CN112702997A

CN112702997A - 细菌组合物及使用其进行聚合物降解的方法

Info

Publication number: CN112702997A
Application number: CN201980053891.8A
Authority: CN
Inventors: 杰伊·梅勒斯; 摩根·维格
Original assignee: Reed Institute
Current assignee: Reed Institute
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2021-04-23
Also published as: EP3806837A1; WO2019245986A1; EP3806837A4; US20210114069A1

Abstract

本发明提供了降解聚合物的方法。这些方法可以包括用假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种和/或其细菌聚生体孵育该聚合物。还提供了用于降解聚合物的试剂盒。这些试剂盒可以包含假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种和/或其细菌聚生体。这些试剂盒也可以包含用于培养该假单胞菌属和/或该芽孢杆菌属物种和/或其细菌聚生体的培养箱。还提供了用于降解含有聚合物的底物的组合物，这些组合物包括假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种和/或其细菌聚生体。

Description

细菌组合物及使用其进行聚合物降解的方法

技术领域

本披露总体上涉及使用细菌降解聚合物的方法。本披露还涉及用于降解含有聚合物的底物的组合物。细菌可以包括假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种。

背景技术

估计每年有3亿吨塑料废物产生，其中仅美国就产生3千万至3千万3百万吨塑料废物(参见Geyer R等人2017.Sci Adv[科学进展]3:e1700782)。然而，这一数字低估了目前正在流向地球的塑料负担，因为它没有反映出每年未报告的数百万吨废物(参见Orhan YB,Hanife.2000.International biodeterioration and biodegradation[国际生物退化和生物降解]45:49-55)。预计塑料行业将继续增长，到2020年，随着塑料开始取代医疗器械行业，并且一次性食品和饮料包装继续主导国际食品格局，其利润预计将超过3750亿美元(参见Research Z.[研究Z.]2016.Plastic Packaging(Rigid Plastic Packaging andFlexible Plastic Packaging)Market for Food&Beverages,Industrial,HouseholdProducts,Personal Care,Medical and Other Applications-Global IndustryPerspective,Comprehensive Analysis,Size,Share,Growth,Segment,Trends andForecast[食品和饮料、工业、日用品、个人护理、医疗和其他应用的塑料包装(硬塑料包装和软塑料包装)市场-全球行业观点，综合分析、规模、份额、增长、细分、趋势和预测]，2014-2020)。

2014年国际上生产的塑料中超过50％用于一次性塑料食品和饮料包装，该包装作为废物而不是回收再利用而被快速丢弃(同上)。然后，这种塑料废料在垃圾填埋场和海洋中积聚，并在那里存留数百年。实际上，自第二次世界大战后将塑料大规模引入消费市场以来，已生产了83亿公吨塑料，估计大约63亿公吨已成为塑料废物，其中79％在垃圾填埋场中积聚，而19％最终进入海洋(参见Geyer R等人2017.Sci Adv[科学进展]3:e1700782)。由于环境研究人员最近确定，海洋中的大部分塑料碎片存在于深海沉积物中，而其具有塑料下沉的作用，因此该数字可能不足以代表目前海洋中存在的塑料(参见Woodall LC等人2014.R Soc Open Sci[皇家学会开放科学]1:140317)。

塑料通常来源于不可再生资源，例如天然气/石油和煤炭。在聚乙烯(PE)的情况下，使用加热和加压过程，乙烯单体中的双键断裂并键合在一起，从而形成总计数千个单体的聚乙烯长链。PE及其衍生物在室温下不反应(化学惰性)，并具有高分子量和支链3D结构。PE衍生物也是疏水的，这降低了其作为供微生物消耗的碳源的可用性(参见Hadad D等人2005.J Appl Microbiol[应用微生物学杂志]98:1093-100)。这些品质以及PE缺乏容易被细菌酶识别的官能团，使PE及其衍生物在很大程度上抵抗生物降解。因此，PE及其衍生物在环境中可存留200年至1,000年，这取决于聚合物的类型(参见Ramesh VK等人2011.AfricanJournal of Microbiology Research[非洲微生物学研究杂志]5(28):5013-5018)。

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是由重复的碳、氢和氧单体组成的聚乙烯塑料衍生物。PET具有非支化的化学结构和高比例的芳族成分，这提高其耐久性并具有化学惰性，使其高度抵抗降解(参见Yoshida S等人2016.Science[科学]351:1196-9)。它的刚性和形成对分子氧的有效气体屏障的能力使其广泛用于水瓶和一次性容器中。它也用于常见的家庭用品，例如地毯纤维、窗帘和纺织品。

生物降解是微生物(通常是细菌或真菌)通过同化或释放可裂解聚合物主链内各种键的酶来诱导聚合物降解的过程。塑料的自发水解、光氧化和机械分离可通过引入可裂解的键或简单地增加用于定殖的塑料表面积来增强生物降解(参见Pettigrew CAP,A.C.1992.Bioscience[生物科学]42:680-685)。通常，认为任何能够将塑料聚合物还原为CO₂和水(有氧条件)、CO₂和甲烷(厌氧条件)或无机分子和生物质的微生物都能够生物降解。尽管已知某些细菌可以降解某些塑料，但是几乎没有经历过研究如何可以将细菌聚生体(bacterial consortia)和/或包含能够降解聚合物的细菌的组合物用于生物强化目的，以减轻PET废料或相关塑料的污染。

附图说明

本文披露的实施例通过结合附图从以下描述和所附权利要求书中将变得更加清楚。

图1示出了脂肪酶活性的罗丹明B琼脂测试。通过将土壤样品浸入水中并收集上清液以分散在溶菌肉汤(LB)平板上来生成混合菌落的主平板。将具有生长的各个平板(左上和左下平板上的代表性平板)压印在罗丹明B平板(右上和右下平板上)上以筛选脂肪酶活性。在365nm紫外线(UV)暴露下，橙色或黄色光晕的存在表明脂肪酶阳性菌落(用箭头指示)。之后，将脂肪酶阳性区域中的各个菌落点到新的罗丹明平板上以分离出脂肪酶生产者，并将阳性斑点重新划线到LB上进行纯化。

图2A示出了罗丹明B琼脂上的代表性阴性(顶部)和阳性(底部)斑点。白色虚线圆圈勾勒出原始接种区域。

图2B是显示测试的分离的脂肪酶阳性和脂肪酶阴性分离株的总数的图。

图2C是显示分离的阳性聚生体和分离株的结果的图，其经多次再测试以确认脂肪酶活性。使分离株10和聚生体9和13生长过夜，点样，并使用365nm UV光进行成像。误差棒代表+/-标准误差。

图3示出了来自脂肪酶阳性聚生体的纯分离株的革兰氏染色。脂肪酶阴性分离株均为革兰氏阳性杆菌(左；9.1和13.1)，而所有三个脂肪酶阳性分离株均为革兰氏阴性杆菌(右；9.2、10和13.2)。分离株10和13.2是比分离株9.2更细长的杆菌。

图4A示出了三天内测试的罗丹明B琼脂的代表性图像，以鉴定脂肪酶阳性分离株。包括已知的阴性对照大肠杆菌MC4100。

图4B是显示阳性聚生体和阴性对照的所有纯分离株成员在接种后一天(黑色)、两天(灰色)或三天(白色)测量的直径的图。

图4C是显示阳性分离株每天的荧光光晕的相对大小的图。配色方案如图4B所示。第三天只有一个分离株明显更大。

图4D是表明脂肪酶阴性结果不是由于无法在罗丹明B琼脂上形成菌落的图。脂肪酶阳性分离株为黑色阴影。在图4A-4D中，误差棒代表平均值的+/-标准误差，并且关于阴性对照大肠杆菌MC4100，使用学生t检验计算的*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。

图5示出了原始PET的傅里叶变换红外光谱法(FTIR)分析。根据键的身份描述峰。通过比较羰基峰(1719cm^-1)与苯峰在1409cm^-1处强度来评估降解。

图6A是评估PET上生物膜形成的一系列扫描电子显微镜(SEM)显微图。将PET条在接种有脂肪酶阳性聚生体和分离株的不含碳培养基中孵育，并用SEM成像。显示了聚生体9、13和分离株10对PET塑料的定殖。例如在下图6B中，原始PET(空白)没有显示出粘附或细菌定殖的其他特征。

