KR20230011505A - 신규한 에스테라아제 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 에스테라아제, 보다 상세하게는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 개선된 활성을 갖는 에스테라아제 변종 및 플라스틱 제품 등과 같은 폴리에스테르 포함 재료를 분해하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 에스테라아제는 특히 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리에틸렌테레프탈레이트를 포함하는 재료를 분해하기에 적절하다.
Description
본 발명은 신규한 에스테라아제, 보다 구체적으로는 부모 에스테라아제에 비하여 개선된 활성을 갖는 에스테라아제 및 플라스틱 제품 등과 같은 폴리에스테르 함유 재료를 분해하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 에스테라아제는 폴리에틸렌테레프탈레이트 및 폴리에틸렌테레프탈레이트를 포함하는 재료를 분해하는 데 특히 적합하다.
에스테라아제는 폴리에스테르를 포함하여 다양한 폴리머의 가수분해를 촉매할 수 있다. 이러한 정황에서, 에스테라아제는 접시세척 및 세탁 응용에 대한 세제로서, 바이오매스 및 음식을 가공하기 위한 분해 효소로서, 환경 오염물의 해독에서 또는 섬유 산업에서 폴리에스테르 직물의 처리를 위한 생물촉매로서 포함하여 다수의 산업 응용에서 유망한 영향을 나타냈다. 동일한 방법으로, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)를 가수분해하기 위한 분해 효소로서의 에스테라아제의 용도가 흥미롭다. 실로, PET가 의류, 카펫의 제조에서 또는 포장 또는 자동차 플라스틱 또는 다른 부품의 제조를 위한 열경화성 수지의 형태로 등과 같이 다수의 기술 분야에서 사용되고, 매립지에서의 PET 누적은 증가하는 생태학적 문제가 되고 있다.
에스테라아제 중에서도, 또한 큐틴 가수분해효소(EC 3.1.1.74)로서 공지된 큐티나아제가 특히 흥미롭다. 큐티나아제는 여러 균류(P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504), 박테리아 및 식물 화분으로부터 동정되었다. 최근, 메타게놈(metagenomics) 접근법은 별도의 에스테라아제의 동정의 결과를 가져왔다.
효소적 분해는 이러한 플라스틱 폐기물 누적을 감소시키기 위한 흥미로운 해결책으로 고려되고 있다. 실로, 효소는 폴리에스테르 함유 재료, 그리고 보다 구체적으로는 플라스틱 제품의 가수분해를 심지어 모노머의 수준까지 촉진할 수 있다. 더욱이, 가수분해물(즉, 모노머 및 올리고머)은 신생 폴리머를 합성하기 위한 재료로 재활용될 수 있다.
이러한 정황에서, 여러 에스테라아제가 후보 분해 효소로서 동정되었다. 예를 들어, 푸사리움 솔라니 피시(Fusarium solani pisi)의 에스테라아제(큐티나아제)의 여러 변종이 공개되었다(Appl. Environm. Microbiol. 64, 2794-2799, 1998; Proteins: Structure, Function and Genetics 26,442-458,1996).
그러나, 보다 높은 효율을 갖는 방법을 제공하고 그에 의하여 생물학적 폴리에스테르 분해 공정의 경쟁력을 향상시킬 수 있는 개선된 활성을 갖는 에스테라아제에 대한 요구가 여전히 존재하고 있다.
본 발명은 부모 또는 야생-형 에스테라아제에 비하여 증가된 활성을 나타내는 에스테라아제의 신규한 변종을 제공한다. 이러한 에스테라아제는 PET를 포함하는 플라스틱 재료 및 제품 등과 같은 플라스틱 재료 및 제품을 분해하기 위한 공정에서 특히 유용하다. 보다 상세하게는, 본 발명은 Sulaiman et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Mar에 기술된 메타게놈-파생 큐티나아제의 아미노산 시퀀스의 아미노산 36 내지 293에 또는 SwissProt의 G9BY57로 참조되는 아미노산의 아미노산 36 내지 293에 대응하는 서열 번호 1에서 규정되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는 에스테라아제의 변종을 제공한다.
이와 관련하여, 본 발명의 하나의 목적은 (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 시퀀스에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖고, (ii) F208, T157, T176, S65, G53, A121, V170, S223, P58, A62, A64, L67, A68, N85, T86, R89, D91, P93, R96, G128, M131, G133, G134, L152, T153, P154, H156, A178, P179, H183, S206, A209, P210 또는 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 치환을 갖고, 여기에서 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 시퀀스를 기준으로 번호가 매겨지고, (iii) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 에스테라아제 변종을 제공하는 것이다.
보다 상세하게는, 에스테라아제는 F208, T157, T176, G53, A121, V170, S65 또는 N211로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 에스테라아제는 서열 번호 1에 비하여 G53L, S65T, A121R/W, T157E/Q/N/G, V170I, T176H/N/Q, F208W/I/L/G/S/N/A/R/T, N211Q, F208W + V170I, Y92P + F208L, Y92P + F208W, T176H + F208W, V170I + A121S, V170I + A121S + S223A, F208W + T157Q, F208W + T157N, F208W + T157S, F208W + S65T, F208W + T157E, F208W + D203C + S248C, F208I + D203C + S248C로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환들의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 상기 나열된 치환들 중의 하나 또는 그 이상에 더하여, G59, Y60, T61, D63, S66, F90, Y92, H129, G132, W155 및 V177로부터 선택되는 포지션에서 적어도 하나의 치환을 더 포함한다. 유리하게도, 추가의 치환은 Y60M/F, T61M/V, D63N/Q, S66H, F90W 및 Y92G/N/P/Q/T로부터 선택된다.
다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제는 Y60M, T61M/V, D63N/Q, S66H, F90W 및 Y92G/N/P/Q/T로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.
다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 G53, P58, G59, Y60, T61, A62, D63, A64, S65, S66, L67, A68, N85, T86, R89, F90, D91, Y92, P93, R96, A121, G128, H129, M131, G132, G133, G134, L152, T153, P154, W155, H156, T157, V170, T176, V177, A178, H183, S206, F208, A209, P210, S223 및 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 2개의 치환을 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 카세트(expression cassette) 또는 발현 벡터 및 상기 핵산 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
(a) 본 발명에 따른 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 발현하기에 적절한 조건 하에서 배양하여 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로
(b) 상기 에스테라아제를 세포 배양물로부터 회수하는 단계,
를 포함하는 에스테라아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한:
(a) 플라스틱 제품을 본 발명에 따른 에스테라아제 또는 숙주 세포와 접촉시키고, 그에 의하여 플라스틱 제품을 분해하는 단계; 및 선택적으로
(b) 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 단계,
를 포함하는, 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하는 방법에 관한 것이다.
정의
본 상세한 설명은 하기 정의를 참조하여 가장 잘 이해될 것이다.
여기에서, 용어 "펩티드(peptide)" "폴리펩티드(polypeptide)" "단백질(protein)" "효소(enzyme)"는 쇄를 형성하는 아미노산의 수와 무관하게 펩티드 결합에 의하여 연결된 아미노산의 쇄를 의미한다. 여기에서 아미노산은 하기 명명법에 따른 이들의 1-문자 또는 3-문자 코드로 표현된다: A: 알라닌(Ala); C: 시스테인(Cys); D: 아스파르트산(Asp); E: 글루탐산(Glu); F: 페닐알라닌(Phe); G: 글리신(Gly); H: 히스티딘(His); I: 이소류신(Ile); K: 라이신(Lys); L: 류신(Leu); M: 메티오닌(Met); N: 아스파라긴(Asn); P: 프롤린(Pro); Q: 글루타민(Gln); R: 아르기닌(Arg); S: 세린(Ser); T: 트레오닌(Thr); V: 발린(Val); W: 트립토판(Trp) 및 Y: 티로신(Tyr).
용어 "에스테라아제(esterase)"는 에스테르의 산 및 알코올로의 가수분해를 촉매하는 Enzyme Nomenclature에 따라 EC 3.1.1로 분류되는 가수분해효소의 클래스(class)에 속하는 효소를 의미한다. 용어 "큐티나아제(cutinase)" 또는 "큐틴 가수분해효소(cutin hydrolase)"는 큐틴으로부터 큐틴 모노머 및 물을 생성하는 화학 반응을 촉매할 수 있는 Enzyme Nomenclature에 따라 EC 3.1.1.74로 분류되는 에스테라아제를 의미한다.
용어 "야생-형 단백질(wild-type protein)" 또는 "부모 단백질(parent protein)"은 상호호환적으로 사용되고 천연적으로 나타나는 것과 같은 폴리펩티드의 미-돌연변이된 버전을 의미한다. 본 경우에 있어서, 부모 에스테라아제는 서열 번호 1에서 규정되는 바와 같은 아미노산 시퀀스를 갖는 에스테라아제를 의미한다.
