JP7392029B2 - 新規エステラーゼ及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、新規エステラーゼ、より特定すると親エステラーゼと比較して改善された活性を有するエステラーゼ、及びポリエステル含有材料、例えばプラスチック製品を分解するためのその使用に関する。本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタラート、及びポリエチレンテレフタラートを含有する材料を分解するのに特に適している。
背景
エステラーゼは、ポリエステルをはじめとする様々なポリマーの加水分解を触媒することができる。この脈絡において、エステラーゼは、例えば、食器洗浄及び洗濯に適用するための洗浄剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の解毒における又は繊維工業におけるポリエステル織物の処理のための生体触媒としてなどの、多くの工業的適用において有望な効果を示している。同じように、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用は、特に関心が高い。実際に、ＰＥＴは、数多くの技術分野において、例えば、服、カーペットの製造などにおいて、あるいは包装又は自動車用プラスチック若しくは他のパーツの製造のための熱硬化性樹脂の形で使用され、埋立地におけるＰＥＴの蓄積は、増加しつつあるエコロジー的問題となっている。
エステラーゼの中でもクチン加水分解酵素（ＥＣ３．１．１．７４）としても知られるクチナーゼは特に興味深い。クチナーゼは、様々な真菌（P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borg- stroem and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504）、細菌、及び植物の花粉から同定されている。近年、メタゲノム解析によるアプローチにより、さらなるエステラーゼが同定された。
酵素的分解は、このようなプラスチック廃棄物の蓄積を減少させるための興味深い解決法として考えられている。実際に、酵素は、ポリエステル含有材料、より特定するとプラスチック製品の加水分解を、モノマーレベルにさえまでも加速し得る。さらに、加水分解物（すなわちモノマー及びオリゴマー）を、新規ポリマーを合成するための材料としてリサイクルすることができる。
この脈絡では、いくつかのエステラーゼが、分解酵素候補として同定されている。例えば、フサリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）のエステラーゼのいくつかの変異体が公開されている（Appl. Environm. Microbiol. 64, 2794-2799, 1998; Proteins: Structure, Function and Genetics 26,442-458,1996）。
しかしながら、より高い効率を有するプロセスを可能とし、これにより生物学的ポリエステル分解プロセスの競争力を増強するために、改善された活性を有するエステラーゼが依然として必要である。
発明の要約
本発明は、親エステラーゼ又は野生型エステラーゼと比較して増加した活性を示す新規なエステラーゼ変異体を提供する。これらのエステラーゼは、プラスチック材料及び製品、例えばＰＥＴを含有しているプラスチック材料及び製品を分解するためのプロセスにおいて特に有用である。より特定すると、本発明は、Sulaiman et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Marに記載のメタゲノム解析から導かれたクチナーゼのアミノ酸配列のアミノ酸３６～２９３、又はスイスプロットのＧ９ＢＹ５７に参照されたアミノ酸配列のアミノ酸３６～２９３に対応する、配列番号１に示されているようなアミノ酸配列を有する、エステラーゼ変異体を提供する。
これに関して、本発明の目的は、（ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一率を有し、（ｉｉ）
Figure 0007392029000001
から選択された位置に少なくとも１つの置換を有し（ここでの位置は配列番号１に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる）、（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、エステラーゼ変異体を提供することである。
より特定すると、前記エステラーゼは、
Figure 0007392029000002
から選択された位置に少なくとも１つの置換を含む。
特定の実施態様によると、前記エステラーゼは、配列番号１と比較して、
Figure 0007392029000003
からなる群より選択された少なくとも１つの置換又は置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記エステラーゼは、
Figure 0007392029000004
から選択された位置に、上記に列挙された１つ以上の置換に加えて、少なくとも１つの置換をさらに含む。有利には、追加の置換は、
Figure 0007392029000005
から選択される。
別の特定の実施態様では、前記エステラーゼは、
Figure 0007392029000006
からなる群より選択された少なくとも１つの置換を含む。
別の特定の実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000007
から選択された位置に少なくとも２つの置換を含む。
本発明の別の目的は、本発明のエステラーゼをコードしている核酸を提供することである。本発明はまた、該核酸を含む発現カセット又は発現ベクター、及び該核酸、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞にも関する。
本発明のさらなる目的は、
（ａ）エステラーゼをコードしている核酸を発現するに適した条件下で、本発明に記載の宿主細胞を培養する工程；及び場合により、
（ｂ）細胞培養液から該エステラーゼを回収する工程
を含む、該エステラーゼを生成する方法を提供することである。
本発明はまた、
（ａ）プラスチック製品を、本発明に記載のエステラーゼ又は宿主細胞と接触させることにより、プラスチック製品を分解する工程；並びに場合により
（ｂ）モノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程
を含む、少なくとも１つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解する方法に関する。
発明の詳細な説明
定義
本開示は、以下の定義への参照によって最善に理解されるだろう。
本明細書では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」という用語は、鎖を形成しているアミノ酸の数に関係なく、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸鎖を指す。アミノ酸は、本明細書において、以下の命名法に従ってそれらの１文字又は３文字のコードによって示される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
「エステラーゼ」という用語は、エステルから酸とアルコールへの加水分解を触媒する酵素命名法に従ってＥＣ３．１．１として分類された加水分解酵素のクラスに属する酵素を指す。「クチナーゼ」又は「クチン加水分解酵素」という用語は、クチン及び水からクチンモノマーを生成する化学反応を触媒することのできる、酵素命名法に従ってＥＣ３．１．１．７４として分類されたエステラーゼを指す。
「野生型タンパク質」又は「親タンパク質」という用語は同義語として使用され、それが天然に出現するような突然変異していないポリペプチド形を指す。今回の場合、親エステラーゼは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列を有するエステラーゼを指す。
したがって、「突然変異体」及び「変異体」という用語は同義語として使用され得、これは配列番号１から誘導され、かつ、１つ以上の（例えばいくつかの）位置において改変又は変化、すなわち、置換、挿入、及び／又は欠失を含み、かつ、ポリエステル分解活性を有する、ポリペプチドを指す。該変異体は、当技術分野において周知である様々な技術によって得ることができる。特に、野生型タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を変化されるための技術の例としては、部位特異的突然変異誘発、無作為突然変異誘発、及び合成オリゴヌクレオチド構築が挙げられるがこれらに限定されない。
位置又はアミノ酸に関して本明細書において使用する「改変」又は「変化」という用語は、特定の位置におけるアミノ酸が、野生型タンパク質のアミノ酸と比較して改変されていることを意味する。
