CN111100835B - Pet降解生物催化剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

针对现有技术中PET塑料降解所存在的问题，本发明提供了一种新型的PET降解生物催化剂及其构建方法。所述PET降解全菌催化剂由PET酶在耐热菌株中表达得到；所述PET酶具有SEQ NO.1的序列或与SEQ NO.1序列相似性达到99%的序列；所述耐热菌株为热纤梭菌。所述PET降解全菌催化剂的构建方法包括①质粒表达PET降解酶、②基因组表达PET降解酶和③表达PET降解小体。所述PET降解全菌催化剂克服了反馈抑制问题，不但降解效率显著高于已知全菌生物降解体系，而且作为厌氧微生物，其培养条件不需要通气和搅拌，从而显著降低了过程成本。此外，本申请还采用一锅法实现了混纺织物中的纤维与PET的同时降解；不但反应温度低，不需纤维前期分离，而且降解过程中不需要额外添加碳源，具有显著的经济性和高效性。

Description

PET降解生物催化剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物催化剂，具体涉及一种用于降解PET塑料的生物催化剂及其在含PET材料的降解中的应用。
背景技术
塑料制品为人类生活带来了巨大的便利，但由于缺乏有效的回收和再生手段，已造成全球性的白色污染。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是全球使用量最大的塑料原料之一；PET塑料在包装领域中具有广泛的应用，如包装膜、卷材和啤酒瓶。PET塑料瓶不仅广泛用于包装碳酸饮料、饮用水、果汁、酵素和茶饮料等，而且广泛用于食品、化工、药品包装等众多领域。每年中国生产的PET塑料瓶达数百亿只，但当这些材料被废弃时，却不得不面临着如何处理的问题。目前，主要通过热解回收PET废物并降级使用，即在采用高温条件下加入化学催化剂的方法实现涤纶纤维中PET的热解回收。这类方法的问题是：对环境二次污染，或采用昂贵催化剂，经济效益较低。
自2005年起，PET生物降解相关的研究逐渐成为国际研究热点。日本科学家发现微生物可以降解并利用PET生长，证实了PET生物处理的可行性（Science, 2016, 351:1196-1199）。目前，PET生物降解包括采用PET水解酶和利用PET降解微生物（全菌降解）两种方法。其中，发明专利申请201810448773.4、201780076589.5和201910439940.3均公开了采用基因工程技术获得PET降解酶的突变体及其应用，即首先对PET降解酶进行了改造，然后采用酶法进行PET生物降解。发明专利201710322634 .2公开了“一种结晶型塑料高效生物降解的方法 ”，该发明通过物理熔融及淬冷处理降低塑料结晶度的方法，提高酶接近和作用塑料的机率，并进一步采用丝氨酸蛋白酶或脂肪酶进行降解，从而大幅提高结晶型塑料生物降解效率。该申请在PET酶解步骤采用的也是外源添加PET水解酶的方法。采用PET水解酶的PET生物降解需要设立独立的体系进行酶的合成，往往采用大肠杆菌等模式菌株进行发酵，需要耗费大量的碳源和氮源，同时需要具有繁琐的细胞破碎及酶纯化的步骤。因此，虽然通过蛋白工程改造和降低塑料结晶度的方法可以一定程度提高塑料的降解效率，但酶的生产成本高昂，使得采用PET水解酶的策略不具有产业上的应用前景。
采用PET降解微生物这种方法，则是通过构建基因工程改造菌株或天然菌株实现PET的生物降解。该方法可以同步实现PET水解酶的外泌生产和塑料的降解，整个过程在一个体系中完成，可以极大简化生产步骤，降低生物催化剂制备成本。发明专利申请201710963873.6“降解PET塑料的基因工程菌”和发明专利申请201811321351.7“一种用于PET塑料降解的基因工程菌”都公开了利用大肠杆菌表达PET水解酶进行PET塑料降解的方法。Moog D. et al.公布了一种利用海洋微藻表达PET酶从而降解PET的方法（Microb cell fact. 2019, 18:171.）。上述文献均采用中温菌株表达低温PET降解酶，然后进行PET的生物降解，其降解效率低。因此，提高PET降解效率是目前PET生物降解亟需解决的技术难题。
然而，本领域技术人员众所周知，蛋白能否在菌株中异源表达并分泌到胞外受到启动子、信号肽、密码子、分子伴侣、蛋白酶、跨膜运输等众多因素的影响，而且往往不能表达得到有功能的酶。因此，要寻找合适的PET降解酶以及与之匹配的菌株，且能提高PET生物降解率是难题，也是重中之重。此外，由于PET是常见的纺织材料，常用于合成涤纶，而涤纶与棉的混纺织物——涤棉用途广泛，然而混纺纤维难以分离回收，因此其废弃物的处理也是目前环境保护所需要解决的严峻问题。
发明内容
针对现有技术中PET塑料降解所存在的问题，本发明提供了一种新型的PET降解生物催化剂，所述PET降解生物催化剂不但实现了PET塑料的高效降解，还实现了含PET混纺材料的简便、高效降解。
本发明的技术方案：
PET降解全菌催化剂，由PET酶在耐热菌株中表达得到；所述PET酶具有SEQ NO.1的序列或与SEQ NO.1序列相似性达到99%的序列；所述耐热菌株为热纤梭菌。所述PET降解全菌催化剂不但降解效率显著高于已知全菌生物降解体系，而且作为厌氧微生物，其培养条件不需要通气和搅拌，从而显著降低了过程成本。
所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，包括①质粒表达PET降解酶、②基因组表达PET降解酶和③表达PET降解小体。
其中，①质粒表达PET降解酶的具体步骤如下：
（1a）利用pHK质粒构建具有PET降解酶表达框的表达质粒pLCC。所述的PET降解酶表达框是从5’端到3’端依次具有启动子I、信号肽和PET降解酶编码基因的序列。所述步骤具体为：利用分子克隆的方法将信号肽序列（SEQ NO. 2）连接到PET降解酶编码基因的5’端，然后连接到pHK质粒的启动子I（SEQ NO. 3）的3’端；所述pHK质粒是同时带有大肠杆菌和梭菌的复制子的穿梭质粒，具有氯霉素和甲砜霉素抗性基因。