따라서, 용어 "돌연변이(mutant)" 및 "변종(variant)"은 서열 번호 1로부터 파생되고 변형 또는 개조, 즉, 하나 이상(예를 들어, 여러 개)의 포지션에서 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하고 폴리에스테르 분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미하도록 상호호환적으로 사용될 수 있다. 변종은 당해 기술분야에서 충분히 공지된 여러 기술로 수득될 수 있다. 특히, 야생-형 단백질을 인코딩하는 DNA 시퀀스를 개조하기 위한 기술의 예는 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis), 무작위 돌연변이(random mutagenesis) 및 합성 올리고뉴클레오티드 구조(synthetic oligonucleotide construction)를 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
포지션 또는 아미노산과 관련하여 여기에서 사용되는 바와 같은 용어 "변형(modification)" 또는 "개조(alteration)"는 특정한 포지션 내의 아미노산이 야생-형 단백질의 아미노산에 비하여 변형된 것을 의미한다.
"치환(substitution)"은 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 천연적으로-발생하는 표준 20가지 아미노산 잔기, 희귀하게 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기(예를 들어 하이드록시프롤린, 하이드록시라이신, 알로하이드록시라이신, 6-N-메틸라이신, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 알로-이소류신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 파이로글루타민, 아미노부티르산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린) 및 종종 합성으로 제조된 비-자연적으로 발생하는 아미노산 잔기(예를 들어 시클로헥실-알라닌)로부터 선택되는 다른 아미노산 잔기로의 아미노산 잔기의 대체를 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 천연적으로-발생하는 표준 20가지 아미노산 잔기(G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S 및 T)로부터 선택되는 다른 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 기호 "+"는 치환의 조합을 나타낸다. 본 문헌에 있어서, 하기 용어들은 치환을 표기하는 데 사용된다: L82A는 부모 시퀀스의 포지션 82의 아미노산 잔기(류신, L)가 알라닌(A)으로 변화된 것을 나타낸다. A121V/I/M은 부모 시퀀스의 포지션 121의 아미노산 잔기(알라닌, A)가 하기의 아미노산들: 발린(V), 이소류신(I) 또는 메티오닌(M) 중의 하나로 치환되는 것을 나타낸다. 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민, 아스파라긴 및 트레오닌), 소수성 아미노산(메티오닌, 류신, 이소류신, 시스테인 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌 및 세린)의 군 이내이다.
아미노산과 관련하여 사용되는 용어 "결실(deletion)"은 제거되거나 부재인 것을 의미한다.
용어 "삽입(insertion)"은 하나 이상의 아미노산이 첨가된 것을 의미한다.
달리 특정되지 않는 한, 본원에서 개시된 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 시퀀스를 기준으로 번호가 매겨진다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시퀀스 상동성(sequence identity)" 또는 "상동성(identity)"은 두 폴리펩티드 시퀀스들 간의 매치(동일한 아미노산 잔기)의 수(또는 백분율 %로 표현되는 분율)를 의미한다. 시퀀스 상동성은 정렬시켜 중첩(overlap)과 상동성을 극대화하는 한편으로 시퀀스 갭(sequence gap)을 최소화하도록 하는 경우에 시퀀스를 비교하는 것에 의하여 결정된다. 특히, 시퀀스 상동성은 2개의 시퀀스들의 길이에 의존적으로 수학적 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘(mathematical global or local alignment algorithm)의 수 중의 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 길이의 시퀀스들은 바람직하게는 전장에 걸쳐 최적으로 시퀀스를 정렬하는 글로벌 정렬 알고리즘(예를 들어 Needleman and Wunsch algorithm; Needleman and Wunsch, 1970)을 사용하여 정렬되는 한편으로 상당히 다른 길이의 시퀀스들은 바람직하게는 로컬 정렬 알고리즘(예를 들어 Smith and Waterman 알고리즘(Smith and Waterman, 1981) 또는 Altschul 알고리즘(Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005))을 사용하여 정렬된다. 백분율 아미노산 시퀀스 상동성을 결정할 목적의 정렬은 당해 기술분야에서의 기술에 속하는 여러 방법들, 예를 들어, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/) 등과 같은 인터넷 웹 사이트 상에서 공공연히 획득가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 비교되는 시퀀스들의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 요구되는 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 여기에서의 목적을 위하여, % 아미노산 시퀀스 상동성 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 2개의 시퀀스의 최적 글로벌 정렬을 생성하는 페어 와이즈 시퀀스 정렬 프로그램(pair wise sequence alignment program) EMBOSS Needle을 사용하여 생성된 값을 의미하며, 여기에서 모든 검색 매개변수는 디폴트 값(default value) 즉, Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 및 End gap extend = 0.5로 설정된다.
“단백질 구성(protein conformation)” 또는 ”단백질 구조(crystal structure)”는 단백질의 3차원 구조를 의미한다.
용어 "재조합(recombinant)"은 유전공학에 의하여 생성되는 핵산 구조(nucleic acid construct), 벡터, 폴리펩티드 또는 세포를 의미한다.
여기에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현(expression)"은 전사, 전사-후 변형, 번역, 번역-후 변형 및 분비를 포함하나 이로 제한되지 않는 폴리펩티드의 생산에 포함되는 임의의 단계를 의미한다.
용어 "발현 카세트(expression cassette)"는 코딩 영역, 즉 본 발명의 핵산 및 조절 영역을 포함하는, 즉 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 시퀀스(control sequence)를 포함하는 핵산 구조를 나타낸다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 벡터(expression vector)"는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 고리형 이중 가닥 DNA 분자이다.
"폴리머(polymer)"는 그의 구조가 공유 화학결합으로 연결되는 다중 모노머(반복 단위)로 구성되는 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 의미한다. 본 발명의 정황 내에서, 용어 폴리머는 단일 형태의 반복 단위로 이루어지거나(즉, 호모폴리머) 다른 반복 단위의 혼합물로 이루어지는(즉, 코폴리머 또는 헤테로폴리머) 천연 또는 합성 폴리머를 포함한다. 본 발명에 따르면, "올리고머(oligomer)"는 2 내지 약 20개의 모노머를 포함하는 분자를 의미한다.
본 발명의 정황에서, "폴리에스테르 함유 재료(polyester containing material)" 또는 "폴리에스테르 함유 제품(polyester containing product)"은 결정, 반-결정 또는 전체적으로 비정질 형태인 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 제품 등과 같은 제품을 의미한다. 특정한 구체예에 있어서, 폴리에스테르 함유 재료는 플라스틱 시트, 튜브, 봉, 프로파일, 형상, 필름, 거대 블록 등과 같은 적어도 하나의 플라스틱 재료로 만들어진 임의의 물품을 의미하며, 이는 적어도 하나의 폴리에스테르 및 가능하게는 가소제, 무기 또는 유기 충진제 등과 같은 다른 물질 또는 첨가제를 포함한다. 다른 특정한 구체예에 있어서, 폴리에스테르 함유 재료는 플라스틱 제품을 만들기에 적절한 용융 또는 고체 상태의 플라스틱 화합물 또는 플라스틱 제형을 의미한다.
본 상세한 설명에 있어서, "폴리에스테르(polyester)"는 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌테레프탈레이트(PBT), 폴리에티렌이소소르비드테레프탈레이트(PEIT), 폴리유산(PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌석시네이트(PBS), 폴리부틸렌식시네이트아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌아디페이트테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌아디페이트)(PEA), 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN) 및 이러한 폴리머의 블렌드/혼합물을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명은 개선된 활성을 갖는 신규한 에스테라아제를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명자는 산업 응용에서 사용하기에 우월한 특성을 갖는 신규한 효소를 디자인하였다. 플라스틱 제품의 산업적 분해가 수행될 수 있는 조건에서 에스테라아제의 안정성 및/또는 활성을 개선시키는 것을 목적으로, 본 발명자는 부모 에스테라아제에 비하여 높은 활성을 나타내는 서열 번호 1의 에스테라아제로부터 파생되는 신규한 에스테라아제를 개발하였다. 본 발명의 에스테라아제는 특히 PET를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하는 데 적절하다. 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 비활성(specific activity) 및/또는 증가된 폴리머 상에 흡수되는 능력을 나타낸다. 흥미롭게도, 본 발명자는 유리하게도 기질의 단백질과의 접촉을 촉진하고 그에 의하여 폴리머의 흡수 및/또는 이러한 폴리머에 대한 단백질의 활성을 증가시키도록 변형될 수 있는 단백질의 결정 구조로 폴리머 기질(substrate)과 접촉하도록 의도된 특정한 아미노산 잔기를 동정하였다.