「置換」は、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されていることを意味する。好ましくは、「置換」という用語は、アミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基、稀に天然に存在するアミノ酸残基（例えばヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、及び合成で作られることの多い非天然アミノ酸残基（例えばシクロヘキシル－アラニン）から選択された別のアミノ酸残基による置換を指す。好ましくは、「置換」という用語は、アミノ酸残基の、天然に存在する標準的な２０種のアミノ酸残基（Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ及びＴ）から選択された別のアミノ酸残基による置換を指す。「＋」の記号は、置換の組合せを示す。本文書では、置換を示すために以下の用語が使用される：Ｌ８２Ａは、親配列の８２位のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）へと変化していることを示す。Ａ１２１Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の１２１位のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸（バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はメチオニン（Ｍ））の１つによって置換されていることを示す。置換は、保存的置換であっても非保存的置換であってもよい。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、及びトレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、及びセリン）のグループ内である。
アミノ酸に関して使用される「欠失」という用語は、アミノ酸が除去されたか又は存在しないことを意味する。
「挿入」という用語は、１つ以上のアミノ酸が付加されていることを意味する。
特記しない限り、本出願に開示された位置は、配列番号１に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる。
本明細書において使用する「配列同一率」又は「同一率」という用語は、２つのポリペプチド配列間の一致（同一のアミノ酸残基）の数（又は、比率％として表現される割合）を指す。配列同一率は、配列ギャップを最小限にしながらオーバーラップ及び同一率が最大限となるようにアラインさせて、配列を比較することによって決定される。特に、配列同一率は、２つの配列の長さに応じて、多くの数学的な全体的又は局所的なアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。同じような長さの配列は好ましくは、全長におよび配列を最適にアラインさせる全体的アラインメントアルゴリズム（例えばNeedleman及びWunschアルゴリズム；Needleman and Wunsch, 1970）を使用してアラインさせ、一方、かなり異なる長さの配列は好ましくは、局所的アラインメントアルゴリズム（例えば、Smith及びWatermanアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）又はAltschulアルゴリズム（Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005））を使用してアラインさせる。アミノ酸配列同一率を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/などのインターネットウェブサイト上で入手可能な公共的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技能範囲内である様々な方法で成し遂げられ得る。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムをはじめとする、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一率の数値％は、Needleman-Wunschアルゴリズムを使用して２つの配列の最適な全体的なアラインメントを作成する、ペアワイズ配列アラインメントプログラムＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを使用して算出された数値を指し、ここでの全ての探索パラメーターは、デフォールト値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝フォールス、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップエクステンド＝０．５に設定されている。
「タンパク質のコンフォメーション」又は「結晶構造」は、タンパク質の３次元構造を指す。
「組換え」という用語は、遺伝子工学によって作製された、核酸構築物、ベクター、ポリペプチド、又は細胞を指す。
本明細書において使用する「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関与する任意の工程を指す。
「発現カセット」という用語は、コード領域（すなわち本発明の核酸）及び調節領域（すなわち、作動可能に連結されている１つ以上の制御配列を含む）を含む核酸構築物を示す。
本明細書において使用する「発現ベクター」という用語は、本発明の発現カセットを含むＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を意味する。好ましくは、発現ベクターは、鎖状又は環状の二本鎖ＤＮＡ分子である。
「ポリマー」は、その構造が、共有化学結合によって連結された複数のモノマー（反復単位）から構成されている化合物又は化合物の混合物を指す。本発明の脈絡において、ポリマーという用語は、１種類の反復単位から構成される（すなわちホモポリマー）又は異なる反復単位の混合物から構成される（すなわちコポリマー又はヘテロポリマー）、天然又は合成のポリマーを含む。本発明によると、「オリゴマー」は、２から約２０個のモノマーを含有している分子を指す。
本発明の脈絡において、「ポリエステル含有材料」又は「ポリエステル含有製品」は、結晶形、半結晶形、又は完全に無定形の少なくとも１つのポリエステルを含む、製品、例えばプラスチック製品を指す。特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１つのポリエステル及びおそらく他の物質又は添加剤、例えば可塑剤、鉱物、又は有機充填剤を含有している、少なくとも１つのプラスチック材料から作製された任意の品物、例えばプラスチックシート、プラスチックチューブ、プラスチック棒、プラスチックプロフィール、プラスチック形状、プラスチックフィルム、プラスチックの大きな塊などを指す。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、プラスチック製品を作製するのに適した溶融した又は固体状態の、プラスチック化合物又はプラスチック構築物を指す。
本明細書では、「ポリエステル」は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）、及びこれらのポリマーのブレンド／混合物を包含するがこれらに限定されない。
改善された活性を有する新規エステラーゼ
本発明は、改善された活性を有する新規エステラーゼを提供する。より特定すると、本発明者らは、工業的プロセスに使用するための優れた特性を有する新規酵素を設計した。プラスチック製品の工業的分解を実施できる条件におけるエステラーゼの活性を改善する目的で、本発明者らは、この親エステラーゼと比較してより高い活性を示す配列番号１のエステラーゼから誘導された新規エステラーゼを開発した。本発明のエステラーゼは、ＰＥＴを含有しているプラスチック製品を分解するのに特に適している。本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、増加した比活性及び／又はポリマー上への増加した吸着能を示す。興味深いことに、本発明者らは、タンパク質と基質の接触を促進し、これにより、ポリマーの吸着及び／又はこのポリマー上におけるタンパク質の活性を増加させるために有利には改変され得る、タンパク質の結晶構造における、ポリマー基質と接触させる予定の特定のアミノ酸残基を同定した。
したがって、本発明の目的は、（ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一率を有し、（ｉｉ）配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸の改変を含有し、（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、エステラーゼを提供することである。
本発明の脈絡では、「増加した活性」又は「増加した分解活性」という用語は、配列番号１のエステラーゼと比較して、プラスチック製品又は材料、より特定するとポリエステル含有プラスチック製品又は材料を分解する酵素の増加した能力を示す。このような増加は典型的には、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又はそれ以上である。特に、エステラーゼ変異体は、配列番号１のエステラーゼのポリエステル分解活性と比べて、少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも２０％、５０％、１００％、２００％、３００％、又はそれ以上高いポリエステル分解活性を有する。
タンパク質の活性は、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って当業者によって評価され得る。例えば、活性は、エステラーゼ比活性の速度の測定、ポリエステルの脱重合比活性の速度の測定、寒天プレートに分散させた固体ポリエステル化合物を分解する速度の測定、又は、反応器における、ポリエステルの脱重合比活性の速度の測定によって評価され得る。
