熱安定性は、少なくとも５０℃～６５℃の温度で、親エステラーゼの熱安定性と比較して改善されている。

特に、熱安定性は、エステラーゼの融点（Ｔｍ）の判定を通して評価され得る。本発明の状況において、「融点」は、考慮される酵素集団の半分が、折り畳まれていないか又は誤って折り畳まれる温度を指す。典型的には、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼのＴｍと比較して、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃又はそれ以上の上昇したＴｍを示す。特に、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、５０℃～９０℃の温度で延長された半減期を有し得る。特に、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、５０℃～９０℃、５０℃～８０℃、５０℃～７５℃、５０℃～７０℃、５０℃～６５℃、５５℃～９０℃、５５℃～８０℃、５５℃～７５℃、５５℃～７０℃、５５℃～６５℃、６０℃～９０℃、６０℃～８０℃、６０℃～７５℃、６０℃～７０℃、６０℃～６５℃、６５℃～９０℃、６５℃～８０℃、６５℃～７５℃、６５℃～７０℃の温度で延長された半減期を有し得る。特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、少なくとも５０℃～６５℃の温度で延長された半減期を有する。

エステラーゼの融点（Ｔｍ）は、当業者によって、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って測定され得る。例えば、ＤＳＦ（示差走査熱量測定）を使用して、エステラーゼの熱変性温度の変化を定量し得、これによりそのＴｍを決定し得る。あるいは、Ｔｍは、円偏光二色性を使用した、タンパク質の折り畳みの分析によって判定され得る。好ましくは、Ｔｍは、実験部に見られるような、示差走査熱量測定又は円偏光二色性を使用して測定される。本発明の状況において、Ｔｍの比較は、同じ条件下（例えばｐＨ、ポリエステルの性質及び量など）で測定されるＴｍを用いて実施される。

あるいは、熱安定性は、様々な温度でのインキュベーション後のエステラーゼ活性及び／又はエステラーゼのポリエステル脱重合活性を測定し、そして親エステラーゼのエステラーゼ活性及び／又はポリエステル脱重合活性と比較することによって評価され得る。様々な温度で複数回のポリエステルの脱重合アッセイを実施する能力も評価され得る。迅速かつ価値ある試験は、様々な温度でのインキュベーション後の寒天プレート中に分散させた固体ポリエステル化合物を分解するエステラーゼの能力の、ハロー直径測定による評価からなり得る。

したがって、本発明の目的は、（ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、そして（ｉｉ）Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ａ１２５Ｇ、Ｌ１５２Ｑ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、ここでの位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参照にして番号が付され、（ｉｉｉ）ポリエステル分解活性を有し、そして好ましくは（ｉｖ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性及び／又は増加した分解活性を有する、エステラーゼを提供することである。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された少なくとも１つの置換を含む。

好ましくは、前記エステラーゼは、Ｄ１２Ｆ／Ｙ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ａ１２５Ｇ、Ｌ１５２Ｑ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ、Ｔ２０７Ｌ、Ｆ２０９Ｉ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された、より好ましくはＤ１２Ｆ／Ｙ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ、Ｔ２０７Ｌ、Ｆ２０９Ｉ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された少なくとも１つの置換を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、より好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ及びＮ２１２Ｄから選択された少なくとも１つの置換を含む。

好ましい実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＴ１６８Ｑから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ及びＴ１６８Ｑから選択された少なくとも１つの置換を含む。

特に、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された少なくとも１つの置換、より好ましくはＦ２０９Ｉの置換を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼはさらに、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｓ２３、Ｔ５０、Ａ５３、Ｙ６０、Ｔ６１、Ｔ６３、Ａ６５、Ｔ８８、Ｔ８９、Ｌ９０、Ｑ９２、Ｍ１０７、Ｓ１２１、Ａ１２５、Ｌ１５２、Ｍ１２７、Ｇ１３５、Ｓ１３６、Ｐ１５１、Ｌ１５７、Ｋ１５９、Ｔ１７７、Ｔ１８３、Ｄ２０４、Ｔ２０７、Ｆ２０９、Ａ２１０、Ｎ２１２、Ｉ２１３、Ｋ２１６、Ｑ２３８、Ｄ２４６、Ｅ２５３及びＤ１７４から選択された、好ましくはＴ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１７７、Ｔ１８３、Ｄ２０４、Ｆ２０９、Ｎ２１２及びＥ２５３から選択された、少なくとも１つの置換を含む。

特に、前記エステラーゼはさらに、Ｔ１１Ｎ、Ｄ１２Ｈ、Ｓ２３Ｐ、Ｔ５０Ｅ、Ａ５３Ｌ、Ｙ６０Ｆ／Ｍ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ｔ６３Ｎ、Ａ６５Ｔ、Ｔ８８Ｓ、Ｔ８９Ｑ、Ｌ９０Ｗ／Ｆ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｍ１０７Ｌ、Ｓ１２１Ｒ、Ａ１２５Ｇ、Ｌ１５２Ｑ、Ｍ１２７Ｖ、Ｇ１３５Ａ、Ｓ１３６Ｔ、Ｐ１５１Ａ、Ｌ１５７Ｅ／Ｇ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｔ、Ｋ１５９Ｔ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｔ２０７Ｄ、Ｆ２０９Ｗ／Ｓ／Ａ、Ａ２１０Ｔ、Ｎ２１２Ｍ、Ｉ２１３Ｆ、Ｋ２１６Ｎ、Ｑ２３８Ｄ、Ｄ２４６Ｙ／Ｃ／Ｅ／Ｐ、Ｅ２５３Ｃ及びＤ１７４Ｒから選択された、好ましくはＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｆ２０９Ｗ／Ｓ／Ａ、Ｎ２１２Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１７７Ｎ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ、Ｆ２０９Ｗ、Ｎ２１２Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、少なくとも１つの置換を含む。

好ましい実施態様では、前記エステラーゼはさらに、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｆ２０９Ｗ／Ｓ／Ａ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｆ２０９Ｗ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換を含む。特に、該エステラーゼはさらに、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換を含む。

好ましい実施態様では、前記エステラーゼはさらに、少なくともＤ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃの置換の組合せを含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼはさらに、Ｄ２０４Ｋ／Ｒから選択された少なくとも１つのアミノ酸置換、及び親エステラーゼにあるような少なくともＥ２５３のアミノ酸残基を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された１つの置換、並びにＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換を含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された１つの置換、並びに、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも２つの置換、好ましくは少なくとも３つの置換を含む。

特に、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも３つの置換、好ましくは少なくとも４つの置換を含む。好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ／Ｗ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも３つの置換、好ましくは少なくとも４つの置換を含む。

特定の実施態様では、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓからなる群より選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された、１～３１個のアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。特に、該エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ及びＮ２１２Ｄから選択された、１～３個のアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＴ１６８Ｑからなる群より選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ及びＴ１６８Ｑから選択された、１つ又は２つのアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

特定の実施態様では、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓからなる群より選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ａ１２５Ｇ、Ｌ１５２Ｑ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された、１つのアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。特に、該エステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ及びＮ２１２Ｄから選択された１つの置換を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＴ１６８Ｑからなる群より選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ及びＴ１６８Ｑから選択された、１つのアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

特に、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された１つのアミノ酸置換、好ましくはＦ２０９Ｉの置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。有利には、該エステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性を示す。

本発明の目的はまた、（ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、そして（ｉｉ）Ｆ２０９、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３、Ｄ２０４、Ｎ２１２及びＥ２５３から選択された位置における少なくとも３つのアミノ酸置換を有し、ここでの位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参考にして番号が付され、（ｉｉｉ）ポリエステル分解活性を有し、そして好ましくは（ｉｖ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性及び／又は増加した分解活性を有する、エステラーゼを提供することである。好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０９、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３、Ｄ２０４、Ｎ２１２及びＥ２５３から選択された位置における少なくとも４つのアミノ酸置換を含む。

好ましくは、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ／Ｗ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｑ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された、少なくとも３つの置換、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸置換を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された１つの置換、並びに、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも２つの置換を含む。特に、該エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された１つの置換、並びに、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された、少なくとも３つの置換を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３の位置における少なくとも１つの置換の組合せ、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換の組合せ、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された組合せ、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃの置換の組合せを含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３の位置における少なくとも１つの置換の組合せ、並びに、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３及びＮ２１２から選択された位置における、好ましくはＱ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８及びＴ１８３から選択された位置における少なくとも１つの置換を含む。