（1b）将表达质粒转化到热纤梭菌中，得到转化子。
（1c）对转化子中PET降解酶编码基因进行PCR和测序验证；通过pNPB为底物的胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达；从而获得质粒表达PET降解酶的全菌催化剂。
其中，②基因组表达PET降解酶的具体步骤如下：
（2a）将具有LCC和MHETase序列的融合表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中。
（2b）选取16SrRNA基因序列为靶位点，采用无疤敲除及筛选方法，将融合表达框整合到热纤梭菌基因组上，分别获得基因组融合表达LCC和MHETase的菌株；
（2c）获得突变株后，通过pNPB为底物的胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达，获得基因组表达PET降解酶的全菌催化剂。
其中，③表达PET降解小体的具体步骤如下：
（3a）构建共转录表达LCC和MHETase的质粒pLa-Mf，LCC和MHETase分别融合来源于丙酮丁醇梭菌和黄色纤维梭菌的组装模块。具体为：利用pHK质粒构建具有PET降解酶表达框的表达质粒pLCC；在上述pLCC质粒的LCC编码基因的3’端融合表达组装模块DocCa（来源于丙酮丁醇梭菌，SEQ NO.4），获得质粒pLa；在pLa中DocCa序列之后顺序插入RBS序列（AGGAGG）、MHETase的编码基因以及组装模块DocCf（来源于黄色纤维梭菌，SEQ NO.5）的基因，获得质粒pLa-Mf。
（3b）将pLa-Mf中的共转录表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中，选取16SrRNA基因序列为靶位点，采用无疤敲除及筛选方法，整合到热纤梭菌基因组上，分别获得基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株；
（3c）利用启动子II（SEQ NO.6）和信号肽（SEQ NO.2）构建表达降解小体脚架的质粒pSca，并将其转化到所述的基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株中；构建质粒pSca具体为：按照启动子II、信号肽、来自丙酮丁醇梭菌的粘连模块（SEQ NO.7）、来自黄色纤维梭菌的粘连模块（SEQ NO.8）的顺序，利用分子克隆的方式获得融合序列，并克隆到质粒pHK中，获得表达降解小体脚架的质粒pSca。
（3d）获得突变株后，通过pNPB为底物的胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达。通过SDS-PAGE分析带有组装模块的LCC和MHETase与带有粘连模块的脚架蛋白通过蛋白质间特异性的相互作用实现了胞外的组装；从而获得基于PET降解小体的全菌催化剂。
如上所述的PET降解全菌催化剂的应用，将其应用于PET或PET-纤维混纺材料的降解。所述降解为批次降解或者持续降解；具体为：将所述PET降解全菌催化剂添加至同时具有培养基和PET塑料/PET-纤维混纺材料的体系中，所述PET降解全菌催化剂的接种量为体系的1-10%体积比。
其中，所述批次降解的具体步骤为：（1）将PET塑料/纤维混纺材料裁剪为薄片状，乙醇浸泡并风干，然后将其加入到GS-2培养基中；（2）向培养基中接入所述PET降解全菌催化剂，在55-70℃的温度条件下培养2-35天。
其中，所述持续降解的具体步骤为：（1）将PET塑料/纤维混纺材料裁剪为薄片状，乙醇浸泡并风干，然后将其置于酶解装置的反应床中，再加入GS-2培养基；（2）在厌氧发酵罐中加入同样的培养基，接种所述PET降解全菌催化剂，间歇式搅拌，在60-65℃、pH=7-8的条件下进行培养。通过管路将厌氧发酵罐与酶解装置连通，实现持续降解。通过采用微循环固态床培养工艺，克服了所述生物催化剂浓度低和降解产物局部浓度过高而产生反馈抑制的问题，实现了PET生物催化剂的持续制备及高固塑料或混纺织物的持续降解，最终实现塑料产品的快速水解。
所述持续降解通过PET材料持续降解装置来实现。所述PET材料持续降解装置包括相互连通的厌氧发酵罐5和与酶解装置7；所述厌氧发酵罐5的上部设有进气口2和进料口3，所述厌氧发酵罐5的内部设有加热装置、控温装置以及与电机1相连的搅拌桨4。所述厌氧发酵罐5的底部设有出料口6；所述出料口6与酶解装置7的进料口8相连通；所述酶解装置7的出料口9与厌氧发酵罐5的进料口3相连通；所述酶解装置内设置固态反应床10。
本发明的有益效果：
（1）与现有技术相比，本申请提供了一种采用高温底盘细胞构建的PET降解生物催化剂，实现了高温下的PET降解，显著提高了降解效率；且所述生物催化剂是厌氧微生物，培养条件不需要通气和搅拌，显著降低过程成本。
（2）本申请所述的PET降解全菌催化剂成功实现了将PET酶与耐热模块的融合或组装，从而克服了现有PET酶法降解存在的中间降解产物反馈抑制问题——即催化中间产物水解的酶不具有耐热型，无法用于高温生物降解体系的技术问题。
（3）本申请所述的生物催化剂采用一锅法实现了混纺织物中的纤维与PET的同时降解；与现有技术中的化学法相比，不但反应温度低，不需纤维前期分离，而且降解过程中不需要额外添加碳源（以纤维素作为碳源），因此，具有显著的经济性和高效性。
附图说明
图1是PET降解酶表达质粒；
图2是PET降解酶同源重组质粒；
图3是PET降解电镜分析；
图4是PET材料持续降解装置。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：质粒表达PET降解酶
选取LCC（SEQ NO.1）、Tcur（序列号ACY96861.1）、PETase（序列号GAP38373.1）、Tcut（序列号WP_011291330）等PET降解酶的编码基因在热纤梭菌DSM1313中进行表达，构建PET降解生物催化剂。具体步骤为：
1）将信号肽序列（SEQ NO. 2）利用无缝克隆的方法连接到上述基因的5’端。