图6B是一系列SEM显微图，显示出作为生物膜形成的一部分分泌的细胞外聚合物(EPS)沉积物(实心白色箭头)。可以看到个体细菌(“b”，虚线箭头)嵌入到EPS中，这可以给到生物膜其结构完整性。

图6C是两个SEM显微图，其示出了聚生体9和分离株10的菌毛形成，该菌毛可以帮助细菌粘附和生物膜形成。实心白色箭头表示菌毛附着在PET塑料上，而虚线箭头表示细菌之间的菌毛，这有助于细胞与细胞的粘附。

图6D是总结在每个聚生体和分离株10的SEM图像中观察到的生物膜形态的图表。对于菌毛和EPS，(+)表示存在给定结构，(-)表示不存在给定结构。对于粘附性，将每个聚生体和隔离株10从显著粘附(+)至较差但可观察到粘附(+)进行分级。

图7描绘了使用FTIR用于评估PET降解的羰基指数计算。*＝p＜0.05；+＝p＝0.0513；n/s＝不显著。统计人员正在将每个样本与各自的“空白”进行比较。

图8是一系列曲线图，其说明了聚生体细菌在PET和双(2-羟乙基)对苯二酸酯(BHET)上的生长比个体分离株更快。向分离株9.1(苏云金芽孢杆菌菌株C15)、分离株9.2(假单胞菌属物种B10)、分离株9.1和9.2的聚生体(苏云金芽孢杆菌菌株C15和假单胞菌属物种B10)、分离株10(假单胞菌属物种SW136)、分离株13.1(白色芽孢杆菌菌株PFYN01)、分离株13.2(假单胞菌属物种SW136)和所有五个分离株(分离株9.1、9.2、10、13.1和13.2)的完整聚生体提供1mM BHET，UV处理的无定形相PET颗粒或UV处理的结晶消费后PET条作为它们的唯一碳源。使所有聚生体和分离株在LB中生长过夜，并稀释至OD₆₀₀为1，以确保将等量的细菌添加到所有样品中。将培养物在30℃下以200rpm震荡孵育。每隔2周测量一次生长作为OD₆₀₀，并一式三份进行实验。误差棒表示标准误差。

图9A和图9B示出了在50天的时间段内，完整聚生体(分离株9.1、9.2和10、13.1和13.2)比任何个体分离株或其他聚生体降解PET的程度更大。将颗粒状PET(西格玛奥德里奇公司，在25℃下1.68g/mL，熔点：250℃-255℃)用UV照射(250nm)预处理过夜。将个体分离株、聚生体9(分离株9.1和9.2)，聚生体13(分离株13.1和13.2)和完整聚生体(FC；分离株9.1、9.2、10、13.1和13.2)的培养物在LB中生长过夜并稀释至OD₆₀₀为1以确保将等量的细菌添加到每个样品中。将每种过夜培养物的等分试样用1x PBS洗涤(2次)，并将等体积的细菌添加到适当的液体无碳基础培养基(LCFBM)的10mL管中，该培养基中含有0.1g的总PET(起始OD₆₀₀ 0.02)。将样品在30℃下不震荡孵育6周。在相同条件下，将含有UV处理的颗粒状PET的阴性对照在未接种的培养基中保持。图9A描绘了在每对图像的右边指示的每种处理的第0天和第50天定性图像。图9B示出了6周时间段内的体重变化。完整聚生体(FC；最小二乘均值_{完整聚生体}：3.15mg；SD：0.07)处理的颗粒状PET重量损失在统计学上显著大于聚生体9(C9)、聚生体13(C13)和个体分离株(*p＜0.0001)处理的颗粒状PET重量损失。

图10A和图10B描绘了在接种样品中PET降解的物理证据。将由所有五种细菌聚生体分离株(分离株9.1、9.2、10、13.1和13.2)组成的完整聚生体接种到无碳培养基中，该培养基含有消费后的结晶PET。在图10A(特别是在左侧的接种样品的边缘)中可以观察到降解的物理证据。在图10B中，光学显微镜在200X放大率下表明了接种的样品(相对未接种的样品)明显降解。

图11示出了对于非特异性酯酶活性的个体分离株的筛选。将分离株9.1(苏云金芽孢杆菌菌株C15)、9.2(假单胞菌属物种B1)、10(假单胞菌属物种SWI36)、13.1(白色芽孢杆菌菌株PFYN01)和13.2(假单胞菌属物种SWI36)在CaCl₂-吐温20琼脂上生长以筛选酯酶活性。将分离株在26℃下孵育96小时。当除分离株10和13.2以外的所有分离株的酯酶分泌超过菌落生长时，出现沉淀。白色箭头指向分离株9.2观察到的沉淀。

具体实施方式

本披露总体上涉及降解聚合物的方法。该方法可以包括用一种或多种假单胞菌属和/或一种或多种芽孢杆菌属物种孵育或合并该聚合物。本披露还涉及用于降解聚合物的试剂盒。这些试剂盒可以包含一种或多种假单胞菌属和/或一种或多种芽孢杆菌属物种。这些试剂盒还可以包含用于培养该一种或多种假单胞菌属和/或该一种或多种芽孢杆菌属物种的培养箱。此外，本披露涉及细菌组合物，这些细菌组合物包含假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种，用于降解含有聚合物的底物。本披露还涉及脂肪酶阳性细菌分离株、脂肪酶阳性细菌聚生体、具有脂肪酶阳性活性的组合物及其组合，用于降解聚合物或含有聚合物的底物。

将容易理解，如本文总体上描述的实施例是示例性的。各种实施例的以下更详细的描述并非旨在限制本披露的范围，而仅仅代表各种实施例。此外，本领域技术人员可以在不脱离本披露的范围的情况下改变本文披露的方法的步骤或动作的顺序。换句话说，除非实施例的正确操作需要特定的步骤或动作顺序，否则可以修改特定步骤或动作的顺序或使用。

除非另有明确定义，否则如本文所用的技术术语具有其如在本领域中理解的正常含义。出于清楚目的，以下术语用实例特别定义。

如本文所用，除非特别指出，否则“一个和一种(a和an)”表示一个(种)或多个(种)。

如本文所用，“约”是指数量、水平、值、数、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、值、数、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。在结合术语“约”使用的数值的上下文中讨论的任何实施例中，特别地考虑到可以省略术语“约”。

不受任何特定理论的束缚，假设在污染环境中的细菌更可能为了生存而适应利用污染物。因此，从沿着东南部徳克萨斯州的海湾滨海地区和大休斯顿地区内的八个不同地点收集了土壤样品。徳克萨斯州的海湾滨海地区包括多个EPA超级基金站点、石油精炼厂和海滩(例如加尔维斯顿湾)，每天有数百加仑的石油泄漏到其中(参见TresaugueM.2014.Oil spills are a routine occurence:Since the late 90s,Galveston Bayhas averaged 285spills a year.[石油泄漏经常发生：自90年代末，加尔维斯顿湾每年平均发生285起泄漏事件]Houston Chronicle.[休斯顿纪事],Hearst Newspapers[赫斯特报],休斯顿,徳克萨斯州。

在徳克萨斯州休斯敦琼斯路1160号的琼斯路化学羽流超级基金站点收集样品1(徳克萨斯州大休斯顿地区存在11个超级基金站点)。尽管土壤中基于四氯乙烯、石油和类似异链烷烃的合成石油的干洗溶剂的含量很高，但琼斯路超级基金站点目前仍是大型带状商业区和公寓大楼的所在地(参见DePrang E.2007.Superfun with Superfund:A scenictour of Harris County’s 11best toxic attractions.[超级基金的超级乐趣：哈里斯县11个最佳有毒旅游胜地的风景游],The Texas Observer[徳克萨斯观察家],奥斯汀,徳克萨斯州)。在徳克萨斯州休斯敦第5区贝尔街3617号的多方利益超级基金站点收集样本2。这个超级基金站点是大型铸造厂和钢铁制造厂所在地，已有70年的历史，在34％的第5区家庭中有高含量的沉积金属沉积和制造过程中产生的石油副产品(同上)。在红崖路111号的帕萨迪纳精炼系统内的多个位置收集样品3、4和5。帕萨迪纳精炼系统是大型石油和石化工业综合体，占地463英亩，位于休斯敦船舶航道上，毗邻向美国东海岸和美国中部州供应的主要输油管道。帕萨迪纳精炼系统每天处理约106,000桶原油(参见U.S.A.P.2017.Operations:Refining,on Petrobas.[操作：精炼，国家石油公司]http://www_petrobras_com/en/countries/u-s-a/operations/.Accessed 10/21/17)。在入口处的停车场收集样品3，在主要输油管道附近收集样品4，并且在精炼厂综合体的大门外收集样品5。