好ましくは、前記エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、少なくとも１つの置換の組合せを含む。特に、該エステラーゼはさらに、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３及びＮ２１２から選択された位置における少なくとも１つの置換、好ましくはＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ及びＮ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ及びＴ１８３Ｅから選択された、さらにより好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ及びＴ１８３Ｅから選択された少なくとも１つの置換を含む。１つの実施態様では、該エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃの置換の組合せ、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された置換の組合せを有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、アミノ酸配列を含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｎ２１２、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｇ１３５＋Ｔ１６８、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｇ１３５＋Ｔ１６８＋Ｔ１８３、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｔ１８３又はＦ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｔ１６８＋Ｔ１８３からなる群より選択された位置における少なくとも１つの置換の組合せを含む。好ましくは、該エステラーゼは、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ／Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ、Ｆ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｔ１８３Ｅ及びＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、少なくとも１つの置換の組合せを含む。有利には、このエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、増加した熱安定性及び増加したポリエステル分解活性の両方を示す。好ましくは、該エステラーゼは、５０℃～６５℃、より好ましくは５０℃及び／又は６５℃の温度で、配列番号１のエステラーゼと比較して、増加した熱安定性及び増加したポリエステル分解活性の両方を示す。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２の位置における少なくとも１つの置換の組合せ、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、より好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇから選択された１つの置換の組合せを含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼはさらに、Ｌ１４、Ｇ６２、Ｒ７３、Ｄ８５、Ｔ８６、Ａ１７９、Ａ２０６、Ｎ２１５、Ｉ２１７、Ｇ２１９、Ｆ２３９、Ｒ２４５、Ｆ２４９、Ｅ２５１、Ｖ２５２及びＤ１７４から選択された位置における少なくとも１つの置換を含み得る。好ましくは、該置換は、Ｌ１４Ｄ／Ｅ、Ｇ６２Ｄ／Ｓ、Ｒ７３Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｍ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｄ８５Ａ／Ｅ／Ｆ、Ｔ８６Ｅ／Ｓ、Ａ１７９Ｃ、Ａ２０６Ｄ、Ｎ２１５Ｃ／Ｄ／Ｅ、Ｉ２１７Ｑ、Ｇ２１９Ａ／Ｅ、Ｆ２３９Ｅ、Ｒ２４５Ｃ／Ｅ、Ｆ２４９Ｔ、Ｅ２５１Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｖ２５２Ｔから選択される。

特定の実施態様では、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された３～１１個の置換を有する、好ましくは、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｑ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された３～７個の置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。

特定の実施態様では、前記エステラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ／Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ、Ｆ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｔ１８３Ｅ及びＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、１つの置換の組合せを有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。有利には、このエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、増加した熱安定性及び増加した分解活性の両方を示す。好ましくは、該エステラーゼは、５０℃～６５℃、より好ましくは５０℃及び／又は６５℃の温度で、配列番号１のエステラーゼと比較して、増加した熱安定性及び増加したポリエステル分解活性の両方を示す。

別の実施態様では、前記エステラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、１つの置換の組合せを有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、親エステラーゼにあるような、Ｄ１７６、Ｈ２０８、Ｓ１３０、Ｍ１３１、Ｃ２４１、Ｃ２５９、Ｇ５９、Ｈ１２９、Ｇ１３２、Ｗ１５５、Ｉ１７１、Ｉ１７８、Ｐ２１４、Ｄ１７４から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、すなわち、本発明のエステラーゼは、これらの位置の１つ、２つ、又は全てにおいて修飾されていない。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、該エステラーゼの触媒部位を形成している少なくともアミノ酸Ｄ１７６、Ｈ２０８及びＳ１３０、並びに／あるいは、親エステラーゼにあるような、ジスルフィド結合を形成しているアミノ酸Ｃ２４１及びＣ２５９を含む。好ましくは、該エステラーゼは、親エステラーゼにあるような、Ｄ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０、Ｃ２４１＋Ｃ２５９及びＤ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０＋Ｃ２４１＋Ｃ２５９から選択された少なくとも１つの組合せを含む。１つの実施態様では、該エステラーゼは、親エステラーゼにあるような、Ｄ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０＋Ｃ２４１＋Ｃ２５９＋Ｍ１３１＋Ｄ１７４の組合せを含む。

あるいは又はそれに加えて、本発明のエステラーゼは、親エステラーゼにあるような、Ｇ５９、Ｈ１２９、Ｇ１３２、Ｗ１５５、Ｉ１７１、Ｉ１７８及びＰ２１４から選択された、少なくとも１つのアミノ酸を含む。好ましくは、該エステラーゼは、親エステラーゼにあるような、Ｉ１７１及びＩ１７８から選択された少なくとも１つのアミノ酸、より好ましくは親エステラーゼにあるようなＩ１７１＋Ｉ１７８の組合せを含む。１つの実施態様では、該エステラーゼは、親エステラーゼにあるような、Ｉ１７１＋Ｉ１７８＋Ｇ５９＋Ｈ１２９＋Ｇ１３２＋Ｗ１５５＋Ｐ２１４の組合せを含む。

１つの実施態様では、前記エステラーゼは、親エステラーゼにあるようなＤ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０＋Ｃ２４１＋Ｃ２５９＋Ｉ１７１＋Ｉ１７８の組合せを含む。

変異体のポリエステル分解活性
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素は、クチナーゼ活性を示す。

特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、ポリエステル分解活性、好ましくはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）分解活性、及び／又はポリブチレンアジペートテレフタラート（ＰＢＡＴ）分解活性、及び／又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）分解活性、及び／又はポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）活性、より好ましくはポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）分解活性、及び／又はポリブチレンアジペートテレフタラート（ＰＢＡＴ）分解活性を有する。さらにより好ましくは、本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）分解活性を有する。

有利には、本発明のエステラーゼは、２０℃～９０℃、好ましくは４０℃～９０℃、より好ましくは５０℃～９０℃、さらにより好ましくは６０℃～９０℃の少なくとも温度範囲で、ポリエステル分解活性を示す。特に、本発明のエステラーゼは、６５℃～９０℃、６５℃～８５℃、６５℃～８０℃、７０℃～９０℃、７０℃～８５℃、７０℃～８０℃の温度範囲で、ポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、該エステラーゼは、６０℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、該エステラーゼは、７０℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、ポリエステル分解活性は、５５℃～７０℃の温度で依然として測定可能である。上記で見られるように、温度は、＋／－１℃で考えられなければならない。

特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、所与の温度で、より特定すると４０℃～９０℃、より好ましくは５０℃～９０℃の温度で、増加したポリエステル分解活性を有する。

特定の実施態様では、前記エステラーゼは、６５℃で、配列番号１のエステラーゼのポリエステル分解活性よりも少なくとも５％高い、好ましくは少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％又はそれ以上高いポリエステル分解活性を有する。

特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、少なくとも５～９のｐＨ範囲、好ましくは６～９のｐＨ範囲、より好ましくは６．５～９のｐＨ範囲、さらにより好ましくは６．５～８のｐＨ範囲で測定可能なエステラーゼ活性を示す。

核酸、発現カセット、ベクター、宿主細胞
本発明のさらなる目的は、上記に定義されているようなエステラーゼをコードしている核酸を提供することである。

本明細書において使用する「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列を指す。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はガイドＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はその混合物であり得る。それは、一本鎖形又は二本鎖の形又はその混合物であり得る。それは、組換え、人工、及び／又は合成起源であり得、そしてそれは、例えば修飾された結合、修飾されたプリン塩基若しくはピリミジン塩基、又は修飾された糖を含む、修飾されたヌクレオチドを含み得る。本発明の核酸は、単離された形態であっても又は精製された形態であってもよく、当技術分野においてそれ自体公知である技術、例えばｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、増幅、酵素合成、又は組換え技術などによって作製、単離及び／又は操作され得る。核酸はまた、インビトロで、例えばBelousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444に記載のような、周知の化学合成技術によって合成されてもよい。

本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、上記に定義されているようなエステラーゼをコードしている核酸にハイブリダイズする核酸を包含する。好ましくは、このようなストリンジェントな条件は、約４２℃で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションフィルターの約２．５時間のインキュベーション、それに続いて、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６５℃でのフィルターの４回の１５分間の洗浄を含む。使用されるプロトコールは、Sambrook et al. (分子クローニング：実験マニュアル、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバーN.Y. (1988)）及びAusubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989））のような参考文献に記載されている。

本発明はまた、本発明のエステラーゼをコードしている核酸も包含し、ここでの該核酸の配列又は少なくとも該配列の一部は、最適化されたコドン使用頻度を使用して工学操作されている。

あるいは、本発明に記載の核酸は、本発明に記載のエステラーゼ配列から推論し得、コドン使用頻度は、核酸が転写されるであろう宿主細胞に応じて適応させ得る。これらの工程は、当業者には周知である方法に従って実施され得、その中のいくつかは、参考マニュアルSambrook et al. (Sambrook et al., 2001）に記載されている。

本発明の核酸はさらに、選択された宿主細胞又は宿主細胞系におけるポリペプチドの発現を引き起こすか又は調節するために使用することのできる、調節領域、すなわち、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、終結因子、シグナルペプチドなどの追加のヌクレオチド配列を含み得る。

