JP2022539814A

JP2022539814A - エステラーゼ及びその使用

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Publication number: JP2022539814A
Application number: JP2022500650A
Authority: JP
Inventors: マルティ，アラン; トゥルニエ，ヴァンサン
Original assignee: Carbios SA
Current assignee: Carbios SA
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2020-07-10
Publication date: 2022-09-13
Also published as: KR20220032091A; US20220251327A1; WO2021005198A1; MX2022000469A; CN114096665A; CA3145635A1; TW202117011A; EP3997220A1

Abstract

本発明は、新規エステラーゼに、特に、配列番号１のエステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された耐性を有するエステラーゼバリアント、ならびにポリエステル含有材料、例えばプラスチック製品などを分解するためのその使用に関する。本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタレート、及びポリエチレンテレフタレートを含む材料を分解するために特に適している。

Description

本発明は、新規エステラーゼに関し、特に、親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を有するエステラーゼに関する。本発明はまた、ポリエステル含有材料、例えばプラスチック製品などを分解するための前記新規エステラーゼの使用に関する。本発明のエステラーゼは、特にポリエチレンテレフタレート、及びポリエチレンテレフタレート含有材料を分解するために適している。

背景

エステラーゼは、多様なポリマー（ポリエステルを含む）の加水分解を触媒することができる。その状況では、エステラーゼは、多くの産業用途（食器洗い及び洗濯用途のための洗剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の無毒化における生体触媒として、又は織物産業におけるポリエステル布地の処理のため、を含む）において有望な効果を示している。ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用が特に興味深い。実際に、ＰＥＴは、多数の技術分野において、例えば衣服、カーペットの製造において、あるいは包装又は自動車用プラスチックなどの製造のための熱硬化性樹脂の形態において使用されており、埋立地におけるＰＥＴ蓄積が増大する生態学的な問題になる。

ポリエステルの、及び特にＰＥＴの酵素分解は、プラスチック廃棄物の蓄積を減少させるための興味深い解決策として考慮される。実際に、酵素はポリエステル含有材料の、特にプラスチック製品の加水分解を、単量体レベルにまで加速させうる。さらに、加水分解物（即ち、単量体及びオリゴマー）は、新たなポリマーを合成するための材料としてリサイクリングすることができる。

このような状況下、いくつかのエステラーゼが、ポリエステルのための分解酵素の候補として同定されており、そのようなエステラーゼの一部のバリアントが開発されている。エステラーゼの中で、クチナーゼは、また、クチンヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．１．７４）として公知であり、特に興味深い。クチナーゼは、種々の菌類（P.E. Kolattukudy in “Lipases”, Ed. B. Borg- strom and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504）、細菌、及び植物花粉から同定されている。近年、メタゲノミクスアプローチによって、追加のエステラーゼが同定されている。

しかし、ポリエステル分解過程をより効率的にし、それにより、より競合的にするために、既に公知のエステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を伴うエステラーゼについての必要性が依然としてある。

発明の概要

本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する親、又は野生型エステラーゼと比較して増加した活性及び／又は増加した熱安定性を示す新たなエステラーゼを提供する。この野生型エステラーゼは、ＵｎｉＰａｒｃデータベースにおいてＵＰＩ０００７Ｃ１ＢＢＡ７として言及され、ポリエステル分解活性を有すると記載されているエステラーゼに対応する。本発明のエステラーゼは、プラスチック製品、特にＰＥＴを含むプラスチック製品を分解するための過程において特に有用である。

この点において、（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、（ｉｉ）Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、Ｓ２５１、Ｇ１３６、Ｔ１６９より選択される残基に対応する位置に少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、それにおいて、この位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられ、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性及び／又は増加した熱安定性を示すエステラーゼを提供することが、本発明の目的である。

（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、及び（ｉｉ）位置Ｌ２１０に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、それにおいて、この位置が、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられ、及びそれにおいて、この置換がＬ２１０Ｆと異なるエステラーゼを提供することが、本発明の別の目的である。

（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、（ｉｉ）Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ２０５Ｃ、Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、それにおいて、この位置が、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられるエステラーゼを提供することが、本発明の別の目的である。

好ましくは、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ又はＲ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃより選択される少なくとも１つの置換又は置換の組み合わせ、好ましくはＬ２１０Ｔを含む。特定の実施形態では、エステラーゼは、少なくとも置換Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉの組み合わせを含む。

好ましくは、エステラーゼは、Ｓ１３１、Ｄ１７７、及びＨ２０９より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは組み合わせＳ１３１＋Ｄ１７７＋Ｈ２０９をさらに含む。

本発明のエステラーゼをコードする核酸を提供することが、本発明の別の目的である。本発明はまた、前記核酸を含む発現カセット又は発現ベクターに、及び前記核酸、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞に関する。

本発明はまた、本発明のエステラーゼ、本発明の宿主細胞又はその抽出物を含む組成物を提供する。

以下を含む本発明のエステラーゼを産生する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である：
（ａ）本発明に従った宿主細胞を、エステラーゼをコードする核酸を発現するために適した条件下で培養すること；及び、場合により
（ｂ）前記エステラーゼを細胞培養物から回収すること。

以下を含むポリエステルを分解する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である：
（ａ）ポリエステルを、本発明に従ったエステラーゼ、又は本発明に従った宿主細胞、又は本発明に従った組成物と接触させること；ならびに、場合により
（ｂ）単量体及び／又はオリゴマーを回収すること。

特に、本発明は、ＰＥＴを、本発明の少なくとも１つのエステラーゼと接触させること、ならびに、場合により、ＰＥＴの単量体及び／又はオリゴマーを回収することを含む、ＰＥＴを分解する方法を提供する。

本発明はまた、以下の工程を含む、ポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルを分解する方法に関する：
（ａ）ポリエステル含有材料を、本発明に従ったエステラーゼ又は宿主細胞と接触させ、それによりポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルを分解すること；ならびに、場合により
（ｂ）前記の少なくとも１つのポリエステルの単量体及び／又はオリゴマーを回収すること。

本発明はまた、ＰＥＴ又はＰＥＴを含むプラスチック製品を分解するための、本発明のエステラーゼの使用に関する。

本発明はまた、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又は組成物が含まれているポリエステル含有材料に関する。

本発明はまた、本発明に従ったエステラーゼ又は宿主細胞、あるいは本発明のエステラーゼを含む組成物を含む洗剤組成物に関する。

発明の詳細な説明

定義

本開示は、以下の定義への参照により最良に理解されるであろう。

本明細書中で、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」、「酵素」は、前記鎖を形成するアミノ酸の数に関係なく、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の鎖を指す。アミノ酸は、本明細書中では、以下の命名法に従って、それらの１文字又は３文字のコードにより表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。

用語「エステラーゼ」は、Enzyme Nomenclatureに従ってＥＣ３．１．１として分類されるヒドロラーゼのクラスに属する酵素を指し、酸及びアルコールへのエステルの加水分解を触媒する。用語「クチナーゼ」又は「クチンヒドロラーゼ」は、Enzyme Nomenclatureに従ってＥＣ３．１．１．７４として分類されるエステラーゼを指し、クチン及び水からのクチン単量体の産生の化学反応を触媒することができる。

用語「野生型タンパク質」又は「親タンパク質」は、ポリペプチドの非変異バージョンを指す。なぜなら、それは自然に現れるからである。本発明の場合では、親エステラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエステラーゼを指す。

用語「変異体」及び「バリアント」は、配列番号１から由来し、１つ又は複数の（例えば、いくつかの）位置に少なくとも１つの改変又は変化、即ち、置換、挿入、及び／又は欠失を含み、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドを指す。バリアントは、当技術分野において周知の技術により得てもよい。特に、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を変化させるための技術の例は、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、及び合成オリゴヌクレオチド構築を含むが、それらに限定しない。このように、本明細書中で特定の位置との関係において使用される用語「改変」及び「変化」は、この特定の位置におけるアミノ酸が、野生型タンパク質中のこの特定の位置におけるアミノ酸と比較して改変されていることを意味する。

「置換」は、アミノ酸残基が別のアミノ酸残基により交換されることを意味する。好ましくは、用語「置換」は、天然の標準的な２０のアミノ酸残基、希少な天然アミノ酸残基（例．ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルバリン、ピログルタミン、アミノ酪酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン）、及び非自然アミノ酸残基（しばしば合成的に作製される）（例、シクロヘキシル－アラニン）より選択される別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の交換を指す。好ましくは、用語「置換」は、天然の標準的な２０のアミノ酸残基（Ｇ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｃ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、及びＴ）より選択される別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の交換を指す。記号「＋」は置換の組み合わせを示す。本文書では、以下の用語法を使用して置換を指定する：Ｌ８２Ａは、親配列の位置８２のアミノ酸残基（ロイシン、Ｌ）がアラニン（Ａ）により置換されていることを表示する。Ａ１２１Ｖ／Ｉ／Ｍは、親配列の位置１２１のアミノ酸残基（アラニン、Ａ）が、以下のアミノ酸の１つにより置換されていることを表示する：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、又はメチオニン（Ｍ）。この置換は保存的又は非保存的置換であることができる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、及びスレオニン）、疎水性アミノ酸（メチオニン、ロイシン、イソロイシン、システイン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、及びセリン）の群内にある。

他に特定しない場合、本願中に開示する位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられる。

本明細書中で使用するように、用語「配列同一性」又は「同一性」は、２つのポリペプチド配列の間の一致（同一のアミノ酸残基）の数（又はパーセント%で表現される割合）を指す。配列同一性は、重複及び同一性を最大限にする一方で、配列ギャップを最小限にするように整列させた場合に配列を比較することにより決定する。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに依存して、多数の数学的グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定してもよい。類似の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたり最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム；Needleman and Wunsch, 1970）を使用して整列させる一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith and Waterman, 1981）又はＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Altschul et al., 1997；Altschul et al., 2005)）を使用して整列させる。パーセントのアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントを、例えば、インターネットウェブサイト、例えばｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／）などで利用可能な、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用し、当技術分野における技能内にある種々の方法において達成することができる。当業者は、アライメントを測定するための適切なパラメータ（比較されている配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。本明細書中の目的のために、%アミノ酸配列同一性値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して２つの配列の最適なグローバルアライメントを作成するペアワイズ配列アライメントプログラムＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅを使用して生成される値を指し、それにおいて、全ての検索パラメータは、デフォルト値、即ち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ拡張＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップ拡張＝０．５にセットされる。