本発明の脈絡において、「比活性」又は「分解比活性」という用語は、ポリエステル含有プラスチック製品を、本発明に記載のエステラーゼなどの分解酵素と接触させた場合に、適切な温度、ｐＨ、及び緩衝液の条件下で遊離されるオリゴマー及び／又はモノマーの初期速度を示す。一例として、ＰＥＴ加水分解の比活性は、加水分解曲線の直線部分において決定されるような、酵素１mgあたり及び１分間あたりに加水分解されるＰＥＴのμmol又は１時間あたりに生成される等価なＴＡのmgに相当する。
基質上にタンパク質が吸着する能力は、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って当業者によって評価され得る。例えば、本発明のエステラーゼを含有している溶液から、タンパク質含量又は残留エステラーゼ活性、残留ポリエステル脱重合活性、寒天プレートに分散させた固体ポリエステル化合物の残留分解、又は反応器中の残留ポリエステル脱重合活性を測定することができ、該エステラーゼは、酵素反応が全く起こり得ない適切な条件下で基質と共に事前にインキュベートされている。
特定の実施態様では、本発明の変異体は、配列番号１のエステラーゼと比較して、改善された熱安定性及び向上したポリエステル分解活性の両方を有する。
本発明の脈絡では、「向上した熱安定性」という用語は、配列番号１のエステラーゼと比較して、高温において、より特定すると５０℃～９０℃の温度において、その化学的構造及び／又は物理的構造の変化に対して酵素が耐える能力が向上していることを示す。このような向上は典型的には、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、又はそれ以上である。特に、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して上昇した融点（Ｔｍ）を示し得る。本発明の脈絡において、融点は、考察されているタンパク質／酵素の個体群の半分が折り畳まれていないか又は誤って折り畳まれている温度を指す。典型的には、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼのＴｍと比較して、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃、又はそれ以上上昇したＴｍを示す。
特に、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較して、５０℃～９０℃の温度において延長された半減期を有し得る。さらに、このような温度で、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較してより高い分解活性を示し得る。
タンパク質の熱安定性は、当技術分野においてそれ自体公知である方法に従って、当業者によって評価され得る。例えば、熱安定性は、円二色性を使用したタンパク質の折り畳みの分析によって評価され得る。代替的に又は追加的に、熱安定性は、様々な温度でインキュベートした後に酵素の残留エステラーゼ活性及び／又は残留ポリエステル脱重合活性を測定することによって評価され得る。様々な温度において複数回のポリエステルの脱重合アッセイを実施する能力も評価され得る。迅速かつ価値ある試験は、様々な温度でのインキュベート後に、寒天プレートに分散させた固体ポリエステル化合物を分解する酵素の能力の、円形光輪の直径の測定による評価からなり得る。好ましくは、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）が、タンパク質／酵素の熱安定性を評価するために実施される。より特定すると、ＤＳＦは、タンパク質の熱変性温度の変化を定量し、これによりその融点（Ｔｍ）を決定するために使用され得る。本発明の脈絡において、特記しない限り、Ｔｍは、実験部に示されているようなＤＳＦを使用して測定される。本発明の脈絡において、Ｔｍの比較は、同じ条件下（例えばポリエステルのｐＨ、性質、及び量など）で測定されるＴｍを用いて実施される。
本発明のエステラーゼは、以下に開示されているような１つ又はいくつかの改変を含み得る。
本発明によると、前記エステラーゼは、配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一率を有し、
Figure 0007392029000008
から選択された位置に少なくとも１つの置換を有する配列番号１のエステラーゼの変異体であり、ここでの位置は配列番号１に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる。
本発明によると、標的化アミノ酸（群）は、１９個の他のアミノ酸のいずれか１つによって置換され得る。
好ましくは、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000009
から選択された位置に少なくとも１つの置換を含む。
より好ましくは、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000010
から選択された位置に少なくとも１つの置換を含む。
特定の実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000011
から選択された少なくとも１つの置換を含む。好ましくは、前記エステラーゼ変異体は、Ｆ２０８Ｗ／Ｉ／Ｌから選択された少なくとも１つの置換を含む。好ましい実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、少なくともＦ２０８Ｗの置換を含む。別の好ましい実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、少なくともＦ２０８Ｉの置換を含む。
特定の実施態様では、前記エステラーゼ変異体はさらに、上記の少なくとも１つの置換に加えて、
Figure 0007392029000012
から選択された位置に少なくとも１つの追加の置換を含む。好ましくは、１つ以上の追加の置換は、
Figure 0007392029000013
から選択される。
代替的に又は追加的に、追加の置換の少なくとも１つは、Ａ１２１Ｓ、Ｔ１５７Ｓ、又はＳ２２３Ａから選択される。
別の特定の実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000014
から選択された位置に配列番号１と比較して少なくとも１つの置換、特に単一の置換を含み、ここでの置換は、
Figure 0007392029000015
とは異なる。好ましくは、前記エステラーゼは、
Figure 0007392029000016
からなる群より選択された１つ以上の置換を含む。別の特定の実施態様では、前記エステラーゼは、
Figure 0007392029000017
からなる群より選択された単一の置換を含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、Ｄ６３Ｎ／Ｑから選択された少なくとも１つの置換を含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、Ｙ９２Ｇ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｔから選択された少なくとも１つの置換、好ましくはＹ９２Ｐを含む。
別の特定の実施態様では、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000018
から選択された位置に少なくとも１つの置換を含む。
別の特定の実施態様によると、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000019
から選択された位置に少なくとも２つの置換を含む。
別の特定の実施態様によると、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000020
から選択された位置に少なくとも２つの置換を含む。
特に、前記エステラーゼ変異体は、
Figure 0007392029000021
から選択された位置に少なくとも２つの置換を含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＦ２０８Ｗ＋Ｖ１７０Ｉからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＹ９２Ｐ＋Ｆ２０８Ｌからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＹ９２Ｐ＋Ｆ２０８Ｗからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＴ１７６Ｈ＋Ｆ２０８Ｗからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＶ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＶ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓ＋Ｓ２２３Ａからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＦ２０８Ｗ＋Ｔ１５７Ｑからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＦ２０８Ｗ＋Ｔ１５７Ｎからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＦ２０８Ｗ＋Ｔ１５７Ｓからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＦ２０８Ｗ＋Ｓ６５Ｔからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、前記変異体は、少なくともＦ２０８Ｗ＋Ｔ１５７Ｅからなる置換の組合せを含む。