在徳克萨斯州休斯敦的西部发电站(West Park Power Station)收集样品6，自徳克萨斯州休斯敦的贝尔街发电站的变压器外面的表土收集样品8。这些发电站有很多埋藏的电线；其中大多数涂覆有聚氨酯塑料或石油基绝缘涂层(参见BenjaminK.2016.Insulated Wire,What’s Protecting Your Cable？,on Performance Wire andCable[绝缘电线，什么在保护您的电缆？，关于高性能电线和电缆]https://www_performancewire_com/insulated-wire-protection/)。在徳克萨斯州加尔维斯顿东部海滩(距离海岸线约12码)的海滩表面以下六英寸处收集样本7。从徳克萨斯州东南部的多个地方收集样品，然后运回波特兰，或用于随后在实验室中流转和筛选。

通过在pH 7.4的PBS中浸泡土壤样品，并在旋转振荡器(225rpm，37℃)上振荡来进行细菌分离。使土壤沉淀物沉降，然后将上清液分散在LB琼脂平板上。然后将这些平板在26℃下孵育，以促进环境分离株的生长。从每个土壤样品制成多个平板，以彻底研究每个位置的原生细菌种群。为了筛选尽可能多的分离株，将LB琼脂生长的主平板直接菌落压印在罗丹明B琼脂平板上，使其生长，并使其经受365nm UV光以可视化脂肪酶活性(参见图1)。对于罗丹明B平板，将橄榄油用作长链脂肪酸的来源以检查脂肪酶活性。罗丹明B染料与游离脂肪酸结合(被分泌的脂肪酶裂解)并且当暴露于UV照射时发光(参见图1，右下图)。因此，菌落周围发光的光晕的存在表明脂肪酶活性。将通过压印显示脂肪酶阳性的菌落分离并重新测试，以确认脂肪酶活性并分离纯培养物。在最初的罗丹明B筛选期间出现脂肪酶阳性(或在脂肪酶阳性生物体附近生长)后，总共对192个菌落进行了点测试。

在最初筛选和点测试菌落之间，采用了新的罗丹明B琼脂配制品，该配制品使用10％的染料并显示出增强的敏感性。在图2A中示出了示例性阳性菌落和阴性菌落。在经点测试的192个菌落中，14个菌落呈阳性，并在多轮点样和划线分离后，三个聚生体保持阳性(参见图2B)。通过革兰氏染色，脂肪酶阳性菌落由多个革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌组成。最初为阳性的14个菌落中的十一(11)个在分离过程中失去了脂肪酶阳性，因此退出这项研究。对分离株10和两个聚生体9和13进行多次测试，以确认存在脂肪酶产物(参见图2C)。

接下来，将每个聚生体重复划线以进行分离，并通过连续革兰氏染色进行纯度测试，直到获得纯分离株(参见图3)。最初的革兰氏染色表明培养物被混合，并且划线分离的LB平板上的菌落形态不均匀。因此，进行了分离脂肪酶阳性菌株的尝试。从聚生体9中，纯化出两个分离株，革兰氏阴性杆菌(分离株9.2；保藏为NRRL号B-67633)和革兰氏阳性杆菌(分离株9.1；保藏为NRRL号B-67632)。从聚生体13中，也纯化出两个分离株，革兰氏阴性杆菌(分离株13.2；保藏为NRRL号B-67634)和革兰氏阳性杆菌(分离株13.1；保藏为NRRL号B-67631)。聚生体10通过革兰氏染色最终具有单一形态，这表明聚生体已被纯化成单一分离株(分离株10；保藏为NRRL号B-67630)。在这种情况下，聚生体的其他组成丢失而不是被分离。总体而言，使用主平板进行的罗丹明B筛选允许筛选数千个菌落的脂肪酶阳性，但是任何阳性培养物都可能被混合，必须通过划线以纯化培养物，使用革兰氏染色、光学显微镜和菌落形态来跟踪进展来分离。

关于图4A-4D，纯化的环境分离株的罗丹明B琼脂筛选鉴定出三种脂肪酶阳性细菌菌株。分离每个聚生体(例如，将聚生体9分离成分离株9.1和9.2)，并分别测试脂肪酶活性。在所有情况下，一个分离株呈脂肪酶阳性，而另一个分离株则不是。通过连续划线纯化聚生体10，以分离成一个单一分离株。测试分离株9.2、13.2和10(所有革兰氏阴性杆菌)的脂肪酶活性为阳性，表明它们是在各自的聚生体中能够降解塑料的微生物(参见图4A和图4B)。分离株9.1和13.1呈脂肪酶阴性，因此对于进一步的实验提供的信息更少。先前，已确定罗丹明B测定中荧光光晕的直径与样品中脂肪酶活性的量成线性比例(参见Kouker G等人1987.Appl Environ Microbiol[应用与环境微生物学]53:211-3)。因此，对不仅知道每个分离株是否呈阳性而且知道每个分离株的阳性程度能够提供有用信息。因此，在三天过程内测量并比较光晕直径。第1天和第2天的光晕大小之间没有显著差异。在第三天，分离株9.2的光晕明显比分离株13.2的光晕(p＝0.022)大，并且趋向于比分离株10的光晕(p＝0.11)大，这表明其可能具有更高活性的脂肪酶(参见图4C)。作为对照，采用三天的菌落直径以确保任何阴性结果都不是因为无法在罗丹明B琼脂上生长(参见图4A中的荧光光晕)。脂肪酶阴性分离株似乎比脂肪酶阳性分离株生长更好，而分离株9.1和13.1在LB琼脂上也生长为相对较大的菌落。因此，不受任何特定理论的束缚，该表型可能是分离株9.1和13.1的菌落形成所特有的形态学特征，而不是对罗丹明B琼脂的特异性反应。另外，阴性对照(大肠杆菌MC4100)形成菌落并且通过罗丹明B琼脂测定呈脂肪酶阴性(参见图4A)。这些结果证实，罗丹明B琼脂试验不仅可以用于鉴定脂肪酶阳性和假定的降解塑料的细菌，而且还可以推定高活性脂肪酶。

通过16S rRNA基因测序来鉴定纯分离株。使用直接菌落PCR，使用引物扩增16SrRNA基因的约900bp片段。净化PCR产物，并使用正向和反向引物进行测序，以实现配对末端序列。这有助于确保对用于属鉴定的序列具有100％的置信度，特别是当一个或两个碱基对的变化可能是同一性匹配之间的差异时。使用桑格测序法在ACGT^TM下进行测序，并使用BIOEDIT^TM软件进行比对，以定义配对末端读数之间的核心共有序列。从正向和反向引物获得配对末端读数。然后，将从反向引物获得的序列进行反向互补，并用正向引物测序数据覆盖。核心序列的长度根据测序读数的质量和一致性而变化。一旦确定核心序列后，则将其输入核苷酸

中，将输入的核苷酸序列与国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中的所有已知核苷酸序列进行比较，以找到最佳比对。使用16S测序，大多数微生物都可能在属水平进行鉴定，但由于相关物种之间缺乏序列变异，因此通常无法在物种水平进行鉴定。

所有三个脂肪酶阳性分离株均被鉴定为具有100％同一性的假单胞菌。对从纯分离株的PCR扩增的分离株9.2和分离株10进行测序，而先前已从测序聚生体13中鉴定出分离株13.2。在对分离株9.2和10进行测序之前，还对聚生体9和10进行测序，并且