「ポリマー」は、構造が、共有結合的な化学結合により連結された複数の単量体（繰り返し単位）で構成される化学的化合物又は化合物の混合物を指す。本発明の文脈では、用語「ポリマー」は、単一の型の繰り返し単位（即ち、ホモポリマー）で、又は異なる繰り返し単位の混合物（即ち、コポリマー又はヘテロポリマー）で構成される天然ポリマー又は合成ポリマーを含む。本発明に従って、「オリゴマー」は、２～約２０の単量体を含む分子を指す。

本発明の文脈では、「ポリエステル含有材料」又は「ポリエステル含有製品」は、結晶性、半結晶性、又は全非晶性の形態において少なくとも１つのポリエステルを含む、製品、例えばプラスチック製品などを指す。特定の実施形態では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１つのプラスチック材料、例えばプラスチックシート、チューブ、ロッド、プロファイル、シェイプ、フィルム、塊状ブロックなどから作製される任意の品目を指し、それは、少なくとも１つのポリエステル、及び、恐らくは、他の物質又は添加物、例えば可塑剤、鉱物、又は有機充填剤などを含む。別の特定の実施形態では、ポリエステル含有材料は、プラスチック製品を作製するために適した、溶融状態又は固体状態におけるプラスチック化合物、又はプラスチック調合物を指す。別の特定の実施形態では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１つのポリエステルを含む織物、布地、又は繊維を指す。別の特定の実施形態では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１つのポリエステルを含むプラスチック廃棄物又は繊維廃棄物を指す。

本説明中では、用語「ポリエステル」は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、及びこれらのポリマーのブレンド／混合物を包含するが、それらに限定しない。

新たなエステラーゼ

本発明は、親エステラーゼと比較して改善された活性及び／又は改善された熱安定性を伴う新規エステラーゼを提供する。特に、本発明者らは、工業的過程における使用のために特に適した新規酵素を設計している。本発明のエステラーゼは、ポリエステル、特にＰＥＴ（ＰＥＴ含有材料、及び特にＰＥＴを含むプラスチック製品を含む）を分解するために特に適している。特定の実施形態では、エステラーゼは、増加した活性及び増加した熱安定性の両方を示す。

従って、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエステラーゼと比較して増加した活性を示すエステラーゼを提供することが本発明の目的である。

特に、本発明者らは、配列番号１において特定のアミノ酸残基を同定しており、それらは、基質とエステラーゼとの接触を促し、ポリマーの増加した吸着に、及び／又は、それにより、このポリマーでのエステラーゼの増加した活性に導くように有利に改変されうるエステラーゼのＸ線結晶構造（即ち、折り畳まれた３Ｄ構造）においてポリマー基質と接触するように意図される。

本発明の文脈内では、用語「増加した活性」又は「増加した分解活性」は、同じ温度で同じポリエステルを分解する及び／又はその上に吸着する配列番号１のエステラーゼの能力と比較し、所与の温度で、ポリエステルを分解するエステラーゼの増加した能力及び／又はポリエステル上に吸着する増加した能力を示す。特に、本発明のエステラーゼは、増加したＰＥＴ分解活性を有する。そのような増加は、配列番号１のエステラーゼのＰＥＴ分解活性よりも少なくとも１０%大きく、好ましくは少なくとも２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、１００%、１１０%、１２０%、１３０%又はそれ以上大きくなりうる。特に、分解活性は、ポリエステルの単量体及び／又はオリゴマーに導く解重合活性であって、それをさらに回収し、場合により再利用することができる。

エステラーゼの「分解活性」は、当業者により、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って評価されうる。例えば、分解活性は、特定のポリマーの解重合活性率の測定、寒天平板中に分散された固体ポリマー化合物を分解する速度の測定、又は反応器におけるポリマーの解重合活性率の測定により評価することができる。特に、分解活性は、エステラーゼの「特異的分解活性」を測定することにより評価してもよい。ＰＥＴについてのエステラーゼの「特異的分解活性」は、反応の初期期間（即ち、最初の２４時間）の間に加水分解されたＰＥＴ（μmol）／分又は産生された等価ＴＡ（mg）／時間及びエステラーゼ１mgに対応し、反応の加水分解曲線の線形部分から決定され、そのような曲線は、最初の２４時間の間に異なる時間で実施された、いくつかのサンプリングにより設定される。別の例として、「分解活性」は、ポリマー又はポリマー含有プラスチック製品を分解酵素と接触させた場合に、温度、ｐＨ、及び緩衝液の適した条件下で放出されるオリゴマー及び／又は単量体の速度及び／又は収量を、定められた期間後に測定することにより評価してもよい。

基質上に吸着する酵素の能力は、当業者により、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って評価されうる。例えば、基質上に吸着する酵素の能力は、酵素を含む溶液から測定することができ、それにおいて、酵素は、適した条件下で基質と以前にインキュベートされている。

本発明者らはまた、高温での、有利には６０℃を上回る、好ましくは７０℃を上回る温度での対応するエステラーゼの安定性を改善する（即ち、改善された熱安定性）ように有利に改変されうる、配列番号１における標的アミノ酸残基を同定している。

従って、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するエステラーゼの熱安定性と比較して増加した熱安定性を示す新たなエステラーゼを提供することが、本発明の目的である。

本発明の文脈内では、用語「増加した熱安定性」は、配列番号１のエステラーゼと比較し、高温で、特に４０℃～８０℃の間の温度でその化学的及び／又は物理的構造における変化に抵抗するエステラーゼの増加した能力を示す。

特に、熱安定性は、エステラーゼの融解温度（Ｔｍ）の評価を通じて評価してもよい。本発明の文脈では、「融解温度」は、考慮される酵素集団の半分がアンフォールド又はミスフォールドされる温度を指す。典型的には、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼのＴｍと比較し、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、１０℃又はそれ以上の増加したＴｍを示す。特に、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較し、４０℃～８０℃の間の温度で増加した半減期を有することができる。

エステラーゼの融解温度（Ｔｍ）は、当業者により、当技術分野においてそれ自体公知の方法に従って測定されうる。例えば、ＤＳＦを使用し、エステラーゼの熱変性温度における変化を定量化し、それによりそのＴｍが決定されうる。あるいは、Ｔｍは、円二色性を使用したタンパク質フォールディングの分析により評価されうる。好ましくは、Ｔｍは、実験部分において曝露されるように、ＤＳＦ又は円二色性を使用して測定される。本発明の文脈では、Ｔｍの比較は、同じ条件（例、ポリエステルのｐＨ、性質、及び量など）下で測定されるＴｍを用いて実施される。

あるいは、熱安定性は、異なる温度でのインキュベーション後のエステラーゼのエステラーゼ活性及び／又はポリエステル解重合活性を測定し、親エステラーゼのエステラーゼ活性及び／又はポリエステル解重合活性と比較することにより評価されうる。異なる温度でポリエステルの解重合アッセイを複数回実施する能力をまた評価することができる。迅速で価値のあるテストは、異なる温度でのインキュベーション後に寒天プレート中に分散された固体ポリエステル化合物を分解するエステラーゼ能力の、ハロー直径測定による評価からなりうる。

このように、（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、（ｉｉ）アミノ酸配列の配列番号１と比較し、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、Ｓ２５１、Ｇ１３６、Ｔ１６９からなる群より選択される残基に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加したポリエステル分解活性及び／又は増加した熱安定性を示すエステラーゼを提供することが、本発明の目的である。

特定の実施形態では、エステラーゼは、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、又はＳ２５１からなる群より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、エステラーゼは、Ｇ１３６又はＴ１６９からなる群より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

別に特定しない場合、本願において開示する位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられる。

本発明に従い、標的アミノ酸は、１９の他のアミノ酸の任意の１つにより交換されうる。

特定の実施形態では、エステラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、Ｓ２５１、Ｇ１３６、又はＴ１６９より選択される残基に対応する位置に単一のアミノ酸残基を伴う。特に、エステラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、又はＳ２５１より選択される残基に対応する位置に単一のアミノ酸置換を有する。好ましくは、エステラーゼは、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｓ１８４、Ｒ２０５、Ｎ２１３、及びＳ２５１より選択される残基に対応する位置に単一の置換、好ましくは、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、Ｒ２０５Ｃ、Ｎ２１３Ｍ／Ｄ、及びＳ２５１Ｃより選択される単一の置換を含む。より好ましくは、エステラーゼは、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｓ１８４、及びＮ２１３より選択される残基に対応する位置に単一の置換、好ましくはＱ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される単一の置換を含む。あるいは、エステラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、Ｇ１３６又はＴ１６９より選択される残基に対応する位置に単一のアミノ酸置換、好ましくはＧ１３６Ａ及びＴ１６９Ｑより選択される単一の置換を有する。

本発明の一実施形態では、エステラーゼは、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、又はＩ２５０より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む。好ましくは、エステラーゼは、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｓ１８４、及びＮ２１３より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む。好ましくは、前記の少なくとも１つの置換は、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、及びＮ２１３Ｄ／Ｍより選択される。

本発明の一実施形態では、エステラーゼは、Ｒ３２、Ａ３５、又はＦ３８より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む。

本発明の一実施形態では、エステラーゼは、Ｑ１７５、Ｉ１７９、Ｒ２０５、Ｇ２０６、又はＳ２５１より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む。特定の実施形態では、エステラーゼは、位置Ｑ１７５に少なくとも１つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した活性を示す。別の特定の実施形態では、エステラーゼは、Ｉ１７９又はＧ２０６より選択される位置に少なくとも１つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性を示す。一実施形態では、エステラーゼは、位置Ｒ２０５＋Ｓ２５１に少なくとも置換の組み合わせ、好ましくは少なくとも置換Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃの組み合わせを含む。好ましい実施形態では、エステラーゼは、置換Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃの組み合わせを含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性を示す。