特定の実施態様によると、本発明のエステラーゼ変異体は、上記に列挙されているような１つ又はいくつかの改変及び／又は突然変異を含む。
改善された活性及び熱安定性を有する新規エステラーゼ
本発明のさらなる目的は、配列番号１のエステラーゼと比較して、向上したポリエステル分解活性及び向上した熱安定性の両方を示す新規エステラーゼを提供することである。
本発明の別の目的は、（ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一率を有し、（ｉｉ）配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含有し、（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して向上した熱安定性及び向上した活性の両方を示す、エステラーゼを提供することである。
有利には、前記変異体は、
Figure 0007392029000022
から選択された少なくとも１つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して向上した熱安定性及び向上した活性の両方を示す。
有利には、前記エステラーゼ変異体は、配列番号１への参照により、上記に開示されているような少なくとも１つの突然変異、及びＤ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃから選択された位置に少なくとも１つの追加の置換を含む。有利には、該変異体は、
Figure 0007392029000023
から選択された置換（群）を少なくとも含み、配列番号１のエステラーゼと比較して向上した熱安定性及び向上した活性の両方を示す。
前記変異体のポリエステル分解活性
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素はさらに、クチナーゼ活性を示す。
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、ポリエステル分解活性、好ましくはポリエチレンテレフタラート分解活性を有する。
別の特定の実施態様では、本発明のエステラーゼはまた、ＰＢＡＴ分解活性も有する。
有利には、本発明のエステラーゼ変異体は、少なくとも２０℃～９０℃、好ましくは４０℃～８０℃、より好ましくは５０℃～７０℃、さらにより好ましくは６０℃～７０℃の温度範囲、さらにより好ましくは６５℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、本発明のエステラーゼ変異体は、７０℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施態様では、ポリエステル分解活性は、６０℃～９０℃の温度で依然として測定可能である。
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼ変異体は、配列番号１のエステラーゼと比較して、所与の温度で、より特定すると４０℃～８０℃、より好ましくは５０℃～７０℃、さらにより好ましくは６０℃～７０℃、さらにより好ましくは６５℃の温度で、増加したポリエステル分解活性を有する。特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、６５℃において、配列番号１のエステラーゼのポリエステル分解活性と比較して少なくとも５％高い、好ましくは少なくとも１０％、２０％、５０％、１００％、２００％、３００％又はそれ以上高いポリエステル分解活性を有する。特定の実施態様では、該エステラーゼ変異体は、６５℃において、配列番号１のエステラーゼのポリエステル分解活性と比較して少なくとも１０％高い、好ましくは少なくとも２０％、５０％、１００％、２００％、３００％又はそれ以上高いポリエステル分解活性を有する。
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼ変異体は、少なくともｐＨ５～１１の範囲、好ましくはｐＨ６～９の範囲、より好ましくはｐＨ６．５～９の範囲、さらにより好ましくはｐＨ６．５～８の範囲の測定可能なエステラーゼ活性を示す。
核酸、発現カセット、ベクター、宿主細胞
本発明のさらなる目的は、上記に定義されているようなエステラーゼをコードしている核酸を提供することである。
本明細書において使用する「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド配列及び／又はリボヌクレオチド配列を指す。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、又は２つの混合物であり得る。それは、一本鎖形であっても、二本鎖形であっても、２つの混合物であってもよい。それは、組換え、人工、及び／又は合成起源であり得、それは、例えば修飾された結合、修飾されたプリン塩基若しくはピリミジン塩基、又は修飾された糖を含む、修飾されたヌクレオチドを含み得る。本発明の核酸は、単離形又は精製形であり得、当技術分野においてそれ自体公知である技術によって、例えばｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、増幅、酵素的合成、又は組換え技術などによって、作製、単離、及び／又は操作され得る。核酸はまた、例えば、Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444に記載のような周知の化学合成技術によってインビトロで合成され得る。
本発明はまた、上記に定義されているようなエステラーゼをコードしている核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も包含する。好ましくは、このようなストリンジェントな条件は、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で約４２℃で約２．５時間ハイブリダイゼーションフィルターをインキュベート、続いて、該フィルターを６５℃の１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１５分間かけて４回洗浄する工程を含む。使用されるプロトコールは、Sambrook et al.（Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) and Ausubel（Current Protocols in Molecular Biology (1989)）のような参考文献に記載されている。
本発明はまた、本発明のエステラーゼをコードしている核酸を包含し、ここでの該核酸の配列又は少なくとも該配列の一部は、最適化されたコドン使用頻度を使用して工学操作されている。
あるいは、本発明による核酸は、本発明によるエステラーゼの配列から推察され得、コドン使用頻度は、核酸が転写されるであろう宿主細胞に応じて適応させ得る。これらの工程は、当業者には周知である方法に従って実施され得、その中のいくつかはSambrook et al.の参考マニュアル（Sambrook et al., 2001）に記載されている。
本発明の核酸はさらに、選択された宿主細胞又は宿主系においてポリペプチドの発現を引き起こすか又は調節するために使用され得る、追加のヌクレオチド配列、例えば調節領域、すなわち、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、終結因子、シグナルペプチドなどを含み得る。
本発明はさらに、適切な宿主細胞において前記核酸の発現を指令する１つ以上の制御配列に作動可能に連結させた本発明に記載の核酸を含む発現カセットに関する。典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び／又は転写終結因子などの制御配列に作動可能に連結された本発明に記載の核酸を含むか又はからなる。制御配列は、本発明のエステラーゼをコードしている核酸の発現のための、宿主細胞又はインビトロ発現系によって認識されるプロモーターを含み得る。該プロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含有している。突然変異プロモーター、切断短縮プロモーター、及びハイブリッドプロモーターをはじめとする、該プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得、宿主細胞に対して相同的であるか又は異種であるかのいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードしている遺伝子から得ることができる。制御配列はまた、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される転写終結因子であり得る。終結因子は、エステラーゼをコードしている核酸の３’末端に作動可能に連結されている。宿主細胞において機能的である任意の終結因子を本発明において使用し得る。典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び転写終結因子に作動可能に連結された本発明に記載の核酸を含むか又はからなる。
本発明はまた、上記に定義されているような核酸又は発現カセットを含むベクターにも関する。
