KR20230093468A

KR20230093468A - 신규한 에스테라아제 및 그 용도

Info

Publication number: KR20230093468A
Application number: KR1020237017517A
Authority: KR
Inventors: 뱅쎙 뚜르니에; 뱅?? 뚜르니에
Original assignee: 까르비오
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-06-27
Also published as: CA3195334A1; EP4237551A1; AU2021367905A1; CN116615491A; JP2023546501A; WO2022090293A1; US20230392130A1

Abstract

본 발명은 신규한 에스테라아제, 특히 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 개선된 활성 및/또는 개선된 열안정성을 갖는 에스테라아제 변종 및 플라스틱 제품과 같은 폴리에스테르 함유 물질을 분해하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 에스테라아제는 특히 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트를 포함하는 물질을 분해하기에 적합하다.

Description

신규한 에스테라아제 및 그 용도

본 발명은 신규한 에스테라아제, 특히 부모 에스테라아제에 비하여 개선된 활성 및/또는 개선된 열안정성을 갖는 에스테라아제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 플라스틱 제품과 같은 폴리에스테르 함유 물질을 분해하기 위한 상기 신규한 에스테라아제의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 에스테라아제는 특히 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트 함유 물질을 분해하기에 적합하다.

에스테라아제는 폴리에스테르를 포함하여 다양한 폴리머의 가수분해를 촉매할 수 있다. 여기서, 에스테라아제는 식기세척 및 세탁용 세제, 바이오매스 및 식품 가공용 분해 효소, 환경오염물의 해독 또는 직물 산업에서의 폴리에스테르 패브릭 처리용 생물 촉매로서 많은 산업 응용분야에서 유망한 효과를 보여 왔다. 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)를 가수분해하기 위한 분해 효소로서의 에스테라아제의 용도는 특히 흥미롭다. 실제로, PET는 의류, 카펫의 제조, 포장 또는 자동차 플라스틱 등의 제조를 위한 열경화성 수지의 형태와 같이 다수의 기술분야에서 사용되고 있어, 매립지에서의 PET 축적이 증가하는 생태학적 문제가 되고 있다.

폴리에스테르, 특히 PET의 효소 분해가 플라스틱 폐기물 축적을 감소시키는 흥미로운 해결책으로 고려되고 있다. 실제로, 효소는 폴리에스테르 함유 물질, 특히 플라스틱 제품들의 모노머 수준까지의 가수분해를 촉진할 수 있다. 더욱이, 가수분해물(즉, 모노머 및 올리고머)은 신재(new) 폴리머를 합성하기 위한 물질로 재활용될 수 있다.

여기서, 여러 에스테라아제가 폴리에스테르의 후보 분해 효소로 동정되었고, 이러한 에스테라아제 중의 일부 변종이 개발되었다. 에스테라아제 중에서도, 큐틴 가수분해 효소(EC 3.1.1.74)로도 알려진 큐티나아제가 특히 흥미롭다. 큐티나아제는 여러 진균(P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504), 박테리아 및 식물 화분(plant pollen)에서 동정되었다. 최근, 메타지노믹스 접근법(metagenomics approaches)로 추가의 에스테라아제의 동정이 이어지고 있다.

그러나, 폴리에스테르 분해 공정을 보다 효율적으로 제공하고 그에 따라 보다 나은 경쟁력을 제공하기 위하여 이미 공지된 에스테라아제에 비하여 개선된 활성 및/또는 개선된 열안정성을 갖는 에스테라아제에 대한 수요가 여전히 존재하고 있다.

본 발명은 서열 번호 1에서 규정되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 부모 또는 야생-형 에스테라아제에 비하여 증가된 활성 및/또는 증가된 열안정성을 나타내는 신규한 에스테라아제를 제공한다. 이러한 야생-형 에스테라아제는 UniProt 데이터베이스에서 E5BBQ3로 참조되고 폴리에스테르 분해 활성을 가지는 것으로 기술되는 에스테라아제에 해당한다. 본 발명의 에스테라아제는 플라스틱 제품, 특히 PET를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하는 공정에서 특히 유용하다.

이와 관련하여, (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, 그리고 (ii) F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환을 갖고, 여기에서 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 기준하여 번호가 매겨지고, (iii) 폴리에스테르 분해 활성을 가지는, 에스테라아제를 제공하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다. 바람직하게는, 상기 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및/또는 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다.

바람직하게는, 에스테라아제는 T168Q, F209I/G/H/L/R/S/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 더 바람직하게는 T168Q, F209I 및 N212D로부터 선택되는, 더 바람직하게는 적어도 F209I인 적어도 하나의 치환을 포함한다.

본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다. 본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 발현 벡터 그리고 상기 핵산, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 에스테라아제, 본 발명의 숙주 세포 또는 이들의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.

하기 단계를 포함하는, 본 발명의 에스테라아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다:

(a) 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 발현시키기에 적절한 조건 하에서 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 임의선택적으로

(b) 세포 배양물로부터 상기 에스테라아제를 회수하는 단계.

하기 단계를 포함하는, 폴리에스테르를 분해하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다:

(a) 폴리에스테르를 본 발명에 따른 에스테라아제 또는 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계; 및 임의선택적으로

(b) 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 단계.

특히, 본 발명은 PET를 본 발명의 적어도 하나의 에스테라아제와 접촉시키는 단계 및 임의선택적으로 PET의 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 단계를 포함하는, PET를 분해하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 PET 또는 PET를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하기 위한 본 발명의 에스테라아제의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포 또는 조성물이 포함된 폴리에스테르 함유 물질에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 에스테라아제 또는 숙주 세포 또는 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 조성물을 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

정의

본 상세한 설명은 하기 정의들을 참조하여 가장 잘 이해될 것이다.

본 명세서에서, 용어 "펩티드(peptide)", "폴리펩티드(polypeptide)", "단백질(protein)", "효소(enzyme)"는 쇄를 형성하는 아미노산의 수와 무관하게 펩티드 결합으로 연결된 아미노산의 쇄를 의미한다. 아미노산은 본 명세서에서는 하기 명명법에 따르는 단일-문자 또는 3-문자들로 표현된다: A: 알라닌(Ala); C: 시스테인(Cys); D: 아스파르트산(Asp); E: 글루탐산(Glu); F: 페닐알라닌(Phe); G: 글리신(Gly); H: 히스티딘(His); I: 이소류신(Ile); K: 라이신(Lys); L: 류신(Leu); M: 메티오닌(Met); N: 아스파라긴(Asn); P: 프롤린(Pro); Q: 글루타민(Gln); R: 아르기닌(Arg); S: 세린(Ser); T: 트레오닌(Thr); V: 발린(Val); W: 트립토판(Trp) 및 Y: 티로신(Tyr).

용어 "에스테라아제(esterase)"는 효소 명명법(Enzyme Nomenclature)에 따라 EC 3.1.1로 분류되는, 에스테르의 산 및 알코올로의 가수분해를 촉매하는 가수분해 효소들의 분류에 속하는 효소를 의미한다. 용어 "큐티나아제(cutinase)" 또는 "큐틴 가수분해 효소(cutin hydrolase)"는 효소 명명법에 따라 EC 3.1.1.74로 분류되는, 큐틴 및 물로부터의 큐틴 모노머의 생산의 화학 반응을 촉매할 수 있는 에스테라아제를 의미한다.

용어 "야생-형 단백질(wild-type protein)" 또는 "부모 단백질(parent protein)"은 자연적으로 나타나는 바와 같은 폴리펩티드의 미-돌연변이 버전(non-mutated version)을 의미한다. 본 발명의 경우에서, 부모 에스테라아제는 서열 번호 1에서 규정되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 에스테라아제를 의미한다.

용어 "돌연변이(mutant)" 및 "변종(variant)"은 서열 번호 1로부터 파생되고 하나 이상의(예를 들어, 여러) 포지션에서 적어도 하나의 변형 또는 변경, 즉, 치환, 삽입(insertion) 및/또는 결실(deletion)을 포함하고 그리고 폴리에스테르 분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 변종은 당해 기술분야에서 충분히 공지된 여러 기술로 수득될 수 있다. 특히, 야생-형 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 변경하기 위한 기술의 예는 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis), 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 및 합성 올리고뉴클레오티드 작제(synthetic oligonucleotide construction)를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 따라서, 특정한 포지션에 대하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "변형(modification)" 및 "변경(alteration)"은 이러한 특정한 포지션에서의 아미노산이 야생-형 단백질에서의 이러한 특정한 포지션에서의 아미노산과 비교하여 변형되었다는 것을 의미한다.

"치환(substitution)"은 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 하나의 아미노산 잔기의 자연적으로-발생하는 표준 20개 아미노산 잔기, 희소하게 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기(예를 들어 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 알로하이드록시라이신, 6-N-메틸라이신, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 알로-이소류신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 파이로글루타민, 아미노부티르산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린) 그리고 종종 합성적으로 만들어지고 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기(예를 들어 사이클로헥실-알라닌)로의 대체를 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 하나의 아미노산 잔기의 자연적으로-발생하는 표준 20개의 아미노산 잔기(G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S 및 T)로부터 선택되는 다른 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 기호 "+"는 치환들의 조합을 나타낸다. 본 문헌에서, 하기 용어들이 치환을 표시하는 데 사용된다: L82A는 부모 서열의 포지션 82에서의 아미노산 잔기(류신, L)가 알라닌(A)로 치환된다는 것을 나타낸다. A121V/I/M은 부모 서열의 포지션 121에서의 아미노산 잔기(알라닌, A)가 하기 아미노산 중의 하나로 치환된다는 것을 나타낸다: 발린(V), 이소류신(I) 또는 메티오닌(M). 치환은 보존적이거나 비-보존적인 치환일 수 있다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴 및 트레오닌), 소수성 아미노산(메티오닌, 류신, 이소류신, 시스테인 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌 및 세린)의 군에 속한다.

달리 특정되지 않는 한, 본원에서 기술되는 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 기준하여 번호가 매겨진다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성(sequence identity)" 또는 "동일성(identity)"은 2개의 폴리펩티드 서열들 간의 매칭된(동일한 아미노산 잔기들) 수(또는 백분율 %로 표현되는 분율)를 의미한다. 서열 동일성은 정렬되었을 때 서열들을 비교하여 중첩 및 동일성을 최대화하는 한편으로 서열 갭들(sequence gaps)을 최소화하도록 결정된다. 특히, 서열 동일성은 2개의 서열들의 길이에 따라 다수의 수학적인 전역적 또는 국부적인 정렬 알고리즘들(mathematical global or local alignment algorithms) 중의 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 서열들을 전장에 걸쳐 최적으로 정렬하는 전역적인 정렬 알고리즘(예를 들어 Needleman and Wunsch algorithm; Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 정렬되는 한편으로, 실질적으로 상이한 길이들의 서열들은 바람직하게는 국부적인 정렬 알고리즘(예를 들어 Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, 1981) 또는 Altschul 알고리즘(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005))을 사용하여 정렬된다. 백분율 아미노산 서열 동일성의 결정의 목적을 위한 정렬은 당해 기술분야의 기술 내의 여러 방법들로, 예를 들어, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)와 같은 인터넷 웹 사이트 상에서 획득가능한 공공연히 획득가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위하여 요구되는 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있을 것이다. 본 명세서의 목적을 위하여는, % 아미노산 서열 동일성 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 2개의 서열들의 최적의 전역적인 정렬을 생성하는 페어 와이즈 서열 정렬 프로그램(pair wise sequence alignment program) EMBOSS Needle을 사용하여 생성된 값을 의미하고, 여기에서 모든 검색 매개변수는 디폴트 값(default values), 즉 Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 11, Gap extend = 1로 설정된다.