特定の実施形態では、エステラーゼは、Ｇ１３６又はＴ１６９からなる群より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特に、エステラーゼは、Ｇ１３６Ａ又はＴ１６９Ｑより選択される少なくとも１つの置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｔ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｎ２１３、Ｐ２１５、Ｇ１３６、Ｓ１８４、又はＴ１６９より選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。特に、エステラーゼは、Ｔ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｐ２１５Ｄ、Ｇ１３６Ａ、Ｓ１８４Ｅ、又はＴ１６９Ｑより選択される少なくとも１つの置換を含む。好ましくは、エステラーゼは、Ｔ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｎ２１３、又はＰ２１５より選択される位置に、特にＴ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、又はＮ２１３Ｄ／Ｍより選択される少なくとも１つの置換を含む。より好ましくは、エステラーゼは、位置Ｖ１７２に少なくとも１つの置換、好ましくはＶ１７２Ｉを含む。

好ましい実施形態では、エステラーゼは、位置Ｌ２１０に、より好ましくはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ／Ｆより選択される少なくとも１つの置換、さらにより好ましくはＬ２１０Ｔをさらに含む。一実施形態では、エステラーゼは、置換Ｌ２１０Ｆをさらに含む。特に、本発明のエステラーゼは、Ｌ２１０＋Ｒ２０５＋Ｓ２５１より選択される位置に、好ましくはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ／Ｆ＋Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ、より好ましくはＬ２１０Ｔ＋Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。一実施形態では、エステラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含み、置換Ｌ２１０Ｔ＋Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃの組み合わせを伴う。

一実施形態では、エステラーゼは、位置Ｖ１７２に少なくとも１つの置換及びＱ９５、Ｎ２１３、Ｇ１３６、Ｔ１６９、Ｓ１８４、又はＬ２１０より選択される位置に少なくとも１つの置換を含む。好ましくは、エステラーゼは、少なくとも置換Ｖ１７２Ｉ及びＱ９５Ｇ／Ｐ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｓ１８４Ｅ、又はＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ／Ｆより選択される少なくとも１つの置換を含む。

特に、エステラーゼは、位置Ｌ２１０＋Ｖ１７２に少なくとも１つの置換の組み合わせ、好ましくはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ／Ｆ＋Ｖ１７２Ｉ、より好ましくはＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。

特定の実施形態では、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ／Ｆ＋Ｖ１７２Ｉより選択される置換の組み合わせ及びＴ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｎ２１３、Ｐ２１５、Ｇ１３６、Ｔ１６９、又はＳ１８４に、好ましくはＴ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｓ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０＋Ｖ１７２＋Ｑ９５、Ｌ２１０＋Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ｓ１８４、Ｌ２１０＋Ｖ１７２＋Ｎ２１３、又はＬ２１０＋Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ｇ１３６＋Ｔ１６９＋Ｓ１８４より選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。特に、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｇ１３６Ａ＋Ｔ１６９Ｑ＋Ｓ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。特定の実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍより選択される１つの置換の組み合わせを含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性及び増加した熱安定性の両方を示す。

別の特定の実施形態では、エステラーゼは、Ａ２、Ｄ２３３、又はＳ２５５より選択される位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。特に、エステラーゼは、Ａ２Ｅ、Ｄ２３３Ｎ、又はＳ２５５Ａより選択される少なくとも１つの置換をさらに含む。

一実施形態では、エステラーゼは、置換Ａ２Ｅ＋Ｌ２１０Ｆ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａの組み合わせをさらに含む。好ましくは、エステラーゼは、置換Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ＋Ａ２Ｅ＋Ｌ２１０Ｆ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａの組み合わせを含む。一実施形態では、エステラーゼは、置換Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ＋Ａ２Ｅ＋Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａの組み合わせを含む。一実施形態では、エステラーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含み、置換Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ＋Ａ２Ｅ＋Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａの組み合わせを伴う。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０＋Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ａ２＋Ｄ２３３＋Ｓ２５５、Ｌ２１０＋Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ｓ１８４＋Ａ２＋Ｄ２３３＋Ｓ２５５、Ｌ２１０＋Ｖ１７２＋Ｎ２１３＋Ａ２＋Ｄ２３３＋Ｓ２５５、又はＬ２１０＋Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ｇ１３６＋Ｔ１６９＋Ｓ１８４＋Ａ２＋Ｄ２３３＋Ｓ２５５より選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。特に、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｇ１３６Ａ＋Ｔ１６９Ｑ＋Ｓ１８４Ｅ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。

好ましい実施形態では、本発明のエステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、Ｓ１３１、Ｄ１７７、及びＨ２０９より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、即ち、本発明のエステラーゼは、これらの位置の１つ、２つ、又は全てで改変されない。好ましくは、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、組み合わせＳ１３１＋Ｄ１７７＋Ｈ２０９を含む。あるいは、又は加えて、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、Ｃ２４２又はＣ２５７より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。好ましくは、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、組み合わせＣ２４２＋Ｃ２５７を含む。より好ましくは、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、組み合わせＳ１３１＋Ｄ１７７＋Ｈ２０９＋Ｃ２４２＋Ｃ２５７を含む。一実施形態では、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、アミノ酸残基Ｐ２１５をさらに含む。

（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、（ｉｉ）位置Ｌ２１０に少なくとも１つの置換を含み、それにおいて、この位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられ、それにおいて、この置換はＬ２１０Ｆとは異なるエステラーゼを提供することが、本発明の別の目的である。一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙの間の少なくとも１つの置換を含む。一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙの間の少なくとも１つの置換を含む。好ましい実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈの間の少なくとも１つの置換を含む。好ましくは、エステラーゼは、少なくとも置換Ｌ２１０Ｔを含む。

特に、エステラーゼはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒの間の置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性を示す。別の特定の実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ｗ／Ｈの間の置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性を示す。好ましくは、エステラーゼは置換Ｌ２１０Ｔを含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性及び増加した熱安定性の両方を示す。

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、Ｓ２５１、Ｇ１３６、又はＴ１６より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。特に、本発明のエステラーゼは、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｒ２０５、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、又はＳ２５１より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。

特に、エステラーゼは、Ｒ３２、Ａ３５、又はＦ３８より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。あるいは、又は加えて、エステラーゼは、Ｑ１７５、Ｉ１７９、Ｒ２０５、Ｇ２０６、又はＳ２５１より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。特に、エステラーゼは、位置Ｑ１７５に少なくとも１つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性を示す、ならびに／あるいは、エステラーゼは、Ｉ１７９又はＧ２０６より選択される位置に少なくとも１つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性を示す。好ましくは、エステラーゼは、位置Ｒ２０５＋Ｓ２５１に置換の組み合わせ、好ましくはＲ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃをさらに含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性を示す。

特に、本発明のエステラーゼは、Ｇ１３６又はＴ１６９より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。好ましくは、エステラーゼは、Ｇ１３６Ａ又はＴ１６９Ｑより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｔ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｎ２１３、Ｐ２１５、Ｇ１３６、Ｓ１８４、又はＴ１６９より選択される位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。好ましくは、エステラーゼは、Ｔ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｐ２１５Ｄ、Ｇ１３６Ａ、Ｓ１８４Ｅ、又はＴ１６９Ｑより選択される少なくとも１つの置換を含む。特に、エステラーゼは、Ｔ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｎ２１３、又はＰ２１５より選択される位置に、好ましくはＴ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、又はＮ２１３Ｄ／Ｍより選択される少なくとも１つの置換をさらに含む。

一実施形態では、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈより選択される置換、及び位置Ｖ１７２の少なくとも１つの置換、好ましくはＶ１７２Ｉを含む。好ましくは、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｖ１７２Ｉより選択される置換の組み合わせ、より好ましくはＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉを含む。

特定の実施形態では、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｖ１７２Ｉより選択される置換の組み合わせ及びＱ９５、Ｎ２１３、Ｇ１３６、Ｔ１６９、又はＳ１８４より選択される位置に、好ましくはＱ９５Ｇ／Ｐ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、又はＳ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈより選択される少なくとも１つの置換及び位置Ｖ１７２＋Ｑ９５、Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ｓ１８４、Ｖ１７２＋Ｎ２１３、又はＶ１７２＋Ｑ９５＋Ｇ１３６＋Ｔ１６９＋Ｓ１８４に少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。特に、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｇ１３６Ａ＋Ｔ１６９Ｑ＋Ｓ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ａ２、Ｄ２３３、又はＳ２５５より選択される位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。好ましくは、エステラーゼは、Ａ２Ｅ、Ｄ２３３Ｎ、又はＳ２５５Ａより選択される少なくとも１つの置換、好ましくは、置換Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａの組み合わせを含む。

特に、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｇ１３６Ａ＋Ｔ１６９Ｑ＋Ｓ１８４Ｅ＋Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。

（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、（ｉｉ）Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ２０５Ｃ、Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、それにおいて、この位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられ、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性及び／又は増加した熱安定性を有するエステラーゼを提供することが本発明の目的である。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ２０５Ｃ、又はＳ２５１Ｃより選択される、好ましくは、Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ２０５Ｃ、又はＳ２５１Ｃより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ、又はＳ２５１Ｃより選択される少なくともアミノ酸置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される、好ましくはＱ９５Ｇ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ又はＮ２１３Ｍより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ、Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。好ましくは、本発明のエステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍより選択される、好ましくはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ及びＲ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃより選択される、より好ましくはＬ２１０Ｔ及びＲ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃより選択される少なくとも１つの置換又は置換の組み合わせを含む。特に、本発明のエステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃの置換の組み合わせを含む。好ましくは、本発明のエステラーゼは、組み合わせＬ２１０Ｔ＋Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃを含む。

好ましい実施形態では、本発明のエステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、Ｓ１３１、Ｄ１７７、及びＨ２０９より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、即ち、本発明のエステラーゼは、これらの位置のうちの１つ、２つ、又は全てで改変されない。好ましくは、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、組み合わせＳ１３１＋Ｄ１７７＋Ｈ２０９を含む。あるいは、又は加えて、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、Ｃ２４２又はＣ２５７より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。好ましくは、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、組み合わせＣ２４２＋Ｃ２５７を含む。より好ましくは、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、組み合わせＳ１３１＋Ｄ１７７＋Ｈ２０９＋Ｃ２４２＋Ｃ２５７を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、親エステラーゼにおけるように、アミノ酸残基Ｐ２１５をさらに含む。

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、Ｇ１３６、又はＴ１６９より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。特に、本発明のエステラーゼは、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、又はＩ２５０より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。