따라서 본 발명의 하나의 목적은 (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 시퀀스에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖고, (ii) 서열 번호 1에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, (iii) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는 에스테라아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 정황 내에서, 용어 "증가된 활성(increased activity)" 또는 "증가된 분해 활성(increased degrading activity)"은 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 플라스틱 제품 또는 재료 그리고 보다 상세하게는 폴리에스테르 함유 플라스틱 제품 또는 재료를 분해하는 효소의 증가된 능력을 나타낸다. 이러한 증가는 전형적으로 약 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 또는 그 이상이다. 특히, 에스테라아제 변종은 서열 번호 1의 에스테라아제의 폴리에스테르 분해 활성 보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 50%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상으로 더 큰 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다.
단백질의 활성은 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 예를 들어, 활성은 특정한 에스테라아제 활성 속도의 측정, 특정한 폴리에스테르의 해중합 활성 속도의 측정, 한천 플레이트 내에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물을 분해하는 속도의 측정 또는 반응기 내에서의 특정한 폴리에스테르 해중합 활성의 측정에 의하여 평가될 수 있다.
본 발명의 정황 내에서, 용어 "비활성(specific activity)" 또는 "비분해활성(specific degrading activity)"은 폴리에스테르 함유 플라스틱 제품을 본 발명에 따른 에스테라아제 등과 같은 분해 효소와 접촉시키는 경우, 온도, pH 및 완충제의 적절한 조건 하에서 방출된 올리고머 및/또는 모노머의 초기 속도를 나타낸다. 하나의 예로서, PET 가수분해의 비활성은 가수분해 곡선의 선형 부분에서 결정된 바와 같이 가수분해된 PET의 μmol/분 또는 시간 당 그리고 효소의 ㎎ 당 등가의 생성된 TA의 ㎎에 대응한다.
기질(substrate) 상에 흡수되는 단백질의 능력은 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 예를 들어, 단백질 함량(proteic content) 또는 잔류 에스테라아제 활성, 잔류 폴리에스테르의 해중합 활성, 한천 플레이트 내에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물의 잔류 분해 또는 반응기 내의 잔류 폴리에스테르의 해중합 활성은 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 용액으로부터 측정될 수 있고, 여기에서 에스테라아제는 앞서 효소적 반응이 일어나지 않는 조건 하에서 기질과 함께 앞서 배양된다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 변종은 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 개선된 열안정성 및 증가된 폴리에스테르 분해 활성 둘 다를 갖는다.
본 발명의 정황 내에서, 용어 "증가된 열안정성(increased thermostability)"은 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 고온, 보다 상세하게는 50℃ 내지 90℃의 온도에서 그의 화학적 및/또는 물리적 구조에서의 변화에 저항하는 효소의 증가된 능력을 나타낸다. 이러한 증가는 전형적으로 약 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5배 또는 그 이상이다. 특히, 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 용융 온도(Tm)를 나타낼 수 있다. 본 발명의 정황에서, 용융 온도는 고려되는 단백질/효소 개체군의 절반이 미접힘(unfolded) 되거나 오접힘(misfolded) 되는 온도를 의미한다. 전형적으로, 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제의 Tm에 비하여 약 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 10℃ 또는 그 이상의 증가된 Tm을 나타낸다.
특히, 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 50℃ 내지 90℃의 온도에서 증가된 반감기를 가질 수 있다. 더욱이, 이러한 온도에서, 본 발명의 에스테라아제는 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 보다 큰 분해 활성을 나타낼 수 있다.
단백질의 열안정성은 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 방법에 따라 평가될 수 있다. 예를 들어, 열안정성은 원이색법(circular dichroism)을 사용하여 단백질 접힘(protein folding)의 분석에 의하여 평가될 수 있다. 달리 또는 추가로, 열안정성은 다른 온도에서의 배양 후 효소의 잔류 에스테라아제 활성 및/또는 잔류 폴리에스테르 해중합 활성을 측정하는 것에 의하여 평가될 수 있다. 다른 온도에서의 폴리에스테르의 해중합을 복수 회 수행하는 능력이 또한 평가될 수 있다. 다른 온도에서의 배양 후 한천 플레이트(agar plate) 내에 분산된 고체 폴리에스테르 화합물을 분해하는 효소 능력의 할로 직경(halo diameter) 측정에 의한 평가에 대하여 신속하고 가치있는 시험이 구성될 수 있다. 바람직하게는, 단백질/효소의 열안정성을 평가하기 위하여 시차주사형광측정법(DSF: Differential Scanning Fluorimetry)이 수행된다. 보다 상세하게는, DSF는 단백질의 열 변성 온도에서의 변화를 정량하고 그에 의하여 그의 용융 온도(Tm)를 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 정황에서, 그리고 특정한 지시가 없는 한, Tm은 실험부에서 노출된 바와 같이 DSF를 사용하여 측정된다. 본 발명의 정황에서, 동일한 조건(예를 들어 pH, 폴리에스테르의 속성 및 양 등) 하에서 측정된 Tm에 대하여 Tm의 비교가 수행된다.
본 발명의 에스테라아제는 하기 기술된 바와 같은 하나 또는 여러 변형들을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 에스테라아제는 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 시퀀스에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖고, G53, P58, A62, A64, S65, L67, A68, N85, T86, R89, D91, P93, R96, A121, G128, M131, G133, G134, L152, T153, P154, H156, T157, V170, T176, A178, P179, H183, S206, F208, A209, P210, N211 또는 S223으로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 치환을 갖는 서열 번호 1의 에스테라아제의 변종이고, 여기에서 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 시퀀스를 기준으로 번호가 매겨진다.
본 발명에 따르면, 표적화된 아미노산(들)은 19개의 다른 아미노산들 중의 임의의 하나로 대체될 수 있다.
바람직하게는 에스테라아제 변종은 G53, A62, A64, S65, A68, N85, T86, R89, A121, T157, V170, T176, S206, F208, N211, S223으로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 치환을 포함한다.
보다 바람직하게는, 에스테라아제 변종은 G53, S65, A121, T157, V170, T176, F208 또는 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 치환을 포함한다.
특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 G53L, S65T, A121R/W, T157E/Q/N/G, V170I, T176H/N/Q, F208W/I/L/G/S/N/A/R/T 및 N211Q로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 바람직하게는, 에스테라아제 변종은 F208W/I/L로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 적어도 F208W 치환을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 적어도 치환 F208I를 포함한다.
특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은, 상기 기술된 적어도 하나의 치환에 더하여, G59, Y60, T61, D63, S66, F90, Y92, H129, G132, W155 및 V177로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 추가의 치환을 더 포함한다. 바람직하게는, 하나 또는 그 이상의 추가의 치환은 Y60M/F, T61M/V, D63N/Q, S66H, F90W 및 Y92G/N/P/Q/T로부터 선택된다.
달리 또는 추가로, 적어도 하나의 추가의 치환은 A121S, T157S 또는 S223A로부터 선택된다.
다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 적어도 하나의 치환, 특히 서열 번호 1에 비하여 Y60, G53, T61, A62, D63, S65, S66, F90, Y92, A121, H129, T157, T176, V170, V177, F208, N211로부터 선택되는 포지션에서의 단일의 치환을 포함하고, 여기에서 치환은 Y60A/F, T61A/G, A62G/S, D63T/R, S66A, F90A/R/Y, Y92A, H129W 및 V177A와는 상이하다. 바람직하게는, 에스테라아제는 Y60M, T61M/V, D63N/Q, S66H, F90W 및 Y92G/N/P/Q/T로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 치환을 포함한다. 다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제는 Y60M, T61M/V, D63N/Q, S66H, F90W 및 Y92G/N/P/Q/T로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단일의 치환을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 D63N/Q로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 Y92G/N/P/Q/T, 바람직하게는 Y92P로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함한다.
다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 D63, A64, A68, N85, R89, W155, T176, S206, F208 또는 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 치환을 포함한다.
다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 G53, P58, G59, Y60, T61, A62, D63, A64, S65, S66, L67, A68, N85, T86, R89, F90, D91, Y92, P93, R96, A121, G128, H129, M131, G132, G133, G134, L152, T153, P154, W155, H156, T157, V170, T176, V177, A178, H183, S206, F208, A209, P210, S223 및 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 2개의 치환을 포함한다.
또 다른 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 G53, Y60, T61, D63, S65, S66, F90, Y92, A121, T157, V170, T176, V177, F208, S223 및 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 2개의 치환을 포함한다.
특히, 에스테라아제 변종은 S65, Y92, A121, T157, V170, T176, F208 및 S223으로부터 선택되는 포지션에서 적어도 2개의 치환을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 F208W + V170I로 이루어지는 치환들을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 Y92P + F208L로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 Y92P + F208W로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 T176H + F208W로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 V170I + A121S로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 V170I + A121S + S223A로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 F208W + T157Q로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 F208W + T157N으로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 F208W + T157S로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 F208W + S65T로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 따르면, 변종은 적어도 F208W + T157E로 이루어지는 치환의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제 변종은 상기 나열된 바와 같은 하나 또는 여러 개의 변형 및/또는 돌연변이를 포함한다.