"폴리머(polymer)"는 그의 구조가 공유적인 화학 결합으로 연결된 다중의 모노머들(반복 단위들)로 구성되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 의미한다. 본 발명의 설명에서, 용어 폴리머는 단일 형태의 반복 단위(즉, 호모폴리머들) 또는 서로 다른 반복 단위들의 혼합물(즉, 코폴리머들 또는 헤테로폴리머들)로 구성되는 천연 또는 합성 폴리머를 포함한다. 본 발명에 따르면, "올리고머(oligomers)"는 2 내지 약 20개의 모노머들을 포함하는 분자를 의미한다.

본 발명의 내용에서, "폴리에스테르 함유 물질(polyester containing material)" 또는 "폴리에스테르 함유 제품(polyester containing product)"은 결정 형태, 반-결정 형태 또는 전적으로 비정질 형태들의 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 제품과 같은 제품을 의미한다. 특정한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 적어도 하나의 폴리에스테르 및 가능하게는 가소제, 무기 필러 또는 유기 필러와 같은 다른 물질 또는 첨가제를 포함하는 플라스틱 시트, 튜브, 막대, 프로파일, 형상, 필름, 거대 블록 등과 같이 적어도 하나의 플라스틱 물질로 만들어지는 임의의 물품을 의미한다. 다른 특정한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 플라스틱 제품을 제조하기에 적절한 용융 상태 또는 고체 상태의 플라스틱 화합물 또는 플라스틱 제형을 의미한다. 다른 특정한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 직물(textile), 패브릭(fabrics) 또는 섬유(fibers)를 의미한다. 다른 특정한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 폐기물 또는 섬유 폐기물을 의미한다.

본 상세한 설명에서, 용어 "폴리에스테르(들)(polyester(s))"는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르비드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리유산(PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 숙시네이트(PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA), 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 및 이들 폴리머의 블렌드/혼합물을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

신규한 에스테라아제

본 발명은 부모 에스테라아제에 비하여 개선된 활성 및/또는 개선된 열안정성을 갖는 신규한 에스테라아제를 제공한다. 특히, 본 발명자들은 산업 공정에서 사용하기에 특히 적절한 신규한 효소를 설계하였다. 본 발명의 에스테라아제는 PET 함유 물질 및 특히 PET를 포함하는 플라스틱 제품을 포함하여 폴리에스테르, 특히 PET를 분해하기에 적절하다. 특정한 구현예에서, 에스테라아제는 증가된 활성 및 증가된 열안정성 둘 모두를 나타낸다.

따라서 서열 번호 1에서 규정되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는, 또는 부모 에스테라아제로 지칭되는 에스테라아제에 비하여 증가된 활성을 나타내는 에스테라아제를 제공하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다.

특히, 본 발명자들은 서열 번호 1에서 특정한 아미노산 잔기를 동정하였으며, 이는 서브스트레이트와 에스테라아제의 접촉을 증진시키고 폴리머의 증가된 흡착을 유도하고/유도하거나 그에 의하여 이러한 폴리머에 대한 에스테라아제의 증가된 활성을 유도하도록 유리하게 변형될 수 있는 에스테라아제의 X-선 결정 구조(즉, 접혀진 3D 구조)에서 폴리머 서브스트레이트와 접촉되도록 의도된다.

본 발명의 설명에서, 용어 "증가된 활성(increased activity)" 또는 "증가된 분해 활성(increased degrading activity)"은 동일한 온도에서 동일한 폴리에스테르를 분해하는 서열 번호 1의 에스테라아제의 능력에 비하여 주어진 온도에서 폴리에스테르를 분해 및/또는 분해하는 에스테라아제의 증가된 능력 및/또는 폴리에스테르를 흡착하는 증가된 능력을 나타낸다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 증가된 PET 분해 활성을 갖는다. 이러한 증가는 서열 번호 1의 에스테라아제의 PET 분해 활성 보다 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130% 또는 그 이상일 수 있다. 특히, 분해 활성은 폴리에스테르의 모노머 및/또는 올리고머를 야기하는 해중합 활성이고, 이들 모노머 및/또는 올리고머는 추가로 회수되고 임의선택적으로 재사용될 수 있다.

에스테라아제의 "분해 활성"은 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 방법들에 따라 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 분해 활성은 특정한 폴리머의 해중합 활성율(depolymerization activity rate)의 측정, 한천 플레이트(agar plate) 중에 분산된 고체 폴리머 화합물을 분해하는 비율의 측정 또는 반응기 중에서의 폴리머의 해중합 활성율의 측정에 의해 평가될 수 있다. 특히, 분해 활성은 에스테라아제의 "비분해 활성(specific degrading activity)"을 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다. PET에 대한 에스테라아제의 "비분해 활성"은 반응의 초기 기간(즉 처음 24시간) 동안 분당 가수분해된 PET의 μmol 또는 에스테라아제 ㎎ 당 시간당 생성된 당량 TA의 ㎎에 상당하고 그리고 처음 24시간 동안 서로 다른 시간에서 수행된 수 차례의 샘플링들에 의해 수립되는 곡선과 같은 반응의 가수분해 곡선의 직선 부분으로부터 결정된다. 다른 예로서, "분해 활성"은, 폴리머 또는 폴리머-함유 플라스틱 제품과 분해 효소의 접촉 시, 소정의 시간 이후, 온도, pH 및 완충제의 적절한 조건 하에서 방출된 올리고머들 및/또는 모노머들의 비율 및/또는 수율을 측정하는 것에 의하여 평가될 수 있다.

서브스트레이트 상에 흡착되는 효소의 능력은 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 방법에 따라 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 평가될 수 있을 것이다. 예를 들어, 서브스트레이트 상에 흡착되는 효소의 능력은 효소를 함유하는 용액들로부터 측정될 수 있고 여기에서 효소는 적절한 조건 하에서 서브스트레이트와 함께 앞서서 배양된다.

본 발명자들은 또한 유리하게는 높은 온도에서, 그리고 유리하게는 50℃ 초과, 바람직하게는 60℃, 더 바람직하게는 65℃ 초과의 온도에서 해당하는 에스테라아제의 안정성을 개선(즉, 개선된 열안정성)하도록 변형될 수 있는 서열 번호 1 중의 표적 아미노산 잔기들을 동정하였다.

따라서 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 갖는 에스테라아제(즉, 부모 에스테라아제)의 열안정성에 비하여 증가된 열안정성을 나타내는 신규한 에스테라아제를 제공하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다.

본 발명의 설명에서, 달리 특정되지 않는 한, 주어진 온도는 상기 온도 +/- 1℃에 대응한다.

본 발명의 설명에서, 용어 "증가된 열안정성(increased thermostability)"은 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 높은 온도에서, 특히 50℃ 내지 90℃의 온도에서 화학적 및/또는 물리적 구조에서의 변화에 저항하는 에스테라아제의 증가된 능력을 나타낸다. 특정한 구현예에서, 에스테라아제의 열안정성은 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 90℃, 55℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 75℃, 55℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 65℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 75℃, 60℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 65℃, 65℃ 내지 90℃, 65℃ 내지 80℃, 65℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 70℃의 온도에서 부모 에스테라아제의 열안정성에 비하여 향상된다. 특정한 구현예에서, 에스테라아제의 열안정성은 적어도 50℃ 내지 65℃의 온도에서 부모 에스테라아제의 열안정성에 비하여 향상된다.

특히, 열안정성은 에스테라아제의 용융 온도(Tm)의 평가를 통하여 평가될 수 있다. 본 발명의 설명에서, "용융 온도(melting temperature)"는 고려되는 효소 개체군의 절반이 펼쳐지거나(unfolded) 또는 오접힘되는(misfolded) 온도를 의미한다. 전형적으로, 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제의 Tm에 비하여 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 10℃ 또는 그 이상의 증가된 Tm을 나타낸다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 50℃ 내지 90℃의 온도에서 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 반감기를 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 70℃, 50℃ 내지 65℃, 55℃ 내지 90℃, 55℃ 내지 80℃, 55℃ 내지 75℃, 55℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 65℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 75℃, 60℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 65℃, 65℃ 내지 90℃, 65℃ 내지 80℃, 65℃ 내지 75℃, 65℃ 내지 70℃의 온도에서 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 반감기를 가질 수 있다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 에스테라아제는 적어도 50℃ 내지 65℃의 온도에서 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 반감기를 가진다.

에스테라아제의 용융 온도(Tm)는 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 방법에 따라 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, DSF가 에스테라아제의 열 변성 온도에서의 변화를 정량하고 그리고 그에 의하여 그의 Tm을 결정하는 데 사용될 수 있다. 대안으로, Tm은 원이색법(circular dichroism)을 사용하는 단백질 접힘의 분석에 의해 평가될 수 있다. 바람직하게는, Tm은 실시예에서 드러난 바와 같은 DSF 또는 원이색법을 사용하여 측정된다. 본 발명의 설명에서, Tm의 비교는 동일한 조건(예를 들어 pH, 폴리에스테르의 속성 및 양 등) 하에서 측정된 Tm으로 수행된다.

대안으로, 열안정성은 에스테라아제 활성 및/또는 서로 다른 온도에서의 배양 후 에스테라아제의 폴리에스테르 해중합 활성을 측정하고 부모 에스테라아제의 에스테라아제 활성 및/또는 폴리에스테르 해중합 활성과 비교하는 것에 의하여 평가될 수 있다. 서로 다른 온도에서의 다중 회의 폴리에스테르의 해중합 평가를 수행하는 능력이 또한 평가될 수 있다. 신속하고 가치있는 시험은, 공간 직경 측정(halo diameter measurement)에 의하여, 서로 다른 온도에서의 배양 후 한천 플레이트 중에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물을 분해하는 에스테라아제 능력의 평가로 이루어질 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은, (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) F209I/A/G/H/L/R/S/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, A125G, L152Q, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S로 부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 가지고, 그 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 참조하여 번호가 매겨지며, (iii) 폴리에스테르 분해 활성을 가지고, 그리고 바람직하게는 (iv) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및/또는 증가된 분해 활성을 가지는 에스테라아제를 제공하는 것이다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

바람직하게는, 에스테라아제는 D12F/Y, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R, D94S, S121W, A125G, L152Q, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C, T207L, F209I, P211A, N212D, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는, 더 바람직하게는 D12F/Y, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C, T207L, F209I, P211A, N212D, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 T168Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 바람직하게는 T168Q, F209I/G/H/L/R/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 더 바람직하게는 T168Q, F209I 및 N212D로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, 에스테라아제는 F209I/G/H/L/R/T 및 T168Q로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I 및 T168Q로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.

특히, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 적어도 하나의 치환, 더 바람직하게는 F209I 치환을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 T11, D12, S23, T50, A53, Y60, T61, T63, A65, T88, T89, L90, Q92, M107, S121, A125, L152, M127, G135, S136, P151, L157, K159, T177, T183, D204, T207, F209, A210, N212, I213, K216, Q238, D246, E253 및 D174로부터 선택되는, 바람직하게는 T61, A65, Q92, G135, T177, T183, D204, F209, N212 및 E253로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환을 더 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, 에스테라아제는 Q92G/P, G135A, T183E, D204C/K/R, F209W/S/A 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G, G135A, T183E, D204C/K/R, F209W 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 더 포함한다. 특히, 에스테라아제는 Q92G/P, G135A, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G, G135A, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 더 포함한다.

바람직한 일 구현예에서, 에스테라아제는 적어도 D204C + E253C의 치환 조합을 더 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 부모 에스테라아제와 같이 D204K/R로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환 및 적어도 E253 아미노산 잔기를 더 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 치환, 및 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 특히, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 치환, 및 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는 적어도 두 개의 치환, 바람직하게는 적어도 세 개의 치환을 포함한다.