特に、エステラーゼは、Ｒ３２、Ａ３５、又はＦ３８より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む。あるいは、又は加えて、エステラーゼは、Ｑ１７５、Ｉ１７９、又はＧ２０６より選択される残基に対応する位置に少なくとも１つの置換を含む。特に、エステラーゼは、位置Ｑ１７５に少なくとも置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した活性を示す、及び／又は、エステラーゼは、Ｉ１７９又はＧ２０６より選択される位置に少なくとも１つの置換を含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した熱安定性を示す。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｔ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｎ２１３、Ｐ２１５、Ｇ１３６、Ｓ１８４、又はＴ１６９より選択される、好ましくはＴ６４、Ｅ６８、Ｑ９５、Ｖ１７２、Ｎ２１３、又はＰ２１５より選択される位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。特に、エステラーゼは、Ｔ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｐ２１５Ｄ、Ｇ１３６Ａ、Ｓ１８４Ｅ、又はＴ１６９Ｑより選択される、好ましくはＴ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｖ１７２Ｉ、又はＮ２１３Ｄ／Ｍより選択される、より好ましくはＴ６４Ｍ、Ｅ６８Ｔ、Ｑ９５Ｇ、Ｖ１７２Ｉ、又はＮ２１３Ｍより選択される少なくとも１つの置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、Ｒ２０５Ｃ、Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される、好ましくはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ、Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍより選択される少なくとも２つの置換を含む。好ましくは、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍより選択される少なくとも２つの置換又は置換の組み合わせを含む。

一実施形態では、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈより選択される置換、及び位置Ｖ１７２に少なくとも１つの、好ましくはＶ１７２Ｉの置換を含む。好ましくは、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｖ１７２Ｉより選択される、より好ましくはＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉの置換の組み合わせを含む。

特定の実施形態では、エステラーゼは、少なくともＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ＋Ｖ１７２Ｉより選択される置換の組み合わせ、及びＱ９５、Ｎ２１３、Ｇ１３６、Ｔ１６９、又はＳ１８４より選択される位置に、好ましくはＱ９５Ｇ／Ｐ、Ｎ２１３Ｄ／Ｍ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、又はＳ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換を含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈより選択される少なくとも１つの置換、及び位置Ｖ１７２＋Ｑ９５、Ｖ１７２＋Ｑ９５＋Ｓ１８４、Ｖ１７２＋Ｎ２１３、又はＶ１７２＋Ｑ９５＋Ｇ１３６＋Ｔ１６９＋Ｓ１８４に少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。

一実施形態では、エステラーゼは、Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｇ１３６Ａ＋Ｔ１６９Ｑ＋Ｓ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む。実施形態では、エステラーゼは、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍより選択される１つの置換の組み合わせを含み、配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性及び増加した熱安定性の両方を示す。

一実施形態では、エステラーゼは、Ａ２、Ｄ２３３、又はＳ２５５より選択される位置に少なくとも１つの置換をさらに含む。好ましくは、エステラーゼは、Ａ２Ｅ、Ｄ２３３Ｎ、又はＳ２５５Ａより選択される少なくとも１つの置換、好ましくは置換Ａ２Ｅ＋Ｄ２３３Ｎ＋Ｓ２５５Ａの組み合わせを含む。

バリアントのポリエステル分解活性

エステラーゼ活性を有する新たな酵素を提供することが本発明の目的である。特定の実施形態では、本発明の酵素は、クチナーゼ活性を示す。

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、ポリエステル分解活性、好ましくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性。及び／又はポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）分解活性及び／又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）分解活性及び／又はポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）活性、より好ましくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性、及び／又はポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）分解活性を有する。さらに好ましくは、本発明のエステラーゼは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）分解活性を有する。

有利には、本発明のエステラーゼは、少なくとも２０℃～９０℃、好ましくは４０℃～８０℃、より好ましくは６０℃～７０℃の温度範囲においてポリエステル分解活性を示す。特定の実施形態では、エステラーゼは、６０℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施形態では、エステラーゼは、７０℃でポリエステル分解活性を示す。特定の実施形態では、ポリエステル分解活性は、７０℃と８０℃の間の温度で依然として測定可能である。

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、配列番号１のエステラーゼと比較し、所与の温度で、特に４０℃と８０℃の間の、より好ましくは５０℃と７０℃の間の温度で、増加したポリエステル分解活性を有する。

特定の実施形態では、エステラーゼは、配列番号１のエステラーゼのポリエステル分解活性よりも少なくとも５%、好ましくは少なくとも１０%、２０%、５０%、１００%又はそれ以上高い、６５℃でのポリエステル分解活性を有する。

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、少なくともｐＨ５～１１の範囲において、好ましくはｐＨ６～９の範囲において、より好ましくはｐＨ６．５～９の範囲において、さらにより好ましくはｐＨ６．５～８の範囲において測定可能なエステラーゼ活性を示す。

核酸、発現カセット、ベクター、宿主細胞

上に定義するエステラーゼをコードする核酸を提供することが本発明のさらなる目的である。

本明細書中で使用するように、用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列を指す。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、又はそれらの混合物でありうる。それは、一本鎖の形態中、又は二重鎖の形態中、又はそれらの混合物中であることができる。それは、組換え、人工及び／又は合成起源であることができ、それは、例えば、修飾結合、修飾プリンもしくはピリミジン塩基、又は修飾糖を含む、修飾ヌクレオチドを含むことができる。本発明の核酸は、単離又は精製形態であることができ、当技術分野においてそれ自体公知の技術、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、増幅、酵素合成又は組換え技術により作製、単離、及び／又は操作することができる。核酸はまた、例えば、Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444において記載されているように、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができる。

本発明はまた、上に定義するエステラーゼをコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を包含する。好ましくは、そのようなストリンジェントな条件は、２×ＳＳＣ／０．１%ＳＤＳ中での約４２℃で約２．５時間にわたるハイブリダイゼーションフィルターのインキュベーション、６５℃の１×ＳＳＣ／０．１% ＳＤＳ中での１５分間の４回のフィルターの洗浄が続く。使用するプロトコールは、Sambrookら（Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)）及びAusubel（Current Protocols in Molecular Biology (1989)）などの参考文献において記載されている。

本発明はまた、本発明のエステラーゼをコードする核酸を包含し、それにおいて、前記核酸の配列、又は少なくとも前記配列の部分は、最適化されたコドン使用法を使用して操作されている。

あるいは、本発明に従った核酸は、本発明に従ったエステラーゼの配列から推定してもよく、コドン使用法は、核酸が転写されるべき宿主細胞に従って適合させてもよい。これらの工程は、当業者に周知の方法に従って行ってもよく、それらの一部は参照マニュアルSambrookら（Sambrook et al., 2001）において記載されている。

本発明の核酸は、追加のヌクレオチド配列、例えば、選択された宿主細胞又はシステムにおいてポリペプチドの発現を起こす又は調節するために使用することができる調節領域、即ち、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、シグナルペプチドなどをさらに含みうる。

本発明はさらに、適した宿主細胞における前記核酸の発現を方向づける１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、本発明に従った核酸を含む発現カセットに関する。

用語「発現」は、本明細書中で使用するように、ポリペプチドの産生において含まれる任意の工程（転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、これらに限定しない）を指す。

用語「発現カセット」は、コード領域、即ち、本発明の核酸、及び調節領域（即ち、１つ又は複数の制御配列を含み、作動可能に連結されている）を含む核酸構築物を表示する。

典型的には、発現カセットは、制御配列、例えば転写プロモーター及び／又は転写ターミネーターなどに作動可能に連結された本発明に従った核酸を含む、又はそれらからなる。制御配列は、本発明のエステラーゼをコードする核酸の発現のために、宿主細胞又はインビトロ発現系により認識されるプロモーターを含みうる。プロモーターは、酵素の発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドでありうるが（変異型、切断型、及びハイブリッドプロモーターを含む）、宿主細胞に対して相同又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。制御配列はまた、転写ターミネーターであってもよく、それは、宿主細胞により認識されて転写を終結させる。ターミネーターは、エステラーゼをコードする核酸の３’末端に作動可能に連結されている。宿主細胞において機能的である任意のターミネーターを本発明において使用してもよい。典型的には、発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに作動可能に連結された、本発明に従った核酸を含む、又はそれからなる。

本発明はまた、上に定義する核酸又は発現カセットを含むベクターに関する。

本明細書中で使用するように、用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、本発明の発現カセットを含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指し、組換え遺伝物質を宿主細胞中へ移すための媒体として使用される。主要な型のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド、及び人工染色体である。ベクター自体は、一般的に、インサート（異種核酸配列、トランスジーン）及びベクターの「骨格」としての役割を果たすより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を宿主に移すベクターの目的は、典型的には、標的細胞においてインサートを単離、増殖、又は発現させることである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞における異種配列の発現のために特に適応され、一般的に、ポリペプチドをコードする異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般的に、発現ベクター中に存在している調節エレメントは、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び場合により存在するオペレーターを含む。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞における自律的複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数についての潜在力を含む。発現ベクターの例は、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミド及びウイルスである。異なる宿主において適したレベルのポリペプチド発現を提供する発現ベクターは、当技術分野において周知である。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。好ましくは、発現ベクターは直鎖状又は環状二本鎖ＤＮＡ分子である。

上に記載する核酸、発現カセット、又はベクターを含む宿主細胞を提供することが、本発明の別の目的である。本発明は、このように、宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、又は形質導入するための、本発明に従った核酸、発現カセット、又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は、典型的には、それが導入されなければならない宿主細胞との適合性に依存するであろう。

本発明に従って、宿主細胞は、一過性又は安定的な様式において形質転換、トランスフェクト、又は形質導入してもよい。本発明の発現カセット又はベクターは、宿主細胞中に導入され、カセット又はベクターが、染色体組み込み体として、又は自己複製する染色体外ベクターとして維持されるようにする。用語「宿主細胞」はまた、複製の間に生じる変異に起因して、親宿主細胞と同一ではない、親宿主細胞の任意の後代を包含する。宿主細胞は、本発明のバリアントの産生において有用な任意の細胞、例えば、原核生物又は真核生物でありうる。原核生物宿主細胞は、任意のグラム陽性又はグラム陰性の細菌でありうる。宿主細胞はまた、真核生物細胞、例えば酵母細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は植物細胞などでありうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌、バチルス、ストレプトミセス、トリコデルマ、アスペルギルス、サッカロミセス、ピキア、ビブリオ、又はヤロウイアの群より選択される。