「ベクター」という用語は、組換え遺伝子材料を宿主細胞に導入するためのビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子を指す。主な種類のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド、及び人工染色体である。ベクターそれ自体は一般的に、挿入断片（異種核酸配列、導入遺伝子）とベクターの「骨格」としての役目を果たすより大きな配列からなる、ＤＮＡ配列である。宿主に遺伝子情報を導入するベクターの目的は、典型的には、標的細胞において挿入断片を単離、複製、又は発現させることである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞における異種配列の発現のために特異的に適応され、一般的にポリペプチドをコードしている異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般的には、発現ベクターに存在する調節配列は、転写プロモーター、リボソーム結合部位、終結因子、及び場合により存在するオペレーターを含む。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択マーカー、少数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数のための容量を含有する。発現ベクターの例は、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド、及びウイルスである。様々な宿主において適切なレベルのポリペプチド発現を与える発現ベクターは当技術分野において周知である。ベクターの選択は典型的には、ベクターを導入しようとする宿主細胞とベクターの適合性に依存するだろう。
本発明の別の目的は、上記のような核酸、発現カセット、又はベクターを含む宿主細胞を提供することである。したがって、本発明は、宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、又は形質導入するための、本発明に記載の核酸、発現カセット、又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は典型的には、それが導入されなければならない宿主細胞とベクターの適合性に依存するだろう。
本発明によると、宿主細胞は、一過性に又は安定的に形質転換、トランスフェクト、又は形質導入され得る。本発明の発現カセット又はベクターを宿主細胞に導入し、これによりカセット又はベクターは、染色体への組み込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持される。「宿主細胞」という用語はまた、複製中に起こる突然変異に因り親宿主細胞とは同一ではない親宿主細胞のあらゆる子孫も包含する。宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞は、本発明の変異体の生成において有用な任意の細胞であり得る。原核宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。宿主細胞はまた、真核細胞、例えば酵母、真菌、哺乳動物、昆虫、又は植物細胞であり得る。特定の実施態様では、宿主細胞は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、ピキア（Pichia）、又はヤロウイア（Yarrowia）の群から選択される。
本発明に記載の核酸、発現カセット、又は発現ベクターは、当業者には公知の任意の方法、例えば、電気穿孔法、コンジュゲーション、形質導入、コンピテントセル形質転換、プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、微粒子銃「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧにより媒介される形質転換、脂質により補助される形質転換又はトランスフェクション、化学的に媒介されるトランスフェクション、酢酸リチウムにより媒介される形質転換、リポソームにより媒介される形質転換によって宿主細胞に導入され得る。
場合により、１つを超えるコピー数の本発明の核酸、カセット又はベクターを、宿主細胞に挿入することにより、変異体の生成を増加させ得る。
特定の実施態様では、宿主細胞は組換え微生物である。本発明は実際に、ポリエステル含有材料を分解する改善された能力を有する微生物の工学操作を可能とする。例えば、本発明の配列は、ポリエステルを分解することができるとしてすでに知られている真菌又は細菌の野生型株を補完して、株の能力を改善及び／又は向上させるために使用され得る。
エステラーゼ変異体の生成
本発明の別の目的は、エステラーゼをコードしている核酸を発現させる工程及び場合により該エステラーゼを回収する工程を含む、本発明のエステラーゼ変異体を生成する方法を提供することである。
特に、本発明は、（ａ）本発明の核酸、カセット、又はベクターをインビトロ発現系と接触させる工程；及び（ｂ）生成されたエステラーゼを回収する工程を含む、本発明のエステラーゼをインビトロで生成する方法に関する。インビトロでの発現系は当業者には周知であり、市販されている。
好ましくは、生成法は、
（ａ）本発明のエステラーゼをコードしている核酸を含む宿主細胞を、該核酸を発現するに適した条件下で培養する工程；及び場合により
（ｂ）該エステラーゼを細胞培養液から回収する工程
を含む。
有利には、宿主細胞は、組換えバチルス、組換えＥ．ｃｏｌｉ、組換えアスペルギルス、組換えトリコデルマ、組換えストレプトマイセス、組換えサッカロマイセス、組換えピキア、又は組換えヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）である。
宿主細胞を、当技術分野において公知である方法を使用して、ポリペプチドの生成に適した栄養培地中で培養する。例えば、該細胞を、適切な培地中及び酵素が発現及び／又は単離されることを可能とする条件下で実施される、実験室又は工場発酵槽において、振盪フラスコ培養、又は小規模若しくは大規模発酵（連続発酵、バッチ発酵、流加発酵、又は固相発酵を含む）によって培養し得る。培養は、業者からの、又は公開（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログにおいて）されている組成に従って調製された、適切な栄養培地中で行なわれる。
エステラーゼが栄養培地に分泌される場合、エステラーゼは、培養上清から直接回収され得る。逆に、エステラーゼは、細胞溶解液から又は透過性処理後に回収されてもよい。エステラーゼは、当技術分野において公知である任意の方法を使用して回収され得る。例えば、エステラーゼは、回収、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈降を含むがこれらに限定されない、慣用的な手順によって栄養培地から回収され得る。場合により、エステラーゼは、実質的に純粋なポリペプチドを得るための、クロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点電気泳動、及びサイズ排除クロマトグラフィー）、電気泳動による手法（例えば分取用等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば硫酸アンモニウム沈降法）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は抽出を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知である様々な手順によって部分的に又は完全に精製され得る。
エステラーゼはしたがって、ポリエステルを含有しているプラスチック製品などのポリエステル含有材料の分解及び／又はリサイクルに関与する酵素反応を触媒するために、精製形で、単独で又は追加の酵素と組み合わせてのいずれかで使用され得る。エステラーゼは、可溶形であり得るか又は固相上に存在し得る。特に、それを、細胞膜若しくは脂質小胞に、又は例えばビーズ、カラム、プレートなどの形状の、ガラス、プラスチック、ポリマー、フィルター、膜などの合成支持体に結合させ得る。
組成物
本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞を含む組成物を提供することである。本発明の脈絡において、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼをが含む任意の種類の組成物を包含する。特定の実施態様では、エステラーゼは、単離された形態又は少なくとも部分的に精製された形態である。
前記組成物は、液体又は乾燥形であり得、例えば粉末の形態であり得る。いくつかの実施態様では、該組成物は凍結乾燥物である。例えば、該組成物は、エステラーゼ及び／又は本発明のエステラーゼをコードしている組換え細胞又はその抽出物、並びに場合により賦形剤及び／又は試薬などを含み得る。適切な賦形剤は、生化学において一般的に使用される緩衝液、ｐＨ調整剤、保存剤、例えば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、若しくはアスコルビン酸ナトリウム、保存剤、保護剤、又は安定化剤、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、塩、糖、例えばソルビトール、トレハロース、若しくはラクトース、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリエテングリコール（polyethene glycol）、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール、捕捉剤、例えばＥＤＴＡ、還元剤、アミノ酸、担体、例えば溶媒若しくは水溶液などを包含する。本発明の組成物は、エステラーゼを１つ又はいくつかの賦形剤と混合することによって得ることができる。