특히, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W, T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는 적어도 세 개의 치환, 바람직하게는 적어도 네 개의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 에스테라아제는 F209I/G/H/L/R/T/W, T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는 적어도 세 개의 치환, 바람직하게는 적어도 네 개의 치환을 포함한다.

특정 구현예에서, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S로 이루어지는 군에서 선택되는, 바람직하게는 F209I, D12F/Y, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C, T207L, P211A, N212D, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I, D12F/Y, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C, T207L, P211A, N212D, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는 1 내지 31개의 아미노산 치환을 가지는 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가진다. 특히, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, T168Q, F209I/G/H/L/R/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 바람직하게는 T168Q, F209I 및 N212D로부터 선택되는, 1 내지 3개의 아미노산 치환을 가지는 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가진다.

특정 구현예에서, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/G/H/L/R/T 및 T168Q로 이루어지는 군에서 선택되는, 바람직하게는 F209I 및 T168Q로부터 선택되는, 1 내지 2개의 아미노산 치환을 가지는 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가진다.

특정 구현예에서, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S로 이루어지는 군에서 선택되는, 바람직하게는 F209I, D12F/Y, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R, D94S, S121W, A125G, L152Q, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C, T207L, P211A, N212D, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I, D12F/Y, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C, T207L, P211A, N212D, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는, 단일 아미노산 치환을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가진다. 특히, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, T168Q, F209I/G/H/L/R/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 바람직하게는 T168Q, F209I 및 N212D로부터 선택되는, 단일 치환을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/G/H/L/R/T 및 T168Q로 이루어지는 군에서 선택되는, 바람직하게는 F209I 및 T168Q로부터 선택되는, 단일 아미노산 치환을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가진다.

특히, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 단일 아미노산 치환, 바람직하게는 F209I 치환을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가진다. 유리하게는, 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 분해 활성을 나타낸다.

또한, 본 발명의 목적은, (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) F209, T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183, D204, N212 및 E253 로부터 선택되는 포지션에서 적어도 세 개의 아미노산 치환을 가지고, 그 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 참조하여 번호가 매겨지며, (iii) 폴리에스테르 분해 활성을 가지고, 및 바람직하게는 (iv) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및/또는 증가된 분해 활성을 나타내는 에스테라아제를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 에스테라아제는 F209, T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183, D204, N212 및 E253로부터 선택되는 포지션에서 적어도 네 개의 아미노산 치환을 포함한다.

바람직하게는, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W, T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T/W, Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I/W, Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I, Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C, 및 E253C로부터 선택되는 적어도 세 개의 치환, 바람직하게는 적어도 네 개의 아미노산 치환을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 치환, 및 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R, 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C, 및 E253C로부터 선택되는 적어도 두 개의 치환을 포함한다. 특히, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 치환, 및 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R, 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C, 및 E253C로부터 선택되는 적어도 세 개의 치환을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209 + D204 + E253 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 조합, 더 바람직하게는 F209I/W + D204C + E253C로부터 선택되는 조합, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C 치환 조합을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209 + D204 + E253 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합 및 T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183 및 N212로부터 선택되는 포지션, 바람직하게는 Q92, G135, T168, 및 T183로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합을 포함한다.

바람직하게는, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T + D204C/K/R + E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 조합을 포함한다. 특히, 에스테라아제는 T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183 및 N212로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E 및 N212D/Q/M로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q 및 T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q 및 T183E로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C 치환 조합, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T + D204C/K/R + E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C로부터 선택되는 치환 조합을 가지는 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209 + D204 + E253, F209 + D204 + E253 + Q92, F209 + D204 + E253 + N212, F209 + D204 + E253 + Q92 + G135 + T168, F209 + D204 + E253 + Q92 + G135 + T168 + T183, F209 + D204 + E253 + Q92 + T183, or F209 + D204 + E253 + Q92 + T168 + T183로 이루어지는 군에서 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합을 포함한다. 바람직하게는, 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + N212D/M/Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/W + D204C + E253C, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P, F209I/W + D204C + E253C + N212D/M, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T183E , F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C + Q92G, F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E and F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E로부터 선택되는, 적어도 하나의 치환 조합을 포함한다. 유리하게는, 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 에스테라아제는 50℃ 내지 65℃의 온도에서, 더 바람직하게는 50℃ 및/또는 65℃에서, 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 F209 + D204 + E253 + Q92 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C + Q92G로부터 선택되는 치환 조합을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 L14, G62, R73, D85, T86, A179, A206, N215, I217, G219, F239, R245, F249, E251, V252 및 D174로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환을 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 치환을 L14D/E, G62D/S, R73C/D/E/F/G/I/M/N/Q/S/V, D85A/E/F, T86E/S, A179C, A206D, N215C/D/E, I217Q, G219A/E, F239E, R245C/E, F249T, E251D/E/H/S, V252T로부터 선택된다.

특정한 구현예에서, 에스테라아제는, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W, T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는 3 내지 7개의 치환을 가지는, 바람직하게는 서열 번호 1과 비교하여 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W, Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I/W, Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I, Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C, 및 E253C로부터 선택되는, 3 내지 7개의 치환을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열로 이루어지는 에스테라아제의 아미노산 서열을 가진다.

특정한 구현예에서, 에스테라아제의 아미노산 서열은, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + N212D/M/Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I/W + D204C + E253C, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P , F209I/W + D204C + E253C + N212D/M, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T183E , F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C + Q92G, F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E and F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E로부터 선택되는 치환 조합을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열로 이루어진다. 유리하게는, 이러한 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 바람직하게는, 에스테라아제는 50℃ 내지 65℃의 온도에서, 더 바람직하게는 50℃ 및/또는 65℃에서, 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다.

다른 구현예에서, 에스테라아제의 아미노산 서열은, 서열 번호 1과 비교하여, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T + D204C/K/R + E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 , F209I + D204C + E253C로부터 선택되는 치환 조합을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열로 이루어진다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 D176, H208, S130, M131, C241, C259, G59, H129, G132, W155, I171, I178, P214, D174로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하며, 즉 본 발명의 에스테라아제는 이러한 포지션들 중 1, 2, 또는 모든 포지션에서 변형되지 않는다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 에스테라아제의 촉매 사이트를 형성하는 적어도 아미노산 D176, H208 및 S130 및/또는 부모 에스테라아제에서와 같이 이황화 결합(disulphide bond)을 형성하는 아미노산 C241 및 C259를 포함한다. 바람직하게는, 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 D176 + H208 + S130, C241 + C259 및 D176 + H208 + S130 + C241 + C259 로부터 선택되는 적어도 하나의 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 D176 + H208 + S130 + C241 + C259 + M131 + D174 의 조합을 포함한다.

대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 G59, H129, G132, W155, I171, I178 및 P214 로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 I171 및 I178로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산, 더 바람직하게는 부모 에스테라아제에서와 같이 적어도 I171 + I178 조합을 포함한다. 일 구현예에서, 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 I171 + I178 + G59 + H129 + G132 + W155 + P214 조합을 포함한다.

일 구현예에서, 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 D176 + H208 + S130 + C241 + C259 + I171 + I178 조합을 포함한다.

변종의 폴리에스테르 분해 활성(polyester degrading activity of the variant)

에스테라아제 활성을 갖는 신규한 효소를 제공하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 효소는 큐티나아제 활성을 나타낸다.

특정 구현예에서, 본 발명의 에스테라아제는 폴리에스테르 분해 활성, 바람직하게는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해 활성 및/또는 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT) 분해 활성 및/또는 폴리카프로락톤(PCL) 분해 활성 및/또는 폴리부틸렌 숙시네이트(PBS) 활성, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해 활성 및/또는 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT) 분해 활성을 갖는다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명의 에스테라아제는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해 활성을 갖는다.

유리하게는, 본 발명의 에스테라아제는 적어도 20℃ 내지 90℃, 바람직하게는 40℃ 내지 90℃, 더 바람직하게는 50℃ 내지 90℃, 더 바람직하게는 60℃ 내지 90℃의 온도의 범위에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 65℃ 내지 90℃, 65℃ 내지 85℃, 65℃ 내지 80℃, 70℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 85℃, 70℃ 내지 80℃의 온도의 범위에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 에스테라아제는 60℃에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 에스테라아제는 70℃에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 폴리에스테르 분해 활성은 55℃ 내지 70℃의 온도에서 여전히 측정가능하다. 상기한 바와 같이, 온도는 +/-1℃로 고려되어야 한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 주어진 온도에서, 특히 40℃ 내지 90℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 90℃ 사이의 온도에서 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다.

특정 구현예에서, 에스테라아제는 65℃에서 서열 번호 1의 에스테라아제의 폴리에스테르 분해 활성 보다 적어도 5% 이상, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 50%, 100% 또는 그 이상의 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다.

특정 구현예에서, 본 발명의 에스테라아제는 적어도 5 내지 9의 pH의 범위 내에서, 바람직하게는 6 내지 9의 pH의 범위 내에서 보다 바람직하게는 6.5 내지 9의 pH의 범위 내에서 보다 더 바람직하게는 6.5 내지 8의 pH의 범위 내에서 측정가능한 에스테라아제 활성을 나타낸다.

핵산, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포

상기 정의되는 바와 같은 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산(nucleic acid)", "핵산 서열(nucleic sequence)", "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 및 "뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)"은 디옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 핵산은 DNA(cDNA 또는 gDNA), RNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이는 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 이는 재조합, 인공 및/또는 합성 유래일 수 있고 이는 예를 들어 변형된 결합, 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 단리되거나 정제된 형태일 수 있고, 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 기술, 예를 들어, cDNA 라이브러리의 복제(cloning) 및 발현, 효소적 합성 또는 재조합 기술에 의하여 재조되고, 단리되고 그리고/또는 조작될 수 있다. 핵산은 또한 시험관 내에서, 예를 들어, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444에서 기술된 바와 같이 충분히 공지된 화학적 합성 기술로 합성될 수 있다.

본 발명은 또한, 엄격한 조건(stringent conditions) 하에서, 상기 정의되는 바와 같은 에스테라아제를 인코딩하는 핵산에 하이브리드화(hybridize)하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 엄격한 조건은 2 X SSC/0.1% SDS 중에서 약 42℃에서 약 2.5시간 동안 하이브리드화 필터들의 배양 후, 필터들을 65℃에서 1 X SSC/0.1% SDS 중에서 15 분으로 4회 세척하는 것을 포함한다. 사용되는 프로토콜들은 Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) 및 Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989))와 같은 참고문헌에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 포함하며, 여기에서 상기 핵산들의 서열 또는 적어도 상기 서열의 일부는 최적화된 코돈 사용(codon usage)을 사용하여 가공된다.

대안으로, 본 발명에 따른 핵산은 본 발명에 따른 에스테라아제의 서열로부터 유래를 찾을 수 있고 그리고 코돈 사용은 핵산이 전사될 숙주 세포에 따라 적용될 수 있을 것이다. 이들 단계들은 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있고 그 중 일부가 참조 매뉴얼 Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001)에서 기술된 방법들에 따라 실행될 수 있다.

본 발명의 핵산은 선택된 숙주 세포 또는 시스템 내에서 폴리펩티드의 발현을 유발하거나 조절하는 데 사용될 수 있는 조절 영역(regulatory regions), 즉, 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers), 사일런서(silencers), 터미네이터(terminators), 신호 펩티드(signal peptides) 등과 같은 추가의 뉴클레오티드 서열들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 적절한 숙주 세포 내에서 상기 핵산의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열(control sequences)에 작동가능하게 연결되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현(expression)"은 전사, 전사 후 변형, 해독, 해독 후 변형 및 분비를 포함하나 이들로 제한되지 않는 폴리펩티드의 생산에 포함되는 임의의 단계를 의미한다.