2）将步骤1）获得的序列利用无缝克隆的方法连接到pHK质粒的启动子I的3’端。其中pHK是同时带有大肠杆菌和梭菌的复制子的穿梭质粒，具有氯霉素和甲砜霉素抗性基因；启动子I序列为SEQ NO. 3，获得的PET降解酶表达质粒见图1。pLCC是表达LCC的质粒；pTcur是表达Tcur的质粒、pPETase是表达PETase的质粒、pTcut是表达Tcut的质粒。
3）将步骤2）获得的带有PET降解酶编码基因的pHK质粒转化到热纤梭菌DSM1313中，得到转化子。其中，转化方法参照文献1：Zhang J, Liu S, Li R, Hong W, Xiao Y,Feng Y, et al. Efficient whole-cell-catalyzing cellulose saccharificationusing engineered Clostridium thermocellum. Biotechnol Biofuels. 2017;10:124.
4）获得转化子后，对PET降解酶编码基因进行PCR和测序验证。通过pNPB为底物的胞外蛋白的酶活测定，测定方法参照文献2：Billig, S., Oeser, T., Birkemeyer, C.,and Zimmermann, W. (2010). Hydrolysis of cyclic poly(ethylene terephthalate)trimers by a carboxylesterase from Thermobifida fusca KW3. Appl MicrobiolBiotechnol 87, 1753-1764.:，确认PET降解酶是否成功表达，从而获得PET降解生物催化剂。其中，CtLCC是表达LCC的生物催化剂；CtTcur是表达Tcur的生物催化剂、CtPETase是表达PETase的生物催化剂、CtTcut是表达Tcut的生物催化剂。
实施例2：基因组表达PET降解酶
（1）利用无缝克隆的方法，依次将SEQ NO.3、SEQ NO.2、SEQ NO.1和SEQ NO.9中启动子I、信号肽、LCC和MHETase的核酸序列连接起来成为融合表达框，其中，去除LCC的终止密码子。
（2）选取16SrRNA基因序列为靶位点，将上述融合表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中（文献1）获得基因组重组质粒pHK-HR-PET（图2）。利用无疤敲除及筛选方法（文献1），整合到热纤梭菌基因组上，分别获得基因组融合表达LCC和MHETase的菌株。
（3）获得突变株后，通过pNPB为底物的胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达。从而获得基因组表达PET降解酶的全菌催化剂CtLM。
实施例3：表达PET降解小体：
（a）构建共转录表达LCC和MHETase的质粒pLa-Mf，且两个酶分别融合来源于丙酮丁醇梭菌和黄色纤维梭菌的组装模块。具体为：在上述pLCC质粒的LCC编码基因的3’端融合表达组装模块DocCa（SEQ NO.4），获得质粒pLa；在pLa中DocCa序列之后顺序插入RBS序列（AGGAGG）、MHETase的编码基因（SEQ NO.9）以及组装模块DocCf（SEQ NO.5）的基因，获得质粒pLDa-MDc。
（b）将pLDa-MDf中的共转录表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中（文献1），选取16SrRNA基因序列为靶位点，利用无疤敲除及筛选方法（文献1），整合到热纤梭菌基因组上，分别获得基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株。
（c）利用启动子II（SEQ NO.6）和信号肽（SEQ NO.2）构建表达降解小体脚架的质粒。具体为：按照启动子II、信号肽、来自丙酮丁醇梭菌的粘连模块（SEQ NO.7）、来自黄色纤维梭菌的粘连模块（SEQ NO.8）的顺序利用无缝克隆的方式获得融合序列，并克隆到质粒pHK中，获得表达降解小体脚架的质粒pSca。将质粒pSca转化到上一步获得的基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株中。
（d）获得突变株后，通过pNPB为底物的胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达。通过SDS-PAGE分析带有组装模块的LCC和MHETase与带有粘连模块的脚架蛋白通过蛋白质间特异性的相互作用实现了胞外的组装。从而获得基于PET降解小体的全菌催化剂CtSLM。
实施例4：PET的批次降解
将PET塑料裁剪为2cm×0.8cm大小的薄片。将薄片在75%的乙醇中浸泡并无菌风干，然后加入到GS-2培养基（每升水中添加磷酸氢二钾2.9 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、尿素0.8 g/L、氯化钙0.1 g/L、氯化镁1.8 g/L、硫酸亚铁0.0005 g/L、半胱氨酸盐酸盐2 g/L、酵母提取物6 g/L、柠檬酸三钠2 g/L、纤维二糖、5 g/L，pH 7.5）中，每10 ml培养基加入50 mgPET薄片。向培养基中按照反应体系1%的体积比，接入实施例1中获得的生物催化剂CtLCC、CtTcur、CtPETase、CtTcut和野生菌株DSM1313，在60℃培养，每24-48小时分析PET薄片的重量变化。
结果表明，加入CtLCC的实验组，PET薄片14天内干重下降31.1mg，降解率达到60%，25天内干重下降约42.3mg，降解率达到84.6%。加入CtTcut的实验组，PET薄片14天内干重下降12.9mg，25天后下降18.2 mg，降解率达到36.4%。加入CtTcur的实验组，PET薄片14天内无显著变化，25天后干重下降5.0 mg，降解率达到10%。加入CtPETase的实验组以及加入野生菌株的对照组，25天后PET薄片干重无变化。