本発明はさらに、適切な宿主細胞における該核酸の発現を指令する、１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、本発明に記載の核酸を含んでいる発現カセットに関する。

本明細書において使用する「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関与する任意の工程を指す。

「発現カセット」という用語は、コード領域、すなわち、本発明の核酸と、調節領域を含んでいる、すなわち、作動可能に連結された１つ以上の制御配列を含んでいる、核酸構築物を示す。

典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び／又は転写終結因子などの制御配列に作動可能に連結された、本発明に記載の核酸を含む又はからなる。制御配列は、宿主細胞によって認識されるプロモーター、又は本発明のエステラーゼをコードしている核酸の発現のためのインビトロでの発現系を含み得る。該プロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含む。突然変異した、切断短縮された、及びハイブリッドのプロモーターを含む、該プロモーターは、宿主細胞内で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得、宿主細胞にとって同種であるか又は異種であるかのいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードしている遺伝子から得ることができる。制御配列はまた、転写終結因子であってもよく、これは宿主細胞によって認識されることにより転写を終結させる。終結因子は、該エステラーゼをコードしている核酸の３’末端に作動可能に連結されている。宿主細胞内で機能する任意の終結因子を、本発明に使用し得る。典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び転写終結因子に作動可能に連結された、本発明に記載の核酸を含む又はからなる。

本発明はまた、上記に定義されているような核酸又は発現カセットを含んでいるベクターにも関する。

本明細書において使用する「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、組換え遺伝子材料を宿主細胞に導入するためのビヒクルとして使用される、本発明の発現カセットを含む、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を指す。主な種類のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド、及び人工染色体である。ベクターそれ自体が一般的に、挿入断片（異種核酸配列、導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」としての役割を果たすより大きな配列からなる、ＤＮＡ配列である。遺伝子情報を宿主に導入するベクターの目的は典型的には、挿入断片を単離、複製、又は標的細胞において発現することである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞内での異種配列の発現に特に適応され、一般的にはポリペプチドをコードしている異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般的には、発現ベクター内に存在する調節配列としては、転写プロモーター、リボソーム結合部位、終結因子、及び場合により存在するオペレータが挙げられる。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択マーカー、少数の有用な制限酵素部位、及び高いコピー数の能力も含む。発現ベクターの例は、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミド及びウイルスである。様々な宿主において適切なレベルのポリペプチドの発現をもたらす発現ベクターは、当技術分野において周知である。ベクターの選択は典型的には、ベクターが形質導入される予定の宿主細胞とベクターの適合性に依存するだろう。好ましくは、発現ベクターは、鎖状又は環状二本鎖ＤＮＡ分子である。

本発明の別の目的は、上記のような核酸、発現カセット、又はベクターを含んでいる、宿主細胞を提供することである。したがって、本発明は、宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、又は形質導入するための、本発明に記載の核酸、発現カセット、又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入されなければならない宿主細胞と該ベクターとの適合性に依存するだろう。

本発明によると、宿主細胞は、一過性に又は安定的に、形質転換、トランスフェクト、又は形質導入され得る。本発明の発現カセット又はベクターは宿主細胞にに導入されることにより、該カセット又はベクターが、染色体への組み込み体として、又は自律複製する染色体外ベクターとして維持される。「宿主細胞」という用語はまた、複製中に起こる突然変異に因り、親宿主細胞と同一ではない、親宿主細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は、本発明の変異体の産生において有用な任意の細胞、例えば原核細胞又は真核細胞であり得る。原核宿主細胞は、任意のグラム陽性菌又はグラム陰性菌であり得る。宿主細胞はまた、真核細胞、例えば酵母、真菌、哺乳動物、昆虫、又は植物の細胞であり得る。特定の実施態様では、宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli）、桿菌（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）、ビブリオ（Vibrio）、又はヤロウィア（Yarrowia）の群から選択される。

本発明に記載の核酸、発現カセット、又は発現ベクターは、電気穿孔法、コンジュゲーション、形質導入、コンピテント細胞の形質転換、プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、微粒子銃「遺伝子銃」による形質転換、ＰＥＧにより媒介される形質転換、脂質により支持される形質転換若しくはトランスフェクション、化学的に媒介されるトランスフェクション、酢酸リチウムにより媒介される形質転換、リポソームにより媒介される形質転換などの、当業者によって知られている任意の方法によって宿主細胞に導入され得る。

場合により、１つを超えるコピー数の本発明の核酸、カセット、又はベクターを宿主細胞に挿入することにより、変異体の産生を増加させてもよい。

特定の実施態様では、宿主細胞は、組換え微生物である。本発明は実際に、ポリエステル含有物質の分解能の改善された微生物の工学操作を可能とする。例えば、本発明の配列を使用することにより、ポリエステルを分解することができることがすでに知られている真菌又は細菌の野生株を補完して、該株の能力を改善及び／又は高め得る。

エステラーゼの生成
本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼをコードしている核酸を発現させる工程及び場合により該エステラーゼを回収する工程を含む、本発明のエステラーゼを生成する方法を提供することである。

特に、本発明は、（ａ）本発明の核酸、カセット又はベクターを、インビトロでの発現系に接触させる工程；及び（ｂ）生成されたエステラーゼを回収する工程を含む。本発明のエステラーゼをインビトロで生成する方法に関する。インビトロでの発現系は、当業者には周知であり、市販されている。

好ましくは、生成法は、
（ａ）本発明のエステラーゼをコードしている核酸を含む宿主細胞を、核酸を発現するに適した条件下で培養する工程；及び場合により
（ｂ）細胞培養液から該エステラーゼを回収する工程
を含む。

有利には、宿主細胞は、組換え桿菌、組換えエシェリヒア・コリ、組換えアスペルギルス、組換えトリコデルマ、組換えストレプトマイセス、組換えサッカロマイセス、組換えピキア、組換えビブリオ、又は組換えヤロウィアである。

宿主細胞は、ポリペプチドの生成に適した栄養培地中で、当技術分野において公知の方法を使用して培養される。例えば該細胞は、振盪フラスコ培養、又は小規模若しくは大規模の発酵（連続、バッチ、フェッドバッチ、又は固体状態の発酵を含む）によって、適切な培地中、酵素が発現及び／又は単離されることを可能とする条件下で実施された、実験室での又は工業用の発酵槽中で培養され得る。培養は、業者の、又は（例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログ内に）公開されている組成に従って調製された適切な栄養培地中で行なわれる。

前記エステラーゼが、栄養培地に分泌される場合、該エステラーゼは、培養上清から直接回収することができる。逆に、該エステラーゼは、細胞溶解液から又は透過処理後に回収されてもよい。該エステラーゼは、当技術分野において公知である任意の方法を使用して回収され得る。例えば、該エステラーゼは、栄養培地から、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈降を含むがこれらに限定されない、従来の手順によって回収されてもよい。場合により、該エステラーゼは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、クロマト分画、及びサイズ排除クロマトグラフィー）、電気泳動の手技（例えば分取等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば硫酸アンモニウム沈降法）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は抽出を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知である多種多様な手順によって、部分的に又は完全に精製され得る。

前記エステラーゼは、そのままで、精製形で、単独で又は追加の酵素と組み合わせてのいずれかで使用されることにより、ポリエステル（群）及び／又はポリエステル含有物質、例えばポリエステル含有プラスチック製品の分解及び／又はリサイクルに関与する酵素反応を触媒し得る。該エステラーゼは、可溶形であっても、又は固体相上に存在してもよい。特に、それは、細胞膜若しくは脂質小胞に、又は合成支持体、例えばガラス、プラスチック、ポリマー、フィルター、膜に、例えばビーズ、カラム、プレートなどの形態で結合していてもよい。

組成物
本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼ、又は宿主細胞、又はその抽出物を含んでいる、組成物を提供することである。本発明の状況では、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞を含んでいる、任意の種類の組成物を包含する。

本発明の組成物は、組成物の全重量に基づいて、０．１重量％～９９．９重量％、好ましくは０．１重量％～５０重量％、より好ましくは０．１重量％～３０重量％、さらにより好ましくは０．１重量％～５重量％のエステラーゼを含み得る。あるいは、該組成物は、５～１０重量％の本発明のエステラーゼを含み得る。

前記組成物は、液体であっても乾燥していてもよく、例えば、粉末の形態であり得る。いくつかの実施態様では、該組成物は凍結乾燥物である。

前記組成物はさらに、賦形剤及び／又は試薬などを含み得る。適切な賦形剤は、生化学で一般的に使用される緩衝液、ｐＨ調整剤、保存剤、例えば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム若しくはアスコルビン酸ナトリウム、防腐剤、保護剤、又は安定化剤、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、塩、糖、例えばソルビトール、トレハロース、若しくはラクトース、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール、捕捉剤、例えばＥＤＴＡ、還元剤、アミノ酸、担体、例えば溶媒若しくは水溶液などを包含する。本発明の組成物は、該エステラーゼを１つ又はいくつかの賦形剤と混合することによって得られてもよい。