本発明の組成物は、０．１重量％～９９．９重量％、好ましくは０．１重量％～５０重量％、より好ましくは０．１重量％～３０重量％、さらにより好ましくは０．１重量％～５重量％の本発明のエステラーゼ、及び０．１重量％～９９．９重量％、好ましくは５０重量％～９９．９重量％、より好ましくは７０重量％～９９．９重量％、さらにより好ましくは９５重量％～９９．９重量％の賦形剤（群）を含み得る。好ましい組成物は、０．１重量％～５重量％の本発明のエステラーゼを含む。
特定の実施態様では、前記組成物はさらに、酵素活性を示す追加のポリペプチド（群）を含み得る。本発明のエステラーゼの量は、例えば、分解される予定のポリエステル含有材料及び／又は該組成物に含有されている追加の酵素／ポリペプチドの性質に応じて、当業者によって容易に適応されるだろう。
特定の実施態様では、本発明のエステラーゼは、１つ又はいくつかの賦形剤、特に、分解からポリペプチドを安定化又は保護することのできる賦形剤と一緒に水性媒体中に可溶化される。例えば、本発明のエステラーゼは、最終的にはグリセロール、ソルビトール、デキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール、塩などの追加の成分と共に、水中に可溶化され得る。次いで、結果として得られた混合物を乾燥させることにより、粉末を得ることができる。このような混合物を乾燥させるための方法は、当業者には周知であり、これには、凍結乾燥（lyophilisation）、凍結－乾燥（freeze-drying）、噴霧乾燥、超臨界乾燥、下向き通風（down-draught）蒸発、薄膜蒸発、遠心蒸発、コンベア乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、又はその任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない。
さらなる特定の実施態様では、本発明の組成物は、本発明のエステラーゼを発現している少なくとも１つの組換え細胞又はその抽出物を含む。「細胞の抽出物」は、実質的に生細胞を含まない、細胞から得られたあらゆる画分、例えば細胞上清、細胞片、細胞壁、ＤＮＡ抽出物、酵素若しくは酵素調製物、又は化学的処理、物理的処理及び／若しくは酵素的処理によって細胞から誘導された任意の調製物を示す。好ましい抽出物は酵素的に活性な抽出物である。本発明の組成物は、本発明の１つ又はいくつかの組換え細胞又はその抽出物、及び場合により１つ又はいくつかの追加の細胞を含み得る。
特定の実施態様では、前記組成物は、本発明のエステラーゼを発現及び分泌している組換え微生物の凍結乾燥させた培養培地からなるか又は含む。特定の実施態様では、粉末は、本発明のエステラーゼ及び安定化量／可溶化量のグリセロール、ソルビトール又はデキストリン、例えばマルトデキストリン及び／又はシクロデキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール、並びに／あるいは塩を含む。
本発明のエステラーゼの使用
本発明のさらなる目的は、ポリエステルから作製されるか又は含有しているプラスチック製品などのポリエステル含有材料を好気的及び／又は嫌気的条件で分解するために、並びに／あるいはリサイクルするために、本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。本発明のエステラーゼ変異体は、ＰＥＴを含むプラスチック製品を分解するのに特に有用である。
それ故、本発明の目的は、ＰＥＴ含有材料などのポリエステル含有材料の酵素的分解のために、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物、又は組成物を使用することである。
本発明の別の目的は、少なくとも１つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解するための方法を提供することであり、ここではプラスック製品を本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又は組成物と接触させることにより、プラスチック製品を分解する。有利には、ポリエステル含有材料のポリエステル（群）を、モノマー及び／又はオリゴマーまで脱重合する。
分解法の１つの実施態様では、少なくとも１つのポリエステルを分解することにより、再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーが得られ、これは有利には再利用するために回収される。
１つの実施態様では、ポリエステル含有材料のポリエステル（群）は、完全に分解される。
特定の実施態様では、プラスチック製品は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）、及びこれらの材料のブレンド／混合物から選択された少なくとも１つのポリエステル、好ましくはポリエチレンテレフタラートを含む。好ましい実施態様では、ポリエステル含有材料はＰＥＴを含み、少なくともモノマー、例えばモノエチレングリコール又はテレフタル酸、並びに／あるいはオリゴマー、例えばメチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、２－ヒドロキシエチル安息香酸（ＨＥＢ）及びジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）が、例えばリサイクル又はメタン化のために回収される。
本発明はまた、ポリエステル含有材料を、本発明のエステラーゼ又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物又は組成物に曝す工程、及び場合によりモノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程を含む、ポリエステル含有材料からモノマー及び／又はオリゴマーを生成する方法にも関する。本発明の方法は、モノエチレングリコール及びテレフタル酸から選択されたモノマー、並びに／又は、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタラート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタラート（ＢＨＥＴ）、２－ヒドロキシエチル安息香酸（ＨＥＢ）、及びジメチルテレフタラート（ＤＭＴ）から選択されたオリゴマーを生成するのに特に有用である。
ポリエステル含有材料を分解するのに必要とされる時間は、ポリエステル含有材料それ自体（すなわち、プラスチック製品の性質及び入手源、その組成、形状など）、使用されるエステラーゼの種類及び量、並びに、様々なプロセスパラメーター（すなわち、温度、ｐＨ、追加の薬剤など）に応じて変更され得る。当業者は、ポリエステル含有材料にプロセスパラメーターを容易に適応させ得る。
有利には、分解プロセスは、２０℃～９０℃、好ましくは４０℃～８０℃、より好ましくは５０℃～７０℃、より好ましくは６０℃～７０℃、さらにより好ましくは６５℃の温度で実施される。別の特定の実施態様では、分解プロセスは７０℃で実施される。より一般的には、温度は、不活化温度未満に維持され、この温度は、エステラーゼが不活性化される及び／又は組換え微生物がもはやエステラーゼを合成しない温度に相当する。特に、温度は、ポリエステル含有材料中のポリエステルのガラス転移温度（Ｔｇ）未満に維持される。より特定すると、プロセスは、連続的に、エステラーゼを数回使用できる及び／又はリサイクルできる温度で実施される。
有利には、分解プロセスは、ｐＨ５～１１、好ましくはｐＨ６～９、より好ましくはｐＨ６．５～９、さらにより好ましくはｐＨ６．５～８で実施される。
特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、エステラーゼと接触させる前に、その構造を物理的に変化させることにより、ポリエステルと本発明の変異体との間の接触表面を増加させるために前処理されていてもよい。
場合により、脱重合から得られたモノマー及び／又はオリゴマーは、順次又は連続的に回収され得る。１種類のモノマー及び／若しくはオリゴマー、又は数種類のモノマー及び／若しくはオリゴマーが、出発ポリエステル含有材料に応じて回収され得る。
回収されたモノマー及び／又はオリゴマーは、全ての適切な精製法を使用してさらに精製され得、再重合可能な形で調整され得る。精製法の例は、剥離プロセス、水溶液による分離、水蒸気選択的凝縮、バイオプロセス後の培地のろ過及び濃縮、分離、蒸留、真空蒸発、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、沈降、結晶化、濃縮、及び酸付加脱水、及び沈降、ナノろ過、酸触媒による処理、半連続モード蒸留、又は連続モード蒸留、溶媒蒸発、蒸発濃縮、蒸発結晶化、液体／液体抽出、水素付加、共沸蒸留プロセス、吸着、カラムクロマトグラフィー、単純真空蒸留、及びマイクロろ過を、組み合わせたもの又は組み合わせないものを含む。
次いで、再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーを、例えば、ポリエステルを合成するために再利用し得る。有利には、同じ性質のポリエステルを再重合する。しかしながら、回収されたモノマー及び／又はオリゴマーを他のモノマー及び／又はオリゴマーと混合し、これにより例えば、新規コポリマーを合成することが可能である。あるいは、回収されたモノマーを、関心対象の新規化合物を生成するための化学物質中間体として使用してもよい。