本発明に従った核酸、発現カセット、又は発現ベクターは、当業者により公知の任意の方法、例えばエレクトロポレーション、コンジュゲーション、形質導入、コンピテント細胞形質転換、プロトプラスト形質転換、プロトプラスト融合、微粒子銃「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧ媒介性形質転換、脂質支援形質転換又はトランスフェクション、化学媒介性トランスフェクション、酢酸リチウム媒介性形質転換、リポソーム媒介性形質転換などにより宿主細胞中に導入されうる。

場合により、本発明の核酸、カセット、又はベクターの１を上回るコピーを宿主細胞中に挿入し、バリアントの産生を増加させてもよい。

特定の実施形態では、宿主細胞は組換え微生物である。本発明は、実際に、ポリエステル含有材料を分解する改善された能力を伴う微生物の操作を可能にする。例えば、本発明の配列は、株の能力を改善及び／又は増加させるために、ポリエステルを分解できることが既に公知である菌類又は細菌の野生型株を補完するために使用してもよい。

エステラーゼの産生

エステラーゼをコードする核酸を発現させ、場合により、エステラーゼを回収することを含む、本発明のエステラーゼを産生する方法を提供することが本発明の別の目的である。

特に、本発明は、（ａ）本発明の核酸、カセット、又はベクターをインビトロ発現系に接触させること；及び（ｂ）産生されたエステラーゼを回収することを含む、本発明のエステラーゼを産生させるインビトロ方法に関する。インビトロ発現系は当業者により周知であり、商業的に入手可能である。

好ましくは、産生の方法は以下を含む：
（ａ）本発明のエステラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞を、該核酸を発現させるために適した条件下で培養すること；及び、場合により
（ｂ）前記細胞培養物から前記エステラーゼを回収すること。

有利には、宿主細胞は、組換えバチルス、組換え大腸菌、組換えアスペルギルス、組換えトリコデルマ、組換えストレプトミセス、組換えサッカロミセス、組換えピキア、組換えビブリオ、又は組換えヤロウイアである。

宿主細胞は、ポリペプチドの産生のために適した栄養培地中で、当技術分野において公知の方法を使用して培養する。例えば、細胞は、撹拌フラスコ培養、又は適した培地中で、酵素を発現及び／又は単離することを可能にする条件下で実施される実験室又は工業用発酵槽中での小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、フィードバッチ、又は固体発酵を含む）により培養されうる。培養は、商業的な供給業者からの、又は公開された組成物（例、American Type Culture Collectionのカタログ）に従って調製された、適した栄養培地中で起こる。

エステラーゼが栄養培地中に排泄される場合、エステラーゼは培養上清から直接的に回収することができる。逆に、エステラーゼを細胞溶解物から又は透過処理後に回収することができる。エステラーゼは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して回収してもよい。例えば、エステラーゼは、従来の手順（収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿を含むが、それらに限定しない）により栄養培地から回収されうる。場合により、エステラーゼは、当技術分野において公知の多様な手順（クロマトグラフィー（例、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例、分取等電点集束）、示差溶解（例、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は抽出などを含むが、それらに限定しない）により部分的又は完全に精製して実質的に純粋なポリペプチドを得てもよい。

本エステラーゼは、そのようなものとして、精製形態において、単独で又は追加の酵素との組み合わせにおいて、ポリエステル及び／又はポリエステル含有材料、例えばポリエステルを含むプラスチック製品などの分解及び／又はリサイクリングにおいて含まれる酵素反応を触媒するために使用されうる。エステラーゼは、可溶性形態において、又は固相上でありうる。特に、それは、細胞膜又は脂質小胞に、あるいは合成支持体、例えばガラス、プラスチック、ポリマー、フィルター、膜などに、例えば、ビーズ、カラム、プレートなどの形態において結合されうる。

組成物

エステラーゼ、又は本発明の宿主細胞、又はその抽出物を含む組成物を提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明の文脈では、用語「組成物」は、エステラーゼ又は本発明の宿主細胞を含む任意の種類の組成物を包含する。

本発明の組成物は、組成物の全重量に基づいて、０．１重量%～９９．９重量%、好ましくは０．１重量%～５０重量%、より好ましくは０．１重量%～３０重量%、さらにより好ましくは０．１重量%～５重量%のエステラーゼを含みうる。あるいは、組成物は、５重量%と１０重量%の間の本発明のエステラーゼを含みうる。

組成物は、液体又は乾燥、例えば、粉末の形態でありうる。一部の実施形態では、組成物は凍結乾燥物である。

組成物は、賦形剤及び／又は試薬などをさらに含みうる。適切な賦形剤は、生化学において一般に使用される緩衝剤、ｐＨを調整するための薬剤、防腐剤、例えば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、又はアスコルビン酸ナトリウムなど、保存剤、保護剤又は安定化剤、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、塩、糖（例、ソルビトール、トレハロース又はラクトース、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール）など、封鎖剤、例えばＥＤＴＡなど、還元剤、アミノ酸、担体、例えば溶剤又は水溶液などを包含する。本発明の組成物は、エステラーゼと１つ又はいくつかの賦形剤を混合することにより得てもよい。

特定の実施形態では、組成物は、組成物の全重量に基づいて、０．１重量%～９９．９重量%、好ましくは５０重量%～９９．９重量%、より好ましくは７０重量%～９９．９重量%、さらにより好ましくは９５重量%～９９．９重量%の賦形剤を含みうる。あるいは、組成物は、９０重量%～９５重量%の賦形剤を含みうる。

特定の実施形態では、組成物は、酵素活性を示す追加のポリペプチドをさらに含みうる。本発明のエステラーゼの量は、例えば、分解するポリエステルの性質及び／又は組成物中に含まれる追加の酵素／ポリペプチドに依存して、当業者により簡単に適応されるであろう。

特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、１つ又はいくつかの賦形剤、特にポリペプチドを分解から安定化又は保護することができる賦形剤と一緒に水性媒質中に可溶化される。例えば、本発明のエステラーゼは、最終的には追加成分、例えばグリセロール、ソルビトール、デキストリン、デンプン、グリコール（例えばプロパンジオールなど）、塩などと、水中に可溶化されうる。結果として得られる混合物は、次に、粉末を得るように乾燥させてもよい。そのような混合物を乾燥させる方法は、当業者に周知であり、限定を伴わず、凍結乾燥、噴霧乾燥、超臨界乾燥、ドラフト蒸発、薄層蒸発、遠心蒸発、コンベア乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

特定の実施形態では、組成物は、粉末形態下であり、エステラーゼならびに安定化／可溶化量のグリセロール、ソルビトール、又はデキストリン、例えばマルトデキストリン及び／又はシクロデキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオールなど、及び／又は塩を含む。

特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明のエステラーゼを発現する少なくとも１つの組換え細胞、又はその抽出物を含む。「細胞の抽出物」は、細胞から得られる任意の画分、例えば化学的、物理的、及び／又は酵素的処理により細胞から由来する細胞上清、細胞破片、細胞壁、ＤＮＡ抽出物、酵素又は酵素調製物、又は任意の調製物などを指定し、それは、生細胞を本質的に含まない。好ましい抽出物は、酵素的に活性な抽出物である。本発明の組成物は、本発明の１つ又はいくつかの組換え細胞又はその抽出物、及び、場合により、１つ又はいくつかの追加の細胞を含みうる。

一実施形態では、組成物は、本発明のエステラーゼを発現及び排出する組換え微生物の培養培地からなる、又はそれを含む。特定の実施形態では、組成物は、凍結乾燥されたそのような培養培地を含む。

エステラーゼの使用

好気性又は嫌気性条件においてポリエステル、又はポリエステル含有材料を分解及び／又はリサイクリングするために本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明のエステラーゼは、ＰＥＴ及びＰＥＴ含有材料を分解するために特に有用である。

従って、ポリエステルの酵素的分解のために、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞もしくはその抽出物、又は組成物を使用することが、本発明の目的である。

特定の実施形態では、エステラーゼにより標的化されるポリエステルは、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、及びこれらの材料のブレンド／混合物より選択され、好ましくはポリエチレンテレフタレートである。

好ましい実施形態では、ポリエステルはＰＥＴであり、少なくとも単量体（例、モノエチレングリコール又はテレフタル酸）、及び／又はオリゴマー（例、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタレート（ＨＥＭＴ）、及びジメチルテレフタレート（ＤＭＴ））が回収される。

また、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞もしくはその抽出物、又は組成物を、ポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルの酵素的分解のために使用することは本発明の目的である。

ポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルを分解するための方法であって、それにおいてポリエステル含有材料を、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞もしくはその抽出物又は組成物と接触させ、それによりポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルを分解する方法を提供することが、本発明の別の目的である。

有利には、ポリエステルは、単量体及び／又はオリゴマーまで解重合される。

特に、本発明は、ＰＥＴ含有材料のＰＥＴを分解するための方法であって、ＰＥＴ含有材料を本発明のエステラーゼ又は宿主細胞又は組成物と接触させ、それによりＰＥＴを分解する方法を提供する。

一実施形態では、少なくとも１つのポリエステルは、再重合可能な単量体及び／又はオリゴマー中に分解され、それらは、再利用するために有利に回収されうる。回収された単量体／オリゴマーは、リサイクリング（例、ポリエステルの再重合）又はメタン化のために使用されうる。特定の実施形態では、少なくとも１つのポリエステルはＰＥＴであって、モノエチレングリコール、テレフタル酸、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタレート（ＨＥＭＴ）、及び／又はジメチルテレフタレート（ＤＭＴ）が回収される。

一実施形態では、ポリエステル含有材料のポリエステルは、完全に分解される。

ポリエステル含有材料を分解するために要求される時間は、ポリエステル含有材料自体（即ち、ポリエステル含有材料の性質及び起源、その組成、形状など）、使用するエステラーゼの型及び量、ならびに種々の過程パラメータ（即ち、温度、ｐＨ、追加の薬剤など）に依存して変動しうる。当業者は、過程パラメータを、ポリエステル含有材料及び想定される分解時間に簡単に適応させうる。

有利には、分解過程は、２０℃と９０℃の間、好ましくは４０℃と８０℃の間、より好ましくは６０℃と７０℃の間に含まれる温度で実施される。特定の実施形態では、分解過程は６０℃で実施される。別の特定の実施形態では、分解過程は６５℃で実施される。別の特定の実施形態では、分解過程は７０℃で実施される。より一般的には、温度は、不活性化温度を下回って維持され、それは、エステラーゼが不活性化される（即ち、その最適温度でのその活性と比較して８０%を上回る活性を喪失している）及び／又は組換え微生物がエステラーゼをもはや合成しない温度に対応する。特に、温度は、標的化されるポリエステルのガラス転移温度（Ｔｇ）を下回って維持される。