개선된 활성 및 열안정성을 갖는 신규한 에스테라아제
본 발명의 또 다른 목적은 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성 및 증가된 열안정성 둘 다를 나타내는 신규한 에스테라아제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 시퀀스에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖고, (ii) 서열 번호 1에 비하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, (iii) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 활성 둘 다를 나타내는 에스테라아제를 제공하는 것이다.
유리하게도, 변종은 T61M, Y92G/P, F208W, Y92P + F208W 및 F208W + V170I로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하고 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 활성 둘 다를 나타낸다.
유리하게도, 에스테라아제 변종은 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 돌연변이 및 시퀀스 1을 기준으로 D203C + S248C로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 추가의 치환을 포함한다. 유리하게도, 변종은 적어도 F208W + D203C + S248C 또는 F208I + D203C + S248C로부터 선택되는 치환(들)을 포함하고 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 열안정성 및 증가된 활성 둘 다를 나타낸다.
변종의 폴리에스테르 분해 활성
본 발명의 하나의 목적은 에스테라아제 활성을 갖는 신규한 효소를 제공하는 것이다. 특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 효소는 추가로 큐티나아제 활성을 나타낸다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제는 폴리에스테르 분해 활성, 바람직하게는 폴리에틸렌테레프탈레이트 분해 활성을 갖는다.
다른 특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제는 또한 PBAT 분해 활성을 갖는다.
유리하게도, 본 발명의 에스테라아제 변종은 적어도 20℃ 내지 90℃, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 70℃, 심지어 보다 바람직하게는 60℃ 내지 70℃의 범위, 심지어 보다 바람직하게는 65℃의 온도에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제 변종은 70℃에서 폴리에스테르 분해 활성을 나타낸다. 특정한 구체예에 있어서, 폴리에스테르 분해 활성은 여전히 60℃ 내지 90℃의 온도에서 측정가능하다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제 변종은 서열 번호 1에 비하여 주어진 온도, 보다 상세하게는 40℃ 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 70℃, 심지어 보다 바람직하게는 60℃ 내지 70℃, 심지어 보다 바람직하게는 65℃의 온도에서 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다. 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 65℃에서 서열 번호 1의 에스테라아제의 폴리에스테르 분해 활성 보다 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 50%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상의 더 큰 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다. 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제 변종은 65℃에서 서열 번호 1의 에스테라아제의 폴리에스테르 분해 활성 보다 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 50%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상의 더 큰 폴리에스테르 분해 활성을 갖는다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제 변종은 적어도 5 내지 11의 pH의 범위, 바람직하게는 6 내지 9의 pH의 범위, 보다 바람직하게는 6.5 내지 9의 pH의 범위, 심지어 보다 바람직하게는 6.5 내지 8의 pH의 범위에서 측정가능한 에스테라아제 활성을 나타낸다.
핵산, 발현 카세트, 벡터, 숙주 세포
본 발명의 또 다른 목적은 상기 정의된 바와 같은 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산(nucleic acid)", "핵산 시퀀스(nucleic sequence) "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)", "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 및 "뉴클레오티드 시퀀스(nucleotide sequence)"는 상호호환적으로 사용되고 디옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드의 시퀀스를 의미한다. 핵산은 DNA (cDNA 또는 gDNA), RNA 또는 둘의 혼합물일 수 있다. 이는 단일 가닥 형태 또는 듀플렉스 형태 또는 둘의 혼합물일 수 있다. 이는 재조합, 인공 및/또는 합성 유래일 수 있고 이는 예를 들어 변형된 결합, 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 당을 포함하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 단리되거나 정제된 형태일 수 있고, 당해 기술분야에서 그 자체로 공지된 기술, 예를 들어, cDNA 라이브러리의 클로닝 및 발현, 증폭, 효소적 합성 또는 재조합 기술로 제조되고, 단리되고/되거나 조작될 수 있다. 핵산은 또한 시험관 내에서, 예를 들어, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444에 기술된 바와 같이 충분히 공지된 화학적 합성 기술로 합성될 수 있다.
본 발명은 또한 엄격한 조건 하에서 상기 정의된 바와 같은 에스테라아제를 인코딩하는 핵산으로 잡종화하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 엄격한 조건은 약 42℃에서 약 2.5 시간 동안 2 X SSC/0.1% SDS 내에서 잡종화 필터(hybridization filter)를 배양하고, 후속하여 필터를 4회 15분 동안 1 X SSC/0.1% SDS 내에서 65℃에서 세척하는 것을 포함한다. 사용된 프로토콜은 Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)) 및 Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989)) 등과 같은 문헌에서 기술된다.
본 발명은 또한 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 포함하고, 여기에서 상기 핵산의 시퀀스 또는 상기 시퀀스의 일부는 적어도 최적화된 코돈사용빈도(codon usage)를 사용하여 조작된다.
달리(Alternatively), 본 발명에 따른 핵산은 본 발명에 따른 에스테라아제의 시퀀스로부터 공제될 수 있고 핵산이 전사될 숙주 세포에 따라 코돈 사용빈도(codon usage)가 적응될 수 있다. 이러한 단계는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 충분히 공지되고 그의 일부가 문헌 매뉴얼 Sambrook et al. (Sambrook et al., 2001)에 기술된 방법에 따라 실행될 수 있다.
본 발명의 핵산은 선택된 숙주 세포 또는 시스템에서 폴리펩티드의 발현을 야기하거나 조절할하는 데 사용될 수 있는 조절 영역, 즉, 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 종결부위(terminator), 신호 펩티드(signal peptide) 등과 같은 추가의 뉴클레오티드 시퀀스를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 핵산의 발현을 적절한 숙주 세포 내로 지향시키는 하나 이상의 조절 시퀀스에 작동가능하게 연결되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 전형적으로, 발현 카세트는 전사 프로모터 및/또는 전사 종결부위 등과 같은 조절 시퀀스에 작동가능하게 연결되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다. 조절 시퀀스는 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산의 발현을 위한 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 인식되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 효소의 발현을 매개하는 전사 조절 시퀀스를 포함한다. 프로모터는 돌연변이 프로모터, 절단된 프로모터 및 하이브리드 프로모터를 포함하여 숙주 세포 내에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 숙주 세포에 동종이거나 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 조절 시퀀스는 또한 숙주 세포에 의해 인식되어 전사를 종결시키는 전사 종결부위일 수 있다. 종결부위는 에스테라아제를 인코딩하는 핵산의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포 내에서 기능적인 임의의 종결부위가 본 발명에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는 전사 프로모터 및 전사 종결부위에 작동가능하게 연결되는 본 발명에 따른 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
용어 "벡터(vector)"는 재조합 유전 물질을 숙주 세포로 전달하는 비히클로서 사용되는 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 주요 형태는 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스, 코스미드 및 인공 크로모좀이다. 벡터 자체는 일반적으로 삽입물(insert ; 이종 핵산 시퀀스, 전이유전자(transgene)) 및 벡터의 "골격(backbone)"의 역할을 하는 보다 큰 시퀀스로 이루어지는 DNA 시퀀스이다. 유전 정보를 숙주에 전달하는 벡터의 목적은 전형적으로 표적 세포 내의 삽입물을 단리시키거나, 증식시키거나, 발현하는 것이다. 발현 벡터(발현 구조물)로 불리우는 벡터는 특히 표적 세포 내에서 이종 시퀀스의 발현을 위하여 적응되고, 일반적으로 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 시퀀스의 발현을 구동하는 프로모터 시퀀스를 갖는다. 일반적으로, 발현 벡터 내에 존재하는 조절 요소(regulatory elements)는 전사 프로모터, 리보솜 결합 사이트, 종결부위를 포함하고 선택적으로 작동유전자(operator)를 제공한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 숙주 세포 내에서 자가 복제를 위한 복제 기점(origin of replication), 선택가능한 마커(marker), 제한된 수의 제한 효소 사이트 및 높은 복제 수를 위한 포텐셜(potential)을 포함한다. 발현 벡터의 예는 복제 벡터(cloning vector), 변형된 복제 벡터, 특히 디자인된 플라스미드 및 바이러스이다. 다른 숙주에서 적절한 수준의 폴리펩티드 발현을 제공하는 발현 벡터는 당해 기술분야에서 충분히 공지되어 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 그 안으로 벡터가 도입되는 숙주 세포의 상용성에 의존한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 기술된 바와 같은 핵산, 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 따라서 본 발명은 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 형질도입하기 위한 본 발명에 따른 핵산, 발현 카세트 또는 벡터의 용도에 관한 것이다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터와 그 안으로 벡터가 도입되어야 할 숙수 세포의 상용성에 의존적이다.