特定の実施態様では、前記組成物は、該組成物の全重量に基づいて、０．１重量％～９９．９重量％、好ましくは５０重量％～９９．９重量％、より好ましくは７０重量％～９９．９重量％、さらにより好ましくは９５重量％～９９．９重量％の賦形剤（群）を含む。あるいは、該組成物は、９０重量％～９５重量％の賦形剤（群）を含み得る。

特定の実施態様では、前記組成物はさらに、酵素活性を示す追加のポリペプチド（群）を含み得る。本発明のエステラーゼの量は、例えば分解しようとするポリエステルの性質及び／又は該組成物に含有されている追加の酵素／ポリペプチドに応じて、当業者によって容易に適応されるだろう。

特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、１つ又はいくつかの賦形剤、特にポリペプチドを安定化又は分解から保護することのできる賦形剤と一緒に、水性媒体中で可溶化される。例えば、本発明のエステラーゼは、水中に、最終的には追加の成分、例えばグリセロール、ソルビトール、デキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール、塩などと共に可溶化されてもよい。その後、結果として得られる混合物を乾燥させることにより、粉末を得てもよい。このような混合物を乾燥させるための方法は、当業者には周知であり、これには、凍結乾燥、フリーズドライ、噴霧乾燥、超臨界乾燥、ダウンドラフト蒸発、薄層蒸発、遠心分離による蒸発、コンベア乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、又はその任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。

特定の実施態様では、前記組成物は、粉末形であり、これはエステラーゼ及び安定化量／可溶化量のグリセロール、ソルビトール又はデキストリン、例えばマルトデキストリン及び／又はシクロデキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール、及び／又は塩を含む。

特定の実施態様では、本発明の組成物は、本発明のエステラーゼを発現している少なくとも１つの組換え細胞又はその抽出物を含む。「細胞の抽出物」は、実質的に生細胞を含まない、細胞から得られた任意の画分、例えば細胞上清、細胞片、細胞壁、ＤＮＡ抽出物、酵素、若しくは酵素調製物、又は、化学的、物理的及び／若しくは酵素的な処理によって細胞から導かれた任意の調製物を示す。好ましい抽出物は、酵素的に活性な抽出物である。本発明の組成物は、１つ又はいくつかの本発明の組換え細胞又はその抽出物、及び場合により１つ又はいくつかの追加の細胞を含み得る。

１つの実施態様では、前記組成物は、本発明のエステラーゼを発現及び分泌している、組換え微生物の培養培地からなるか又は含む。特定の実施態様では、該組成物は、凍結乾燥されたこのような培養培地を含む。

エステラーゼの使用
本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼを使用して、好気性又は嫌気性条件下で、ポリエステル又はポリエステル含有物質を分解及び／又はリサイクルするための方法を提供することである。本発明のエステラーゼは、ＰＥＴ及びＰＥＧ含有物質を分解するのに特に有用である。

それ故、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物を、ポリエステルの酵素的分解のために使用することである。

特定の実施態様では、前記エステラーゼによって標的化されるポリエステルは、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルバイドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）、及びこれらの物質のブレンド／混合物、好ましくはポリエチレンテレフタラートから選択される。

好ましい実施態様では、前記ポリエステルはＰＥＴであり、少なくともモノマー（例えばモノエチレングリコール又はテレフタル酸）、及び／又はオリゴマー（例えばメチル－２－ヒドロキシテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタラート（ＨＥＭＴ）及びジメチルテレフタラート（ＤＭＴ））が回収される。

本発明の目的はまた、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物をポリエステル含有物質の少なくとも１つのポリエステルの酵素的分解のために使用することである。

本発明の別の目的は、ポリエステル含有物質の少なくとも１つのポリエステルを分解するための方法を提供することであり、ここでのポリエステル含有物質を、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又はその抽出物又は組成物と接触させ、それにより、ポリエステル含有物質の少なくとも１つのポリエステルを分解する。

有利には、ポリエステル（群）は、モノマー及び／又はオリゴマーへと脱重合される。

特に、本発明は、ＰＥＴ含有物質のＰＥＴを分解するための方法を提供し、ここでのＰＥＴ含有物質を、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又は組成物と接触させ、これによりＰＥＴを分解する。

１つの実施態様では、少なくとも１つのポリエステルが、再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーへと分解され、これは有利には回収されることにより、再利用され得る。回収されたモノマー／オリゴマーは、リサイクル（例えば再重合可能なポリエステル）又はメタン化のために使用され得る。特定の実施態様では、少なくとも１つのポリエステルはＰＥＴであり、モノエチレングリコール、テレフタル酸、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタラート（ＨＥＭＴ）及び／又はジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）が回収される。

１つの実施態様では、ポリエステル含有物質のポリエステル（群）は完全に分解される。

ポリエステル含有物質を分解するのに必要とされる時間は、ポリエステル含有物質それ自体（すなわち、ポリエステル含有物質の性質及び入手原、その組成、形状など）、使用されるエステラーゼの種類及び量、並びに、様々なプロセスパラメーター（すなわち、温度、ｐＨ、追加の物質など）に応じて変更され得る。当業者は、ポリエステル含有物質及び想定される分解時間にプロセスパラメーターを容易に適応させ得る。

有利には、分解プロセスは、２０℃～９０℃、好ましくは４０℃～９０℃、より好ましくは５０℃～７０℃の温度で実施される。特定の実施態様では、分解プロセスは、６０℃で実施される。別の特定の実施態様では、分解プロセスは６５℃で実施される。別の特定の実施態様では、分解プロセスは７０℃で実施される。より一般的には、温度は、エステラーゼが不活化される温度（すなわち、その至適温度におけるその活性と比較して活性の８０％超を失う温度）及び／又は組換え微生物がもはやエステラーゼを合成しない温度に相当する、不活化温度より低く維持される。特に、温度は、標的化ポリエステルのガラス転移温度（Ｔｇ）より低く維持される。

有利には、プロセスは、連続フロープロセスで、該エステラーゼが数回使用及び／又はリサイクルできる温度で実施される。

有利には、分解プロセスは、ｐＨ５～９、好ましくはｐＨ範囲６～９、より好ましくはｐＨ範囲６．５～９、さらにより好ましくはｐＨ範囲６．５～８で実施される。

特定の実施態様では、ポリエステル含有物質は、エステラーゼと接触させる前に、その構造を物理的に変化させ、ポリエステルとエステラーゼとの間の接触表面を増加させるために、前処理されてもよい。

本発明の別の目的は、ポリエステル含有物質を、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物に曝す工程、並びに場合によりモノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程を含む、ポリエステル含有物質からモノマー及び／又はオリゴマーを生成する方法を提供することである。

脱重合から生じるモノマー及び／又はオリゴマーは、順次又は連続的に回収され得る。一種類のモノマー及び／又はオリゴマーあるいはいくつかの異なる種類のモノマー及び／又はオリゴマーが、ポリエステル含有出発物質に応じて、回収され得る。

本発明の方法は、モノエチレングリコール及びテレフタル酸から選択されたモノマー、並びに／あるいは、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタラート（ＨＥＭＴ）及びジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）から選択されたオリゴマーを、ＰＥＴ及び／又はＰＥＴ含有プラスチック製品から生成するのに特に有用である。

回収されたモノマー及び／又はオリゴマーは、全ての適した精製法を使用してさらに精製され得、そして再重合可能な形態で調整され得る。

回収された再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーは、例えば、ポリエステルを合成するために再使用され得る。有利には、同じ性質のポリエステルを再重合させる。しかしながら、回収されたモノマー及び／又はオリゴマーを、他のモノマー及び／又はオリゴマーと混合して、例えば、新規コポリマーを合成することが可能である。あるいは、回収されたモノマーは、関心対象の新規化合物を生成するための、化学物質中間体として使用されてもよい。

本発明はまた、ポリエステル含有物質を本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物に曝す工程を含む、ポリエステル含有物質の表面加水分解又は表面官能基化の方法に関する。本発明の方法は、ポリエステル物質の親水性又は吸水性を高めるのに特に有用である。このような高まった親水性は、織物の生産、電子工学、及び生物医学の用途に特に関心が高くあり得る。

本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は該エステラーゼを発現及び分泌している組換え微生物が含まれている、ポリエステル含有物質を提供することである。一例として、本発明のエステラーゼを含む、このようなポリエステル含有物質を調製するためのプロセスは、特許出願第ＷＯ２０１３／０９３３５５号、第ＷＯ２０１６／１９８６５０号、第ＷＯ２０１６／１９８６５２号、第ＷＯ２０１９／０４３１４５号及び第ＷＯ２０１９／０４３１３４号に開示されている。