结果与个体分离株的结果相符。尽管16S测序通常在物种水平的鉴定中不可靠，但重要地是注意到，比对和

结果表明这些分离株是不同的假单胞菌物种，尤其是分离株9.2。尽管

中的所有物种比对均来自假单胞菌属，但它们与在分离株10或聚生体13中被鉴定为可能的多种假单胞菌没有重叠。结合不同的革兰氏染色形态(分离杆10和13.2的短杆菌和矮宽杆均与细长杆菌)和脂肪酶光晕结果(分离株9.2的脂肪酶光晕明显更大，这表明脂肪酶活性更高)，分离株9.2(与分离株13.2相比)可能是独特的假单胞菌属物种。

尽管脂肪酶是最常被鉴定的可降解塑料的酶，但是脂肪酶的存在是暗示性的，而通常不能确定分离株是否能够降解塑料。另外，有许多种塑料不能被所有脂肪酶均匀降解(参见Yoshida S等人2016.Science[科学]351:1196-9)。因此，直接测试这些环境分离株降解塑料的能力非常重要。通过将每个脂肪酶阳性聚生体接种到不含碳培养基中来制备液体培养物。这迫使塑料被用作碳源，而不是培养基中的其他营养物。将低密度聚乙烯(LDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)或PET的无菌预称重塑料条放入每个管中。另外，先前的研究已表明，UV预处理可以更准确地模拟垃圾填埋场和海洋塑料斑块中的环境暴露，可以通过引入脂肪酶可裂解的酯键来增强塑料降解。这些实验用脂肪酶阳性聚生体(聚生体9、10和13)建立。样品必须孵育至少6周(如果不需要更长的时间)，以便观察到任何明显的变化，因此在分离每个聚生体的个体成员之前建立一些实验。在26℃下进行孵育六周。

使用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)以评估PET塑料在键合水平下的分解。捕获原始PET的FTIR光谱，并用每个脂肪酶阳性聚生体来孵育塑料条。图5示出了原始PET的光谱，其中识别出对应于PET固有的各种键的重要峰。通过将羰基峰(1719cm^-1)与光谱中的另一个峰(在这种情况下为1409cm^-1处的峰对应于苯环的弯曲)的相对强度进行比较(以称为羰基指数的比率表示)，来评估塑料的生物降解。

因为羰基键由于短烃链的裂解和释放而丢失，因此羰基指数的降低表明塑料降解。然后这些烃链(如果足够小)能够被细菌吸收并用作碳和能量的来源。计算在有和没有UV预处理的情况下用三个聚生体孵育的PET的羰基指数(表1)。当用聚生体9、聚生体13或分离株10孵育时，未经UV照射的塑料的羰基指数没有降低。对于用UV预处理的PET，所有三个聚生体/分离株均显示出羰基指数降低，这表明已降解(表1)。另外，包含所有三个聚生体/分离株的完整聚生体在所有样品中的羰基指数最低，为3.35，相比空白为4.2，这表明同时使用多种脂肪酶生产者可能对塑料降解一起具有联合作用。总体而言，在UV预处理的样品中羰基指数下降最大，这表明UV处理和微生物的生物降解具有协同作用。

表1：在无碳培养基中孵育6周后，每种UV照射和无UV照射的PET处理条件下的计算的羰基比。

处理条件<sup>1</sup>	平均峰高(1719cm<sup>-1</sup>)	平均峰高(1409cm<sup>-1</sup>)	平均羰基指数
				非UV照射的塑料
原始物<sup>2</sup>	0.1155	0.025	4.62
				空白<sup>3</sup>	0.0512	0.0112	4.8
聚生体9	0.02	0.0037	5.0
				分离株10	0.0474	0.0103	4.6
聚生体13	0.0484	0.0094	6.0
				UV照射的塑料
原始物	0.1632	0.0353	4.63
				空白	0.138	0.0322	4.2
聚生体9	0.0567	0.0146	3.88
				分离株10	0.0409	0.011	3.7
聚生体13	0.0734	0.0197	3.7
				全聚生体	0.1047	0.307	3.35

¹将空白PET条在无碳进行或未进行细菌接种的培养基中孵育。所有实验一式三份进行，但由于FTIR的设备限制，因此对单一点进行分析并反映在该表中。

²将空白PET条在未进行细菌接种的不含碳培养基中孵育。所有实验一式三份进行，但由于FTIR的设备限制，因此仅对单一点进行分析并反映在该表中。

³将空白PET条在未进行细菌接种的不含碳培养基中孵育。

鉴于通过FTIR的降解塑料的证据，通过SEM评估形成生物膜的能力。生物膜是评估降解塑料能力的第一步，也是最重要的步骤之一。生物膜形成对于微生物对塑料的定殖是必需的，并且没有微生物，塑料就无法有效降解。有多种方式可以评估生物膜形成，但通常最严格的方式是通过SEM。SEM允许细菌定殖和生物膜架构的可视化，该生物膜架构包括细胞外聚合物(EPS)沉积物，已证明这些沉积物是生产性生物膜所必需的支架(参见Ritenberg M等人2016.ACS Chem Biol.[ACS化学生物学]11:1265-70)。所有三个脂肪酶阳性聚生体都能够不同程度上在PET上定殖并形成生物膜(参见图6)。聚生体13在PET上具有较少的粘附细胞和较少的EPS沉积物，这表明在塑料上形成生物膜的能力降低(参见图6A和图6B)。聚生体13是唯一没有菌毛证据的聚生体，这表明：1)这些菌毛对于稳健的生物膜形成可能是必需的，以及2)该假单胞菌物种可能缺乏形成这些菌毛所需的基因，从而不允许稳健的生物膜形成(参见图6D)。菌毛允许附着在塑料上，并且在相邻细胞之间粘附(在图6C中分别为实心白色箭头和虚线箭头)，这促进在疏水性塑料表面上的菌落形成。图6D中总结了每个聚生体的生物膜特征。尽管无法像聚生体9和分离株10一样在PET上形成成熟的生物膜，但聚生体13始终具有最低的羰基指数(表1)，这表明形成了足够多的生物膜以进行塑料降解。

通过SEM得到的菌毛的证据，连同鉴定分离株为假单胞菌的测序数据，表明在聚生体9和分离株10中的假单胞菌使用IV型菌毛(TFP)系统(如先前表征的)以铺设生物膜并定殖PET塑料。已确定TFP通常为假单胞菌的唯一菌毛，而实际上大多数革兰氏阴性菌都具有它们(参见Craig L等人2004.Nat Rev Microbiol[自然微生物学综述]2:363-78)。TFP是在许多革兰氏阴性细菌(包括假单胞菌属物种)表面发现的纺锤形纤维细胞器。它们通常通过蹭动参与细菌在固体表面上的运动，以及细菌附着在宿主细胞和细胞外或环境表面上(参见Wall D等人1999.Mol Microbiol[分子生物学]32:1-10)。另外，已证明TFP参与大分子的摄取，如其在将DNA转化成淋病奈瑟氏菌细菌细胞中的作用所证明的(参见Wolfgang M等人1998.Mol Microbiol[分子生物学]29:321-30)。已证明TFP是细菌生物膜形成的主要组成，如TFP敲除铜绿假单胞菌未能在固体表面上建立生物膜的多细胞层所证明的(参见SmythCJ等人1996.FEMS Immunol Med Microbiol[FEMS免疫医学微生物学]16:127-39和Merz AJ等人1999.Mol Microbiol[分子生物学]32:1316-32)。在此，TFP似乎负责放置EPS的岛(如通过SEM观察到的)，并且可以发现细菌嵌入这些基本生物膜中(参见图6B)。

在聚生体13的SEM成像中未观察到菌毛，尽管通过16S测序将其鉴定为假单胞菌。可以解释这是因为并非所有假单胞菌都具有TFP系统。实际上，恶臭假单胞菌(相关物种)缺乏形成功能性菌毛的所有必需的亚基，并且观察到在其表面上没有任何亚基(参见deGroot A等人1994.J Bacteriol[细菌学杂志]176:642-50)。功能性TFP的缺乏可以解释为何包含一个脂肪酶生产者和一个革兰氏阳性杆菌的聚生体13难以定殖PET。如通过SEM所观察到的，附着在PET表面的细菌数量最少，并且EPS产生最少。