본 발명에 따르면, 숙주 세포는 일시적이거나 안정한 방법으로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입 될 수 있다. 본 발명의 발현 카세트 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되어 카세트 또는 벡터가 염색체 구성요소(chromosomal integrant)로서 또는 자가-복제 염색체외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포(host cell)"는 또한 복제 동안 일어나는 돌연변이로 인하여 부모 숙주 세포와 동일하지 않은 부모 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 본 발명의 변종의 생산에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 원핵 숙주 세포는 임의의 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아일 수 있다. 숙주 세포는 또한 효모, 진균, 포유동물, 곤충 또는 식물 세포 등과 같은 진핵 세포일 수 있다. 특정한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus,), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 트리코더마(Trichoderma), 아스퍼질러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia) 또는 야로위아(Yarrowia)의 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 핵산, 발현 카세트 또는 발현 벡터는 전기천공(electroporation), 공액화(conjugation), 형질도입, 경쟁적 세포 형질전환(competent cell transformation), 원형질체 형질전환(protoplast transformation), 원형질체 융합(protoplast fusion), 바이오리스틱 "유전자총" 형질전환(biolistic "gene gun" transformation), PEG-매개 형질전환(PEG-mediated transformation), 지질-보조 형질전환 또는 형질감염(lipid-assisted transformation or transfection), 화학적 매개 형질감염(chemically mediated transfection), 아세트산리튬-매개 형질전환(lithium acetate-mediated transformation), 리포좀-매개 형질전환(liposome-mediated transformation) 등과 같이 숙련된 자에게 공지된 임의의 방법에 의하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
선택적으로(optionally), 본 발명의 핵산, 카세트 또는 벡터의 하나 이상의 복제가 숙주 세포 내로 삽입되어 변종의 생산을 증가시킬 수 있다.
특정한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 재조합 미생물이다. 본 발명은 실로 폴리에스테르 함유 재료를 분해하는 개선된 능력을 갖는 미생물의 조작을 허용한다. 예를 들어, 본 발명의 시퀀스는 폴리에스테르를 분해할 수 있는 것으로 이미 공지된 진균 또는 박테리아의 야생형 균주를 보완하여 균주 능력을 개선하고/하거나 증가하도록 한다.
에스테라아제 변종의 생산
본 발명의 다른 목적은 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 발현하고 선택적으로 에스테라아제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 에스테라아제 변종의 생산 방법을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명은 (a) 본 발명의 핵산, 카세트 또는 벡터를 시험관 내 발현 시스템과 접촉시키는 단계; 및 (b) 생산된 에스테라아제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 에스테라아제의 시험관 내 생산 방법에 관한 것이다. 시험관 내 발현 시스템은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 충분히 공지된 것이고 상용적으로 획득가능하다.
바람직하게는, 생산 방법은
(a) 적절한 조건 하에서 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키는 단계; 및 선택적으로
(b) 세포 배양물로부터 상기 에스테라아제를 회수하는 단계를
포함한다.
유리하게도, 숙주 세포는 재조합 바실러스, 재조합 대장균, 재조합 아스퍼질러스, 재조합 트리코더마, 재조합 스트렙토마이세스, 재조합 사카로마이세스, 재조합 피치아 또는 재조합 야로위아 리폴리티카이다.
숙주 세포는 폴리펩티드의 생산을 위하여 적절한 영양 배지 내에서 당해 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 배양된다. 예를 들어, 세포는 진탕 플라스크 배양 또는 적절한 배지 중에서 그리고 효소가 발현되고/되거나 단리되도록 하는 조건 하에서 실험실 또는 산업용 발효기 중에서의 소규모 또는 대규모 발효(연속, 배치, 유가(fed-batch) 또는 고상 발효를 포함)로 배양될 수 있다. 배양은 상용적인 공급원 또는 공개된 조성물(예를 들어, American Type Culture Collection의 카다로그에)에 따라 제조된 적절한 영양 배지 내에 위치된다.
에스테라아제가 영양 배지 내로 분비되는 경우, 에스테라아제는 직접적으로 배양 상청액으로부터 회수될 수 있다. 역으로, 에스테라아제는 세포 용해물로부터 또는 침투화(permeabilisation) 후 회수될 수 있다. 에스테라아제는 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 에스테라아제는 수집(collection), 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이로 제한되지 않는 통상의 절차로 영양 배지로부터 회수될 수 있다. 선택적으로, 에스테라아제는 크로마토그래피(예를 들어, 이온교환, 친화성, 소수성, 크로마토 초점 맞춤 및 크기 배제), 전기영동 절차(예를 들어, 제조 등전위 초점 맞춤), 시차 용해도(differential solubility ; 예를 들어, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE 또는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수득하기 위한 추출을 포함하나 이로 제한되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 절차로 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있다.
에스테라아제는 있는 그대로, 정제된 형태로, 단독으로 또는 추가의 효소와 조합으로 사용되어 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 제품 등과 같은 폴리에스테르 함유 재료의 분해 및/또는 재생에 포함되는 효소 반응을 촉매할 수 있다. 에스테라아제는 가용성 형태 또는 고상일 수 있다. 특히, 이는 세포막 또는 지질 소포에 또는 유리, 플라스틱, 폴리머, 필터, 막, 예를 들아 비드, 컬럼, 플레이트 등의 형태와 같은 합성 지지체에 결합될 수 있다.
조성물
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 정황에서, 용어 "조성물(composition)"은 본 발명의 에스테라아제를 포함하는 임의의 종류의 조성물을 포함한다. 특정한 구체예에 있어서, 에스테라아제는 단리되거나 적어도 부분적으로 정제된 형태이다.
조성물은 액체 또는 건조물, 예를 들어 분말의 형태일 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 조성물은 동결건조물이다. 예를 들어, 조성물은 에스테라아제 및/또는 본 발명의 에스테라아제를 인코딩하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 및 선택적으로 부형제 및/또는 시약을 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 생화학에서 통상적으로 사용되는 완충제, pH를 조정하기 위한 약품, 소듐벤조에이트, 소듐소르베이트 또는 소듐아스코르베이트 등과 같은 방부제, 보존제, 녹말, 덱스트린 등과 같은 보호 또는 안정화제, 아라비아검, 염, 당, 예를 들어 소르비톨, 트레할로스 또는 락토오스, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 프로필렌글리콜, EDTA 등과 같은 봉쇄제, 환원제, 아미노산, 용매 또는 수용액 등과 같은 담체 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 에스테라아제를 하나 또는 여러 부형제들과 혼합하는 것에 의하여 수득될 수 있다.
본 발명의 조성물은 0.1중량% 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.1중량% 내지 50중량%, 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 30중량 %, 심지어 보다 바람직하게는 0.1중량% 내지 5 중량%의 본 발명의 에스테라아제 및 0.1중량% 내지 99.9중량%, 바람직하게는 50중량% 내지 99.9중량%, 보다 바람직하게는 70중량% 내지 99.9중량%, 심지어 보다 바람직하게는 95중량% 내지 99.9중량%의 부형제(들)을 포함할 수 있다. 바람직한 조성물은 0.1 내지 5중량%의 본 발명의 에스테라아제를 포함한다.
특정한 구체예에 있어서, 조성물은 효소 활성을 나타내는 추가의 폴리펩티드(들)을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 에스테라아제의 양은 예를 들어, 분해되어야 할 폴리에스테르 함유 재료의 속성 및/또는 조성물 중에 포함된 추가 효소/폴리펩티드에 따라 당해 기술분야에서 숙련된 자에 의하여 용이하게 적응될 수 있다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 에스테라아제는 하나 또는 여러 부형제, 특히 폴리펩티드를 안정시키거나 분해로부터 보호하는 부형제와 함께 수성 매질 중에 용해된다. 예를 들어, 본 발명의 에스테라아제는 종국적으로 글리세롤, 소르비톨, 덱스트린, 녹말, 프로판디올 등과 같은 글리콜, 염 등과 같은 추가 구성성분과 함께 수 중에 용해될 수 있다. 계속해서 그 결과의 혼합물은 건조되어 분말을 수득하도록 할 수 있다. 이러한 혼합물을 건조시키기 위한 방법은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 충분히 공지되어 있고 제한없이 동결건조(lyophilisation), 냉동-건조(freeze-drying), 분무-건조, 초임계 건조, 하향기류 증발(down-draught evaporation), 박-층 증발(thin-layer evaporation), 원심분리 증발(centrifugal evaporation), 컨베이어 건조(conveyer drying), 유동상 건조(fluidized bed drying), 드럼 건조(drum drying) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
추가의 특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 에스테라아제를 발현하는 적어도 하나의 재조합 세포 또는 그의 추출물을 포함한다. "세포의 추출물(extract of a cell)"은 세포 상청액, 세포 부스러기, 세포벽, DNA 추출물, 효소 또는 효소 제제 또는 화학적, 물리적 및/또는 효소적 처리에 의하여 세포로부터 파생되는 임의의 제제 등과 같이 세포로부터 수득되는 임의의 분획을 지칭하며, 이는 필수적으로 살아있는 세포가 없는 것이다. 바람직한 추출물은 효소적으로-활성인 추출물이다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 하나 또는 여러 재조합 세포 또는 그의 추출물 및 선택적으로 하나 또는 여러 추가의 세포를 포함할 수 있다.