这一方面说明，与野生菌株相比，本申请实施例1获得的生物催化剂CtLCC、CtTcur、CtTcut实现了PET的高效降解。另一方面也说明，并非所有的蛋白均能在菌株中异源表达、分泌并得到有功能的酶。因此，本申请采用PET降解酶以及与之匹配的菌株得到PET生物催化剂，且能提高PET生物降解率是不可预料的技术效果，具有非显而易见性。
实施例5：PET批次降解电镜观察
选取实施例4中CtLCC不同时间点的PET薄片，进行扫描电镜观察；发现薄片表面随着时间从光滑变粗糙，并出现降解的孔洞以及裂痕（图3），证明了PET的高效降解。
实施例6：PET批次降解发酵液分析
采用pNPB为底物，检测实施例4中CtLCC不同时间点的发酵液中的PET降解酶的酶活。结果显示，上清酶比活力达到5 U/mg，即每分钟每毫克上清蛋白可以降解5毫摩尔的底物；随培养时间的延长而逐渐降低，两周时上清液比酶活降至最初酶活的10%。
利用HPLC定量分析实施例4中CtLCC不同时间点的发酵液中的PET降解产物，发现其中的对苯二甲酸（TPA）及其中间降解产物MHET的含量呈逐渐上升趋势，14天时分别积累7.71 mM以及5.18 mM，与PET失重趋势一致，而对照组基本无变化。这也验证了PET的高效降解。
实施例7：PET的批次降解
与实施例4不同的是，向培养基中接入实施例1中获得的生物催化剂CtLCC，先在60℃培养48小时后，再转移到55、65、70℃培养。结果表明，55℃培养，PET薄片14天内干重下降22.7mg；65℃培养，PET薄片14天内干重下降23.8mg；70℃培养，PET薄片12天内干重下降16.8mg。
实施例8：PET批次降解分析
与实施例4不同的是，接入实施例2中获得的生物催化剂CtLM。结果表明，PET薄片25天内干重下降41.9mg，降解率达到83.8%。
实施例9：PET批次降解分析
与实施例4不同的是，接入实施例3中获得的生物催化剂CtSLM。结果表明， PET薄片25天内干重下降45.2mg，降解率达到90.4%。
实施例10：涤棉混纺布批次降解分析
与实施例4不同的是，将涤棉混纺布（PET聚酯纤维与棉混合纺织材料，涤纶与棉质量比大于1.5）裁剪约为1 cm×0.8 cm大小的薄片，采用无纤维二糖的培养基，每10 ml培养基加入50 mg混纺布薄片，并按照体积比10%的接种量接入实施例2中获得的CtLM或实施例3中获得的CtSLM。
结果表明，采用CtLM作为生物催化剂，涤棉混纺布薄片35天内干重下降25.7mg，降解率达到51.4%；采用CtSLM作为生物催化剂，涤棉混纺布薄片35天内干重下降27.1mg，降解率达到54.2%。这说明，所述的生物催化剂对于涤棉混纺材料具有良好的降解能力。
实施例11：PET材料持续降解分析
与实施例4不同的是，1L厌氧发酵罐中加入GS-2培养基，按10%的体积比接种实施例3制备的生物催化剂CtSLM，采用间歇式搅拌方式，在60℃的温度条件进行培养，通过流加氢氧化钠使pH控制在7。
将PET或涤棉混纺布（纤维素与PET的比例为2:1）裁剪为2 cm × 0.8 cm（直径不大于5 cm）大小的薄片。在75%的乙醇中浸泡并无菌风干后平铺于1L酶解装置的固态反应床中，并加入不具有碳源的GS-2培养基，每升培养基加入50 g 薄片。
通过PET材料持续降解装置来实现所述PET材料的持续降解。所述PET材料持续降解装置包括相互连通的厌氧发酵罐5和与酶解装置7；所述厌氧发酵罐5的上部设有进气口2和进料口3，所述厌氧发酵罐5的内部设有加热装置、控温装置以及与电机1相连的搅拌桨4。所述厌氧发酵罐5的底部设有出料口6；所述出料口6与酶解装置7的进料口8相连通；所述酶解装置7的出料口9与厌氧发酵罐5的进料口3相连通；所述酶解装置内设置固态反应床10。
生物催化剂在厌氧发酵罐5中培养36-48小时后，通过管路将厌氧发酵罐5与酶解装置7联通，通过蠕动泵使发酵液从厌氧发酵罐5底部的出料口6进入酶解装置7的进料口8（流速5 ml/min），流通整个酶解装置7所具有的固态反应床10；然后从酶解装置7的出料口9循环回到厌氧发酵罐5的进料口3，从而实现生物催化剂的持续生产、在固态反应床10上的吸附富集，以及薄片的持续降解。
当进行PET降解时，通过厌氧发酵罐5的进料口3补加纤维二糖及尿素，使纤维二糖浓度保持在5 g/L，使尿素浓度保持在2 g/L。当从酶解装置7的底物出料口9流出的发酵液中PET水解产物（TPA、MHET、BHET的总和）的含量≥260 mM时，更换厌氧发酵罐5与酶解装置7中的培养基。结果表明，PET薄片在35天内干重下降81.6%；涤棉混纺布薄片35天内干重下降61.9%。
实施例12：PET材料持续降解分析
与实施例11不同的是，1L厌氧发酵罐中加入GS-2培养基，按5%的体积比接种实施例3制备的生物催化剂CtSLM，采用间歇式搅拌方式，在65℃的温度条件进行培养，通过流加氢氧化钠使pH控制在8。
结果表明，PET薄片在35天内干重下降85.2%；涤棉混纺布薄片35天内干重下降69.7%。
综上可知：由实施例4-7可知，采用本申请实施例1获得的生物催化剂CtLCC、CtTcur、CtTcut，PET薄片在25天内干重下降分别达到42.3mg，18.2 mg，5.0 mg，降解率分别达到84.6%，36.4%，10%。加入CtPETase的实验组以及加入野生菌株的对照组，25天后PET薄片干重无变化。此外，采用实施例2、实施例3获得的生物催化剂CtLM和CtSLM，PET薄片25天内干重分别下降41.9mg和45.2mg，降解率达到83.8%和90.4%。说明，本申请所述的PET生物催化剂实现了PET 的高效降解。
此外，由实施例8-9可知，采用实施例1中获得的生物催化剂CtLCC，先在60℃培养48小时后，再转移到55、65、70℃培养，PET薄片14天内干重下降分别为22.7mg、23.8mg和16.8mg。这说明，在55-70℃的温度范围内，PET批次降解均可实现良好的降解效果。