通过添加生物表面活性剂来辅助定殖也可以帮助产生初始生物膜。已证明生物表面活性剂通过允许最初的菌落形成和维持生产性成熟生物膜必需的营养通道，从而促进和拮抗生物膜的形成，然后在需要迁移时促进其分解(参见Pamp SJ等人2007.J Bacteriol[细菌学杂志]189:2531-9和Banat IM等人2014.Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学生物技术]98:9915-29)。生物表面活性剂具有增加疏水性表面积的额外益处，不仅有助于细菌的附着，而且在整个降解过程中增强聚合物的溶解性(参见Chang JS等人2004.Environ Toxicol Chem[环境毒性化学]23:2816-22和Santos DK等人2016.Int JMol Sci[国际分子科学杂志]17:401)。合成的生物表面活性剂(例如矿物油)也可以帮助塑料的定殖和降解(参见Gilan(Orr)I.等人2004.Applied Microbiology andBiotechnology[应用微生物学与生物技术]65:97-104)。

表面活性剂是在固体、液体和气体之间的界面处降低表面和界面张力的化合物，以使此类化合物混合和分散(参见参考文献1)。大多数合成表面活性剂是石油基的，通常是不可生物降解的并且对环境有害。然而，以证明合成表面活性剂矿物油通过赤红球菌促进聚乙烯塑料的微生物降解(参见参考文献2)。生物表面活性剂是由多种细菌生物体合成和分泌的低分子量(＜10kDa)糖脂和脂肽化合物。生物表面活性剂显著降低烃类化合物的界面表面张力，这有助于细菌定殖和降解(参见参考文献3和4)。生物表面活性剂是细菌自然产生的，但已证明在某些压力条件下会诱导或增加它们的产生。例如，当与正构烷烃烃类一起孵育时，红平红球菌DSM43215会产生大量海藻糖脂(参见参考文献3)。下表2中提供了可以由某些细菌产生的示例性生物表面活性剂。

表2：基于其产生生物体和化学性质的相关生物表面活性剂

生物表面活性剂参考文献

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以上提到的生物表面活性剂参考文献(参考文献1-18)中的每篇的内容均通过引用以其全文特此并入。

已证明用UV照射对塑料进行预处理通过自由基形成和将酯键引入塑料聚合物的烃主链中来增强塑料的生物降解(参见Singh BS等人2008.Polymer Degradation andStability[聚合物降解与稳定性]93:561-584)。本文尝试进行三十分钟的UV预处理，但可能需要更长的时间。尽管30分钟在细胞存活研究的范围之内，但一些生物降解研究已将塑料聚合物暴露在365nM的UV下长达八周(参见Lee B等人1991.Appl Environ Microbiol[应用与环境微生物学]57:678-85和Yousif E等人2013.Photodegradation andphotostabilization of polymers,especially polystyrene:review.Springerplus[聚合物，尤其是聚苯乙烯的光降解和光稳定作用：Springerplus综述]2:398)。尽管如此，但在本研究中，经过30分钟的UV预处理的PET样品中的羰基指数下降的百分数比未经UV预处理的PET样品中的羰基指数下降的百分数更多。第二个因素是缩短了孵育时间。这项研究的孵育时间是六周，但一些塑料降解研究尤其在评估重量减轻时进行了六个月或更长时间(参见Gomez EMJ,F.2013.Polymer Degradation and Stability[聚合物降解与稳定性]98:2583-2591和Kyaw BM等人2012.Indian J Microbiol[印度微生物学杂志]52:411-9)。

有机催化剂或生物催化剂可以用于引发或促进PET的分解，并且还可以用于开发通过聚生体细菌进行有效的生物降解的技术，例如糖酵解、甲醇分解和水解反应。可以使用阳光和物理磨损，尽管这类方法可能会产生可被土壤细菌降解的微塑料(例如，小于5mm)，尽管这种降解会在数年内缓慢进行。然而，这些塑料微粒会对野生生物、生态系统并最终对人类健康造成危害。

有机催化剂或生物催化剂，例如1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)可以诱导PET的糖酵解，从而产生BHET。BHET可以在三周内被细菌的完整聚生体完全降解。1H核磁共振可用于评估解聚效率。有机催化剂或生物催化剂具有以下优点：不需要将重金属引入系统中，不需要高温来催化糖酵解或其他分解机理，并且它们可以再生。在一些实施例中，可用于引发PET的生物降解以形成更具有可生物利用性的化合物BHET的有机催化剂或生物催化剂可以选自1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD))(参见Fukushima等人2001.Journal of Polymer Science[聚合物科学期刊]A部分:Polymer Chemistry[聚合物化学],49(5):1273-1281)、N-杂环卡宾(参见Kamber等人2010.J.Chem.Educ.[化学教育期刊]87,5,519-521)等。

PET的解聚以形成BHET的其他参考文献：

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聚生体成员产生脂肪酶和酯酶活性。脂肪酶作用在疏水表面，而酯酶在PET聚合物末端的亲水界面处切割酯键(参见Chahiniana和Sarda 2009.Protein Peptide Letters[蛋白肽快报]16(10):1149-61)。通过将分离株铺板到含有CaCl₂-吐温20的固体培养基上并筛选钙盐沉淀来鉴定非特异性酯酶活性。分离株9.1、9.2和13.1均表现出分泌的酯酶活性(参见图11)。先前，已证明芽孢杆菌属物种的羧酸酯酶部分水解PET聚合物(参见Wei和Zimmermann 2017.Microbial Biotechnology[微生物与生物技术]10(6):1308-1322)。因此，脂肪酶和酯酶都可用于降解消费后的PET塑料。

酯酶参考文献

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Ren Wei and Wolfgang Zimmermann.Microbial enzymes for the recyclingof recalcitrant petroleum-based plastics:how far are we？MicrobialBiotechnology,10(6):1308-1322,March 2017.

在一些实施例中，可以组合具有不同优势的多种细菌物种，这些细菌物种可以协同作用以增强、改善和/或最大化聚合物降解。例如，本文提供的数据表明，聚生体13(分离株13.2)中的假单胞菌是强大的塑料降解剂，但是与聚生体9和分离株10相比，其形成健康且成熟的生物膜的能力似乎较小(参见图6B)。这可能会限制其降解塑料的能力并最大化其全部塑料降解潜力。然而，将分离株13.2与能够强健生物膜形成的另一种物种(例如聚生体9中的假单胞菌)一起孵育，可能允许形成可由分离株13.2利用的复合生物膜，或许能增强塑料降解的潜力。

在一些实施例中，生物强化方法可以包括在封闭的无碳系统内生长细菌的塑料降解聚生体。使细菌在无碳系统中生长可以确保细菌利用并降解引入到系统中的塑料废物(例如，作为碳源)。可以在细菌降解之前进行塑料的预处理，以使惰性塑料或聚合物更易于细菌降解。首先，可以对塑料废料进行一次或多次UV预处理，以将官能团引入惰性聚合物主链，该官能团更容易被细菌脂肪酶识别和裂解。在进行一次或多次UV预处理之后进行机械研磨或分解塑料废料(例如，分解成较小的碎片)，这可以产生增加的细菌定殖的表面积。然后可以将塑料废料送入封闭的系统中以使其降解。在某些实施例中，该过程的终产物可以包括细菌生物质和二氧化碳。生物质可以用作肥料。通过将固碳细菌引入到系统中可以抵消二氧化碳的产生。可替代地，可以通过将系统安排在植物丰富的区域中来抵消二氧化碳的产生。

本披露的第一方面涉及降解聚合物的方法。该方法可以包括用一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种孵育该聚合物。

在一些实施例中，该一种或多种假单胞菌可以是假单胞菌属物种SWI36和/或假单胞菌属物种B10。例如，该一种或多种假单胞菌可以选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10、和/或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。在某些实施例中，芽孢杆菌属物种可以是苏云金芽孢杆菌菌株C15和/或白色芽孢杆菌菌株PFYN01。例如，该一种或多种芽孢杆菌属物种可以选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1和/或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。NRRL是指农业研究服务(ARS)培养物保藏中心。