특정한 구체예에 있어서, 조성물은 본 발명의 에스테라아제를 발현하고 분비하는 재조합 미생물의 동결건조된 배양 배지로 이루어지거나 이를 포함한다. 특정한 구체예에 있어서, 분말은 본 발명의 에스테라아제 및 안정화/가용화하는 양의 글리세롤, 소르비톨 또는 말토덱스트린 및/또는 사이클로덱스트린 등과 같은 덱스트린, 녹말, 프로판디올 등과 같은 글리콜 및/또는 염을 포함한다.
본 발명의 에스테라아제의 용도
본 발명의 또 다른 목적은 호기성 조건 또는 혐기성 조건에서 분해하고/하거나 폴리에스테르를 포함하거나 이로 만들어지는 플라스틱 제품으로서 폴리에스테르 함유 재료를 재생하기 위한 본 발명의 에스테라아제를 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 변종 에스테라아제는 PET를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하는 데 특히 유용하다.
따라서 본 발명의 목적은 PET 함유 재료 등과 같은 폴리에스테르 함유 재료를 효소적 분해하는 데 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 이의 추출물 또는 조성물을 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하는 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 플라스틱 제품이 본 발명의 에스테라아제 또는 숙주 세포와 접촉되고, 그에 의하여 플라스틱 제품을 분해한다. 유리하게도, 폴리에스테르 함유 재료의 폴리에스테르(들)가 모노머 및/또는 올리고머까지 해중합된다.
분해 방법의 하나의 구체예에 있어서, 적어도 하나의 폴리에스테르가 분해되어 재중합가능한 모노머 및/또는 올리고머가 수득되고, 이는 유리하게도 재사용되도록 회수된다.
하나의 구체예에 있어서, 폴리에스테르 함유 재료의 폴리에스테르(들)는 완전히 분해된다.
특정한 구체예에 있어서, 플라스틱 제품은 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌테레프탈레이트(PBT), 폴리에티렌이소소르비드테레프탈레이트(PEIT), 폴리유산(PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌석시네이트(PBS), 폴리부틸렌식시네이트아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌아디페이트테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌아디페이트)(PEA), 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN) 및 이러한 폴리머의 블렌드/혼합물로부터 선택되는, 적어도 하나의 폴리에스테르, 바람직하게는 폴리에틸렌테레프탈레이트를 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 폴리에스테르 함유 재료는 PET를 포함하고, 적어도 모노에틸렌글리콜 또는 테레프탈산 등과 같은 모노머 및/또는 메틸-2-하이드록시에틸테레프탈레이트(MHET), 비스(2-하이드록시에틸)테레프탈레이트(BHET), 2-하이드록시에틸벤조에이트(HEB) 및 디메틸테레프탈레이트(DMT) 등과 같은 올리고머가 회수되어 재생되거나 예를 들어 메탄화(methanisation) 된다.
본 발명은 또한 폴리에스테르 함유 재료를 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 또는 조성물에 노출시키고, 선택적으로 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 것을 포함하는, 폴리에스테르 함유 재로로부터 모노머 및/또는 올리고머를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 모노에틸렌글리콜 및 테레프탈산으로부터 선택되는 모노머 및/또는 메틸-2-하이드록시에틸테레프탈레이트(MHET), 비스(2-하이드록시에틸)테레프탈레이트(BHET), 2-하이드록시에틸벤조에이트(HEB) 및 디메틸테레프탈레이트(DMT)로부터 선택되는 올리고머를 제조하는 데 특히 유용하다.
폴리에스테르 함유 재료를 분해하는 데 요구되는 시간은 폴리에스테르 함유 재료 자체(즉, 플라스틱 제품의 속성 및 유래, 그의 조성, 형상 등), 사용되는 에스테라아제의 형태 및 양과 마찬가지로 여러 공정 매개변수(즉, 온도, pH, 추가의 약품 등)에 따라 변할 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 공정 매개변수를 폴리에스테르 함유 재료에 용이하게 적응시킬 수 있을 것이다.
유리하게도, 분해 공정은 20℃ 내지 90℃, 바람직하게는 40℃ 내지 80℃, 보다 바람직하게는 50℃ 내지 70℃, 보다 바람직하게는 60℃ 내지 70℃가 포함되는 온도에서, 심지어 보다 바람직하게는 65℃에서 실행된다. 다른 특정한 구체예에 있어서, 분해 공정은 70℃에서 실행된다. 보다 일반적으로, 온도는 에스테라아제가 비활성화되는 온도에 대응하는 비활성화 온도 및/또는 재조합 미생물이 더 이상 에스테라아제를 합성하지 않는 온도 미만으로 유지된다. 특히, 온도는 폴리에스테르 함유 재료 중의 폴리에스테르의 유리전이온도(Tg) 미만으로 유지된다. 보다 상세하게는 공정은 에스테라아제가 수 회 사용되고/되거나 재생될 수 있는 온도에서 연속적인 방법으로 실행된다.
유리하게도, 분해 공정은 5 내지 11이 포함되는 pH에서, 바람직하게는 6 내지 9의 pH에서, 보다 바람직하게는 6.5 내지 9의 pH에서, 심지어 보다 바람직하게는 6.5 내지 8의 pH에서 실행된다.
특정한 구체예에 있어서, 폴리에스테르 함유 재료는 에스테라아제와 접촉되기 이전에 전처리되어 그의 구조를 물리적으로 변화시켜 폴리에스테르와 본 발명의 변종 간의 접촉의 면적을 증가시킬 수 있다.
선택적으로, 해중합으로부터 야기되는 모노머 및/또는 올리고머는 순차적으로 또는 연속적으로 회수될 수 있다. 출발 폴리에스테르 함유 재료에 따라 단일 형태의 모노머 및/또는 올리고머 또는 여러 다른 형태의 모노머 및/또는 올리고머가 회수될 수 있다.
회수된 모노머 및/또는 올리고머는 모든 적절한 정제 방법을 사용하여 추가로 정제되고 재-중합가능한 형태로 조건화될 수 있다. 정제 방법의 예는, 조합되거나 조합되지 않은, 스트리핑 공정(stripping process), 수용액에 의한 분리, 스팀 선택 응축(steam selective condensation), 생물공정 후 매질의 여과 및 농축, 분리, 증류, 진공 증발, 추출, 전기투석, 흡수, 이온교환, 침전, 결정화, 농축 및 산 부가 탈수 및 침전, 나노여과(nanofiltration), 산 촉매 처리, 반연속식 증류(semi continuous mode distillation) 또는 연속식 증류, 용매 추출, 증발 농축, 증발 결정화, 액체/액체 추출, 수소화, 공비 증류 공정(azeotropic distillation process), 흡수, 컬럼크로마토그래피, 단순 진공 증류 및 마이크로여과를 포함한다.
계속해서 재중합가능한 모노머 및/또는 올리고머는 예를 들어 폴리에스테르를 합성하기 위하여 재사용될 수 있다. 유리하게도, 동일한 속성의 폴리에스테르가 재중합된다. 그러나, 회수된 모노머 및/또는 올리고머를 다른 모노머 및/또는 올리고머와 혼합하여 예를 들어 신재 코폴리머를 합성하는 것이 가능하다. 달리, 회수된 모노머는 화학 중간체로 사용되어 대상의 신재 화합물을 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 폴리에스테르 함유 재료를 본 발명의 에스테라아제 또는 대응하는 재조합 세포 또는 그의 추출물 또는 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는 폴리에스테르 함유 재료의 표면 가수분해 또는 표면 관능화의 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 폴리에스테르 재료의 친수성 또는 흡수도(water absorbency)를 증가시키는 데 특히 유용하다. 이러한 증가된 친수성은 섬유 제조, 전자 및 생물의학 응용에서 특별한 흥미를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 에스테라아제 및/또는 상기 에스테라아제를 발현하고 분비하는 재조합 미생물이 포함되는 폴리에스테르 함유 재료를 제공하는 것이다. 특정한 구체예에 있어서, 이러한 폴리에스테르 함유 재료는 플라스틱 화합물일 수 있다. 따라서 본 발명의 하나의 목적은 본 발명의 에스테라아제 및/또는 재조합 세포 및/또는 조성물 또는 그의 추출물 및 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 플라스틱 화합물을 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 폴리에스테르는 PET이다.
실시예
실시예 1 - 에스테라아제의 구조(construction), 발현(expression) 및 정제(purification)
- 구조
플라스미드 구조 pET26b-LCC-His 를 사용하여 에스테라아제 변종이 생성되었다. 이 플라스미드는 NdeI 와 XhoI 제한 부위(restriction site) 사이에서 대장균 발현에 대하여 최적화된, 서열 번호 1의 에스테라아제를 인코딩하는 유전자를 복제하는 것으로 이루어진다. 2개의 부위 특이적 돌연변이 유도 키트를 공급자의 추천에 따라 사용하여 에스테라아제 변종을 생성하였다: QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kit 및 QuikChange Lightning Multi Site-Directed from Agilent (Santa Clara, California, USA).