由实施例10-12可知，采用实施例2制备的CtLM和实施例3制备的CtSLM作为生物催化剂进行批次降解，涤棉混纺布薄片35天内干重分别下降25.7mg和27.1mg，降解率达到51.4%和54.2%。而进行持续降解的实施例11和实施例12，PET薄片在35天内干重下降达到81.6%和85.2%；涤棉混纺布薄片35天内干重下降达到61.9%和69.7%。这充分说明，持续降解的效果要优于批次降解。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> PET降解生物催化剂及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> 未培养微生物(uncultured bacterium)
<400> 1
Met Asn Pro Tyr Gln Arg Gly Pro Asn Pro Thr Arg Ser Ala Leu Thr
1 5 10 15
Ala Asp Gly Pro Phe Ser Val Ala Thr Tyr Thr Val Ser Arg Leu Ser
20 25 30
Val Ser Gly Phe Gly Gly Gly Val Ile Tyr Tyr Pro Thr Gly Thr Ser
35 40 45
Leu Thr Phe Gly Gly Ile Ala Met Ser Pro Gly Tyr Thr Ala Asp Ala
50 55 60
Ser Ser Leu Ala Trp Leu Gly Arg Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val
65 70 75 80
Val Leu Val Ile Asn Thr Asn Ser Arg Phe Asp Tyr Pro Asp Ser Arg
85 90 95
Ala Ser Gln Leu Ser Ala Ala Leu Asn Tyr Leu Arg Thr Ser Ser Pro
100 105 110
Ser Ala Val Arg Ala Arg Leu Asp Ala Asn Arg Leu Ala Val Ala Gly
115 120 125
His Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Arg Ile Ala Glu Gln Asn Pro
130 135 140
Ser Leu Lys Ala Ala Val Pro Leu Thr Pro Trp His Thr Asp Lys Thr
145 150 155 160
Phe Asn Thr Ser Val Pro Val Leu Ile Val Gly Ala Glu Ala Asp Thr
165 170 175
Val Ala Pro Val Ser Gln His Ala Ile Pro Phe Tyr Gln Asn Leu Pro
180 185 190
Ser Thr Thr Pro Lys Val Tyr Val Glu Leu Asp Asn Ala Ser His Phe
195 200 205
Ala Pro Asn Ser Asn Asn Ala Ala Ile Ser Val Tyr Thr Ile Ser Trp
210 215 220
Met Lys Leu Trp Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Arg Gln Phe Leu Cys
225 230 235 240
Asn Val Asn Asp Pro Ala Leu Ser Asp Phe Arg Thr Asn Asn Arg His
245 250 255
Cys Gln
<210> 2
<211> 108
<212> DNA
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 2
atggtaaaaa gcagaaagat ttctattctg ttggcagttg caatgctggt atccataatg 60
atacccacaa ctgcattcgc aggtcctaca aaggcaccta caaaagat 108
<210> 3
<211> 141
<212> DNA
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 3
gataaacaaa ggacggttca gggcttctgc tcatcctact ctgcattgta aaaaggtagg 60
atgaattttt atttttaatc ttattgaaaa aaatttttga aaatcggttt tattaaaaaa 120
aagtgggtat atttataata g 141
<210> 4
<211> 57
<212> PRT
<213> 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400> 4
Pro Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Val Val Asn Gly Arg Asp Leu Met
1 5 10 15
Glu Leu Arg Gln Tyr Leu Ala Gly Lys Leu Asp Ala Ser Lys Ile Asn
20 25 30
Leu Ala Ala Ala Asp Val Asn Asn Asp Gly Val Val Asn Gly Arg Asp
35 40 45
Ile Met Glu Leu Thr Lys Leu Ile Ala
50 55
<210> 5
<211> 57
<212> PRT
<213> 黄色纤维梭菌(Clostridium clarifavum)
<400> 5
Leu Gly Asp Ile Asn Phe Asp Gly Asp Ile Asn Ser Ile Asp Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Leu Lys Ala His Leu Leu Gly Ile Asn Lys Leu Ser Gly Asp Ala