该聚合物可以选自PET、HDPE、LDPE、和/或聚丙烯(PP)中的至少一种。在一些实施例中，该聚合物可以是PET。在某些实施例中，该聚合物可以是HDPE。在不同实施例中，该聚合物可以是LDPE。在另外的实施例中，该聚合物可以是PP。

可以将聚合物和一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种在液体无碳基础培养基(LCFBM)中孵育。在一些实施例中，降解聚合物的方法可以把控将该聚合物暴露于UV照射。例如，可以在用一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种孵育该聚合物前，将聚合物暴露于UV照射。可以将该聚合物暴露于UV照射持续约15分钟至约10小时、约30分钟至约5小时、约1小时至约3小时、或另一合适的时间段。

在某些实施例中，该方法可以进一步包括用生物表面活性剂孵育聚合物和一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种。在不同实施例中，生物表面活性剂可以由一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种产生。在一些实施例中，可以将生物表面活性剂添加到孵育中。生物表面活性剂可以选自矿物油、海藻糖脂(例如，海藻糖二霉菌酸酯，海藻糖二白喉菌酸酯等)、鼠李糖脂、槐糖脂、肽脂、粘液菌素、表面活性素、沙雷湿润素、节杆菌纤维型肌动蛋白、枯草杆菌蛋白酶、鸟氨酸脂、乳化剂、生物分散剂、甲壳素中的至少一种，和/或另一种合适的生物表面活性剂。

在某些实施例中，该方法可以进一步包括用有机催化剂或生物催化剂孵育聚合物和一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种。在一些实施例中，可以将有机催化剂或生物催化剂添加到孵育中。有机催化剂或生物催化剂可以选自1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(TBD)、N-杂环卡宾中的至少一种，和/或另一种合适的有机催化剂或生物催化剂。

该方法可以进一步包括破碎、切割、分解和/或研磨聚合物。例如，可以在用一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种孵育该聚合物前，将聚合物研磨。

本披露的另一方面涉及用于降解聚合物的试剂盒。该试剂盒可以包含一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种。该试剂盒还可以包括用于培养一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种的培养箱。该一种或多种假单胞菌可以是假单胞菌属物种SWI36和/或假单胞菌属物种B10。例如，该一种或多种假单胞菌可以选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10、和/或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。在某些实施例中，芽孢杆菌属物种可以是苏云金芽孢杆菌菌株C15和/或白色芽孢杆菌菌株PFYN01。例如，该芽孢杆菌属物种可以选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1和/或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。

本披露的另一方面涉及用于降解含有聚合物的底物的方法。该方法可以包括获得含有聚合物的底物(例如，PET底物、HDPE底物、LDPE底物、和/或PP底物)。在一些实施例中，该方法可以包括破碎、切割、分解和/或研磨含有聚合物的底物的至少一部分。例如，该方法可以包括机械破碎、切割、分解和/或研磨含有聚合物的底物的至少一部分。在某些实施例中，该方法可以包括使含有聚合物的底物经受UV照射。在不同实施例中，该方法可以包括用一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种孵育含有聚合物的底物。

本披露的另一方面涉及用于降解含有聚合物的底物的组合物，其中该组合物可以包含如上所述的一种或多种假单胞菌属和/或芽孢杆菌属物种。

本披露的另一方面涉及用于降解含有聚合物的底物的组合物，其中该组合物可以包含一种或多种假单胞菌，其中该一种或多种假单胞菌可以选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10、和/或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。

本披露的又一方面涉及用于降解含有聚合物的底物的组合物，其中该组合物可以包含芽孢杆菌属物种，其中该芽孢杆菌属物种可以选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1和/或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。

实例

以下实例说明了所披露的方法和组合物。根据本披露，本领域技术人员将认识到，无需进行多度实验，这些实例以及所披露的方法和组合物的其他实例的变化将是可能的。

实例1-土壤样品收集

从徳克萨斯州东南部的八个不同地点收集了土壤样品(500g)。在徳克萨斯州休斯敦琼斯路1160号的琼斯路化学羽流超级基金站点收集样品1。在徳克萨斯州休斯顿第5区的贝尔街铸造厂超级基金站点收集样品2。在红崖路111号的帕萨迪纳精炼系统大门外收集样品3。在徳克萨斯州帕萨迪纳红崖路市111号帕萨迪纳精炼系统的停车场收集样品4。在帕萨迪纳精炼系统的主要输气管道附近收集样品5。在徳克萨斯州休斯敦的贝尔街发电站收集样品6。在徳克萨斯州加尔维斯顿东部海滩(距离海岸线约12码)的表面以下六英寸处收集样本7。自徳克萨斯州休斯顿的西部发电站的变压器外面的表层土收集样品8。在表土层以下约六英寸处收集所有样品，并在运输至波特兰之前立即冷藏，或者放入密封的可重新密封的带拉链存储袋中。

实例2-从土壤中提取细菌

将每个土壤样品(2g)重悬于按如下相应制备的9mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中：每1升diH₂O:8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、和0.24g KH₂PO₄，使用pH计调节至pH 7.4，并在15psi、121℃下高压灭菌20分钟。将土壤和PBS悬浮液置于旋转振荡器(250rpm)上24小时。使沉淀物沉降，然后将100μL的此悬浮液分散在按如下相应制备的LB琼脂平板上：每1升diH₂O:10g胰蛋白胨、5g酵母、5g NaCl、18g琼脂，使用pH计调节至pH 7，并在15psi、121℃下高压灭菌。将平板倒置并在26℃下孵育24小时。

实例3-罗丹明蓝琼脂

制备罗丹明蓝琼脂平板以测试分离的细菌菌落的脂肪酶活性。按如下相应制备罗丹明琼脂平板：每1升:950mL diH₂O、4.5g营养液体培养基粉、1.25g酵母提取物和10g琼脂。对于脂肪乳剂培养基，将250μL

80添加到50mL diH₂O中并在搅拌器中乳化。将橄榄油(30mL)添加到类脂乳剂中并混合直至乳化。使用pH计将最终的类脂乳剂调节至pH 7。将基础培养基和类脂乳剂分别高压灭菌。高压灭菌后，将20mL的罗丹明蓝(50mg至50mLdiH₂O，并过滤消毒)添加到无菌无菌类脂乳剂中。然后将无菌类脂乳剂(50mL)添加到基础营养培养基中，使其最终体积为1L，并充分混合。如先前所述(Kouker G等人1987.ApplEnviron Microbiol[应用与环境微生物学]53:211-3)将平板倒入12mL体积。当暴露于350-400nm的UV灯时，罗丹明蓝平板上产生脂肪酶的菌落发出荧光。橄榄油是脂肪酶特异性长链脂肪酸，编码脂肪酶的细菌可以将其用作碳源(参见Lanka SL等人2015.InternationalJournal of Biological Chemistry[国际生物化学杂志]9:207-219)。脂肪酸的水解和释放与染料罗丹明B结合，这导致在365nm UV照射暴露下出现荧光光晕。

实例4-脂肪酶筛选

通过菌落转移测定，从LB分散平板转移到罗丹明蓝琼脂平板，来筛选含有100μL液体培养物的细菌LB琼脂分散平板的脂解活性。菌落转移测定涉及具有培养皿尺寸的大陶瓷杵。无菌毡附在杵的末端，可将一组细菌菌落压印到另一块平板上。将罗丹明蓝平板倒置并在26℃下孵育24小时。然后用UV透射仪在365nm处测定脂肪酶活性。大肠杆菌MC4100用作阴性对照。将表现出发光的荧光光晕的菌落和生长区域进行标记，并将其重新划线到单独的LB平板上进行分离和纯化。对八个土壤样品进行多次筛选，以筛选具有脂解活性的任何微生物。在所有这些实验中均使用此测定法，以确保分离的菌株保持脂肪酶阳性，特别是在尝试纯化混合培养物期间。

实例5-纯化培养物

使三个细菌聚生体的过夜培养物生长，并在LB上使用象限划线法连续重新划线直到获得纯培养物。使用革兰氏染色来帮助确认细菌菌株的纯度并证实16S PCR结果。

实例6-革兰氏染色

将液体培养物的一个无菌环(OD₆₀₀＝1.0)分散在无菌载玻片上并火焰固定。将载玻片用结晶紫浸没一分钟，用diH2O洗涤五秒，用革兰氏碘浸没一分钟，用diH2O浸没五秒，用95％EtOH浸没十秒，再用番红浸没一分钟，然后用diH2O冲洗并用吸水纸吸干。使用1000×放大率将载玻片可视化。使用KEYENCE^TMBZ-X700倒置荧光和彩色显微镜捕获图像。