したがって、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物若しくは抽出物と、少なくともＰＥＴとを含有している、ポリエステル含有物質を提供することである。１つの実施態様によると、本発明は、ＰＥＴと、ＰＥＴ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含んでいる、プラスチック製品を提供する。

したがって、本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物若しくは抽出物と少なくともＰＢＡＴとを含有している、ポリエステル含有物質を提供することである。１つの実施態様によると、本発明は、ＰＢＡＴと、ＰＢＡＴ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含んでいる、プラスチック製品を提供する。

したがって、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物若しくは抽出物と少なくともＰＢＳとを含有している、ポリエステル含有物質を提供することである。１つの実施態様によると、本発明は、ＰＢＳと、ＰＢＳ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含んでいる、プラスチック製品を提供する。

したがって、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物若しくは抽出物と少なくともＰＣＬとを含有している、ポリエステル含有物質を提供することである。１つの実施態様によると、本発明は、ＰＣＬと、ＰＣＬ分解活性を有する本発明のエステラーゼとを含んでいる、プラスチック製品を提供する。

古典的には、本発明のエステラーゼは、洗剤、食品、動物の食餌、製紙、織物及び医薬品の用途に使用され得る。より特定すると、本発明のエステラーゼは、洗剤組成物の一成分として使用され得る。洗剤組成物としては、手洗い又は洗濯機洗い用の洗剤組成物、例えばシミの付いた生地の前処理に適した洗濯用添加組成物、及びリンスの添加された生地柔軟組成物、一般家庭用の硬質表面の清浄作業に使用するための洗剤組成物、手洗い又は食器洗浄機作業用の洗剤組成物が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、洗剤の添加剤として使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明のエステラーゼを含んでいる洗剤組成物を提供する。特に、本発明のエステラーゼは、織物の洗濯中の毛玉及び灰色化の影響を減らすための、洗剤添加剤として使用されてもよい。

本発明はまた、動物の食餌に本発明のエステラーゼを使用するための方法、並びに、本発明のエステラーゼを含んでいるフィード組成物及びフィード添加剤に関する。「フィード」及び「フィード組成物」という用語は、動物による摂取に適しているか又は目的としている、任意の化合物、調製物、混合物、又は組成物を指す。別の特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、タンパク質を加水分解するために、及びペプチドを含んでいる加水分解物を生成するために使用される。このような加水分解物は、フィード組成物又はフィード添加物として使用され得る。

本発明のさらなる目的は、製紙産業で本発明のエステラーゼを使用するための方法を提供することである。より特定すると、本発明のエステラーゼは、製紙用パルプ及び抄紙機の水パイプラインからの粘着物を除去するために使用され得る。

実施例
実施例１－エステラーゼの構築、発現、及び精製
構築
本発明に記載のエステラーゼは、プラスミド構築物を使用して作製された。このプラスミドは、エシェリヒア・コリでの発現のために最適化された、配列番号１のエステラーゼをコードしている遺伝子を、ｐＥＴ－２６（＋）発現ベクター（メルク・ミリポア社、モルスアイム、フランス）のＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素部位の間にクローニングする工程からなる。ＰｅｌＢリーダー配列をコードしているヌクレオチド配列は、配列番号１とＮｄｅＩ制限酵素部位の間に付加された。発現された融合タンパク質は、細菌の周辺質に指向され、ここでＰｅｌＢリーダー配列がシグナルペプチダーゼによって除去されて、配列番号１と同一であるがＣ末端のアミノ酸の伸長が付加された、機能的タンパク質が生じる。２つの部位特異的な突然変異誘発キットが、業者の推奨に従って使用され、これによりエステラーゼの変異体が作製された：アジレント社製のQuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directed（サンタクララ、カリフォルニア州、米国）。

エステラーゼの発現及び精製
Ｓｔｅｌｌａｒ株（商標）（クロンテック社、カリフォルニア州、米国）及びＥ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ニューイングランドバイオラボラトリーズ社、エヴリー、フランス）が、５０mLのＬＢ－ミラー培地又はＺＹＭ自己誘導性培地中でのクローニング及び組換え発現を実施するために成功裏に使用された（Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234）。ＬＢ－ミラー培地中での誘導が、１６℃で、０．５mMのイソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、ユーロメディックス社、ゾウフェルヴァイヤースハイム、フランス）を用いて実施された。培養は、アバンティ社のＪ－２６ＸＰ遠心機（ベックマンコールター社、ブレア、米国）での遠心分離（８０００rpm、１０℃で２０分間）によって停止された。細胞を、タロン緩衝液 ２０mL（トリス－ＨＣｌ、３００mMのＮａＣｌ、ｐＨ８）に懸濁した。その後、細胞懸濁液を、２分間、３０％の振幅（２秒間オン、１秒間オフのサイクル）を用いて、ＦＢ７０５超音波処理機（フィッシャーブランド、イルキルシュ、フランス）によって超音波処理した。その後、遠心分離工程を行なった：エッペンドルフ遠心管中で１０℃で１００００ｇで３０分間。可溶性画分を収集し、アフィニティクロマトグラフィーにかけた。この精製工程は、タロン（登録商標）金属アフィニティ樹脂（クロンテック社、カリフォルニア州、米国）を用いて完了した。タンパク質の溶出を、イミダゾールの補充されたタロン緩衝液の工程を用いて実施した。精製されたタンパク質を、タロン緩衝液に対して透析し、その後、製造業者の説明書（ライフサイエンスバイオラッド社、フランス）に従ってバイオラッド社のタンパク質アッセイを使用して定量し、＋４℃で保存した。

実施例２－エステラーゼの分解活性の評価
エステラーゼの分解活性を決定し、配列番号１のエステラーゼの活性と比較した。

比活性を判定するために複数の方法が使用された：
ＰＥＴの加水分解に基づいた比活性
（２）固体形のポリエステルの分解に基づいた活性
（３）１００mLを上回るリアクター中でのＰＥＴの加水分解に基づいた活性。

２．１．ＰＥＴ加水分解に基づいた比活性
粉末形の無定形ＰＥＴ １００mg（２０％未満の結晶化度に到達するために第ＷＯ２０１７／１９８７８６号に従って調製）を秤量し、１００mLのガラス瓶に入れた。配列番号１のエステラーゼ（レファレンス対照として）を含んでいるエステラーゼ調製物、又はタロン緩衝液（２０mMのトリス－ＨＣｌ、０．３mMのＮａＣｌ、ｐＨ８）中で０．６９μＭで調製された本発明のエステラーゼ １mLを、ガラス瓶に入れた。最後に、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）４９mLを加えた。

脱重合は、各ガラス瓶を４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃で、１５０rpmで、ＭａｘＱ４４５０インキュベーター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）中でインキュベートすることによって開始された。

脱重合反応の初期速度（１時間あたりに生じた等価なＴＡのmg）を、最初の２４時間中の様々な時点で実施されたサンプリングによって決定し、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）によって分析した。必要であれば、試料を、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）で希釈した。その後、メタノール １５０μL及び６Ｎの塩酸 ６．５μLを、試料又は希釈液 １５０μLに加えた。混合し、０．４５μmのシリンジフィルター上でろ過した後、試料を、ＵＨＰＬＣにのせて、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの遊離をモニタリングした。使用されたクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃で温度自動調節されたカラムオーブン、及び２４０nmにおける紫外線検出器を含む、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＵＨＰＬＣシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）であった。使用されたカラムは、Discovery（登録商標）ＨＳ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６mm、５μm、プレカラムを具備、スペルコ社、ベルフォント、米国）であった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴは、１mMのＨ_２ＳＯ_４中メタノール（３０％から９０％）の勾配を使用して、１mL/分で分離した。注入量は、試料 ２０μLであった。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴは、試料と同じ条件で、市販のＴＡ及びＢＨＥＴ並びに社内合成されたＭＨＥＴから準備された標準曲線に従って測定された。ＰＥＴ加水分解の比活性（酵素１mgあたり１時間あたりの等価なＴＡのmg）は、加水分解反応曲線の直線部分において決定され、このような曲線は、最初の２７時間中の様々な時点で実施されたサンプリングによって設定された。等価なＴＡは、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴとＢＨＥＴに含有されるＴＡの合計に相当する。前記の等価なＴＡの測定はまた、所与の時点におけるＰＥＴ脱重合アッセイの収量を反映するために使用され得る。

２．２．固体形のポリエステルの分解に基づいた活性
酵素調製物 ２０μLを、ＰＥＴを含有している寒天プレート中に作成されたウェルに沈着させた。寒天プレートの調製は、ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）中にＰＥＴ ５００mgを可溶化し、この培地を、水溶液 ２５０mLに注ぐことによって実現した。５２℃で１４０ミリバール下でＨＦＩＰを蒸発させた後、溶液を、３％寒天を含有している０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）とｖ／ｖで混合した。約３０mLの混合物を使用して、各プレートを調製し、４℃で保存した。