용어 "발현 카세트(expression cassette)"는 코딩 영역, 즉 본 발명의 핵산 및 조절 영역, 즉 작동가능하게 연결되는 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 조절 영역을 포함하는 핵산 작제물(nucleic acid construct)을 지칭한다.

전형적으로, 발현 카세트는 전사 프로모터(transcriptional promoter) 및/또는 전사 터미네이터(transcription terminator)와 같은 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 조절 서열은 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산의 발현을 위한 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템(in vitro expression system)으로 인식되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 효소의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이 프로모터(mutant promoter), 절두된 프로모터(truncated promoter) 및 하이브리드 프로모터(hybrid promoter)를 포함하여 숙주 세포 내에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 숙주 세포에 대하여 동종성 또는 이종성인 세포 외 또는 세포 내 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 조절 서열은 또한 숙주 세포에 의해 인식되어 전사를 종결하는 전사 터미네이터일 수 있다. 터미네이터는 에스테라아제를 인코딩하는 핵산의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포 내에서 관능적인 임의의 터미네이터가 본 발명에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.

본 발명은 또한 상기 정의되는 바와 같은 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터(vector)" 또는 "발현 벡터(expression vector)"는 숙주 세포 내로 재조합 유전 물질을 전달하는 비히클로서 사용되는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 벡터의 대부분의 형태들은 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체이다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입물(insert: 이종 핵산 서열, 전이유전자) 및 벡터의 "골격(backbone)"으로서 기능하는 보다 큰 서열로 이루어지는 DNA 서열이다. 숙주로 유전 정보를 전달하는 벡터의 목적은 전형적으로 표적 세포 내에서 삽입물을 단리하거나, 증식시키거나 발현시키는 것이다. 발현 벡터(발현 작제물(expression constructs))로 불리우는 벡터는 구체적으로 표적 세포 내에서 이종 서열의 발현을 위하여 적용되며, 일반적으로 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 서열의 발현을 구동하는 프로모터 서열을 갖는다. 일반적으로, 발현 벡터 내에 존재하는 조절 요소(regulatory elements)은 전사 프로모터, 리보솜 결합 부위, 터미네이터 및 임의선택적으로 존재하는 오퍼레이터(operator)를 포함한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 숙주 세포 내에서 자가 복제하기 위한 복제 기점(origin of replication), 선택가능한 마커, 제한된 수의 유용한 제한 효소 부위 및 고 카피 수를 위한 퍼텐셜(potential for high copy number)을 포함한다. 발현 벡터의 예는 복제 벡터, 변형된 복제 벡터(modified cloning vectors), 특별히 디자인된 플라스미드 및 바이러스이다. 서로 다른 숙주 내에서 적절한 수준의 폴리펩티드를 제공하는 발현 벡터는 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 상화성(compatibility)에 의존적일 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 환형 이중 가닥 DNA 분자이다.

상기 기술되는 바와 같은 핵산, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다. 따라서 본 발명은 숙주 세포를 형질전환시키거나, 형질감염시키거나, 형질도입시키기 위한 본 발명에 따른 핵산, 발현 카세트 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입되어야 하는 숙주 세포와 벡터의 상화성에 의존적일 수 있다.

본 발명에 따르면, 숙주 세포는 일시적이거나 안정한 방식으로 형질전환되거나, 형질감염되거나, 형질도입될 수 있다. 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 카세트 또는 벡터가 염색체 통합체(chromosomal integrant)로서 또는 자가-복제 염색체 외 벡터(self-replicating extra-chromosomal vector)로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 또한 복제 동안 일어나는 돌연변이로 인하여 부모 숙주 세포와 동일하지 않는 부모 숙주 세포의 임의의 자손(progeny)을 포함한다. 숙주 세포는 본 발명의 변종의 생산에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 원핵 숙주 세포는 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다. 숙주 세포는 또한 효모, 진균, 포유 동물, 곤충 또는 식물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 특정한 구현예에서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 트리코데르마(Trichoderma), 아스퍼질러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 비브리오(Vibrio) 또는 야로위아(Yarrowia)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 핵산, 발현 카세트 또는 발현 벡터는 전기천공(electroporation), 접합(conjugation), 형질도입, 활성화 세포 형질전환(competent cell transformation), 원형질체 형질전환(protoplast transformation), 원형질체 융합(protoplast fusion), 입자사출 "유전자 총" 형질전환(biolistic "gene gun" transformation), PEG-매개 형질전환(PEG-mediated transformation), 지질-보조 형질전환(lipid-assisted transformation) 또는 형질감염, 화학적으로 매개된 형질감염, 리튬 아세테이트-매개 형질전환, 리포좀-매개 형질전환과 같이 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

임의선택적으로, 본 발명의 핵산, 카세트 또는 벡터의 하나 이상의 카피가 숙주 세포 내로 삽입되어 변종의 생산을 증가시킬 수 있다.

특정한 구현예에서, 숙주 세포는 재조합 미생물이다. 본 발명은 실제로 폴리에스테르 함유 물질을 분해하는 개선된 능력을 수반하는 미생물의 가공을 허용한다. 예를 들어, 본 발명의 서열은 균주 능력을 개선하고/하거나 증가시키도록 폴리에스테르를 분해할 수 있는 것으로 이미 공지된 진균 또는 박테리아의 야생형 균주를 보완하는 데 사용될 수 있다.

에스테라아제의 생산

에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계 및 임의선택적으로 에스테라아제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 에스테라아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.

특히, 본 발명은 (a) 본 발명의 핵산, 카세트 또는 벡터를 시험관 내 발현 시스템과 접촉시키는 단계; 및 (b) 생산된 에스테라아제를 회수하는 단계;를 포함하는, 본 발명의 에스테라아제의 시험관 내 생산 방법에 관한 것이다. 시험관 내 발현 시스템들은 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있고 상용적으로 획득가능하다.

바람직하게는, 생산 방법은 하기를 포함한다:

(a) 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 핵산을 발현하기에 적절한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 임의선택적으로

(b) 세포 배양물로부터 상기 에스테라아제를 회수하는 단계.

유리하게도, 숙주 세포는 재조합 바실러스, 재조합 대장균, 재조합 아스퍼질러스, 재조합 트리코데르마, 재조합 스트렙토마이세스, 재조합 사카로마이세스, 재조합 피키아, 재조합 비브리오 또는 재조합 야로위아이다.

숙주 세포는 당해 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여, 폴리펩티드의 생산에 적절한 영양 배지 중에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 효소가 발현되고/되거나 단리되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 수행되는 실험실용 또는 산업용 발효기 내에서의 진탕 플라스크 배양 또는 소-규모 발효 또는 대-규모 발효(연속식 발효, 배치식 발효, 공급물-배치식 발효 또는 고체상 발효)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 상업적인 공급업자로부터 공급되거나 공개된 조성물(예를 들어, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 따라 제조된 적절한 영양 배지 중에서 일어난다.

에스테라아제가 영양 배지 내로 분비되는 경우, 에스테라아제는 직접적으로 배양 상청액(culture supernatant)으로부터 회수될 수 있다. 역으로, 에스테라아제는 세포 용해물로부터 또는 투과화(permeabilisation) 후 회수될 수 있다. 에스테라아제는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 에스테라아제는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침강을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 통상적인 절차로 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 임의선택적으로, 에스테라아제는 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 크기 배제 크로마토그래피), 전기천공 절차(예를 들어, 제조용 등전점 집중화(preparative isoelectric focusing)), 차등 용해도(differential solubility: 예를 들어, 황산암모늄 침강), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하나 이들로 제한되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 절차에 의해 부분적으로 또는 전적으로 정제되어 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수득할 수 있다.

에스테라아제는 그 자체로, 정제된 형태로, 단독으로 또는 추가의 효소와 함께 폴리에스테르를 함유하는 플라스틱 제품과 같은 폴리에스테르(들) 및/또는 폴리에스테르 함유 물질의 분해 및/또는 재생에 포함되는 효소 반응을 촉매하도록 사용될 수 있다. 에스테라아제는 가용성 형태 또는 고체 상으로 존재할 수 있다. 특히, 에스테라아제는 세포 막 또는 지질 소낭(lipid vesicles)에 또는 예를 들어 비드, 컬럼, 플레이트 등의 형태의 유리, 플라스틱, 폴리머, 필터, 멤브레인과 같은 합성 지지체에 결합될 수 있다.

조성물

본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포 또는 이들의 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다. 본 발명의 설명에서, 용어 "조성물(composition)"은 본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포을 포함하는 임의의 종류의 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 30중량%, 보다 더 바람직하게는 0.1중량% 내지 5중량%의 에스테라아제를 포함할 수 있다. 대안으로, 조성물은 5 내지 10중량%의 본 발명의 에스테라아제를 포함할 수 있다.

조성물은 액체 또는 예를 들어 분말의 형태의 건조물일 수 있다. 일부 구현예들에서, 조성물은 동결건조물이다.

조성물은 부형제 및/또는 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 생화학에서 통상적으로 사용되는 완충제, pH를 조정하기 위한 시약, 소듐 벤조에이트, 소듐 소르베이트 또는 소듐 아스코르베이트와 같은 방부제들, 보존제들, 전분, 덱스트린, 아라비아 검 등과 같은 보호 또는 안정화제, 염, 소르비톨, 트레할로스 또는 락토오스와 같은 당류, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 프로필렌 글리콜, EDTA와 같은 금속봉쇄제(sequestering agent), 환원제, 아미노산, 용매 또는 수용액과 같은 담체 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 에스테라아제를 하나 또는 여러 부형제를 혼합하는 것에 의하여 수득될 수 있다.

특정한 구현예에서, 조성물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1중량% 내지 99.9중량%, 바람직하게는 50중량% 내지 99.9중량%, 보다 바람직하게는 70중량% 내지 99.9중량%, 보다 더 바람직하게는 95중량% 내지 99.9중량%의 부형제(들)를 포함한다. 대안으로, 조성물은 90중량% 내지 95중량%의 부형제(들)를 포함할 수 있다.

특정한 구현예에서, 조성물은 효소 활성을 나타내는 추가의 폴리펩티드(들)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 에스테라아제의 양은 예를 들어, 분해되어야 할 폴리에스테르의 속성 및/또는 조성물 중에 포함된 추가의 효소/폴리펩티드에 따라 당해 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 용이하게 채택될 수 있을 것이다.

특정한 구현예에서, 본 발명의 에스테라아제는 하나 또는 여러 부형제, 특히 폴리펩티드를 분해로부터 안정화하거나 보호할 수 있는 부형제과 함께 수성 매질 중에 용해된다. 예를 들어, 본 발명의 에스테라아제는 궁극적으로 글리세롤, 소르비톨, 덱스트린, 전분, 프로판디올과 같은 글리콜, 염 등과 같은 추가의 구성성분들과 함께 수 중에 용해될 수 있다. 계속해서 그 결과의 혼합물은 건조되어 분말로 수득될 수 있다. 이러한 혼합물을 건조시키기 위한 방법은 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 충분히 공지되어 있고, 제한 없이, 동결건조, 냉동-건조, 분무-건조, 초임계 건조, 하향류 증발(down-draught evaporation), 박층 증발, 원심분리 증발, 컨베이어 건조, 유동층 건조, 드럼 건조 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

특정한 구현예에서, 조성물은 분말 형태로 존재하고 에스테라아제 및 안정화/가용화 양의 글리세롤, 소르비톨 또는 말토덱스트린 및/또는 사이클로덱스트린과 같은 덱스트린, 전분, 프로판디올과 같은 글리콜 및/또는 염을 포함한다.