本発明はまた、ポリエステル含有材料を本発明のエステラーゼ又は対応する組換え細胞若しくはその抽出物又は組成物に曝す工程を含む、ポリエステル含有材料の表面加水分解又は表面官能基化の方法にも関する。本発明の方法は、ポリエステル材料の親水性又は水吸着性を高めるのに特に有用である。このような高められた親水性は、繊維生産、電子工学、及び生物医学への適用に特に関心がもたれ得る。
本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼ並びに／又は該エステラーゼを発現及び分泌している組換え微生物が含まれている、ポリエステル含有材料を提供することである。特定の実施態様では、このようなポリエステル含有材料は、プラスチック化合物であり得る。したがって、本発明の目的は、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又は組成物若しくはその抽出物；並びに少なくとも１つのポリエステルを含有している、プラスチック化合物を提供することである。好ましい実施態様では、ポリエステルはＰＥＴである。
実施例
実施例１－エステラーゼの構築、発現、及び精製
－構築
エステラーゼ変異体は、プラスミド構築物ｐＥＴ２６ｂ－ＬＣＣ－Ｈｉｓを使用して作製された。このプラスミドは、ＮｄｅＩ制限酵素部位とＸｈｏＩ制限酵素部位との間に、エシェリヒア・コリにおける発現のために最適化された、配列番号１のエステラーゼをコードしている遺伝子をクローニングすることからなる。エステラーゼ変異体を作製するために、２つの部位特異的突然変異誘発キットが業者の推奨に従って使用された：アジレント社（サンタクララ、カリフォルニア州、米国）製のQuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directed。
－エステラーゼの発現及び精製
Ｓｔｅｌｌａｒ（商標）株（クロンテック社、カリフォルニア州、米国）及びＥ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１ ＤＥ３（ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）が、５０mLのＬＢ－Ｍｉｌｌｅｒ培地又はＺＹＭ自己誘導性培地中でのクローニング及び組換え発現を実施するために成功裡に使用された（Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234）。ＬＢ－Ｍｉｌｌｅｒ培地中での誘導は、０．５mMのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、ユーロメディックス社、ゾウフェルヴァイヤースハイム、フランス）を用いて１６℃で実施された。ＡｖａｎｔｉＪ－２６ＸＰ遠心機（ベックマンコールター社、ブレア、米国）での遠心分離（８０００rpm、１０℃で２０分間）によって培養を停止した。細胞を、２０mLのＴａｌｏｎ緩衝液（トリス－ＨＣｌ２０mM、ＮａＣｌ ３００mM、ｐＨ８）に懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、３０％の振幅で（２秒オン、１秒ＯＦＦのサイクル）ＦＢ超音波発生器（フィシャーブランド社、イルキルシュ、フランス）によって、２分間、超音波処理にかけた。次いで、遠心分離工程を実現した：エッペンドルフ遠心機で１１０００rpmで１０℃で３０分間。可溶性画分を回収し、アフィニティクロマトグラフィーにかけた。この精製工程は、Ｔａｌｏｎ（登録商標）金属アフィニティ樹脂（クロンテック社、ＣＡ州、米国）を用いて完了させた。タンパク質の溶出は、イミダゾールの補充されたＴａｌｏｎ緩衝液の勾配を用いて実施された。精製されたタンパク質を、Ｔａｌｏｎ緩衝液に対して透析し、その後、製造業者の説明書（ライフサイエンスバイオラッド社、フランス）に従ってバイオラッドタンパク質アッセイを使用して定量し、＋４℃で保存した。
実施例２－エステラーゼの活性の評価
エステラーゼの比活性を決定し、配列番号１のエステラーゼの比活性と比較した。
比活性を評価するために複数の方法を使用した：
（１）ｐＮＰ－ブチラート加水分解に基づいた比活性；
（２）ＰＥＴ加水分解に基づいた比活性；
（３）固体形下のポリエステルの分解に基づいた比活性；
（４）反応器中のＰＥＴ加水分解に基づいた比活性。
２．１ ｐＮＰ－ブチラートの加水分解
溶液中のタンパク質 ２０μLを、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１７５μＬ及びｐＮＰ－ブチラート（２－メチル－２－ブタノール中４０mM）５μLと合わせた。酵素反応を、撹拌下で３０℃で１５分間行ない、４０５nmにおける吸光度をマイクロプレート分光光度計（Versamax、モレキュラーデバイス社、サニーベール、ＣＡ州、米国）によって取得した。比活性（酵素１mgあたり１分あたりに遊離されたｐＮＰのμmolで表現される初期速度）を加水分解曲線の直線部分において決定し、これを使用して野生型エステラーゼの活性を該変異体の活性と比較した。
２．２ ＰＥＴの加水分解
無定形ＰＥＴ １００mgを秤量し、１００mLのガラス瓶に導入した。エステラーゼ調製物（基準対照として）又は変異体調製物 １mLをそれぞれ、Ｔａｌｏｎ緩衝液（トリス－ＨＣｌ ２０mM、ＮａＣｌ ０．３Ｍ、ｐＨ８）中０．０２又は０．０３mg/mLで調製し、ガラス瓶に導入した。最後に、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）４９mLを加えた。
各ガラス瓶を６５℃及び１５０rpmでＭａｘＱ４４５０インキュベーター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、ＭＡ州、米国）中でインキュベートすることによって脱重合を開始した。
脱重合反応の初期速度（１時間あたりに生成された等価なＴＡのmg）は、最初の２４時間中の様々な時点において実施された試料採取によって決定され、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）によって分析された。必要であれば、試料を、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）で希釈した。次いで、メタノール １５０μL及びＨＣｌ ６Ｎ ６．５μLを、試料又は希釈液 １５０μLに加えた。混合し０．４５μmのシリンジフィルターでのろ過後、試料をＵＨＰＬＣに載せ、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの遊離をモニタリングした。使用されたクロマトグラフィーシステムは、ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃で温度制御されたカラムオーブン、及び２４０nmのＵＶ検出器を含む、Ultimate 3000ＵＨＰＬＣシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、ＭＡ州、米国）であった。使用されたカラムは、Discovery（登録商標）ＨＳ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０×４．６mm、５μm、プレカラムを具備、スペルコ社、ベルフォンテ、米国）であった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴを、１mMのＨ２ＳＯ４中のＭｅＯＨ勾配（３０％～９０％）を使用して１mL/分で分離した。注入液は２０μLの試料であった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴを、市販のＴＡ及びＢＨＥＴ並びに社内で合成されたＭＨＥＴから調製された標準曲線に従って試料と同じ条件で測定した。ＰＥＴ加水分解比活性（酵素１mgあたり１時間あたりの等価なＴＡのmg）を、加水分解曲線の直線部分において決定した。等価なＴＡは、測定されたＴＡと、測定されたＭＨＥＴ及びＢＨＥＴに含有されているＴＡの合計に相当する。
２．３ 固体形下のポリエステルの分解
固体形下のポリエステルの分解
酵素調製物 ２０μLを、ＰＥＴを含有している寒天プレートに作られたウェルに沈着させた。寒天プレートの調製は、ＨＦＩＰに可溶化させたＰＥＴ ５００mgを可溶化することによって実現し、この培地を２５０mLの水溶液に注いだ。５２℃でＨＦＩＰを蒸発させた後、溶液を、３％寒天を含有している０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）と混合（ｖ/ｖ）した。約３０mLの混合物を使用して、各々のＯｍｎｉＴｒａｙを調製し、４℃で保存する。
野生型エステラーゼ及び変異体によるポリエステルの分解に因り形成された円形光輪の直径を、６０℃又は６５℃で２～４時間後に測定し比較した。
２．４ 反応器中のＰＥＴの加水分解
Minibio 500バイオリアクター（アプリコン・バイオテクノロジー社、デルフト、オランダ）を、無定形ＰＥＴ ５ｇ、及びエステラーゼ ２．５～５mgを含有している１０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）１００mLを用いて開始した。撹拌を、マリンインペラーを使用して２５０rpmに設定した。バイオリアクターは、外付けの水浴への浸漬によって６５℃に温度制御された。ｐＨは、３ＭのＫＯＨの添加によって８に調節された。様々なパラメーター（ｐＨ、温度、撹拌、塩基の添加）を、BioXpertソフトウェアＶ２．９５によりモニタリングした。反応培地 ５００μLを定期的に試料採取した。
ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴの量を、実施例２．２に記載のようにＨＰＬＣによって決定した。ＥＧの量を、６５℃に温度制御されたAminex HPX-87Kカラム（バイオラッドラボラトリーズ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を使用して決定した。溶出液は、０．６mL/分の５mMのＫ２ＨＰＯ４であった。注入液は２０μLであった。エチレングリコールを、屈折計を使用してモニタリングした。
加水分解率は、所与の時間におけるモル濃度（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）、対、初期試料中に含有されているＴＡの総量の比に基づくか、又は、所与時間におけるモル濃度（ＥＧ＋ＭＨＥＴ＋２×ＢＨＥＴ）、対、初期試料中に含有されているＥＧの総量の比に基づいて計算された。比活性は分解比速度に相当し、１時間あたり酵素１mgあたりに遊離された等価な全ＴＡのmg、又は１時間あたり酵素１mgあたりの等価な全ＥＧのmgで計算される。
本発明のエステラーゼ変異体の比較される分解比活性を表１に示す。配列番号１のエステラーゼの分解比活性は基準として使用され、１００％分解活性と考える。分解活性は、実施例２．２に示されているように測定される（１時間あたり酵素１mgあたりの等価なＴＡのmg）。
Figure 0007392029000024
Figure 0007392029000025

Figure 0007392029000026
実施例３－本発明のエステラーゼ変異体の活性及び熱安定性の評価
本発明のエステラーゼ変異体の熱安定性を評価し、配列番号１のエステラーゼの熱安定性と比較した。
示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して熱安定性を評価した。
ＤＳＦを使用して、それらの融点（Ｔｍ）、すなわちタンパク質個体群の半分が折り畳まれていない温度を決定することによって、野生型タンパク質及びその変異体の熱安定性を評価した。タンパク質試料を、１４μM（０．４mg/mL）の濃度で調製し、２０mMのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００mMのＮａＣｌからなる緩衝液Ａに保存した。ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ色素の５０００倍のＤＭＳＯ中ストック溶液をまず、水で２５０倍に希釈した。タンパク質試料を、白色透明の９６ウェルのＰＣＲプレート（バイオラッド社、製造番号ＨＳＰ９６０１）に載せ、各ウェルは最終容量２５μlを含有している。各ウェル中のタンパク質及びＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ色素の最終濃度は、それぞれ５μM（０．１４mg/ml）及び１０倍であった。１ウェルあたりに積載された容量は以下の通りであった：緩衝液Ａ １５μL、０．４mg/mLのタンパク質溶液 ９μL、及び２５０倍のＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ希釈溶液 １μL。次いで、ＰＣＲプレートを、光学的品質のシールテープで封をし、室温で２０００rpmで１分間遠心機にかけた。次いで、ＤＳＦ実験を、４５０/４９０励起フィルター及び５６０/５８０発光フィルターを使用するために設定されたＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行なった。試料を、１．１℃/分の速度で２５℃から１００℃まで加熱した。０．３℃毎に１回の蛍光測定を行なった。融点は、曲線をボルツマン式にあてはめることによって決定された。
次いで、野生型タンパク質及び変異体を、それらのＴｍ値に基づいて比較した。異なる生成に由来する同じタンパク質に関する実験間での高い再現性に因り、０．８℃のΔＴｍが、変異体を比較するのに有意であると判断した。Ｔｍ値は、少なくとも２回の測定の平均値に相当する。
本発明のエステラーゼ変異体の比較される分解比活性及び熱安定性を表２に示す。配列番号１のエステラーゼの分解比活性を基準として使用し、これを１００％分解活性と考える。分解比活性は、実施例２．２に従って測定される（１時間あたり酵素１mgあたりの等価なＴＡのmg）。熱安定性は、Ｔｍ値で表現され（実施例３に従って測定される）、配列番号１のエステラーゼのＴｍと比較したＴｍの増加が、括弧内に示されている。
Figure 0007392029000027

Claims (16)

  1. （ｉ）配列番号１に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、又は９９％の同一率を有し、（ｉｉ）Ｇ５３Ｌ、Ａ１２１Ｒ／Ｗ、Ｖ１７０Ｉ、Ｙ６０Ｍ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ｄ６３Ｎ／Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｆ９０Ｗ及びＹ９２Ｇ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｔから選択された位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し（ここでの位置は配列番号１に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる）、（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性を示す、エステラーゼ変異体。
  2. 前記エステラーゼが、Ｇ５３Ｌ、Ａ１２１Ｒ／Ｗ、Ｙ６０Ｍ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ｄ６３Ｎ／Ｑ、Ｓ６６Ｈ、Ｆ９０Ｗ及びＹ９２Ｇ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｔからなる群より選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１記載のエステラーゼ変異体。
  3. 前記エステラーゼが、Ｇ５３Ｌ、Ａ１２１Ｒ／Ｗ、Ｙ６０Ｍ、Ｔ６１Ｍ／Ｖ、Ｄ６３Ｎ／Ｑ及びＹ９２Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｔからなる群より選択された少なくとも１つの置換を含む、請求項１記載のエステラーゼ変異体。
  4. 前記エステラーゼがさらに、Ｄ２０３Ｃ＋Ｓ２４８Ｃの置換の組合せを含む、請求項１～３のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
  5. 前記エステラーゼがさらに、置換Ｖ１７０Ｉを含む、請求項２～４のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
  6. 前記エステラーゼがさらに、Ａ１２１Ｓ、Ｔ１５７Ｓ又はＳ２２３Ａから選択される少なくとも追加の置換を含む、請求項１～５のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
  7. 前記エステラーゼが、Ｔ６１Ｍ及びＹ９２Ｇ／Ｐからなる群より選択される少なくとも一つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比べて、増加した熱安定性及び増加した活性の両者を示す、請求項１～６のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
  8. Ｖ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓ又はＶ１７０Ｉ＋Ａ１２１Ｓ＋Ｓ２２３Ａから選択される少なくとも一つの置換の組み合わせを含む、請求項１及び６のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体。
  9. 請求項１～８のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体をコードしている核酸。
  10. 請求項９記載の核酸を含む発現カセット又はベクター。
  11. 請求項９記載の核酸又は請求項１０記載の発現カセット若しくはベクターを含む宿主細胞。
  12. 請求項１～８のいずれか一項記載のエステラーゼ変異体、又は請求項１１記載の宿主細胞を含む、組成物。
  13. （ａ）エステラーゼをコードしている核酸を発現するに適した条件下で、請求項１１記載の宿主細胞を培養する工程；及び場合により、
    （ｂ）細胞培養液から該エステラーゼを回収する工程
    を含む、該エステラーゼを生成する方法。
  14. （ａ）プラスチック製品を、請求項１～８のいずれか一項記載のエステラーゼ、又は請求項１１記載の宿主細胞、又は請求項１２記載の組成物と接触させる工程；並びに場合により
    （ｂ）モノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程
    を含む、少なくとも１つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解する方法。
  15. プラスチック製品が、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタラート（ＰＥＮ）、及びこれらの材料のブレンド／混合物から選択された少なくとも１つのポリエステル、好ましくはポリエチレンテレフタラートを含む、請求項１４記載の方法。
  16. 請求項１～８のいずれか一項記載のエステラーゼ又は請求項１１記載の宿主細胞を含む、ポリエステル。
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