有利には、過程は、エステラーゼをいくつかの回数使用及び／又はリサイクリングできる温度で、連続フロー過程において実施される。

有利には、分解過程は、５と１１の間に含まれるｐＨで、好ましくは６と９の間のｐＨで、より好ましくは６．５と９の間のｐＨで、さらにより好ましくは６．５と８の間のｐＨで実施される。

特定の実施形態では、ポリエステル含有材料は、ポリエステルとエステラーゼの間の接触の面を増加させるようにその構造を物理的に変化させるために、エステラーゼと接触させる前に前処理されうる。

ポリエステル含有材料を本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞もしくはその抽出物、又は組成物に曝露すること、ならびに、場合により、単量体及び／又はオリゴマーを回収することを含む、ポリエステル含有材料から単量体及び／又はオリゴマーを産生する方法を提供することが、本発明の別の目的である。

解重合から起因する単量体及び／又はオリゴマーは、順次又は連続的に回収されうる。単一の型の単量体及び／又はオリゴマーあるいはいくつかの異なる型の単量体及び／又はオリゴマーを、出発ポリエステル含有材料に依存して回収してもよい。

本発明の方法は、モノエチレングリコール及びテレフタル酸より選択される単量体、ならびに／あるいは、メチル－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）、１－（２－ヒドロキシエチル）４－メチルテレフタレート（ＨＥＭＴ）及びジメチルテレフタレート（ＤＭＴ）（ＰＥＴ、及び／又はＰＥＴを含むプラスチック製品からの）より選択されるオリゴマーを産生するために特に有用である。

回収された単量体及び／又はオリゴマーは、全ての適した精製方法を使用してさらに精製され、再重合可能な形態において条件づけされうる。精製方法の例は、ストリッピング過程、水溶液による分離、蒸気選択的凝縮、バイオプロセス後の媒質のろ過及び濃縮、分離、蒸留、真空蒸発、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、沈殿、結晶化、濃縮ならびに酸添加脱水及び沈殿、ナノろ過、酸触媒処理、半連続モード蒸留又は連続モード蒸留、溶媒抽出、蒸発濃縮、蒸発結晶化、液／液抽出、水素添加、共沸蒸留過程、吸着、カラムクロマトグラフィー、単純真空蒸留及び精密ろ過（組み合わせ、又はそうでないもの）を含む。

回収された再重合可能な単量体及び／又はオリゴマーは、例えば、ポリエステルを合成するために再利用されうる。有利には、同じ性質のポリエステルが再重合される。しかし、例えば、新たなコポリマーを合成するために、回収された単量体及び／又はオリゴマーを他の単量体及び／又はオリゴマーと混合することが可能である。あるいは、目的の新たな化学的化合物を産生するために、回収された単量体を化学的中間体として使用してもよい。

本発明はまた、ポリエステル含有材料を、本発明のエステラーゼ、又は対応する組換え細胞もしくはその抽出物、又は組成物に曝露することを含む、ポリエステル含有材料の表面加水分解又は表面機能化の方法に関する。本発明の方法は、ポリエステル材料の親水性、又は水吸収性を増加させるために特に有用である。そのような増加した親水性は、織物産生、電子工学、及び生物医学的な用途において特に関心が持たれうる。

本発明のエステラーゼ及び／又は前記エステラーゼを発現及び排出する組換え微生物が含まれるポリエステル含有材料を提供することが、本発明のさらなる目的である。一例として、本発明のエステラーゼを含むそのようなポリエステル含有材料を調製するための過程が、特許出願ＷＯ２０１３／０９３３５５、ＷＯ２０１６／１９８６５０、ＷＯ２０１６／１９８６５２、ＷＯ２０１９／０４３１４５、及びＷＯ２０１９／０４３１３４において開示されている。

このように、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物もしくは抽出物ならびに少なくともＰＥＴを含むポリエステル含有材料を提供することが、本発明の目的である。一実施形態に従って、本発明は、ＰＥＴ及びＰＥＴ分解活性を有する本発明のエステラーゼを含むプラスチック製品を提供する。

このように、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物もしくは抽出物ならびに少なくともＰＢＡＴを含むポリエステル含有材料を提供することが、本発明の別の目的である。一実施形態に従って、本発明は、ＰＢＡＴ及びＰＢＡＴ分解活性を有する本発明のエステラーゼを含むプラスチック製品を提供する。

このように、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物もしくは抽出物ならびに少なくともＰＢＳを含むポリエステル含有材料を提供することが、本発明の別の目的である。一実施形態に従って、本発明は、ＰＢＳ及びＰＢＳ分解活性を有する本発明のエステラーゼを含むプラスチック製品を提供する。

このように、本発明のエステラーゼ及び／又は組換え細胞及び／又はその組成物もしくは抽出物ならびに少なくともＰＣＬを含むポリエステル含有材料を提供することが、本発明の別の目的である。一実施形態に従って、本発明は、ＰＣＬ及びＰＣＬ分解活性を有する本発明のエステラーゼを含むプラスチック製品を提供する。

古典的には、本発明のエステラーゼは、洗剤、食品、動物用飼料、製紙、織物、及び医薬的な用途において使用されうる。特に、本発明のエステラーゼは、洗剤組成物の成分として使用されうる。洗剤組成物は、限定しないが、手又は機械洗濯洗剤組成物、例えば汚れた布地の前処理のために適した洗濯添加剤組成物及びリンスを加えた布地柔軟剤組成物など、一般家庭用硬質表面クリーニング作業における使用のための洗剤組成物、手又は機械食器洗浄作業用の洗剤組成物を含む。特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、洗剤添加剤として使用されうる。本発明は、このように、本発明のエステラーゼを含む洗剤組成物を提供する。特に、本発明のエステラーゼは、織物クリーニングの間のピリング及びグレーイング効果を低下させるために、洗剤添加剤として使用されうる。

本発明はまた、本発明のエステラーゼを動物用飼料中で使用するための方法、ならびに本発明のエステラーゼを含む飼料組成物及び飼料添加物に向けられる。用語「飼料」及び「飼料組成物」は、動物による摂取のために適した、又はそれを意図した、任意の化合物、調製物、混合物、又は組成物を指す。別の特定の実施形態では、本発明のエステラーゼは、タンパク質を加水分解し、ペプチドを含む加水分解物を産生するために使用される。そのような加水分解物は、飼料組成物又は飼料添加物として使用されうる。

製紙産業において本発明のエステラーゼを使用するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。特に、本発明のエステラーゼは、抄紙機の紙パルプ及び水パイプラインからの粘着物を除去するために使用されうる。

実施例

実施例１－エステラーゼの構築、発現、及び精製

構築

本発明に従ったエステラーゼを、プラスミド構築物ｐＥＴ２６ｂ－２２０／５－Ｈｉｓを使用して生成している。このプラスミドは、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位の間での大腸菌発現用に最適化された、配列番号１のエステラーゼをコードする遺伝子をクローニングすることにある。２つの部位特異的変異導入キットを、エステラーゼのバリアントを生成するために、供給業者の推奨事項に従って使用した：AgilentからのQuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directed（米国カリフォルニア州サンタクララ）。

エステラーゼの発現及び精製

株、Stellar（商標）（Clontech、米国カリフォルニア州）及び E. coli One Shot（登録商標）BL21 DE3（Life technologies、米国カリフォルニア州カールスバッド）を連続的に用いて、５０mL ＬＢ－Ｍｉｌｌｅｒ培地又はＺＹＭ自動誘導性培地（Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234）中でクローニング及び組み換え発現を実施した。ＬＢ－Ｍｉｌｌｅｒ培地中での誘導を、０．５mMのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、Euromedex、フランス、ゾウフェルヴァイヤースハイム）を用いて１６℃で実施した。培養物は、Avanti J-26 XP遠心機（Beckman Coulter、米国ブレア）中での遠心分離（８０００rpm、１０℃で２０分）により停止させた。細胞を２０mLのTalon緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ２０mM、ＮａＣｌ３００mM、ｐＨ８）中に懸濁させた。細胞懸濁液を次に、ＦＢ７０５超音波処理器（Fisherbrand、フランス、イルキルシュ）により、３０%の振幅で２分間超音波処理した（２秒間のＯＮ及び１秒間のＯＦＦのサイクル）。次に、遠心分離の工程を実現させた：Eppendorf遠心機において、１１０００rpm、１０℃で３０分。可溶性画分を収集し、アフィニティークロマトグラフィーに供した。この精製工程は、Talon（登録商標）Metal Affinity Resin（Clontech、米国カリフォルニア州）を用いて完了した。タンパク質溶出は、イミダゾールを添加したTalon緩衝液の工程を用いて行った。精製タンパク質は、Talon緩衝液に対して透析し、製造元の指示に従ってBio-Radタンパク質アッセイ（Lifescience Bio-Rad、フランス）を使用して定量化し、＋４℃で保存した。

実施例２－エステラーゼの分解活性の評価。

エステラーゼの分解活性を決定し、配列番号１のエステラーゼの活性と比較した。

特異的活性を評価するために複数の方法論が使用されてきた：
（１）ＰＥＴ加水分解に基づく特異的活性
（２）固体形態下でのポリエステルの分解に基づく活性
（３）１００mLを上回る反応器中でのＰＥＴ加水分解に基づく活性

２．１．ＰＥＴの加水分解に基づく特異的活性

粉末形態下の１００mgの非晶質ＰＥＴ（ＷＯ２０１７／１９８７８６に従って、２０%を下回る結晶化度に達するように調製）を秤量し、１００mLガラスボトル中に導入した。配列番号１のエステラーゼ（参照対照として）又は本発明のエステラーゼを含む１mLのエステラーゼ調製物を、Talon緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ２０mM、ＮａＣｌ０．３M、ｐＨ８）中に０．０２mg/mLで調製し、ガラスボトル中に導入した。最後に、４９ｍＬの０．１Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８を加えた。

解重合を、Max Q 4450インキュベーター（Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham、米国マサチューセッツ州）中で各々のガラスボトルを６０℃、６５℃、又は７０℃及び１５０rpmでインキュベートすることにより開始した。