특정한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 에스테라아제를 발현하는 적어도 하나의 재조합 세포 또는 그의 추출물을 포함한다. "세포의 추출물"은 세포 상청액, 세포 부스러기, 세포 벽, DNA 추출물, 효소 또는 효소 제제 또는 화학적, 물리적 및/또는 효소적 처리에 의해 세포로부터 파생되는 임의의 제제와 같은 세포로부터 수득되는 임의의 분획물을 규정하며, 이는 필수적으로 살아있는 세포들을 포함하지 않는다. 효소적으로-활성인 추출물이 바람직한 추출물이다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 또는 여러 재조합 세포 또는 그의 추출물 및 임의선택적으로 하나 또는 여러 추가의 세포를 포함할 수 있다.

하나의 구현예에서, 조성물은 본 발명의 에스테라아제를 발현하고 분비하는 재조합 미생물의 배양 배지로 이루어지거나 이를 포함한다. 특정한 구현예에서, 조성물은 동결건조된 이러한 배양 배지를 포함한다.

에스테라아제의 용도

호기성 또는 혐기성 조건에서 폴리에스테르 또는 폴리에스테르 함유 물질을 분해 및/또는 재생하기 위한 본 발명의 에스테라아제를 사용하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다. 본 발명의 에스테라아제는 PET 및 PET 함유 물질을 분해하는 데 특히 유용하다.

따라서 폴리에스테르의 효소적 분해를 위하여 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 또는 조성물을 사용하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다.

특정한 구현예에서, 에스테라아제에 의해 표적화되는 폴리에스테르는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르비드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리유산(PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 숙시네이트(PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA), 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 및 이들 물질들의 블렌드들/혼합물, 바람직하게는 폴리에틸렌 테레프탈레이트로부터 선택된다.

바람직한 구현예에서, 폴리에스테르는 PET이고, 그리고 적어도 모노머(예를 들어, 모노에틸렌 글리콜 또는 테레프탈산) 및/또는 올리고머(예를 들어, 메틸-2-하이드록시에틸 테레프탈레이트(MHET), 비스(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트(BHET), 1-(2-하이드록시에틸) 4-메틸 테레프탈레이트(HEMT) 및 디메틸 테레프탈레이트(DMT))이 회수된다.

또한 폴리에스테르 함유 물질의 적어도 하나의 폴리에스테르의 효소적 분해를 위하여 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 또는 조성물을 사용하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다.

폴리에스테르 함유 물질의 적어도 하나의 폴리에스테르를 분해하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이고, 여기에서 폴리에스테르 함유 물질이 본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포 또는 그 추출물 또는 조성물과 접촉되고, 그에 의하여 폴리에스테르 함유 물질의 적어도 하나의 폴리에스테르를 분해한다.

유리하게도, 폴리에스테르(들)는 모노머 및/또는 올리고머까지 해중합된다.

특히, 본 발명은 PET 함유 물질의 PET를 분해하는 방법을 제공하며, 여기에서 PET 함유 물질이 본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포 또는 조성물과 접촉되고, 그에 의하여 PET가 분해된다.

하나의 구현예에서, 적어도 하나의 폴리에스테르가 재중합가능한 모노머 및/또는 올리고머로 분해되고, 이들은 유리하게도 재사용되도록 회수될 수 있다. 회수된 모노머/올리고머는 재생(예를 들어, 폴리에스테르를 재중합) 또는 메탄화(methanization)를 위하여 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 적어도 하나의 폴리에스테르는 PET이고, 모노에틸렌 글리콜, 테레프탈산, 메틸-2-하이드록시에틸 테레프탈레이트(MHET), 비스(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트(BHET), 1-(2-하이드록시에틸) 4-메틸 테레프탈레이트(HEMT) 및/또는 디메틸 테레프탈레이트(DMT)가 회수된다.

하나의 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질의 폴리에스테르(들)가 충분히 분해된다.

폴리에스테르 함유 물질을 분해하는 데 요구되는 시간은 폴리에스테르 함유 물질 자체(즉, 폴리에스테르 함유 물질의 속성 및 유래, 그의 조성, 형상 등), 사용되는 에스테라아제의 형태 및 양과 마찬가지로 여러 공정 매개변수(즉, 온도, pH, 추가 시약 등)에 따라 변할 수 있다. 당해 기술분야에서 통상의 기술자는 폴리에스테르 함유 물질 및 가시적인 분해 시간에 공정 매개변수를 용이하게 적용할 수 있을 것이다.

유리하게도, 분해 공정은 20℃ 내지 90℃, 바람직하게는 40℃ 내지 90℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 70℃에 포함되는 온도에서 수행된다. 특정한 구현예에서, 분해 공정은 60℃에서 수행된다. 다른 특정한 구현예에서, 분해 공정은 65℃에서 수행된다. 다른 특정한 구현예에서, 분해 공정은 70℃에서 수행된다. 보다 일반적으로, 온도는 에스테라아제가 비활성화되고(즉, 최적 온도에서의 활성에 비하여 80% 이상의 활성이 소실) 그리고/또는 재조합 미생물이 더 이상 에스테라아제를 합성하지 않는 온도에 해당하는 비활성화 온도 미만으로 유지된다. 특히, 온도는 표적화된 폴리에스테르의 유리전이온도(Tg) 미만으로 유지된다.

유리하게도, 공정은 연속 흐름 공정에서, 에스테라아제가 여러 차례 사용되고/되거나 재활용될 수 있는 온도에서 수행된다.

유리하게도, 분해 공정은 5 내지 9에 포함되는 pH에서, 바람직하게는 6 내지 9의 pH에서, 보다 바람직하게는 6.5 내지 9의 pH에서, 보다 더 바람직하게는 6.5 내지 8의 pH에서 수행된다.

특정한 구현예에서, 폴리에스테르 함유 물질은 에스테라아제와 접촉되기 이전에 그의 구조를 물리적으로 변화시키도록 전처리되어 폴리에스테르와 에스테라아제 간의 접촉의 표면을 증가시키도록 할 수 있다.

폴리에스테르 함유 물질을 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 또는 조성물에 노출시키는 단계 및 임의선택적으로 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리에스테르 함유 물질로부터 모노머 및/또는 올리고머를 제조하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.

해중합의 결과의 모노머 및/또는 올리고머는 순차적으로 또는 연속적으로 회수될 수 있다. 출발 폴리에스테르 함유 물질에 따라 단일 형태의 모노머 및/또는 올리고머 또는 여러 서로 다른 형태의 모노머 및/또는 올리고머이 회수될 수 있다.

본 발명의 방법은 PET 및/또는 PET를 함유하는 플라스틱 제품으로부터 모노에틸렌 글리콜 및 테레프탈산으로부터 선택되는 모노머 및/또는 메틸-2-하이드록시에틸 테레프탈레이트(MHET), 비스(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트(BHET), 1-(2-하이드록시에틸) 4-메틸 테레프탈레이트(HEMT) 및 디메틸 테레프탈레이트(DMT)로부터 선택되는 올리고머를 생산하는데 특히 유용하다.

회수된 모노머 및/또는 올리고머는 모든 적절한 정제 방법을 사용하여 추가로 정제되고 재중합가능한 형태로 조건화될 수 있다.

회수된 재중합가능한 모노머 및/또는 올리고머이 재사용되어 예를 들어 폴리에스테르를 합성할 수 있다. 유리하게도, 동일한 속성의 폴리에스테르가 재중합된다. 그러나, 예를 들어 신재 코폴리머을 합성하기 위하여 회수된 모노머 및/또는 올리고머를 다른 모노머 및/또는 올리고머과 혼합하는 것이 가능하다. 대안으로, 대상의 신재 화합물을 제조하기 위하여 회수된 모노머는 중간체로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 폴리에스테르 함유 물질을 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 또는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는, 폴리에스테르 함유 물질의 표면 가수분해 또는 표면 관능화의 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 폴리에스테르 물질의 친수성 또는 물 흡수능을 증가시키는 데 특히 유용하다. 이러한 증가된 친수성은 직물 제조, 전자 및 생물의학 응용예에서 특히 흥미로울 수 있다.

본 발명의 에스테라아제 및/또는 상기 에스테라아제를 발현하고 분비하는 재조합 미생물이 포함된 폴리에스테르 함유 물질을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다. 하나의 예로서, 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 이러한 폴리에스테르 함유 물질을 제조하기 위한 방법이 특허 출원 WO2013/093355, WO2016/198650, WO2016/198652, WO2019/043145 및 WO2019/043134에 기술되어 있다.

따라서 본 발명의 에스테라아제 및/또는 재조합 세포 또는 그의 추출물 및/또는 조성물과 적어도 PET를 포함하는 폴리에스테르 함유 물질을 제공하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다. 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 PET 및 PET 분해 활성을 갖는 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 플라스틱 제품을 제공한다.

따라서 본 발명의 에스테라아제 및/또는 재조합 세포 또는 그의 추출물 및/또는 조성물과 적어도 PBAT를 포함하는 폴리에스테르 함유 물질을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다. 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 PBAT 및 PBAT 분해 활성을 갖는 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 플라스틱 제품을 제공한다.

따라서 본 발명의 에스테라아제 및/또는 재조합 세포 또는 그의 추출물 및/또는 조성물과 적어도 PBS를 포함하는 폴리에스테르 함유 물질을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다. 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 PBS 및 PBS 분해 활성을 갖는 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 플라스틱 제품을 제공한다.

따라서 본 발명의 에스테라아제 및/또는 재조합 세포 또는 그의 추출물 및/또는 조성물과 적어도 PCL을 포함하는 폴리에스테르 함유 물질을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다. 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 PCL 및 PCL 분해 활성을 갖는 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 플라스틱 제품을 제공한다.

전통적으로, 본 발명의 에스테라아제는 세제, 식품, 동물 사료, 종이 제조, 직물 및 약제학적 응용예에서 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 세제 조성물의 구성성분으로서 사용될 수 있다. 세제 조성물은, 제한 없이, 얼룩진 패브릭의 전처리 및 첨가된 패브릭 유연제 조성물을 세정하기에 적절한 세탁 첨가 조성물과 같은 손세탁 및 기계세탁 세제 조성물, 일반적으로 가정용 경질 표면 세척 작업에서 사용하기 위한 세제 조성물, 손 식기세척 및 기계 식기세척 작업을 위한 세제 조성물을 포함한다. 특정한 구현예에서 본 발명의 에스테라아제는 세제 첨가제로서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 세제 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 직물 세정 동안 파일링(pilling) 및 백화 효과(greying effects)을 감소시키기 위한 세제 첨가제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 동물 사료에서 본 발명의 에스테라아제를 사용하는 방법과 마찬가지로 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 사료 조성물 및 사료 첨가제에 관한 것이다. 용어 "사료(feed)" 및 "사료 조성물(feed composition)"은 동물에 의해 섭취되기에 적절하거나 섭취되도록 의도되는 임의의 화합물, 제제, 혼합물 또는 조성물을 의미한다. 다른 특정한 구현예에서, 본 발명의 에스테라아제는 단백질을 가수분해하고 그리고 펩티드를 포함하는 가수분해물을 생산하는 데 사용된다. 이러한 가수분해물은 사료 조성물 또는 사료 첨가제로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 에스테라아제를 종이 제조 산업에서 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 종이 펄프 및 종이 기계의 워터 라인에서 점착물을 제거하는데 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1 - 에스테라아제의 작제, 발현 및 정제

- 작제

플라스미드 작제물를 사용하여 본 발명에 따른 에스테라아제가 생성되었다. 이러한 플라스미드는 pET-26b(+) 발현 벡터(Merck Millipore, Molsheim, France)의 NdeI와 XhoI 제한 부위(restriction sites) 사이에서 대장균 발현에 대하여 최적화된, 서열 번호 1의 에스테라아제를 인코딩하는 유전자를 복제하는 것으로 이루어진다. PelB 리더 서열을 위한 뉴클레오티드 서열 코딩이 서열 번호 1과 NdeI 제한 부위 사이에 추가되었다. 발현된 융합 단백질은, 서열 번호 1과 동일하지만 C-말단 아미노산 연장부가 부가된 기능적 단백질을 제공하는 신호 펩티다아제에 의해 PelB 리더 서열이 제거된 세균 주변세포질로 향한다.