野生型エステラーゼ及び変異体によるポリエステルの分解に因り形成されたハローの直径又は表面積を測定し、２～２４時間後に、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃で比較した。

２．３．リアクター中のＰＥＴ加水分解に基づいた活性
１００mMのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）８０mL中で調製された０．６９μmolから２．０７μmolの精製エステラーゼを、５００mLのMinibioバイオリアクター（アプリコン・バイオテクノロジー社、デルフト、オランダ）中の無定形ＰＥＴ（２０％未満の結晶化度に到達するように第ＷＯ２０１７／１９８７８６号に従って調製）２０ｇと混合した。４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃での温度調節を、水浴への浸漬によって行ない、１つのマリンインペラーを使用して、２５０rpmの一定の攪拌を維持した。ＰＥＴ脱重合アッセイのｐＨは、６ＮのＮａＯＨによってｐＨ８に調節され、my-Controlバイオコントローラシステム（アプリコン・バイオテクノロジー社、デルフト、オランダ）によって確認された。塩基の消費量は、アッセイ中に記録され、ＰＥＴ脱重合アッセイの特徴付けのために使用され得る。

ＰＥＴ脱重合アッセイの最終収量は、残留ＰＥＴ重量の決定によって、又は生成した等価なＴＡの決定によって、又は塩基量の消費量を通してのいずれかによって決定された。残留ＰＥＴの重量の決定は、反応終了時における１２～１５μmのグレード１１の無灰ろ紙（Dutscher SAS社、ブリュマト、フランス）を通した反応容量のろ過、及びこのような残余分の乾燥、その後にそれを秤量することによって判定された。生成された等価なＴＡの決定は、２．１に記載されたＵＨＰＬＣ法を使用して実現し、加水分解率は、所与の時点におけるモル濃度（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）、対、最初の試料に含有されているＴＡの総量の比に基づいて計算された。ＰＥＴの脱重合は、酸性モノマーを生成し、これは、塩基で中和されることにより、リアクター内のｐＨを維持することができるだろう。生成された等価なＴＡの決定は、対応する塩基のモル消費量を使用して計算され、加水分解の比率は、所与の時点における、等価なＴＡのモル濃度、対、最初の試料中に含有されるＴＡの総量の比に基づいて計算された。

２４時間後の本発明のエステラーゼ（変異体）によるＰＥＴの脱重合の収量は、以下の表１（５０℃における）及び表２（６５℃における）に示されている。どちらの表も、リファレンスとして使用された配列番号１のエステラーゼのＰＥＴ脱重合の収量と比較した（そのＰＥＴ脱重合の収量は、１に等しいと考える）、本発明の変異体によるＰＥＴの脱重合の収量の改善を示す。

ＰＥＴ脱重合の収量は、実施例２．１．に見られるように測定する。

変異体Ｖ１～Ｖ４は、表１に列挙される置換の組合せを除いて、それぞれ、配列番号１に示されるようなまさにそのアミノ酸配列を有する。

表１は、全ての変異体の５０℃におけるＰＥＴ脱重合の収量が、配列番号１のエステラーゼによるＰＥＴの脱重合の収量の少なくとも２．４倍であることを示す。

変異体Ｖ１～Ｖ３は、表２に列挙される置換の組合せを除いて、それぞれ、配列番号１に示されるようなまさにそのアミノ酸配列を有する。

表２は、全ての変異体の６５℃におけるＰＥＴ脱重合の収量が、配列番号１のエステラーゼによるＰＥＴの脱重合の収量の少なくとも１１倍であることを示す。

本発明のエステラーゼ（変異体）の特異的分解活性は、以下の表３に示されている。配列番号１のエステラーゼの特異的分解活性は、リファレンスとして使用され、１００％特異的分解活性と考える。特異的分解活性は、６５℃で実施例２．１に見られるように測定される。

変異体Ｖ１～Ｖ３は、表３に列挙される置換の組合せを除いて、それぞれ、配列番号１に示されるようなまさにそのアミノ酸配列を有する。

実施例３－本発明のエステラーゼの熱安定性の評価
本発明のエステラーゼの熱安定性を決定し、配列番号１のエステラーゼの熱安定性と比較した。

熱安定性を推定するために、様々な方法が使用された。
（１）溶液中のタンパク質の円偏光二色性；
（２）所与の温度、時間、及び緩衝液の条件でタンパク質をインキュベーションした後の、残留エステラーゼ活性；
（３）所与の温度、時間、及び緩衝液の条件でタンパク質をインキュベーションした後の、残留ポリエステルの脱重合活性；
（４）所与の温度、時間、及び緩衝液の条件でタンパク質をインキュベーションした後に、寒天プレート中に分散させた固体ポリエステル化合物（例えばＰＥＴ又はＰＢＡＴ又は類似体）を分解する能力；
（５）所与の温度、時間、緩衝液、タンパク質濃度及びポリエステル濃度の条件で、複数回のポリエステルの脱重合アッセイを実施する能力；
（６）示差走査熱量測定（ＤＳＦ）；
このような方法のプロトコールに関する詳細が以下に示されている。

３．１ 円偏光二色性
配列番号１のエステラーゼの融点（Ｔｍ）を、本発明のエステラーゼのＴｍと比較するために、円偏光二色性（ＣＤ）が、Jasco 815機器（イーストン、米国）を用いて実施された。技術的には、タンパク質試料 ４００μLが、ＣＤのために使用されたタロン緩衝液中０．５mg/mLで調製された。２８０～１９０nmでの初回の走査を行ない、タンパク質の正しい折り畳みに相当するＣＤの２つの最大強度を決定した。その後、２回目の走査を２５℃～１１０℃で、このような最大強度に相当する波長で実施して、特異的な曲線（Ｓ字状の３つのパラメーターｙ＝ａ／（１＋ｅ^（（ｘ－ｘ０）／ｂ）））を得、これをシグマプロットバージョン１１．０ソフトウェアによって分析し、Ｔｍは、ｘ＝ｘ０の場合に決定される。得られたＴｍは、所与のタンパク質の熱安定性を反映する。Ｔｍが高ければ高いほど、高温で変異体はより安定となる。

３．２ 残留エステラーゼ活性
配列番号１のエステラーゼ又は本発明のエステラーゼの４０mg/Ｌ（タロン緩衝液中）溶液１mLを、様々な温度（４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０及び９０℃）で最大１０日間インキュベートした。定期的に、試料を採取し、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で１～５００倍希釈し、パラニトロフェノール－ブチレート（ｐＮＰ－Ｂ）アッセイを実現した。試料 ２０μLを、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１７５μL、及び２－メチル－２－ブタノール中ｐＮＰ－Ｂ溶液（４０mM）５μLと混合した。酵素反応を、３０℃で、攪拌下で、１５分間の間に実施し、４０５nmにおける吸光度を、マイクロプレート吸光光度計（Versamax、モレキュラーデバイス社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）によって取得した。遊離されたパラニトロフェノールについてのｐＮＰ－Ｂ加水分解活性（１分あたりのｐＮＰＢのμmolで表現される初期速度）を、標準的な曲線を使用して、加水分解曲線の線形部分において決定した。

３．３ 残留ポリエステル脱重合活性
配列番号１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼの（タロン緩衝液中）４０mg/Ｌの溶液 １０mLを、様々な温度（４０℃、５０℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃及び９０℃）で最大３０日間インキュベートした。定期的に、試料 １mLを採取し、２５０～５００μmで微粒子化された無定形ＰＥＴ（２０％未満の結晶化度に到達するように第ＷＯ２０１７／１９８７８６号に従って調製）１００mgと０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）４９mLとを含有している瓶に移し、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃でインキュベートした。緩衝液 １５０μLを定期的にサンプリングした。必要であれば、試料を、０．１Mのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した。その後、メタノール １５０μL及び６Ｎの塩酸 ６．５μLを、試料又は希釈液 １５０μLに加えた。混合し、０．４５μmのシリンジフィルターでろ過した後、試料を、ＵＨＰＬＣにのせ、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの遊離をモニタリングした。使用されたクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃で温度自動調節されたカラムオーブン、及び２４０nmにおける紫外線検出器を含む、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＵＨＰＬＣシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）であった。使用されたカラムは、Discovery（登録商標）ＨＳ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６mm、５μm、プレカラムを具備、スペルコ社、ベルフォント、米国）であった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴは、１mMのＨ_２ＳＯ_４中メタノール（３０％から９０％）の勾配を使用して、１mL/分で分離した。注入量は、試料 ２０μLであった。ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴは、試料と同じ条件で、市販のＴＡ及びＢＨＥＴ並びに社内合成されたＭＨＥＴから準備された標準曲線に従って測定された。ＰＥＴ加水分解の活性（１分間あたりに加水分解されるＰＥＴのμmol又は１時間あたりに生成される等価なＴＡのmg）は、加水分解曲線の直線部分において決定され、このような曲線は、最初の２４時間中の様々な時点で実施されたサンプリングによって設定された。等価なＴＡは、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴとＢＨＥＴに含有されるＴＡの合計に相当する。