20 25 30
Leu Lys Ala Ala Asp Val Asp Gln Asn Gly Asp Val Asn Ser Ile Asp
35 40 45
Tyr Ala Lys Met Lys Ser Tyr Leu Leu
50 55
<210> 6
<211> 235
<212> DNA
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermocellum)
<400> 6
taatattaat ggacaaaaaa acaaagaatt acatcaaagg aagataaaaa tactttgtta 60
aaaaattaat tattttttat ctaaactatt gaaaatgaaa ataaaataat ataaaatgaa 120
tcatagtgca agagatactt gccagaggat gaatatttta ctgcattcat gctttatggc 180
agctaataga ggcattaaat taaattttaa tttacaatag gaggcgatat taatg 235
<210> 7
<211> 137
<212> PRT
<213> 丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400> 7
Thr Asn Ile Thr Val Gly Asp Val Thr Gly Ala Lys Lys Gly Asp Thr
1 5 10 15
Ile Lys Val Pro Val Ser Val Ser Thr Val Lys Thr Pro Ile Gly Leu
20 25 30
Ile Asp Met Glu Ile Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Leu Thr Ala Lys Asp
35 40 45
Val Val Pro Thr Asp Leu Val Lys Asp Thr Asp Asn Tyr Ser Phe Ile
50 55 60
Val Asn Thr Ser Thr Pro Gly Lys Ile Ser Ile Thr Phe Thr Asp Pro
65 70 75 80
Thr Leu Gly Thr Tyr Pro Ile Gly Thr Asp Gly Ile Phe Ala Tyr Leu
85 90 95
Glu Phe Leu Val Ala Gly Glu Lys Ala Gly Lys Tyr Asp Leu Lys Val
100 105 110
Asn Pro Thr Thr Leu Ile Leu Ala Asp Glu Asn Asp Asn Asp Ile Asp
115 120 125
Cys Asn Pro Pro Lys Asp Gly Ser Val
130 135
<210> 8
<211> 134
<212> PRT
<213> 黄色纤维梭菌(Clostridium clarifavum)
<400> 8
Val Ala Val Gly Lys Val Glu Gly Lys Ala Gly Glu Thr Val Thr Val
1 5 10 15
Pro Val Thr Leu Thr Asn Val Ser Ala Asn Gly Val Thr Ser Ala Asp
20 25 30
Phe Ala Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Val Leu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu
35 40 45
Ala Gly Ser Ile Val Lys Asn Pro Ser Val Asn Leu Ala Leu His Lys
50 55 60
Glu Lys Asp Gly Leu Leu Asn Val Leu Phe Leu Asp Glu Thr Leu Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Ile Ala Glu Asp Gly Ile Met Leu Asn Leu Lys Phe Lys
85 90 95
Ile Asn Ser Asn Ala Lys Ala Gly Thr Ser Ala Thr Val Ala Ile Gly
100 105 110
Asp Lys Pro Thr Phe Ala Asp Arg Ser Leu Lys Ala Ile Lys Leu Ala
115 120 125
Val Val Asn Gly Ser Val
130
<210> 9
<211> 603
<212> PRT
<213> 大阪伊德氏杆菌(Ideonella sakaiensis)
<400> 9
Met Gln Thr Thr Val Thr Thr Met Leu Leu Ala Ser Val Ala Leu Ala
1 5 10 15
Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Pro Leu Pro Gln Gln Gln
20 25 30
Pro Pro Gln Gln Glu Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Leu Ala Ser Arg
35 40 45
Ala Ala Cys Glu Ala Leu Lys Asp Gly Asn Gly Asp Met Val Trp Pro
50 55 60
Asn Ala Ala Thr Val Val Glu Val Ala Ala Trp Arg Asp Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Leu Pro Glu His Cys Glu Val Ser Gly
85 90 95
Ala Ile Ala Lys Arg Thr Gly Ile Asp Gly Tyr Pro Tyr Glu Ile Lys