2개의 부위 지향적 돌연변이 키트가 공급업자의 추천에 따라 사용되어 에스테라아제 변종을 생성하였다: Agilent의 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis 키트 및 QuikChange Lightning Multi Site-Directed(Santa Clara, California, USA).

- 에스테라아제의 발현 및 정제

균주 Stellar™ (Clontech, California, USA) 및 E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs, Evry, France) 을 연속적으로 사용하여 50 ㎖ LB-Miller 배지 또는 ZYM 자가 유도성 배지(Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234) 중에서 복제 및 재조합 발현을 수행하였다. LB-Miller 배지 중에서의 유도는 16℃에서 0.5 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG, Euromedex, Souffelweyersheim, France)로 수행되었다. Avanti J-26 XP 원심분리기(Beckman Coulter, Brea, USA) 내에서의 원심분리(10℃에서 8000 rpm, 20 분)에 의하여 배양이 중단되었다. 세포는 20㎖의 Talon 완충제(Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, pH 8) 중에 현탁되었다. 계속해서 세포 현탁액을 2 분 동안 FB 705 소니케이터(Fisherbrand, Illkirch, France)로 30%의 진폭(2 초 ON 및 1 초 OFF 사이클)으로 음파처리하였다. 계속해서, 원심분리의 단계가 실현되었다: Eppendorf 원심분리기 내에서 10000 g, 10℃에서 30 분. 가용성 분획을 수집하고 친화도 크로마토그래피에 적용시켰다. 이러한 정제 단계는 Talon® Metal Affinity Resin(Clontech, CA, USA)으로 완성되었다. 이미다졸로 보충된 Talon 완충제의 단계로 단백질 용리가 실행되었다. 정제된 단백질이 Talon 완충제에 대하여 투석되었고 계속해서 제조업자(Lifescience Bio-Rad, France) 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석기를 사용하여 정량되었고 +4℃에 저장하였다.

실시예 2 - 에스테라아제의 분해 활성의 평가

에스테라아제의 분해 활성이 결정되었고 서열 번호 1의 에스테라아제의 활성과 비교되었다.

비활성(specific activity)을 평가하기 위한 여러 방법론이 사용되었다:

(1) PET 가수분해에 기반하는 비활성

(2) 고체 형태 하에서의 폴리에스테르의 분해에 기반하는 활성

(3) 100 ㎖ 초과 반응기 내에서의 PET 가수분해에 기반하는 활성

2.1. PET 가수분해에 기반하는 비활성

100 ㎎의 분말 형태의 비정질 PET (20% 미만의 결정화도에 달하도록 WO 2017/198786에 따라 제조됨)를 평량하고 100 ㎖ 유리병 내로 도입시켰다. Talon 완충제(Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.3 M, pH 8) 중의 0.69 μM로 제조된, 서열 번호 1의 에스테라아제(기준 대조로서) 또는 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 에스테라아제 제제 1 ㎖를 유리병 내에 도입시켰다. 마지막으로, 0.1 M 인산칼륨 완충제(pH 8) 49 ㎖를 첨가하였다.

각 유리병을 Max Q 4450 배양기(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA) 내에서 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃, 및 150 rpm에서 배양시켜 해중합을 개시하였다.

시간 당 생성된 당량 TA의 ㎎으로의 해중합 반응의 초기 비율을 처음 24시간 동안 서로 다른 시간에서 수행된 샘플링에 의해 결정하였고 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다. 필요한 경우, 샘플을 0.1 M 인산칼륨 완충제(pH 8)에 희석시켰다. 계속해서, 메탄올 150 ㎕ 및 6 N HCl 6.5 ㎕를 샘플 또는 샘플 희석액 150 ㎕에 첨가하였다. 혼합 및 0.45 ㎛ 주사기 필터로 여과한 후, 샘플을 UHPLC에 적재하여 테레프탈산(TA), MHET 및 BHET의 유리를 모니터링 하였다. 사용된 크로마토그래피 시스템은 펌프 모듈, 오토샘플러(autosampler), 25℃로 온도조절된 컬럼 오븐 및 240 ㎚에서의 UV 검출기를 포함하는 Ultimate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)이었다. 사용된 컬럼은 Discovery® HS C18 HPLC 컬럼(150 x 4.6 ㎜, 5 ㎛, 프리컬럼(precolumn)이 장착됨, Supelco, Bellefonte, USA)이었다. 1 ㎖/분의 속도에서 1 mM의 H₂SO₄ 중의 MeOH의 경사(30% 내지 90%)를 사용하여 TA, MHET 및 BHET를 분리시켰다. 20 ㎕의 샘플이 주입되었다. 샘플과 동일한 조건에서 상용 TA 및 BHET 그리고 자가합성된(in house synthetized) MHET로부터 준비된 표준 곡선에 따라 TA, MHET 및 BHET를 측정하였다. 처음 72 시간 동안 서로 다른 시간에서 수행된 샘플링에 의해 설정된 곡선과 같은 반응의 가수분해 곡선의 직선 부분에서 PET 가수분해의 비활성(㎎ 단위의 당량 TA/시간/㎎의 효소)을 결정하였다. 당량 TA는 측정된 TA와 측정된 MHET 및 BHET에 포함된 TA의 합에 해당한다. 상기 당량 TA의 특정은 또한 주어진 시간에서 PET 해중합 분석의 수율을 반영하는데 사용될 수 있다.

2.2. 고체 형태 하의 폴리에스테르의 분해에 기반하는 활성

효소 제제 20 ㎕를 PET를 포함하는 한천 플레이트 내에 생성된 웰 내에 퇴적시켰다. 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP) 중에 PET 500 ㎎을 용해시키고 이 배지를 250 ㎖ 수성 용액 내에 부어 넣어 PET를 포함하는 한천 플레이트를 제조하였다. 52℃에서 140 mbar 하에서의 HFIP 증발 이후, 용액을 3% 한천을 포함하는 0.2 M 인산칼륨 완충제(pH 8)와 용적비(v/v)로 혼합하였다. 혼합물 대략 30 ㎖을 사용하여 각 플레이트를 제조하고 4℃에서 저장하였다.

야생-형 에스테라아제와 변종에 의한 폴리에스테르 분해로 인하여 형성된 공간(halo)의 직경 또는 표면적을 측정하고 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃에서의 2 내지 24 시간 후에서와 비교하였다.

2.3. 반응기 내에서의 PET 가수분해에 기반하는 활성

500 ㎖ Minibio 생물반응기(Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands) 내에서 100 mM 인산칼륨 완충제(pH 8) 80 ㎖ 중에서 제조된 0.69 μmol 내지 2.07 μmol의 정제된 에스테라아제를 20 g의 비정질 PET(20% 미만의 결정화도에 달하도록 WO 2017/198786에 따라 제조됨)와 혼합하였다. 수욕(water bath)에 침지시켜 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃로 온도 조절을 수행하고 단축의 해상용 임펠러(single marine impeller)를 사용하여 250 rpm에서 정속 교반(constant agitation)을 유지시켰다. PET 해중합 분석의 pH는 6N NaOH로 pH 8로 조절되었고 my-Control bio controller system(Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands)으로 확인되었다. 분석 동안 염기 소모가 기록되었고 PET 해중합 분석의 특정을 위하여 사용될 수 있다.

잔류 PET 중량의 결정에 의하거나 또는 생성된 당량 TA의 결정에 의하여 또는 염기 소모를 통하여 PET 해중합 분석의 최종 수율이 결정되었다. 잔류 PET의 중량 결정은, 반응의 종점에서, 12 내지 15 ㎛, 11급(grade 11) 무회분 여과지(ashless paper filter: Dutscher SAS, Brumath, France)를 통한 반응 용적의 여과 및 이러한 잔류물(retentate)의 건조 후 평량에 의해 평가되었다. 생성된 당량 TA의 결정을 2.1에서 기술된 UHPLC 법을 사용하여 구현하였고, 가수분해의 백분율은 주어진 시간에서의 (TA + MHET + BHET) 몰 농도 대 초기 샘플 중에 포함된 TA의 총량의 비율에 기초하여 산출되었다. PET 해중합은 반응기 내의 pH를 유지하도록 할 수 있는 염기로 중화될 수 있는 산성 모노머를 생성하였다. 생성된 당량 TA의 결정이 대응하는 염기 소모를 사용하여 산출되었고, 가수분해의 백분율은 주어진 시간에서의 몰 농도의 당량 TA의 몰 농도 대 초기 샘플 중에 포함된 TA의 총량의 비율에 기초하여 산출되었다.

24 시간 후에 본 발명의 에스테라아제(변종)의 PET 해중합 수율을 표 1(50℃에서) 및 표 2(65℃에서)에 표시하였다. 두 표는 참조로서 사용된 서열 번호 1의 에스테라아제의 PET 해중합 수율과 비교하여 본 발명의 변종의 PET 해중합 수율의 향상을 나타낸다(PET 해중합 수율은 1과 동일한 것으로 고려됨).

PET 해중합 수율이 실시예 2.1에 나타낸 바와 같이 측정되었다.

서열 번호 1의 에스테라아제와 비교하여 50℃에서 24 시간 후에 본 발명의 에스테라아제의 PET 해중합 수율의 향상

변종	서열 번호 1과 비교한 PET 해중합 수율의 향상
V1　: F209I + D204C + E253C + Q92G	4.4 배
V2　: F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E	9.5 배
V3　: F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E	12.4 배
V4　: F209I	2.4 배

변종 V1-V4는 각각, 표 1에 나열된 치환 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 규정된 것과 같은 정확한 아미노산 서열을 갖는다.

표 1은 모든 변종의 50℃에서의 PET 해중합 수율이 서열 번호 1의 에스테라제의 PET 해중합 수율보다 적어도 2.4배 이상 높다는 것을 보여준다.

서열 번호 1의 에스테라아제와 비교하여 65℃에서 24 시간 후에 본 발명의 에스테라아제의 PET 해중합 수율의 향상

변종	서열 번호 1과 비교한 PET 해중합 수율의 향상
V1　: F209I + D204C + E253C + Q92G	11 배
V2　: F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E	25.7 배
V3　: F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E	15.9 배

변종 V1-V3는 각각, 표 2에 나열된 치환 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 규정된 것과 같은 정확한 아미노산 서열을 갖는다.

표 2는 모든 변종의 65℃에서의 PET 해중합 수율이 서열 번호 1의 에스테라제의 PET 해중합 수율보다 적어도 11배 이상 높다는 것을 보여준다.

본 발명의 에스테라제(변이체)의 특정 분해 활성을 아래 표 3에 나타내었다. 서열 번호 1의 에스테라아제의 특정 분해 활성이 참조로 사용되며 100% 특정 분해 활성으로 간주된다. 특정 분해 활성은 65℃에서 실시예 2.1에서 나타낸 바와 같이 측정됩니다.