- 에스테라아제의 발현 및 정제
균주 Stellar™California, USA) 및 E. coli One Shot®BL21 DE3(Life technologies, Carlsbad, California, USA)를 연속적으로 사용하여 50 ㎖ LB-Miller 배지 또는 ZYM 자가 유도성 배지(Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234) 중에서 복제 및 재조합 발현을 수행하였다. LB-Miller 배지 중에서의 유도는 16℃에서 0.5 mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG, Euromedex, Souffelweyersheim, France)로 수행되었다. Avanti J-26 XP centrifuge(Beckman Coulter, Brea, USA) 내에서의 원심분리(10℃에서 8000 rpm, 20 분)에 의하여 배양이 중단되었다. 세포는 20㎖의 Talon 완충제(Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, pH 8) 중에 현탁되었다. 계속해서 세포 현탁액을 2 분 동안 FB 705 소니케이터(Fisherbrand, Illkirch, France)로 30%의 진폭(2 초 ON 및 1 초 OFF 사이클)으로 음파처리하였다. 계속해서, 원심분리의 단계가 실현되었다: Eppendorf 원심분리 내에서 11000 rpm, 10℃에서 30초. 가용성 분획을 수집하고 친화도 크로마토그래피에 적용시켰다. 이러한 정제 단계는 Talon®Metal Affinity Resin(Clontech, CA, USA)로 완성되었다. 이미다졸로 보충된 Talon 완충제의 경사로 단백질 용리가 실행되었다. 정제된 단백질은 Talon 완충제에 대하여 투석되었고 계속해서 생산자(Lifescience Bio-Rad, France) 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석기를 사용하여 정량되었고 +4℃에 저장하였다.
실시예 2 - 본 발명의 에스테라아제의 활성의 평가
에스테라아제의 비활성이 결정되었고 서열 번호 1의 에스테라아제의 비활성과 비교되었다.
비활성을 평가하는 데 여러 방법론이 사용되었다:
(1) pNP-부티레이트 가수분해에 기초하는 비활성;
(2) PET 가수분해에 기초하는 비활성;
(3) 고체 형태 하에서의 폴리에스테르의 분해에 기초하는 비활성;
(4) 반응기 내에서의 PET 가수분해에 기초하는 비활성.
2.1 pNP-부티레이트 가수분해
용액 중의 단백질 20 ㎕을 0.1 M 인산칼륨 완충제 pH 8.0 175㎕ 및 pNP-부티레이트(2-메틸-2-부탄올 중의 40 mM) 5㎕와 결합시켰다. 효소적 반응을 30℃에서 교반 하에서 15 분 동안 수행하고 마이크로플레이트 분광광도계(microplate spectrophotometer ; Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 405 ㎚에서 흡광도를 획득하였다. 비활성(방출된 pNPB/분/㎎ 효소 의 μmol로 표현된 초기 속도)이 가수분해 곡선의 직선부에서 결정되었고 야생형 에스테라아제의 활성과 변종의 활성을 비교하는 데 사용되었다.
2.2 PET 가수분해
100 ㎎의 비정질 PET를 평량하고 100 ㎖ 유리병 내에 도입하였다. 1 ㎖의 에스테라아제 제제(기준 대조로서) 또는 변종 제제 각각을 Talon 완충제(Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.3M, pH 8) 중에 0.02 또는 0.03 ㎎/㎖로 준비하고 유리병 내에 도입시켰다. 마지막으로, 49 ㎖의 0.1 M 인산칼륨 완충제 pH 8를 첨가하였다.
각 유리병을 Max Q 4450 배양기(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA) 내에서 65℃ 및 150 rpm에서 배양하는 것에 의하여 해중합을 시작하였다.
시간 당 생성된 당량 TA의 ㎎으로의 해중합 반응의 초기 속도를 처음 24 시간 동안 서로 다른 시간에서 수행된 샘플링에 의하여 결정하였고 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다. 필요한 경우, 샘플을 0.1 M 인산칼륨 완충제 pH 8에 희석시켰다. 계속해서, 150 ㎕의 메탄올 및 6.5 ㎕의 HCl 6 N을 150 ㎕의 샘플 또는 희석액에 첨가하였다. 혼합 및 0.45 ㎛ 주사기 필터 상에서 여과한 후, 샘플을 UHPLC 적재하여 테레프탈산(TA), MHET 및 BHET의 유리를 모니터링 하였다. 사용된 크로마토그래피 시스템은 펌프 모듈, 오토샘플러(autosampler), 25℃로 온도조절된 컬럼 오븐 및 240 ㎚에서의 UV 검출기를 포함하는 Ultimate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)이었다. 사용된 컬럼은 Discovery®HS C18 HPLC 컬럼(프리컬럼이 장착된 150 x 4.6 ㎜, 5 ㎛, Supelco, Bellefonte, USA)이었다. 1 mM의 H2SO4 중의 MeOH의 경사(30% 내지 90%)를 사용하여 1㎖/분에서 TA, MHET 및 BHET를 분리하였다. 20 ㎕의 샘플이 주입되었다. 샘플 보다 상용 TA 및 BHET 및 자가 합성된 MHET로부터 준비된 표준 곡선에 따라 TA, MHET 및 BHET를 측정하였다. PET의 비분해활성(당량 TA의 ㎎/시간/효소의 ㎎)을 가수분해 곡선의 선형 부분에서 결정하였다. 당량 TA는 측정된 TA와 측정된 MHET 및 BHET 중에 포함된 TA의 합에 대응한다.
2.3 고체 형태 하에서의 폴리에스테르의 분해
20 ㎕의 효소 제제를 PET를 포함하는 한천 플레이트 중에 형성된 웰 내에 퇴적시켰다. HFIP 중에 용해된 500㎎의 PET를 용해시켜서 한천 플레이트의 제조를 실현하였고, 이 매질을 250 ㎖ 수용액 중에 부어넣었다. 52℃에서의 HFIP 증발 후, 용액을 3% 한천을 포함하는 0.2 M 인산칼륨 완충제 pH 8과 용적비(v/v)로 혼합하였다. 대략 30 ㎖의 혼합물을 사용하여 각 옴니트레이(omnitray)를 제조하고 4℃에서 저장하였다.
야생-형 에스테라아제 및 변종에 의한 폴리에스테르 분해로 인하여 형성된 공간(halo)의 직경을 측정하고 60 또는 65℃에서 2 내지 4 시간 후 비교하였다.
2.4 반응기 중에서의 PET 가수분해
Minibio 500 생물반응기(Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands)를 5 g의 비정질 PET 및 2.5 내지 5 ㎎의 LC-에스테라아제를 포함하는 10 mM 인산칼륨 완충제 pH 8 100 ㎖로 시작하였다. 교반을 수중 임펠러를 사용하여 250 rpm으로 설정하였다. 생물반응기를 외부 수조(water bath) 내에 함침시켜 65℃로 온도조절하였다. 3 M의 KOH를 첨가하여 pH를 8로 조절하였다. BioXpert 소프트웨어 V2.95의 덕분으로 다른 매개변수(pH, 온도, 교반, 염기의 첨가)가 모니터링 되었다. 500 ㎕의 반응 매질을 정기적으로 샘플링 하였다.
실시예 2.2에서 기술된 바와 같이 HPLC로 TA, MHET 및 BHET의 양을 결정하였다. 65℃로 온도조절된 Aminex HPX-87K 컬럼(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, California, United States)를 사용하여 EG의 양을 결정하였다. 용리액은 0.6 ㎖.min-1의 K2HPO4 5 mM이었다. 주입은 20 ㎕이었다. 에틸렌글리콜을 굴절율 측정기를 사용하여 모니터링 하였다.
가수분해의 백분율은 초기 샘플 중에 포함된 TA의 총량에 대한 주어진 시간에서의 몰 농도의 비율(TA +MHET + BHET)에 기초하거나, 초기 샘플 중에 포함된 EG의 총량에 대한 주어진 시간에서의 몰 농도의 비율(EG +MHET + 2 x BHET)에 기초하여 산출되었다. 비활성은 분해의 비속도(specific rate)에 대응하고, 시간 당 및 효소의 ㎎ 당 총 유리된 당량 TA의 ㎎ 또는 시간 당 및 효소의 ㎎ 당 총 당량 EG의 ㎎에 대응한다.