100 105 110
Phe Arg Leu Arg Met Pro Ala Glu Trp Asn Gly Arg Phe Phe Met Glu
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Thr Asn Gly Ser Leu Ser Ala Ala Thr Gly Ser Ile
130 135 140
Gly Gly Gly Gln Ile Ala Ser Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Thr Ile
145 150 155 160
Ala Thr Asp Gly Gly His Asp Asn Ala Val Asn Asp Asn Pro Asp Ala
165 170 175
Leu Gly Thr Val Ala Phe Gly Leu Asp Pro Gln Ala Arg Leu Asp Met
180 185 190
Gly Tyr Asn Ser Tyr Asp Gln Val Thr Gln Ala Gly Lys Ala Ala Val
195 200 205
Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Ala Ala Asp Lys Ser Tyr Phe Ile Gly Cys
210 215 220
Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly Met Met Leu Ser Gln Arg Phe Pro Ser
225 230 235 240
His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Gln Leu Pro Lys
245 250 255
Ala Gly Ile Ser Gly Ala Trp Thr Thr Gln Ser Leu Ala Pro Ala Ala
260 265 270
Val Gly Leu Asp Ala Gln Gly Val Pro Leu Ile Asn Lys Ser Phe Ser
275 280 285
Asp Ala Asp Leu His Leu Leu Ser Gln Ala Ile Leu Gly Thr Cys Asp
290 295 300
Ala Leu Asp Gly Leu Ala Asp Gly Ile Val Asp Asn Tyr Arg Ala Cys
305 310 315 320
Gln Ala Ala Phe Asp Pro Ala Thr Ala Ala Asn Pro Ala Asn Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Cys Val Gly Ala Lys Thr Ala Asp Cys Leu Ser Pro Val
340 345 350
Gln Val Thr Ala Ile Lys Arg Ala Met Ala Gly Pro Val Asn Ser Ala
355 360 365
Gly Thr Pro Leu Tyr Asn Arg Trp Ala Trp Asp Ala Gly Met Ser Gly
370 375 380
Leu Ser Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Ser Trp Trp Leu Gly
385 390 395 400
Ser Phe Asn Ser Ser Ala Asn Asn Ala Gln Arg Val Ser Gly Phe Ser
405 410 415
Ala Arg Ser Trp Leu Val Asp Phe Ala Thr Pro Pro Glu Pro Met Pro
420 425 430
Met Thr Gln Val Ala Ala Arg Met Met Lys Phe Asp Phe Asp Ile Asp
435 440 445
Pro Leu Lys Ile Trp Ala Thr Ser Gly Gln Phe Thr Gln Ser Ser Met
450 455 460
Asp Trp His Gly Ala Thr Ser Thr Asp Leu Ala Ala Phe Arg Asp Arg
465 470 475 480
Gly Gly Lys Met Ile Leu Tyr His Gly Met Ser Asp Ala Ala Phe Ser
485 490 495
Ala Leu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Glu Arg Leu Gly Ala Ala Met Pro
500 505 510
Gly Ala Ala Gly Phe Ala Arg Leu Phe Leu Val Pro Gly Met Asn His
515 520 525
Cys Ser Gly Gly Pro Gly Thr Asp Arg Phe Asp Met Leu Thr Pro Leu
530 535 540
Val Ala Trp Val Glu Arg Gly Glu Ala Pro Asp Gln Ile Ser Ala Trp
545 550 555 560
Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Phe Gly Val Ala Ala Arg Thr Arg Pro Leu
565 570 575
Cys Pro Tyr Pro Gln Ile Ala Arg Tyr Lys Gly Ser Gly Asp Ile Asn
580 585 590
Thr Glu Ala Asn Phe Ala Cys Ala Ala Pro Pro
595 600

Claims (10)