본 발명의 변종의 PET 특정 분해 활성

변종	특정 분해 활성
V1　: F209I + D204C + E253C + Q92G	1040%
V2　: F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E	2738%
V3　: F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E	1958%

변종 V1-V3는 각각, 표 3에 나열된 치환 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 규정된 것과 같은 정확한 아미노산 서열을 갖는다.

실시예 3 - 본 발명의 에스테라아제의 열안정성의 평가

본 발명의 에스테라아제의 열안정성을 결정하였고 그리고 서열 번호 1의 에스테라아제의 열안정성과 비교하였다.

서로 다른 방법론을 사용하여 열안정성을 추정하였다:

(1) 용액 중의 단백질의 원이색법;

(2) 온도, 시간 및 완충제의 주어진 조건에서의 단백질 배양 후 잔류 에스테라아제 활성;

(3) 온도, 시간 및 완충제의 주어진 조건에서의 단백질 배양 후 잔류 폴리에스테르의 해중합 활성;

(4) 온도, 시간 및 완충제의 주어진 조건에서의 단백질 배양 후 한천 플레이트 중에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물(PET 또는 PBAT 또는 유사체와 같은)을 분해하는 능력;

(5) 온도, 완충제, 단백질 농도 및 폴리에스테르 농도의 주어진 조건에서의 다중 회의 폴리에스테르의 해중합 분석을 수행하는 능력;

(6) 시차주사형광법(DSF: Differential Scanning Fluorimetry).

이러한 방법의 프로토콜에 대한 세부사항이 하기에 주어진다.

3.1 원이색법

원이색법(CD)을 Jasco 815 장치(Easton, USA)로 수행하여 서열 번호 1의 에스테라아제의 용융 온도(Tm)를 본 발명의 에스테라아제의 Tm과 비교하였다. 기술적으로 Talon 완충제 중에 0.5 ㎎/㎖로 400 ㎕의 단백질 샘플을 제조하였고 CD를 위하여 사용하였다. 280 내지 190 ㎚의 1차 주사를 실현하여 단백질의 정확한 접힘에 해당하는 CD의 2개의 최대 세기를 결정하였다. 계속해서 그러한 최대 세기에 해당하고 비곡선(specific curves: S자형 3 매개변수 y=a/(1+e^((x-x0)/b)))을 제공하는 길이 파장에서 25℃ 내지 110℃에서 2차 주사를 수행하고 이를 Sigmaplot version 11.0 소프트웨어로 분석하였고, x=x0인 경우에서 Tm이 결정되었다. 수득된 Tm은 주어진 단백질의 열안정성을 반영한다. Tm이 높을수록 변종이 고온에서 더 안정하다.

3.2 잔류 에스테라아제 활성

서열 번호 1의 에스테라아제 또는 본 발명의 에스테라아제의 40 ㎎/ℓ(Talon 완충제 중)의 용액 1 ㎖를 서로 다른 온도(40, 50, 60, 65, 70, 75, 80 및 90℃)에서 10 일 이하 동안 배양시켰다. 정기적으로, 샘플을 취하고, 0.1 M 인산칼륨 완충제(pH 8) 중에 1 내지 500 배 희석시키고 파라 니트로 페놀-부티레이트(pNP-B: para nitro phenol-butyrate) 분석을 실현하였다. 20 ㎕의 샘플을 0.1 M 인산칼륨 완충제(pH 8.0) 175 ㎕ 및 2-메틸-2 부탄올 중의 pNP-B 용액(40 mM) 5 ㎕와 혼합시켰다. 효소 반응을 30℃에서 교반 하에서 15 분 동안 수행하고 마이크로플레이트 분광광도계(Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 405 ㎚에서 흡광도를 획득하였다. pNP-B 가수분해의 활성(pNPB/분의 μmol로 표현된 초기 비율)을 가수분해 비율의 직선 부분에서 유리된 파라 니트로 페놀에 대한 표준 곡선을 사용하여 결정하였다.

3.3 잔류 폴리에스테르 해중합 활성

서열 번호 1의 에스테라아제 및 본 발명의 에스테라아제 각각의 40 ㎎/ℓ(Talon 완충제 중)의 용액 10 ㎖을 서로 다른 온도(40, 50, 60, 65, 70, 75, 80 및 90℃)에서 30 일 이하 동안 배양시켰다. 정기적으로, 샘플 1 ㎖을 취하고, 250 내지 500 ㎛로 미분된 비정질 PET(20% 미만의 결정화도에 달하도록 WO 2017/198786에 따라 제조됨) 100 ㎎ 및 0.1 M 인산칼륨 완충제(pH 8.0) 49 ㎖를 포함하는 병 내로 옮기고 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃에서 배양하였다. 완충제 150 ㎕를 정기적으로 샘플링하였다. 필요한 경우, 샘플을 0.1 M 인산칼륨 완충제(pH 8) 중에 희석시켰다. 계속해서, 메탄올 150 ㎕ 및 6N HCl 6.5 ㎕를 샘플 150 ㎕ 또는 희석물에 첨가하였다. 혼합 및 0.45 ㎛ 주사기 필터 상에서 여과한 후, 샘플을 UHPLC에 적재하여 테레프탈산(TA), MHET 및 BHET의 유리를 모니터링하였다. 사용된 크로마토그래피 시스템은 펌프 모듈, 오토샘플러, 25℃로 온도조절된 컬럼 오븐 및 240 ㎚에서의 UV 검출기를 포함하는 Ultimate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)이었다. 사용된 컬럼은 Discovery® HS C18 HPLC 컬럼(150 x 4.6 ㎜, 5 ㎛, 프리컬럼이 장착됨, Supelco, Bellefonte, USA)이었다. 1 ㎖/분의 속도에서 1 mM의 H₂SO₄ 중의 MeOH의 경사(30% 내지 90%)를 사용하여 TA, MHET 및 BHET를 분리시켰다. 20 ㎕의 샘플이 주입되었다. 샘플과 동일한 조건에서 상용 TA 및 BHET 그리고 자가합성된 MHET로부터 준비된 표준 곡선에 따라 TA, MHET 및 BHET를 측정하였다. 처음 24 시간 동안 서로 다른 시간에서 수행된 샘플링에 의해 설정된 곡선과 같은 반응의 가수분해 곡선의 직선 부분에서 PET 가수분해의 활성(분 당 가수분해된 PET의 μmol 또는 시간 당 생성된 당량 TA의 ㎎)을 결정하였다. 당량 TA는 측정된 TA와 측정된 MHET 및 BHET에 포함된 TA의 합에 해당한다.

3.4 고체 형태 하의 폴리에스테르의 분해

서열 번호 1의 에스테라아제 및 본 발명의 에스테라아제의 40 ㎎/ℓ(Talon 완충제 중)의 용액 1 ㎖를 각각 서로 다른 온도(40℃, 50℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 및 90℃)에서 30 일 이하 동안 배양시켰다. 정기적으로, 효소 제제 20 ㎕를 PET를 포함하는 한천 플레이트 내에 생성된 웰 내에 퇴적시켰다. 헥사플루오로-2-프로판올(HFIP) 중에 PET 500 ㎎을 용해시키고 이 배지를 250 ㎖ 수성 용액 내에 부어 넣어 PET를 포함하는 한천 플레이트의 제조를 실현하였다. 52℃에서 140 mbar 하에서의 HFIP 증발 이후, 용액을 3% 한천을 포함하는 0.2 M 인산칼륨 완충제(pH 8)와 용적비로 혼합하였다. 혼합물 대략 30 ㎖을 사용하여 각 옴니트레이를 제조하고 4℃에서 저장하였다.

야생-형 에스테라아제 및 본 발명의 변종에 의한 폴리에스테르 분해로 인하여 형성된 공간의 직경 또는 표면적을 측정하고 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃에서 2 내지 24 시간 후 비교하였다. 주어진 온도에서의 효소의 반감기는 공간의 직경을 2-배량으로 감소시키는 데 요구되는 시간에 해당한다.

3.5 다중 회의 폴리에스테르의 해중합

연속적인 회의 폴리에스테르의 해중합 분석을 수행하기 위한 에스테라아제의 능력을 효소 반응기 내에서 평가하였다. 3 g의 비정질 PET(20% 미만의 결정화도에 달하도록 WO 2017/198786에 따라 제조됨) 및 3 ㎎의 에스테라아제를 포함하는 10 mM 인산칼륨(pH 8) 100 ㎖로 Minibio 500 생물반응기(Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands)를 시작하였다. 해상용 임펠러를 사용하여 교반을 250 rpm으로 설정하였다. 생물반응기를 외부 수욕 내에 함침시켜 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 70℃로 온도조절하였다. 3 M의 KOH를 첨가하여 pH를 8로 조절하였다. BioXpert 소프트웨어 V2.95의 덕분으로 서로 다른 매개변수(pH, 온도, 교반, 염기의 첨가)가 모니터링되었다. 1.8 g의 비정질 PET(20% 미만의 결정화도에 달하도록 WO 2017/198786에 따라 제조됨)을 매 20 시간 마다 첨가하였다. 반응 매질 500 ㎕를 정기적으로 샘플링하였다.

실시예 2.3에서 기술된 바와 같이 HPLC로 TA, MHET 및 BHET의 양을 결정하였다. 65℃로 온도조절된 Aminex HPX-87K 컬럼(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, California, United States)을 사용하여 EG의 양을 결정하였다. 용리액은 0.6 ㎖.min-1의 5 mM K₂HPO₄이었다. 주입은 20 ㎕이었다. 에틸렌 글리콜을 굴절율 측정기를 사용하여 모니터링 하였다.

가수분해의 백분율은 주어진 시간에서의 (TA +MHET + BHET) 몰 농도 대 초기 샘플 중에 포함된 TA의 총량의 비율에 기초하거나, 주어진 시간에서의 (EG +MHET + 2 x BHET) 몰 농도 대 초기 샘플 중에 포함된 EG의 총량의 비율에 기초하여 산출되었다. 분해의 비율은 시간 당 총 유리된 TA의 ㎎으로 또는 시간 당 총 EG의 ㎎으로 산출되었다.

효소의 반감기를 분해 비율의 50%의 손실을 수득하는 데 요구되는 배양 시간으로 평가하였다.

3.6 시차주사형광법(DSF)

DSF를 사용하여 단백질 개체군의 절반이 펼쳐지는 온도인 용융 온도(Tm)를 결정하는 것에 의하여 야생-형 단백질(서열 번호 1) 및 그의 변종의 열안정성을 평가하였다. 단백질 샘플을 14 μM의 농도로 제조하였고 20 mM Tris HCl(pH 8.0), 300 mM NaCl로 이루어지는 완충제 A 중에 저장하였다. DMSO 중의 SYPRO orange dye 5000x 스톡 용액을 먼저 수 중에 250 배까지 희석시켰다. 단백질 샘플을 각 웰이 25 ㎕의 최종 용적을 포함하는 백색의 투명한 96-웰 PCR 플레이트(white clear 96-well PCR plate: Bio-Rad cat# HSP9601)에 적재시켰다. 각 웰 중의 단백질 및 SYPRO Orange 염료의 최종 농도는 각각 5 μM(0.14 ㎎/㎖) 및 10배량(10X)이었다. 웰 당 적재된 용적은 다음과 같다: 완충제 A 15 ㎕, 14 μM 단백질 용액 9 ㎕ 및 Sypro Orange 250배 희석된 용액 1 ㎕. 계속해서 PCR 플레이트를 광학적 품질의 밀봉 테이프(optical quality sealing tape)로 밀봉하고 실온에서 2000 rpm으로 1 분 동안 회전시켰다. 계속해서 450/490 여기 및 560/580 방출 필터를 사용하도록 설정된 CFX96 실시간 PCR 시스템을 사용하여 DSF 실험을 실행하였다. 샘플을 25 내지 100℃까지 0.3℃/초의 속도로 가열하였다. 매 0.03 초 마다 단일의 형광 측정을 취하였다. Bio-Rad CFX Manager 소프트웨어를 사용하여 용융 온도의 제1 변형의 피크(들)로부터 용융 온도를 결정하였다.