３．４ 固体形のポリエステルの分解
配列番号１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼの（タロン緩衝液中）４０mg/Ｌの溶液 １mLを、様々な温度（４０℃、５０℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃及び９０℃）で最大３０日間インキュベートした。定期的に、酵素調製物 ２０μLを、ＰＥＴを含有している寒天プレート中に作成されたウェルに沈着させた。ＰＥＴ含有寒天プレートの調製は、ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）中にＰＥＴ ５００mgを可溶化し、この培地を、水溶液 ２５０mLに注ぐことによって実現した。５２℃で１４０ミリバール下でＨＦＩＰを蒸発させた後、溶液を、３％寒天を含有している０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）とｖ／ｖで混合した。約３０mLの混合物を使用して、各オムニトレイを調製し、４℃で保存した。

野生型エステラーゼ及び本発明の変異体によるポリエステルの分解に因り形成されたハローの直径又は表面積を測定し、２～２４時間後に、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃で比較した。所与の温度における酵素の半減期は、ハローの直径が２倍減少するのに必要とされる時間に相当する。

３．５ 複数回のポリエステルの脱重合
エステラーゼが連続回のポリエステルの脱重合アッセイを実施する能力が、酵素リアクター中で評価された。Minibio500バイオリアクター（アプリコン・バイオテクノロジー社、デルフト、オランダ）を、無定形ＰＥＴ（２０％未満の結晶化度に到達するように第ＷＯ２０１７／１９８７８６号に従って調製）３ｇ、及びエステラーゼ ３mgを含有している１０mMのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）１００mlを用いて開始した。攪拌は、マリンインペラーを使用して、２５０rpmに設定された。バイオリアクターは、外部の水浴への浸漬によって、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃に温度調節された。ｐＨは、３ＭのＫＯＨの添加によって８に調節された。様々なパラメーター（ｐＨ、温度、攪拌、塩基の添加）を、BioXpertソフトウェアバージョン２．９５によりモニタリングした。無定形ＰＥＴ（２０％未満の結晶化度に到達するように第ＷＯ２０１７／１９８７８６号に従って調製）１．８ｇを２０時間毎に加えた。反応培地 ５００μLを定期的にサンプリングした。

ＴＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの量は、実施例２．３に記載のように、ＨＰＬＣによって決定された。ＥＧの量は、６５℃に温度自動調節された、アミネックスＨＰＸ－８７Ｋカラム（バイオラッド・ラボラトリーズ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して決定された。溶出液は、０．６mL/分で５mMのＫ_２ＨＰＯ_４であった。注入量は２０μLであった。エチレングリコールは、屈折率計を使用してモニタリングされた。

加水分解の比率は、所与の時点におけるモル濃度（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）、対、最初の試料に含有されているＴＡの総量の比に基づいて、又は、所与の時点におけるモル濃度（ＥＧ＋ＭＨＥＴ＋２×ＢＨＥＴ）、対、最初の試料に含有されているＥＧの総量の比に基づいて計算された。分解率は、１時間あたりに遊離したＴＡの総量のmg、又は１時間あたりの総量のＥＧのmgで計算される。

酵素の半減期は、５０％の分解率の低下を得るのに必要とされるインキュベーション時間として評価された。

３．６ 示差走査熱量測定（ＤＳＦ）
ＤＳＦを使用して、その融点（Ｔｍ）、すなわちタンパク質集団の半分が折り畳まれていない温度を決定することによって、野生型タンパク質（配列番号１）及びその変異体の熱安定性を評価した。タンパク質の試料は、１４μMの濃度で調製され、２０mMのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mMのＮａＣｌからなる緩衝液Ａ中に保存された。ＤＭＳＯ中のＳＹＰＲＯオレンジ色素５０００倍のストック溶液をまず、水で２５０倍まで希釈した。タンパク質の試料を、白色透明な９６ウェルのＰＣＲプレート（バイオラッド社、製造番号ＨＳＰ９６０１）上にのせ、各ウェルは、２５μlの最終容量を含有していた。各ウェル中のタンパク質及びＳＹＰＲＯオレンジ色素の最終濃度は、それぞれ５μM（０．１４mg/ml）及び１０倍であった。１ウェルあたりに載せられた容量は、以下の通りであった：緩衝液Ａ １５μL、１４μMのタンパク質溶液 ９μL、及び２５０倍のＳｙｐｒｏオレンジ希釈溶液 １μL。その後、ＰＣＲプレートを光学品質シーリングテープを用いて密封し、２０００rpmで１分間室温で遠心分離にかけた。その後、示差走査熱量測定実験を、４５０／４９０励起及び５６０／５８０発光フィルターを使用するために設定された、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステムを使用して実施した。試料を、１秒あたり０．３℃の速度で、２５～１００℃まで加熱した。０．０３秒毎に１回の蛍光測定を行なった。融点は、バイオラッドＣＦＸマネージャーソフトウェアを使用した融解曲線の一次導関数の極値（群）から決定された。

その後、配列番号１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼを、それらのＴｍ値に基づいて比較した。異なる生成法からの同じタンパク質に関する実験間の高い再現性に因り、変異体を比較するのに０．８℃のΔＴｍを有意と判断した。Ｔｍ値は、少なくとも３回の測定の平均値に相当する。

配列番号１のエステラーゼの融点は、実施例３．６に見られるように、６８．０℃＋／－０．２℃に等しいと評価されている。

本発明のエステラーゼ変異体の熱安定性は、以下の表４に示され、融点値で表現され、実施例３．６に従って評価される。配列番号１のエステラーゼと比較した融点の上昇を括弧内に示す。

変異体Ｖ１～Ｖ３は、表４に列挙される置換の組合せを除いて、それぞれ、配列番号１に示されるようなまさにそのアミノ酸配列を有する。

Claims (36)