본 발명의 에스테라아제 변종의 비교된 비분해활성을 표 1에 나타내었다. 서열 번호 1의 에스테라아제의 비분해활성이 기준으로 사용되었고 100% 분해활성으로 고려하였다. 실시예 2.2에 노출된 바와 같이 분해활성이 측정되었다(당량 TA의 ㎎/시간/효소의 ㎎)
실시예 3 - 본 발명의 에스테라아제 변종의 활성 및 열안정성의 평가
본 발명의 에스테라아제 변종의 열안정성을 평가하고 서열 번호 1의 에스테라아제의 열안정성과 비교하였다.
시차주사형광측정법(DSF)을 사용하여 열안정성을 추산하였다.
DSF를 사용하여 용융 온도(Tm), 단백질 개체군의 절반이 미접힘되는 온도를 결정하여 야생-형 단백질 및 변종의 열안정성을 평가하였다. 단백질 샘플을 14 μM (0.4 ㎎/㎖)의 농도로 제조하고 20 mM Tris HCl pH 8.0, 300 mM NaCl로 이루어지는 완충제 A 중에 저장하였다. DMSO 중의 SYPRO orange 염료 5000x 저장 용액을 수중에 250x로 초회 희석시켰다. 단백질 샘플을 각 웰이 25 ㎕의 최종 용적을 포함하는 백색의 투명한 96-웰 PCR 플레이트(Bio-Rad cat# HSP9601)에 적재시켰다. 각 웰 중의 단백질 및 SYPRO Orange 염료의 최종 농도는 각각 5 μM(0.14 ㎎/㎖) 및 10X이었다. 웰 당 적재된 용적은 다음과 같다: 15 ㎕의 완충제 A, 9 ㎕의 0.4 ㎎/㎖ 단백질 용액 및 1 ㎕의 250x Sypro Orange 희석 용액. 계속해서 PCR 플레이트를 광학적 품질의 밀봉 테이프로 밀봉하고 실온에서 2000 rpm으로 1 분 동안 회전시켰다. 계속해서 450/490 여기 및 560/ 580 방출 필터를 사용하도록 설정된 CFX96 실시간 PCR 시스템을 사용하여 DSF 실험을 실행하였다. 샘플을 25 내지 100℃까지 1.1℃/분의 속도로 가열하였다. 매 0.3℃ 마다 단일의 형광 측정을 취하였다. Boltzmann 식에 곡선 맞춤을 수행하여 용융 온도를 결정하였다.
계속해서 야생-형 단백질 및 변종을 이들의 Tm 값에 기초하여 비교하였다. 다른 제조로부터의 동일한 단백질에 대한 실험들 간의 높은 재현성으로 인하여, 0.8℃의 Tm이 변종을 비교하기에 유의미한 것으로 고려되었다. Tm 값은 적어도 2회 측정의 평균에 대응한다.
본 발명의 에스테라아제 변종의 비교된 비분해활성 및 열안정성을 표 2에 나타내었다. 서열 번호 1의 에스테라아제의 비분해활성을 기준으로 사용되었고 100% 분해활성으로 고려하였다. 비분해활성이 실시예 2.2에 따라 측정되었다(당량 TA의 ㎎/시간/효소의 ㎎). 열안정성을 Tm 값으로 표현하였고(실시예 3에 따라 측정된) 서열 번호 1의 에스테라아제의 Tm에 비하여 Tm의 이득이 꺽쇠 내에 표시되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> CARBIOS
<120> Novel esterases and uses thereof
<130> IP20234253FR
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> esterase
<400> 1
Ser Asn Pro Tyr Gln Arg Gly Pro Asn Pro Thr Arg Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ala Asp Gly Pro Phe Ser Val Ala Thr Tyr Thr Val Ser Arg Leu Ser
20 25 30
Val Ser Gly Phe Gly Gly Gly Val Ile Tyr Tyr Pro Thr Gly Thr Ser
35 40 45
Leu Thr Phe Gly Gly Ile Ala Met Ser Pro Gly Tyr Thr Ala Asp Ala
50 55 60
Ser Ser Leu Ala Trp Leu Gly Arg Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val
65 70 75 80
Val Leu Val Ile Asn Thr Asn Ser Arg Phe Asp Tyr Pro Asp Ser Arg
85 90 95
Ala Ser Gln Leu Ser Ala Ala Leu Asn Tyr Leu Arg Thr Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Val Arg Ala Arg Leu Asp Ala Asn Arg Leu Ala Val Ala Gly
115 120 125
His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Arg Ile Ala Glu Gln Asn Pro
130 135 140
Ser Leu Lys Ala Ala Val Pro Leu Thr Pro Trp His Thr Asp Lys Thr
145 150 155 160
Phe Asn Thr Ser Val Pro Val Leu Ile Val Gly Ala Glu Ala Asp Thr
165 170 175
Val Ala Pro Val Ser Gln His Ala Ile Pro Phe Tyr Gln Asn Leu Pro
180 185 190
Ser Thr Thr Pro Lys Val Tyr Val Glu Leu Asp Asn Ala Ser His Phe
195 200 205
Ala Pro Asn Ser Asn Asn Ala Ala Ile Ser Val Tyr Thr Ile Ser Trp
210 215 220
Met Lys Leu Trp Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Arg Gln Phe Leu Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn Asp Pro Ala Leu Ser Asp Phe Arg Thr Asn Asn Arg His
245 250 255
Cys Gln
Claims (13)
- (i) 서열 번호 1에서 규정되는 전장 아미노산 시퀀스에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖고, (ii) F208, T157, T176, S65, G53, A121, V170, S223, P58, A62, A64, L67, A68, N85, T86, R89, D91, P93, R96, G128, M131, G133, G134, L152, T153, P154, H156, A178, P179, H183, S206, A209, P210 또는 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖고, 여기에서 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 치환을 기준으로 번호가 매겨지고, (iii) 서열 번호 1의 에스테라아제에 비하여 증가된 폴리에스테르 분해 활성을 나타내는, 에스테라아제 변종(esterase variant).
- 제1항에 있어서,
상기 에스테라아제가 F208, T157, T176, G53, A121, V170, S223, S65 또는 N211로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 여기에서 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 치환을 기준으로 번호가 매겨지는, 에스테라아제 변종. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 에스테라아제가 F208W/I/L/G/S/N/A/R/T, G53L, S65T, A121R/W, T157E/Q/N/G, V170I, T176H/N/Q, N211Q로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 에스테라아제 변종. - 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제가 G59, Y60, T61, D63, S66, F90, Y92, H129, G132, W155 및 V177로부터 선택되는 포지션에서의 적어도 하나의 치환을 더 포함하는 에스테라아제 변종. - 제4항에 있어서,
적어도 하나의 치환이 Y60M/F, T61M/V, D63N/Q, S66H, F90W 및 Y92G/N/P/Q/T로 이루어지는 군으로부터 선택되는 에스테라아제 변종. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 에스테라아제가 F208W/I/L/G/S/N/A/R/T, G53L, S65T, A121R/W, T157E/Q/N/G, V170I, T176H/N/Q, N211Q, F208W + V170I, Y92P + F208L, Y92P + F208W, T176H + F208W, V170I + A121S, V170I + A121S + S223A, F208W + T157Q, F208W + T157N, F208W + T157S, F208W + S65T 또는 F208W + T157E로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환 또는 치환의 조합을 포함하고, 여기에서 포지션은 서열 번호 1에서 규정되는 아미노산 치환을 기준으로 번호가 매겨지는 에스테라아제 변종. - 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에서 정의되는 바와 같은 에스테라아제 변종을 인코딩하는 핵산.
- 제7항의 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
- 제7항의 핵산 또는 제8항의 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에서 정의되는 바와 같은 에스테라아제 변종 또는 제9항에 따른 숙주 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물.
- (a) 제9항에 따른 숙주 세포를 에스테라아제를 인코딩하는 핵산을 발현하기에 적절한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 선택적으로
(b) 세포 배양물로부터 상기 에스테라아제를 회수하는 단계,
를 포함하는 에스테라아제의 제조 방법. - (a) 플라스틱 제품을 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 에스테라아제 또는 제9항에 따른 숙주 세포 또는 제10항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및 선택적으로
(b) 모노머 및/또는 올리고머를 회수하는 단계,
를 포함하는, 적어도 하나의 폴리에스테를 포함하는 플라스틱 제품을 분해하는 방법. - 제12항에 있어서,
플라스틱 제품이 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리트리메틸렌테레프탈레이트(PTT), 폴리부틸렌테레프탈레이트(PBT), 폴리에티렌이소소르비드테레프탈레이트(PEIT), 폴리유산(PLA), 폴리하이드록시알카노에이트(PHA), 폴리부틸렌석시네이트(PBS), 폴리부틸렌식시네이트아디페이트(PBSA), 폴리부틸렌아디페이트테레프탈레이트(PBAT), 폴리에틸렌푸라노에이트(PEF), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(에틸렌아디페이트)(PEA), 폴리에틸렌나프탈레이트(PEN) 및 이러한 재료의 블렌드/혼합물, 바람직하게는 폴리에틸렌테레프탈레이트로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리에스테르를 포함하는 방법.
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