계속해서 서열 번호 1의 에스테라아제 및 본 발명의 에스테라아제를 Tm 값에 기초하여 비교하였다. 서로 다른 제조로부터의 동일한 단백질에 대한 실험 간의 높은 재현성으로 인하여, 0.8℃의 ΔTm이 변종을 비교하기에 유의미한 것으로 고려되었다. Tm 값은 적어도 3회의 측정의 평균에 해당한다.

서열 번호 1의 에스테라아제의 Tm은 실시예 3.6에서 노출된 바와 같은 68.0℃ +/-0.2℃ 과 동일하게 평가되었다.

본 발명의 에스테라아제 변종의 열안정성이 하기 표 4에 도시되었으며, Tm 값으로 표현하였고 실시예 3.6에 따라 평가되었다. 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 Tm의 증가가 괄호 내에 표시되었다.

본 발명의 에스테라아제의 Tm

변종	Tm
V1　: F209I + D204C + E253C + Q92G	87.6 ℃(+19.6 ℃)
V2　: F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E	90.0 ℃ (+22.0 ℃)
V3　: F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E	82.6 ℃ (+14.6 ℃)

변종 V1-V3는 각각, 표 4에 나열된 치환 조합을 제외하고는, 서열 번호 1에 규정된 것과 같은 정확한 아미노산 서열을 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> CARBIOS <120> NOVEL ESTERASES AND USES THEREOF <130> IP20234290FR <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 261 <212> PRT <213> Thermobifida fusca <400> 1 Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Pro Thr Asp Ala Leu Leu Glu 1 5 10 15 Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser Arg Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro Arg Glu Asn 35 40 45 Asn Thr Tyr Gly Ala Val Ala Ile Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Glu 50 55 60 Ala Ser Ile Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ile Ala Ser His Gly Phe Val 65 70 75 80 Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser Arg 85 90 95 Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn His Met Ile Asn Arg Ala Ser 100 105 110 Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly 115 120 125 His Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro 130 135 140 Asp Leu Lys Ala Ala Ile Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn 145 150 155 160 Trp Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp 165 170 175 Thr Ile Ala Pro Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu 180 185 190 Pro Ser Ser Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His 195 200 205 Phe Ala Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala 210 215 220 Trp Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu 225 230 235 240 Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr Arg 245 250 255 Ser Thr Cys Pro Phe 260

Claims

(i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장(full length) 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S 로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, 여기에서 포지션들은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 기준으로하여 번호가 매겨지며, (iii) 폴리에스테르 분해 활성을 가지고, 및 (iv) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및/또는 증가된 분해 활성을 가지는, 에스테라아제.
제1항에 있어서,
상기 에스테라아제는 T168Q, F209I/G/H/L/R/T 및 N212D/Q로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 T168Q, F209I 및 N212D로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209I/G/H/L/R/T 및 T168Q로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I 및 T168Q로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 적어도 F209I 치환 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 T11N, D12H, S23P, T50E, A53L, Y60F/M, T61M/V, T63N, A65T, T88S, T89Q, L90W/F, Q92G/P, M107L, S121R, A125G, L152Q, M127V, G135A, S136T, P151A, L157E/G/N/Q/W/T, K159T, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, T207D, F209W/S/A, A210T, N212M, I213F, K216N, Q238D, D246Y/C/E/P, E253C 및 D174R로부터 선택되는 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, F209W/S/A, N212M 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환, 더 바람직하게는 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T177N, T183E, D204C, F209W, N212M 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 더 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 Q92G/P, G135A, T183E, D204C/K/R, F209W/S/A 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G, G135A, T183E, D204C/K/R, F209W 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 더 포함하는, 에스테라아제.
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 에스테라아제는 Q92G/P, G135A, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G, G135A, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 더 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는, 적어도 D204C + E253C 치환 조합을 더 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되는 치환을 포함하고, 및 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환, 바람직하게는 적어도 두 개의 치환, 더 바람직하게는 적어도 세 개의 치환을 포함하는, 에스테라아제.
(i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장(full length) 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고, (ii) F209, T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183, D204, N212 및 E253로부터 선택되는 포지션에서 적어도 세 개의 아미노산 치환, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W, T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E, D204C/K/R, N212D/Q/M 및 E253C로부터 선택되는 포지션에서 적어도 세 개의 아미노산 치환을 갖고, 여기에서 상기 포지션들은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 기준으로하여 번호가 매겨지며, (iii) 폴리에스테르 분해 활성을 가지고, 및 (iv) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및/또는 증가된 분해 활성을 가지는, 에스테라아제.
제10항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W, Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C/K/R, 및 E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/W, Q92G/P, G135A, T168Q, T183E, D204C, 및 E253C로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I, Q92G, G135A, T168Q, T183E, D204C 및 E253C로부터 선택되는 적어도 세 개의 아미노산 치환을 포함하는, 에스테라아제.
제10항 또는 제11항에 있어서,
상기 에스테라아제는, F209 + D204 + E253 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 조합, 더 바람직하게는 F209I/W + D204C + E253C로부터 선택되는 조합을 포함하는, 에스테라아제.
제12항에 있어서,
상기 에스테라아제는 T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183 및 N212로부터 선택되는 포지션에서, 바람직하게는 Q92, G135, T168, 및 T183로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환을 더 포함하는, 에스테라아제.
제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T + D204C + E253C로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 조합을 포함하고, 및 T61M/V, A65T, Q92G/P, G135A, T168Q, T177N/H/Q, T183E및 N212D/Q/M로부터 선택되는, 바람직하게는 Q92G/P, G135A, T168Q 및 T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 Q92G, G135A, T168Q 및 T183E로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는, F209, T61, A65, Q92, G135, T168, T177, T183, D204, N212 및 E253로부터 선택되는 포지션에서 적어도 네 개의 아미노산 치환을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209 + D204 + E253, F209 + D204 + E253 + Q92, F209 + D204 + E253 + N212, F209 + D204 + E253 + Q92 + G135 + T168, F209 + D204 + E253 + Q92 + G135 + T168 + T183, F209 + D204 + E253 + Q92 + T183, 또는 F209 + D204 + E253 + Q92 + T168 + T183로 이루어지는 군으로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209 + D204 + E253 + Q92 포지션에서 적어도 하나의 치환 조합, 바람직하게는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P로부터 선택되는, 더 바람직하게는, F209I/W + D204C + E253C + Q92G로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C + Q92G로부터 선택되는 치환 조합을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + N212D/M/Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C/K/R + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/W + D204C + E253C, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P , F209I/W + D204C + E253C + N212D/M, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T183E , F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C + Q92G, F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E 및 F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 조합을 포함하는, 에스테라아제.
제1항에 있어서,
상기 에스테라아제는, 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여, F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 내지 31개의 아미노산 치환을 가지는, 바람직하게는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 T168Q, F209I/G/H/L/R/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 더 바람직하게는 T168Q, F209I 및 N212D로부터 선택되는 1 내지 3개의 아미노산 치환을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열을 가지는, 에스테라아제.
제1항에 있어서,
상기 에스테라아제의 아미노산 서열은, 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여, F209I/G/H/L/R/T, D12F/Y/R, T50P, T63Q, S66H, W69R, T89R/F, D94S, S121W, T153A, N158Q, T168Q, P180E, A182R, F188I/Y, S197P, E202M, G205C/K, T207L, P211A, N212D/Q, K216P, K220E, Q238T, L240A, P242K, G243Y, P244N, G247A/D/E/H/S, G250C/Y 및 P260S로부터 선택되는, 바람직하게는 T168Q, F209I/G/H/L/R/T 및 N212D/Q로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I/G/H/L/R/T 및 T168Q로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I 및 T168Q로부터 선택되는, 단일의 아미노산 치환을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열로 이루어지는, 에스테라아제.
제20항에 있어서,
상기 단일 치환은 F209I/G/H/L/R/T로부터 선택되며, 바람직하게는 F209I인, 에스테라아제.
제18항에 있어서,
상기 에스테라아제의 아미노산 서열은, 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + N212D/M/Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + T183E, F209I/A/G/H/L/R/S/T/W + D204C + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 바람직하게는 F209I/W + D204C + E253C, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P , F209I/W + D204C + E253C + N212D/M, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + G135A + T168Q + T183E, F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T183E , F209I/W + D204C + E253C + Q92G/P + T168Q + T183E로부터 선택되는, 더 바람직하게는 F209I + D204C + E253C + Q92G, F209I + D204C + E253C + Q92G + T183E 및 F209I + D204C + E253C + Q92G + G135A + T168Q + T183E로부터 선택되는 치환 조합을 가지는, 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 서열로 이루어지는, 에스테라아제.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 D176, H208, S130, M131, C241, C259, G59, H129, G132, W155, I171, I178, P214, D174로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하며, 바람직하게는 상기 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 D176 + H208 + S130, C241 + C259 및 D176 + H208 + S130 + C241 + C259로부터 선택되는, 더 바람직하게는 D176 + H208 + S130 + C241 + C259 + M131 + D174을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 부모 에스테라아제에서와 같이 G59, H129, G132, W155, I171, I178 및 P214로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산, 바람직하게는 I171 및 I178로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 I171 + I178 조합, 더 바람직하게는 부모 에스테라아제에서와 같이 적어도 I171 + I178 + G59 + H129 + G132 + W155 + P214 조합을 포함하는, 에스테라아제.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는, 에스테라아제.
제25항에 있어서,
상기 에스테라아제는 50℃ 내지 65℃의 온도에서, 더 바람직하게는 50℃ 및/또는 65℃에서, 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는, 에스테라아제.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 에스테라아제를 인코딩하는 핵산.
제27항의 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
제27항의 핵산 또는 제28항의 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 에스테라아제, 또는 제29항에 따른 숙주 세포, 또는 그의 추출물을 포함하는, 조성물.
하기 단계를 포함하는, 폴리에스테르를 분해하는 방법:
(a) 폴리에스테르를 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 에스테라아제 또는 제29항에 따른 숙주 세포 또는 제30항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로
(b) 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 단계.
제31항에 있어서,
상기 폴리에스테르는, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌 테레프탈레이트(PBT), 폴리에틸렌 이소소르비드 테레프탈레이트(PEIT), 폴리유산(PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌 숙시네이트(PBS), 폴리부틸렌 숙시네이트 아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌 아디페이트 테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌 푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌 아디페이트)(PEA), 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 및 이들 물질의 블렌드/혼합물로부터 선택되며, 바람직하게는 폴리에틸렌 테레프탈레이트인, 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서,
단계 (a)는 20℃ 내지 90℃, 바람직하게는 40℃ 내지 90℃, 더 바람직하게는 50℃ 내지 70℃의 온도에서 수행되는, 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)는 5 내지 9의 pH의 범위에서, 바람직하게는 6 내지 9의 pH의 범위에서, 더 바람직하게는 6.5 내지 9의 pH의 범위에서 수행되는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 에스테라아제 또는 제29항에 따른 숙주 세포 또는 제30항에 따른 조성물을 포함하는 폴리에스테르 함유 물질(polyester containing material).
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 에스테라아제 또는 제29항에 따른 숙주 세포 또는 제30항에 따른 조성물을 포함하는, 세제(detergent) 조성물.