解重合反応の初期速度（生成された等価のＴＡ（mg）／時間）は，最初の２４時間の間に異なる時間に実施されたサンプリングにより決定し，超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）により分析した。必要な場合、サンプルを０．１Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８中に希釈した。次に、１５０μLのメタノール及び６．５μLのＨＣｌ６Ｎを１５０μLのサンプル又は希釈液に加えた。混合及び０．４５μmシリンジフィルター上でのろ過後、サンプルをＵＨＰＬＣ上に充填し、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴの遊離をモニターした。使用したクロマトグラフィーシステムは、Ultimate 3000 UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）（ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃に温度調節されたカラムオーブン、及び２４０nmのＵＶ検出器を含む）であった。使用したカラムはDiscovery（登録商標）HS C18 HPLC Column（１５０×４．６mm、５μm、プレカラム付き、Supelco、米国ベルフォンテ）であった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴは、１mMのＨ２ＳＯ４中のＭｅＯＨの勾配（３０%～９０%）を１mL/分で使用して分離した。注入は２０μLのサンプルであった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴは、商業的なＴＡ及びＢＨＥＴならびに自社で合成したＭＨＥＴから作成した標準曲線に従って、サンプルと同じ条件において測定した。ＰＥＴ加水分解の特異的活性（等価のＴＡ（mg）／時間／酵素（mg））を、反応の加水分解曲線の線形部分において決定し、そのような曲線は、最初の２４時間の間に異なる時間で実施されたサンプリングにより設定した。等価のＴＡは、測定されたＴＡの、ならびに測定されたＭＨＥＴ及びＢＨＥＴ中に含まれるＴＡの合計に対応する。

２．２．固体形態下でのポリエステルの分解に基づく活性。

２０μLの酵素調製物を、ＰＥＴを含む寒天プレートのウェル中に沈殿させた。寒天プレートの調製は、５００mgのＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）中に可溶化し、この媒質を２５０mLの水溶液中に注ぐことにより実現した。５２℃で、１４０mbar下でのＨＦＩＰ蒸発後、この溶液を、３%寒天を含む０．２Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８と混合（ｖ／ｖ）した。約３０mLの混合物を使用し，各々のプレートを調製し、４℃で保存した。

野生型エステラーゼ及びバリアントによるポリエステル分解に起因して形成されるハローの直径又は表面積を測定し、６０℃，６５℃、又は７０℃で２～２４時間後に比較した。

２．３．反応器中でのＰＥＴ加水分解に基づく活性。

８０mLの１００mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８中で調製された０．６９μmol～２．０７μmolの精製エステラーゼを、５００mLのMinibioバイオリアクター（Applikon Biotechnology、オランダ、デルフト）中で２０gの非晶質ＰＥＴ（ＷＯ２０１７／１９８７８６に従って、２０%を下回る結晶化度に達するように調製）と混合させた。６０℃、６５℃、又は７０℃での温度調節は、水浴浸漬により実施し、単一のマリンインペラーを使用して２５０rpmで一定の撹拌を維持した。ＰＥＴ解重合アッセイのｐＨを、６N ＮａＯＨによりｐＨ８に調節し、my-Controlバイオコントローラーシステム（Applikon Biotechnology、オランダ、デルフト）により保証された。塩基消費量をアッセイの間に記録し、ＰＥＴ解重合アッセイの特徴付けのために使用されうる。

ＰＥＴ解重合アッセイの最終収量を，残留ＰＥＴ重量の決定により，又は生成された等価のＴＡの決定により，又は塩基消費量を通じて決定した。残留ＰＥＴの重量決定を、反応の終了時での、１２～１５μmのグレード１１の無灰ペーパーフィルター（Dutscher SAS、フランス、ブリュマト）を通じた反応容量のろ過、及びそれを秤量する前でのそのような残余分の乾燥により評価した。生成された等価のＴＡの決定を、２．１において記載するＵＨＰＬＣ法を使用して実現し、加水分解のパーセンテージを、初期サンプル中に含まれるＴＡの総量に対する、所与の時間でのモル濃度の比率（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）に基づいて算出した。ＰＥＴ解重合によって、反応器中のｐＨを維持することができるように塩基を用いて中和される酸単量体が産生された。産生された等価のＴＡの決定を、対応するモル塩基消費量を使用して算出し、加水分解のパーセンテージを、初期サンプル中に含まれるＴＡの総量に対する、所与の時間での等価のＴＡのモル濃度の比率に基づいて算出した。

本発明のエステラーゼ（バリアント）の特異的分解活性を下の表１中に示す。配列番号１のエステラーゼの特異的分解活性を参照として使用し、１００%の特異的分解活性として考慮した。特異的分解活性を、６５℃で実施例２．１において曝露されたように測定する。

実施例３－本発明のエステラーゼの熱安定性の評価。

本発明のエステラーゼの熱安定性を決定し、配列番号１のエステラーゼの熱安定性と比較した。

異なる方法論を使用して、熱安定性を推定している：
（１）溶液中のタンパク質の円二色性；
（２）温度、時間、及び緩衝液の所与の条件におけるタンパク質インキュベーション後の残留エステラーゼ活性；
（３）温度、時間、及び緩衝液の所与の条件におけるタンパク質インキュベーション後の残留ポリエステルの解重合活性；
（４）寒天培地中に分散された固体ポリエステル化合物（例えばＰＥＴもしくはＰＢＡＴ、又はその類縁体）を、温度、時間、及び緩衝液の所与の条件においてタンパク質インキュベーション後に分解する能力；
（５）温度、緩衝液、タンパク質濃度、及びポリエステル濃度の所与の条件において複数回のポリエステルの解重合アッセイを実施する能力；
（６）示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）；それらの方法のプロトコールの詳細を以下に与える。

３．１円二色性

円二色性（ＣＤ）を、Jasco 815装置（米国イーストン）を用いて実施し、配列番号１のエステラーゼの融解温度（Ｔｍ）（Ｔｍ＝７９．８℃）と本発明のエステラーゼのＴｍを比較している。技術的には、４００μLのタンパク質サンプルをTalon緩衝液中で０．５mg/mLに調製し、ＣＤのために使用した。２８０nmから１９０nmまでの第１スキャンを実現させ、タンパク質の正しいフォールディングに対応するＣＤの２つの最大強度を決定する。第２スキャンを次に、２５℃から１１０℃まで、そのような最大強度に対応し、Sigmaplotバージョン１１．０ソフトウェアにより分析された特定の曲線（シグモイド３パラメータｙ＝ａ／（１＋ｅ＾（（ｘ－ｘ０）／ｂ））を提供する波長で実施し、Ｔｍをｘ＝ｘ０の時に決定する。得られたＴｍは、所与のタンパク質の熱安定性を反映する。Ｔｍが高いほど、そのバリアントは高い温度でより安定である。

３．２残留エステラーゼ活性

配列番号１のエステラーゼ又は本発明のエステラーゼの４０mg/L（Talon緩衝液中）の１mLの溶液を、異なる温度（４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、及び９０℃）で１０日間までインキュベートした。定期的に、サンプルを採取し、０．１Mリン酸カリウム緩衝液中で１～５００倍に希釈し、パラニトロフェノールブチレート（ｐＮＰ－Ｂ）アッセイを実現した。２０μLのサンプルを、２－メチル－２ブタノール（４０mM）中の１７５μLの０．１Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０及び５μＬのｐＮＰ－Ｂ溶液と混合する。酵素反応を、３０℃で、撹拌下で１５分間の間に実施し、４０５nmでの吸光度をマイクロプレート分光光度計（Versamax、Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール）により取得した。ｐＮＰ－Ｂ加水分解の活性（初期速度をｐＮＰＢ（μmol）／分で表現する）を、加水分解曲線の直線部分における遊離パラニトロフェノールについての標準曲線を使用して決定した。

３．３残留ポリエステル解重合活性。

配列番号１のエステラーゼの及び本発明のエステラーゼのそれぞれの４０mg/L（Talon緩衝液中）の１０mLの溶液を、１～３０日間の間、異なる温度（４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、及び９０℃）でインキュベートした。定期的に、１mLのサンプルを採取し、２５０～５００μmで微粉化した１００mgの非晶質ＰＥＴ（ＷＯ２０１７／１９８７８６に従って、２０%を下回る結晶化度に達するように調製）及び４９mLの０．１Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．０を含むボトルに移し、６０℃、６５℃、又は７０℃でインキュベートした。１５０μLの緩衝液を定期的にサンプリングした。要求される場合、サンプルを０．１Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８中で希釈した。次に、１５０μLのメタノール及び６．５μLのＨＣｌ６Nを１５０μLのサンプル又は希釈液に加えた。混合し、０．４５μmシリンジフィルター上でろ過した後、サンプルをＵＨＰＬＣ上に充填し、テレフタル酸（ＴＡ）、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴの遊離をモニターした。使用したクロマトグラフィーシステムは、Ultimate 3000 UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific, Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム）（ポンプモジュール、オートサンプラー、２５℃に温度調節されたカラムオーブン、及び２４０nmのＵＶ検出器を含む）であった。使用したカラムはDiscovery（登録商標）HS C18 HPLC Column（１５０×４．６mm、５μm、プレカラム付き、Supelco、米国ベルフォンテ）であった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴは、１mMのＨ２ＳＯ４中のＭｅＯＨの勾配（３０%～９０%）を１mL/分で使用して分離した。注入は２０μLのサンプルであった。ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴは、商業的なＴＡ及びＢＨＥＴならびに自社で合成したＭＨＥＴから作成した標準曲線に従って、サンプルと同じ条件において測定した。ＰＥＴ加水分解の活性（加水分解されたＰＥＴ（μmol）／分又は産生された等価のＴＡ（mg）／時間）を、加水分解曲線の線形部分において決定し、そのような曲線は、最初の２４時間の間に異なる時間で実施されたサンプリングにより設定した。等価のＴＡは、測定されたＴＡの、ならびに測定されたＭＨＥＴ及びＢＨＥＴ中に含まれるＴＡの合計に対応する。