实例7-补充有塑料的LCFBM

按以下相应地制备不含碳基础培养基：每1L diH₂O:0.7g KH₂PO₄、0.7g K₂HPO₄、1.0g NH₄NO₃和0.005g NaCl。制备了不含碳基础培养基，以确保添加的塑料条将是孵育期间细菌可获得的唯一碳源。分别制备了1M的必需金属储备溶液。在100mL无菌H₂O中：7g MgSO₄*7H₂O、20mg Fe₂SO₄*7H₂O、20mg ZnSO₄*7H₂O、和9mg MnSO₄*H₂O。将该1M溶液搅拌四小时，将10mL进行过滤器灭菌，并添加至1L高压灭菌的液体基础培养基中。将LDPE、HDPE和PET样品切成2.5cm×0.5cm的条。将条在70％EtOH中灭菌，然后悬挂在生物安全柜中干燥。

使三个脂肪酶阳性聚生体的培养物在LB中生长过夜，并稀释至OD₆₀₀为1。这种稀释确保了将等量的细菌添加到每个样品中。对于单一点LCFBM孵育，将10μL过夜培养物添加到每个4mL的LCFBM管中。将预先称重并灭菌的塑料条添加到每个管中(每管1种)。将样品在旋转振荡器(26℃，125rpm)上孵育三个月。由于蒸发，每月向样品补充无菌LCFBM。

在该实验后，在两种处理条件下建立另一组LCFBM培养物：1)UV预处理，和2)未经UV预处理。在灭菌和接种前，将经UV处理的HDPE、LDPE和PET条(2.5cm×0.5cm)暴露于365nmUV下30分钟。在添加到测试管前，将未经UV处理的条也用EtOH灭菌。包括未经UV处理以测试UV预处理是否导致更大的降解。每个测试管中填充8mL LCFBM，并接种50μL过夜培养物(OD₆₀₀)。一式三份设置试管并在26℃下静置孵育。不受任何特定理论的束缚，此举旨在增加生物膜的形成。这些孵化持续约六周。

实例8-16S rRNA基因PCR和DNA测序

使用表现出脂肪酶活性的三种分离的菌株进行直接菌落PCR。使用通用16S引物(表3)和定制的热循环程序(表4)进行PCR，并且使产物在1.2％琼脂糖凝胶中在110mV运行的TAE缓冲液中成像30分钟。

表3：通用16S引物对

F<sup>1</sup>	A18	5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3’(SEQ ID NO:1)	55℃<sup>2</sup>
				F	A19	5’-GTGCCSGCMGCCGCGGTAA-3’<sup>3</sup>(SEQ ID NO:2)	55℃
R	S17	5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’(SEQ ID NO:3)	55℃
				R	S20	5’-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’(SEQ ID NO:4)	55℃

¹引物对：SDBact0338aA18(Fwd)/SDBact1525aS17(Rvs)和SDBact0515aA19(Fwd)/SDBact1525aS17(Rev)(参见Kroes IL等人1999.PNAS 96)。

²建议的退火温度(同上)

³根据IUPAC核苷酸歧义性代码，S表示强氢键(G或C)，M表示C或A。

表4：用于16S rRNA基因扩增的热循环程序

步骤	℃	时间
			1.热启动	95	30秒
2.变性	95	30秒
			3.退火	54	30秒
4.延伸	68	2分钟
			5.跳至步骤2
6.最终延伸	72	5分钟

使用具有GLASSMILK^TM技术的

试剂盒净化PCR产物。简而言之，将每个样品在GLASSMILK^TMNaI溶液中以1:4稀释，然后涡旋并以12000rpm离心30秒。弃去上清液，并将沉淀洗涤并再沉淀两次。最终将沉淀重悬于5μL无菌水中。将每个样品以1:1稀释，并使用NANODROP^TM仪器确定浓度。

使用

试剂盒净化PCR后，将每个样品稀释至1-2ng/μl，并送至ACGT^TM使用正向和反向引物进行桑格测序，以获取每个分离株的配对末端测序数据。

实例9-基于16S rDNA测序数据的属鉴定

在ACGT^TM测序后，在比对之前，使用BIOEDIT^TM7.2.5生物序列比对编辑器将序列彼此比对，检查色谱图以确保质量序列，并由于测序伪影去除每个序列的前约25-30个核苷酸。然后将反向引物序列反向互补，并使用带有滑动末端的双序列比对将两个序列(正向和修饰的反向)彼此比对。手动插入空位，直到实现最大比对。没有观察到嵌合序列。仅使用具有100％一致性(150-764个核苷酸)的核心序列来确定属同一性。使用核苷酸

(BLASTn)进行属鉴定，并且仅对100％匹配的那些设置一致性截止值。由于这些引物靶向的16S rRNA基因的保守性质，因此采用100％同一性度量。16S rRNA基因的这些保守区域可以容许极少的碱基对变化，因此单一碱基对可能是两个属之间的差异。另外，由于有限的序列输入，短序列比对需要更高的截止值。

实例10-IR光谱

将塑料PET条浸没在30mL 2％SDS的diH2O中，并置于旋转振荡器上两小时(225rpm，37℃)以去除生物膜。然后将样品风干，并通过ATR-FTIR固体红外光谱法进行可视化，以评估塑料降解的迹象。由于塑料降解，在聚合物主链中会产生其他酯键和羧基键。这些基团的出现或改变引起在1719cm^-1和1409cm^-1处的吸光度强度变化，并且这些变化可通过计算羰基指数比率来测量。通过找到在1719cm^-1和1409cm^-1处的吸光度高度，然后除以1719/1409，来计算该羰基比。峰的比率可以定量比较IR光谱的变化，因为比率说明了样品在IR中的差异(例如，样品厚度)。另外，通过光氧化而缩短的烃链的羧化标记了准备进入β-氧化循环的烃链。指示降解的聚合物键的这些变化可以通过比较原始塑料片和经接种塑料片的羰基指数来测量。低羰基指数以及其他羰基和OH峰的出现可用于确定细菌是否正在将塑料主动转化为β-氧化循环或TCA循环的前体。

实例11-扫描电子显微图

将塑料样品浸泡在2％磷酸盐缓冲的戊二醛中以进行细胞固定。对于固定后，将样品浸入2％的四氧化锇的冰浴中三小时。然后将样品各自在分级EtOH(50％、75％和100％)浴中脱水15分钟，然后用CO₂进行临界点干燥。使用金溅射镀膜仪(LEICA^TMACE600镀膜仪)对干燥后的样品进行镀膜，并在电子束强度为2kV下操作的扫描电子显微镜仪器(FEI HELIOSNANOLAB^TM660DUALBEAM^TM显微镜)上进行可视化。

实例12-使用FTIR评估PET降解的羰基指数计算

使用在1720cm^-1处的酯羰基峰除以对应于在1409cm^-1处苯的C-H拉伸的峰来计算羰基指数(参见图7)。每个条件一式三份进行，每列代表平均值的平均数±标准误差。单独孵育的PET没有显著降解。当用分离的聚生体孵育时，经UV预处理的PET表现出显著降解，但对照的大肠杆菌则没有。*＝p＜0.05；+＝p＝0.058；n/s＝不显著。