1.PET降解全菌催化剂，其特征在于：所述PET降解全菌催化剂由PET酶在耐热菌株中表达得到；所述PET酶的序列如SEQ NO.1所示；所述耐热菌株为热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）。
2.如权利要求1所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：包括①质粒表达PET降解酶、②基因组表达PET降解酶和③表达PET降解小体；所述PET降解小体由带组装模块的LCC和MHETase与带粘连模块的脚架蛋白通过蛋白质间的特异性相互作用实现胞外组装得到。
3.根据权利要求2所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述①质粒表达PET降解酶的具体步骤为：（1a）利用pHK质粒构建具有PET降解酶表达框的表达质粒pLCC；（1b）将表达质粒转化到热纤梭菌（Clostridium thermocellum）中，得到转化子；（1c）对转化子中PET降解酶编码基因进行PCR和测序验证，并进行胞外蛋白的酶活测定，获得质粒表达PET降解酶的全菌催化剂。
4.根据权利要求3所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述步骤（1a）中的PET降解酶表达框是从5’端到3’端依次具有启动子I、信号肽和PET降解酶编码基因的序列；所述步骤具体为：利用分子克隆的方法将信号肽序列连接到PET降解酶编码基因的5’端，然后连接到pHK质粒的启动子I的3’端；所述pHK质粒是同时带有大肠杆菌和梭菌的复制子的穿梭质粒，具有氯霉素和甲砜霉素抗性基因。
5.根据权利要求2所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述②基因组表达PET降解酶的具体步骤为：（2a）将具有LCC和MHETase序列的融合表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中；（2b）选取16SrRNA基因序列为靶位点，采用无疤敲除及筛选方法，将融合表达框整合到热纤梭菌基因组上，获得基因组融合表达LCC和MHETase的菌株；（2c）通过胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达，获得基因组表达PET降解酶的全菌催化剂。
6.根据权利要求2所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：所述③表达PET降解小体的具体步骤为：（3a）构建共转录表达LCC和MHETase的质粒pLa-Mf，LCC和MHETase分别融合来源于丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和黄色纤维梭菌（Clostridium clariflavum）的组装模块；（3b）将pLa-Mf中的共转录表达框作为目标基因克隆到同源重组质粒pHK-HR中，选取16SrRNA基因序列为靶位点，采用无疤敲除及筛选方法，整合到热纤梭菌基因组上，分别获得基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株；（3c）利用启动子II和信号肽构建表达降解小体脚架的质粒pSca，并将其转化到所述的基因组共转录表达LCC和MHETase的菌株中；（3d）通过胞外蛋白的酶活测定，确认PET降解酶是否成功表达，从而获得基于PET降解小体的全菌催化剂。
7.根据权利要求6所述的PET降解全菌催化剂的构建方法，其特征在于：步骤（3a）具体为：利用pHK质粒构建具有PET降解酶表达框的表达质粒pLCC；所述pLCC质粒的LCC编码基因的3’端融合表达来自丙酮丁醇梭菌的组装模块DocCa，获得质粒pLa；在质粒pLa中DocCa序列之后顺序插入RBS序列、MHETase的编码基因以及来自黄色纤维梭菌的组装模块DocCf的基因，获得质粒pLa-Mf；步骤（3c）中构建质粒pSca具体为：按照启动子II、信号肽、来自丙酮丁醇梭菌的粘连模块、来自黄色纤维梭菌的粘连模块的顺序利用分子克隆的方式获得融合序列，并克隆到质粒pHK中，获得表达降解小体脚架的质粒pSca。
8.如权利要求1所述的PET降解全菌催化剂的应用，其特征在于：将其应用于PET或PET-纤维混纺材料的降解；所述降解为批次降解或者持续降解；具体为：将所述PET降解全菌催化剂添加至同时具有培养基和PET塑料/PET-纤维混纺材料的体系中，所述PET降解全菌催化剂的接种量为体系的1-10%体积比。
9.根据权利要求8所述的PET降解全菌催化剂的应用，其特征在于：所述批次降解的具体步骤为：（1）将PET塑料/PET-纤维混纺材料裁剪为薄片状，灭菌后将其加入到GS-2培养基中；（2）向培养基中接入所述PET降解全菌催化剂，在55-70℃的温度条件下培养2-35天；其中，PET纤维混纺材料的降解中，GS-2培养基中不添加碳源；所述持续降解的具体步骤为：（1）将PET塑料/PET-纤维混纺材料裁剪为薄片状，灭菌后将其置于酶解装置的反应床中，再加入GS-2培养基；（2）在厌氧发酵罐中加入同样的培养基，接种所述PET降解全菌催化剂，间歇式搅拌，在60-65℃、pH=7-8的条件下进行培养；（3）通过管路将厌氧发酵罐与酶解装置连通，实现持续降解。
10.PET材料持续降解装置在权利要求8或9中所述的持续降解中的应用；其特征在于：所述PET材料持续降解装置包括相互连通的厌氧发酵罐（5）和酶解装置（7）；所述厌氧发酵罐（5）的上部设有进气口（2）和进料口（3），所述厌氧发酵罐（5）的内部设有加热装置、控温装置以及与电机（1）相连的搅拌桨（4）；所述厌氧发酵罐（5）的底部设有出料口（6）；所述出料口（6）与酶解装置（7）的进料口（8）相连通；所述酶解装置（7）的出料口（9）与厌氧发酵罐（5）的进料口（3）相连通；所述酶解装置（7）内设置固态反应床（10）。
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