３．４固体形態下でのポリエステルの分解。

配列番号１のエステラーゼの及び本発明のエステラーゼのそれぞれ４０mg/L（Talon緩衝液中）の１mLの溶液を、異なる温度（６５、７０、７５、８０、及び９０℃）で１～３０日間の間にインキュベートした。定期的に、２０μLの酵素調製物を、ＰＥＴを含む寒天プレート中に作成したウェル中に沈殿させた。ＰＥＴを含む寒天プレートの調製は、５００mgのＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）中に可溶化し、この媒質を２５０mLの水溶液中に注ぐことにより実現した。５２℃で、１４０mbar下でのＨＦＩＰ蒸発後、この溶液を、３%の寒天を含む０．２Mリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８と混合（ｖ／ｖ）した。約３０mLの混合物を使用し、各々のオムニトレイを調製し、４℃で保存する。

野生型エステラーゼ及び本発明のバリアントによるポリエステル分解に起因して形成されるハローの直径又は表面積を測定し、２～２４時間後に６０℃、６５℃、又は７０℃で比較した。所与の温度での酵素の半減期は、２倍だけハローの直径を減少させるために要求される時間に対応する。

３．５複数回のポリエステルの解重合。

連続回数のポリエステルの解重合アッセイを実施するエステラーゼの能力を、酵素反応器中で評価した。Minibio 500バイオリアクター（Applikon Biotechnology B.V.、オランダ、デルフト）を、３gの非晶質ＰＥＴ（ＷＯ２０１７／１９８７８６に従って、２０%を下回る結晶化度に達するように調製）及び３mgのＬＣエステラーゼを含む１００mLの１０mMリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８を用いて開始した。撹拌を、マリンインペラーを使用して２５０rpmに設定した。バイオリアクターは、外部水浴中での浸漬により、６０℃、６５℃、又は７０℃に温度調節した。ｐＨは、３MでのＫＯＨの添加により８に調整した。異なるパラメータ（ｐＨ、温度、撹拌、塩基の添加）を、BioXpertソフトウェアＶ２．９５を用いてモニターした。１．８gの非晶質ＰＥＴ（ＷＯ２０１７／１９８７８６に従って、２０%を下回る結晶化度に達するように調製）を２０時間毎に加えて、５００μLの反応媒質を定期的にサンプリングした。

ＴＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴの量を、実施例２．３において記載するように、ＨＰＬＣにより決定した。ＥＧの量を、６５℃に温度調節したAminex HPX-87Kカラム（Bio-Rad Laboratories, Inc、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して決定した。溶離液は０．６mL/分でのＫ２ＨＰＯ４５mMであった。注入は２０μLであった。エチレングリコールを、屈折計を使用してモニターした。

加水分解のパーセンテージを、初期サンプル中に含まれるＴＡの総量に対する、所与の時間でのモル濃度（ＴＡ＋ＭＨＥＴ＋ＢＨＥＴ）の比率に基づいて、又は初期サンプル中に含まれるＥＧの総量に対する、所与の時間でのモル濃度（ＥＧ＋ＭＨＥＴ＋２×ＢＨＥＴ）の比率に基づいて算出した。分解の速度を、１時間当たりの総遊離ＴＡ（mg）又は１時間当たりの総ＥＧ（mg）で算出する。

酵素の半減期を、分解速度の５０%の喪失を得るために要求されるインキュベーション時間として評価した。

３．６示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）

ＤＳＦを使用し、野生型タンパク質（配列番号１）及びそのバリアントの融解温度（Ｔｍ）（タンパク質集団の半分がアンフォールドする温度）を測定することにより、それらの熱安定性を評価した。タンパク質サンプルを１４μMの濃度で調製し、２０mM ＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、３００mM ＮａＣｌからなる緩衝液Ａ中に保存した。ＤＭＳＯ中のSYPRO Orange色素５０００×ストック溶液を最初に水中で２５０×に希釈した。タンパク質サンプルを、白色透明９６ウェルＰＣＲプレート（Bio-Rad ｃａｔ＃ＨＳＰ９６０１）上に添加し、各々のウェルは２５μlの最終容量を含んだ。各々のウェル中のタンパク質及びSYPRO Orange色素の最終濃度は、それぞれ５μM（０．１４mg/ml）及び１０Ｘであった。ウェル当たりの添加容量は以下の通りであった：１５μLの緩衝液Ａ、９μLの１４μMタンパク質溶液、及び１μLの２５０×SYPRO Orange希釈溶液。ＰＣＲプレートを次に、光学的品質のシールテープを用いて密封し、２０００rpmで、１分間にわたり室温でスピンさせた。ＤＳＦ実験を次に、４５０／４９０励起及び５６０／５８０発光フィルターを使用するように設定されたＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲシステムを使用して行った。サンプルを０．３℃／秒の速度で２５℃から１００℃まで加熱した。単一の蛍光測定値を０．０３秒毎に取った。融解温度を、Bio-Rad CFX Managerソフトウェアを使用し、融解曲線の第１誘導体のピークから決定した。

配列番号１のエステラーゼ及び本発明のエステラーゼを次に、それらのＴｍ値に基づいて比較した。異なる産生からの同じタンパク質での実験の間の高い再現性に起因して、０．８℃のΔＴｍが、バリアントを比較するために有意であると考慮された。Ｔｍ値は、少なくとも３つの測定値の平均に対応する。配列番号１のエステラーゼのＴｍは、実施例３．６において曝露されているように、７９．８℃で評価する。

本発明のエステラーゼバリアントの熱安定性を、以下の表２において示し、Ｔｍ値で表現し、実施例３．６に従って評価する。配列番号１のエステラーゼと比較したＴｍの増加を括弧中に示す。

Claims

（ｉ）配列番号１に示す全長アミノ酸配列と少なくとも７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有し、（ｉｉ）Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ、Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ／Ｐ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍ／Ｄより選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、それにおいて、前記位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列への参照により番号付けられ、ならびに（ｉｉｉ）配列番号１のエステラーゼと比較して増加した分解活性及び／又は増加した熱安定性を有するエステラーゼ。
前記エステラーゼが、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ、Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ、Ｑ９５Ｇ、Ｇ１３６Ａ、Ｔ１６９Ｑ、Ｖ１７２Ｉ、Ｓ１８４Ｅ、又はＮ２１３Ｍより選択される、好ましくはＬ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈ又はＲ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃより選択される少なくとも１つの置換又は置換の組み合わせを含む、より好ましくはＬ２１０Ｔを含む、請求項１に記載のエステラーゼ。
前記エステラーゼが、Ｔ１２、Ｅ１３、Ｓ１４、Ｓ１５、Ｉ１６、Ｅ１７、Ａ１８、Ｖ１９、Ｒ２０、Ｒ３２、Ａ３５、Ｆ３８、Ｇ６２、Ｆ６３、Ｔ６４、Ａ６５、Ｇ６６、Ｑ６７、Ｅ６８、Ｓ６９、Ｉ７０、Ａ７１、Ｗ７２、Ｐ７５、Ｒ７６、Ｄ８８、Ｔ８９、Ｒ９２、Ｌ９３、Ｄ９４、Ｑ９５、Ｐ９６、Ｄ９７、Ｈ１３０、Ｍ１３２、Ｇ１３３、Ｓ１３９、Ｗ１５６、Ｔ１５８、Ｒ１５９、Ｖ１７２、Ｑ１７５、Ｔ１７８、Ｉ１７９、Ａ１８０、Ｐ１８１、Ｓ１８４、Ｆ１８９、Ｌ２０４、Ｇ２０６、Ａ２０７、Ｓ２０８、Ｖ２１１、Ｓ２１２、Ｎ２１３、Ｔ２１４、Ｐ２１５、Ｄ２１６、Ｔ２１７、Ｔ２１８、Ｔ２１９、Ａ２２０、Ｋ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２３９、Ｆ２４０、Ｌ２４１、Ｐ２４３、Ａ２４４、Ｐ２４５、Ｄ２４６、Ｄ２４７、Ｆ２４８、Ａ２４９、Ｉ２５０、Ｇ１３６、又はＴ１６９より選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１又は２に記載のエステラーゼ。
前記エステラーゼが、Ｌ２１０Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｗ／Ｈより選択される少なくとも１つの置換、及び位置Ｖ１７２の少なくとも１つの置換、好ましくは少なくとも置換Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のエステラーゼ。
前記エステラーゼが、Ｒ２０５Ｃ＋Ｓ２５１Ｃ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｓ１８４Ｅ、Ｌ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｎ２１３Ｍ、又はＬ２１０Ｔ＋Ｖ１７２Ｉ＋Ｑ９５Ｇ＋Ｇ１３６Ａ＋Ｔ１６９Ｑ＋Ｓ１８４Ｅより選択される少なくとも１つの置換の組み合わせを含む、請求項１～３いずれか一項に記載のエステラーゼ。
前記エステラーゼが、Ａ２、Ｄ２３３、又はＳ２５５より選択される位置における少なくとも１つの置換、好ましくはＡ２Ｅ、Ｄ２３３Ｎ、又はＳ２５５Ａより選択される少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のエステラーゼ。
前記エステラーゼが、Ｓ１３１、Ｄ１７７、及びＨ２０９より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは組み合わせＳ１３１＋Ｄ１７７＋Ｈ２０９、ならびに／あるいはＣ２４２及びＣ２５７より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくは組み合わせＣ２４２＋Ｃ２５７をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のエステラーゼ。
請求項１～７のいずれか１項において定義するエステラーゼをコードする核酸。
請求項８に記載の核酸を含む発現カセット又はベクター。
請求項８に記載の核酸又は請求項９に記載の発現カセットもしくはベクターを含む宿主細胞。
請求項１～７のいずれかにおいて定義するエステラーゼ、又は請求項１０に記載の宿主細胞もしくはその抽出物を含む組成物。
ポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルを分解する方法であって
（ａ）ポリエステル含有材料を、請求項１～７のいずれか一項に記載のエステラーゼ、又は請求項１０に記載の宿主細胞、又は請求項１１に記載の組成物と接触させること；ならびに、場合により
（ｂ）単量体及び／又はオリゴマーを回収することを含む方法。
ポリエステルが、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタレート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジペートテレフタレート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノエート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジペート）（ＰＥＡ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、及びこれらの材料のブレンド／混合物より選択され、好ましくはポリエチレンテレフタレートである、請求項１２に記載の方法。
請求項１～７のいずれか一項に記載のエステラーゼ又は請求項１０に記載の宿主細胞又は請求項１１に記載の組成物を含むポリエステル含有材料。
請求項１～７のいずれか一項に記載のエステラーゼ、又は請求項１０に記載の宿主細胞、又は請求項１１に記載の組成物を含む洗剤組成物。