1. （ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、そして（ｉｉ）Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、ここでの位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参考にして番号が付され、（ｉｉｉ）ポリエステル分解活性を有し、そして（ｉｖ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性及び／又は増加した分解活性を有する、エステラーゼ。
2. 前記エステラーゼが、Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ及びＮ２１２Ｄから選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１記載のエステラーゼ。
3. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＴ１６８Ｑから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ及びＴ１６８Ｑから選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１又は２記載のエステラーゼ。
4. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された少なくとも１つの置換、好ましくは少なくともＦ２０９Ｉの置換を含む、請求項１～３のいずれか一項記載のエステラーゼ。
5. 前記エステラーゼがさらに、Ｔ１１Ｎ、Ｄ１２Ｈ、Ｓ２３Ｐ、Ｔ５０Ｅ、Ａ５３Ｌ、Ｙ６０Ｆ／Ｍ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ｔ６３Ｎ、Ａ６５Ｔ、Ｔ８８Ｓ、Ｔ８９Ｑ、Ｌ９０Ｗ／Ｆ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｍ１０７Ｌ、Ｓ１２１Ｒ、Ａ１２５Ｇ、Ｌ１５２Ｑ、Ｍ１２７Ｖ、Ｇ１３５Ａ、Ｓ１３６Ｔ、Ｐ１５１Ａ、Ｌ１５７Ｅ／Ｇ／Ｎ／Ｑ／Ｗ／Ｔ、Ｋ１５９Ｔ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｔ２０７Ｄ、Ｆ２０９Ｗ／Ｓ／Ａ、Ａ２１０Ｔ、Ｎ２１２Ｍ、Ｉ２１３Ｆ、Ｋ２１６Ｎ、Ｑ２３８Ｄ、Ｄ２４６Ｙ／Ｃ／Ｅ／Ｐ、Ｅ２５３Ｃ及びＤ１７４Ｒから選択された少なくとも１つの置換、好ましくはＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｆ２０９Ｗ／Ｓ／Ａ、Ｎ２１２Ｍ及びＥ２５３Ｃ、より好ましくはＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１７７Ｎ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ、Ｆ２０９Ｗ、Ｎ２１２Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１～４のいずれか一項記載のエステラーゼ。
6. 前記エステラーゼがさらに、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｆ２０９Ｗ／Ｓ／Ａ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｆ２０９Ｗ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１～５のいずれか一項記載のエステラーゼ。
7. 前記エステラーゼがさらに、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項５又は６記載のエステラーゼ。
8. 前記エステラーゼがさらに、少なくともＤ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃの置換の組合せを含む、請求項１～７のいずれか一項記載のエステラーゼ。
9. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択された１つの置換、並びに、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された、少なくとも１つの置換、好ましくは少なくとも２つの置換、より好ましくは少なくとも３つの置換を含む、請求項１～８のいずれか一項記載のエステラーゼ。
10. （ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、そして（ｉｉ）Ｆ２０９、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３、Ｄ２０４、Ｎ２１２及びＥ２５３から選択された位置における少なくとも３つのアミノ酸置換、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも３つのアミノ酸置換を有し、ここでの位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を参考にして番号が付され、（ｉｉｉ）ポリエステル分解活性を有し、そして（ｉｖ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性及び／又は増加した分解活性を有する、エステラーゼ。
11. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ及びＤ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ、及びＥ２５３Ｃから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ、Ｑ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１８３Ｅ、Ｄ２０４Ｃ及びＥ２５３Ｃから選択された少なくとも３つのアミノ酸置換を含む、請求項１０記載のエステラーゼ。
12. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３の位置における少なくとも１つの置換の組合せ、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換の組合せ、より好ましくはＦ２０９Ｉ/Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃら選択された組合せを含む、請求項１０又は１１記載のエステラーゼ。
13. 前記エステラーゼがさらに、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３及びＮ２１２から選択された位置に、好ましくはＱ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８及びＴ１８３から選択された位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項１２記載のエステラーゼ。
14. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃから選択された少なくとも１つの置換の組合せ、並びにＴ６１Ｍ／Ｖ、Ａ６５Ｔ、Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ、Ｔ１７７Ｎ／Ｈ／Ｑ、Ｔ１８３Ｅ及びＮ２１２Ｄ／Ｑ／Ｍから選択された、好ましくはＱ９２Ｇ／Ｐ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ及びＴ１８３Ｅから選択された、より好ましくはＱ９２Ｇ、Ｇ１３５Ａ、Ｔ１６８Ｑ及びＴ１８３Ｅから選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１２及び１３記載のエステラーゼ。
15. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９、Ｔ６１、Ａ６５、Ｑ９２、Ｇ１３５、Ｔ１６８、Ｔ１７７、Ｔ１８３、Ｄ２０４、Ｎ２１２及びＥ２５３から選択された位置における少なくとも４つのアミノ酸置換を含む、請求項１～１４のいずれか一項記載のエステラーゼ。
16. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｎ２１２、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｇ１３５＋Ｔ１６８、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｇ１３５＋Ｔ１６８＋Ｔ１８３、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｔ１８３、又はＦ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２＋Ｔ１６８＋Ｔ１８３からなる群より選択された位置における少なくとも１つの置換の組合せを含む、請求項１～１５のいずれか一項記載のエステラーゼ。
17. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９＋Ｄ２０４＋Ｅ２５３＋Ｑ９２の位置における少なくとも１つの置換の組合せ、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇから選択された置換の組合せを含む、請求項１～１６のいずれか一項記載のエステラーゼ。
18. 前記エステラーゼが、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ／Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ／Ｋ／Ｒ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ、Ｆ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｔ１８３Ｅ及びＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、少なくとも１つの置換の組合せを含む、請求項１～１７のいずれか一項記載のエステラーゼ。
19. 前記エステラーゼが、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓからなる群より選択された１～３１個のアミノ酸置換、配列番号１と比較して、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ及びＮ２１２Ｄから選択された１～３つのアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のエステラーゼ。
20. 前記エステラーゼのアミノ酸配列が、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ、Ｄ１２Ｆ／Ｙ／Ｒ、Ｔ５０Ｐ、Ｔ６３Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｗ６９Ｒ、Ｔ８９Ｒ／Ｆ、Ｄ９４Ｓ、Ｓ１２１Ｗ、Ｔ１５３Ａ、Ｎ１５８Ｑ、Ｔ１６８Ｑ、Ｐ１８０Ｅ、Ａ１８２Ｒ、Ｆ１８８Ｉ／Ｙ、Ｓ１９７Ｐ、Ｅ２０２Ｍ、Ｇ２０５Ｃ／Ｋ、Ｔ２０７Ｌ、Ｐ２１１Ａ、Ｎ２１２Ｄ／Ｑ、Ｋ２１６Ｐ、Ｋ２２０Ｅ、Ｑ２３８Ｔ、Ｌ２４０Ａ、Ｐ２４２Ｋ、Ｇ２４３Ｙ、Ｐ２４４Ｎ、Ｇ２４７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｈ／Ｓ、Ｇ２５０Ｃ／Ｙ及びＰ２６０Ｓから選択された、好ましくはＴ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＮ２１２Ｄ／Ｑから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔ及びＴ１６８Ｑから選択された、さらにより好ましくはＦ２０９Ｉ及びＴ１６８Ｑから選択された、１つのアミノ酸置換を有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のエステラーゼ。
21. １つの置換が、Ｆ２０９Ｉ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｔから選択され、好ましくはＦ２０９Ｉである、請求項２０記載のエステラーゼ。
22. 前記エステラーゼのアミノ酸配列が、配列番号１と比較して、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ／Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、好ましくはＦ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｎ２１２Ｄ／Ｍ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１８３Ｅ、Ｆ２０９Ｉ／Ｗ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ／Ｐ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、より好ましくはＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ、Ｆ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｔ１８３Ｅ及びＦ２０９Ｉ＋Ｄ２０４Ｃ＋Ｅ２５３Ｃ＋Ｑ９２Ｇ＋Ｇ１３５Ａ＋Ｔ１６８Ｑ＋Ｔ１８３Ｅから選択された、置換の組合せを有する、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１８記載のエステラーゼ。
23. 前記エステラーゼが、親エステラーゼにあるＤ１７６、Ｈ２０８、Ｓ１３０、Ｍ１３１、Ｃ２４１、Ｃ２５９、Ｇ５９、Ｈ１２９、Ｇ１３２、Ｗ１５５、Ｉ１７１、Ｉ１７８、Ｐ２１４、Ｄ１７４から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、好ましくは該エステラーゼが、親エステラーゼにあるＤ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０、Ｃ２４１＋Ｃ２５９、及びＤ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０＋Ｃ２４１＋Ｃ２５９から選択された、より好ましくはＤ１７６＋Ｈ２０８＋Ｓ１３０＋Ｃ２４１＋Ｃ２５９＋Ｍ１３１＋Ｄ１７４から選択された少なくとも１つの組合せを含む、請求項１～２２のいずれか一項記載のエステラーゼ。
24. 前記エステラーゼが、親エステラーゼにあるＧ５９、Ｈ１２９、Ｇ１３２、Ｗ１５５、Ｉ１７１、Ｉ１７８及びＰ２１４から選択された少なくとも１つのアミノ酸、好ましくはＩ１７１及びＩ１７８から選択された少なくとも１つのアミノ酸、より好ましくは少なくともＩ１７１＋Ｉ１７８の組合せ、さらにより好ましくは親エステラーゼにあるＩ１７１＋Ｉ１７８＋Ｇ５９＋Ｈ１２９＋Ｇ１３２＋Ｗ１５５＋Ｐ２１４の組合せを含む、請求項１～２３のいずれか一項記載のエステラーゼ。
25. 前記エステラーゼが、配列番号１のエステラーゼと比較して、増加した熱安定性及び増加した分解活性の両方を示す、請求項１～２４のいずれか一項記載のエステラーゼ。
26. 前記エステラーゼが、配列番号１のエステラーゼと比較して、５０℃～６５℃、より好ましくは５０℃及び／又は６５℃の温度で、増加した熱安定性及び／又は増加したポリエステル分解活性の両方を示す、請求項２５記載のエステラーゼ。
27. 請求項１～２６のいずれか一項に定義されているエステラーゼをコードしている核酸。
28. 請求項２７の核酸を含んでいる、発現カセット又はベクター。
29. 請求項２７の核酸、又は請求項２８の発現カセット若しくはベクターを含んでいる、宿主紙細胞。
30. 請求項１～２６のいずれかに定義されているエステラーゼ、又は請求項２９記載の宿主細胞、又はその抽出物を含んでいる、組成物。
31. （ａ）ポリエステルを、請求項１～２６のいずれか一項記載のエステラーゼ、又は請求項２９記載の宿主細胞、又は請求項３０記載の組成物と接触させる工程；及び場合により、
    （ｂ）モノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程
    を含んでいる、ポリエステルを分解する方法。
32. 前記ポリエステルが、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルバイドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）、及びこれらの物質のブレンド／混合物、好ましくはポリエチレンテレフタラートから選択される、請求項３１の方法。
33. 工程（ａ）が、２０℃～９０℃、好ましくは４０℃～９０℃、より好ましくは５０℃～７０℃の温度で実施される、請求項３１又は３２の方法。
34. 工程（ａ）が、ｐＨ５～９で、好ましくはｐＨ範囲６～９で、より好ましくはｐＨ範囲６．５～９で実施される、請求項３１～３３の方法。
35. 請求項１～２６のいずれか一項記載のエステラーゼ、又は請求項２９記載の宿主細胞、又は請求項３０記載の組成物を含有している、ポリエステル含有物質。
36. 請求項１～２６のいずれか一項記載のエステラーゼ、又は請求項２９記載の宿主細胞、又は請求項３０記載の組成物を含んでいる洗剤組成物。