对于以上每个实例，通过学生t检验比较以生物学一式三份或更多次进行的研究，并使用＜0.05的p值来确定显著性。

实例13-细菌聚生体和分离株中物种的鉴定

为了鉴定细菌聚生体和分离株中的细菌物种，对所有五个分离株(分离株9.1、9.2、10、13.1和13.2)进行16S rRNA基因测序。使细菌在溶菌肉汤中在26℃下生长过夜。使用GenEluteTM细菌基因组DNA试剂盒(密理博西格玛公司(MilliporeSigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))提取DNA。对于在OSU基因组研究和生物计算中心进行的文库制备，按照制造商的说明，使用依诺米那公司的NexteraXT DNA样品制备型试剂盒(依诺米那公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)。在依诺米那公司MiSeq仪器上进行测序，其中在微型流通池上运行类型为150bp的配对末端片段。使用FastQC(v0.11.5，1)和Trimmomatic(v0.36，2)评估Q30质量标准(LEADING:3TRAILING:3HEADCROP:10SLIDINGWINDOW:4:30MINLEN:36)的序列片段的质量。然后使用SPAdes(v3.13.0，3)与配对末端读数和高质量单例组装高质量序列片段(每个样品的读数平均值为1,652,364)。使用Quast(v5)分析质量和基因组度量。初稿基因组的大小范围从5,261,475至6,456,746bps，而芽孢杆菌初稿基因组的GC％含量为34.9，假单胞菌初稿基因组的GC％含量为61.5。使用PROKKA(v1.13.3，5)注释组装。16S rRNA基因的近亲如下：分离株9.1菌株苏云金芽孢杆菌菌株C15(100％覆盖/100％同一性)、分离株9.2假单胞菌属物种B10(100％覆盖/99％同一性)、分离株10假单胞菌属物种SWI36(100％覆盖/100％同一性)、分离株13.1白色芽孢杆菌菌株PFYN01(100％覆盖/100％同一性)和分离株13.2假单胞菌属物种SWI36(100％覆盖/100％同一性)。

实例14-在PET和BHET上聚生体细菌和个体分离株生长以及脂肪酶产生的比较

为了确定细菌能够在PET和BHET上生长的程度，接种个体分离株和聚生体细菌，如图8中所示。在56天时间段内进行光密度测量。始终观察到，聚生体细菌的倍增时间和生长产率均比个体分离株低。对于在无碳培养基中用作唯一碳源的所有三种塑料产品都观察到了这一点。含有完整聚生体(9.1、9.2、10、13.1和13.2)的培养物在结晶PET、无定形PET和BHET上的倍增时间分别为4.15、2.63和1.16天。另外，在不含其他聚生体成员(即假单胞菌分离株9.2)的情况下，芽孢杆菌属分离株9.1不能在无定形或结晶PET上生长。芽孢杆菌属分离株9.1不能单独降解PET，并且很可能缺乏最初将PET降解为可代谢产物所必需的酶促能力、脂肪酶和/或酯酶。

因为在塑料上聚生体比个体分离株生长更健壮，所以预测，聚生体细菌比单一分离株产生更多的脂肪酶活性。的确，已观察到，由分离株9.1和9.2组成的聚生体9在罗丹明B平板上的光晕与生长比率比个体分离株9.2和10更大(表5)。

表5.聚生体9和个体分离株的脂肪酶生产与菌落生长的比率。

在以PET为唯一碳源的培养物中，用PET塑料擦拭苏云金芽孢杆菌菌株C15与假单胞菌属物种B10(聚生体9：分离株9.1和分离株9.2)、单独的假单胞菌属物种B10(分离株9.2)和单独的假单胞菌属物种SWI36(分离株10或分离株13.2)，然后接种到罗丹明B平板上(n＝5)。48小时后，测量每种分离株的生长和相应的光晕直径。在ImageJ中通过每个光晕的柱平均图对直径进行量化，并将光晕与生长的比率与单独的两个假单胞菌进行比较。作为对照，通过标准平板计数，将大约等量(约200CFU/ml)的苏云金芽孢杆菌菌株C15和假单胞菌属物种B10(构成聚生体9)在室温下孵育8周后，轻轻涡旋，然后从PET塑料中释放出来。使用PET作为唯一碳源，单独的苏云金芽孢杆菌菌株C15(分离株9.1)无法生长。

实例15-PET的聚生体细菌和个体分离株降解的比较

进行进一步的实验以确定与个体分离株相比，聚生体细菌是否能够更好地降解塑料。在50天时间段内，将颗粒状PET在不含碳培养基中用细菌孵育。观察到，在孵育期间，包含所有5种分离株(分离株9.1、9.2、10、13.1和13.2)的完整聚生体将100mg颗粒状PET沉淀减少了3mg，减少了3％，这比其他个体和聚生体分离株中任一种减少的都多(参见图9A和图9B)。如图10A和图10B中所示，观察到PET降解的物理证据。

实例16-个体分离株酯酶活性的比较

进行进一步的实验以确定哪些分离株具有非特异性酯酶活性。将分离株9.1(苏云金芽孢杆菌菌株C15)、9.2(假单胞菌属物种B1)、10(假单胞菌属物种SWI36)、13.1(白色芽孢杆菌菌株PFYN01)和13.2(假单胞菌属物种SWI36)在CaCl₂-吐温20琼脂上生长以筛选酯酶活性。将分离株在26℃下孵育96小时。分离株9.1、9.2和13.1均表现出分泌的酯酶活性。当除分离株10和13.2以外的所有分离株的酯酶分泌超过菌落生长时，出现沉淀。白色箭头指向分离株9.2观察到的沉淀(参见图11)。

对于本领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的基本原则的情况下，可以对上述实施例的细节进行许多改变。因此，本发明的范围仅由如下权利要求书决定。

Claims

1.一种降解聚合物的方法，该方法包括用一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种孵育该聚合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，该一种或多种假单胞菌是假单胞菌属物种SWI36或假单胞菌属物种B10。

3.如权利要求1所述的方法，其中，该一种或多种假单胞菌选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10、或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。

4.如权利要求1所述的方法，其中，该芽孢杆菌属物种是苏云金芽孢杆菌菌株C15或白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

5.如权利要求1所述的方法，其中，该芽孢杆菌属物种选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，该聚合物选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、或聚丙烯(PP)中的至少一种。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，该聚合物是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，将该聚合物和该一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种在液体无碳基础培养基(LCFBM)中孵育。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

将该聚合物暴露于紫外线(UV)照射。

10.如权利要求9所述的方法，其中，在用该一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种孵育该聚合物前，将该聚合物暴露于UV照射。

11.如权利要求9或权利要求10所述的方法，其中，将该聚合物暴露于UV照射持续约15分钟至约10小时、约30分钟至约5小时、或约1小时至约3小时。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，该方法进一步包括：用生物表面活性剂和/或生物催化剂孵育该聚合物和该一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种。

13.如权利要求12所述的方法，其中，该生物表面活性剂选自矿物油、海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、肽脂、粘液菌素、表面活性素、沙雷湿润素、节杆菌纤维型肌动蛋白、枯草杆菌蛋白酶、鸟氨酸脂、乳化剂、生物分散剂、或甲壳素中的至少一种。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，该方法进一步包括研磨该聚合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中，在用该一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种孵育该聚合物前，将该聚合物研磨。

16.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法，该方法包括：

用一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种接种培养基；并且

向该经接种的培养基中添加PET。

17.如权利要求16所述的方法，其中，该一种或多种假单胞菌是假单胞菌属物种SWI36或假单胞菌属物种B10。

18.如权利要求16所述的方法，其中，该一种或多种假单胞菌选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10、或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。

19.如权利要求16所述的方法，其中，该芽孢杆菌属物种是苏云金芽孢杆菌菌株C15或白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

20.如权利要求16所述的方法，其中，该芽孢杆菌属物种选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。

21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中，该培养基是液体无碳基础培养基(LCFBM)。

22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

将该PET暴露于紫外线(UV)照射。

23.如权利要求22所述的方法，其中，在向经接种的培养基中添加该PET前，将该PET暴露于UV照射。

24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中，将该PET暴露于UV照射持续约15分钟至约10小时、约30分钟至约5小时、或约1小时至约3小时。

25.如权利要求16-24中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该经接种的培养基中添加生物表面活性剂和/或生物催化剂。

26.如权利要求25所述的方法，其中，该生物表面活性剂选自矿物油、海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、肽脂、粘液菌素、表面活性素、沙雷湿润素、节杆菌纤维型肌动蛋白、枯草杆菌蛋白酶、鸟氨酸脂、乳化剂、生物分散剂、或甲壳素中的至少一种。

27.如权利要求16-26中任一项所述的方法，该方法进一步包括研磨该PET的一部分。

28.如权利要求27所述的方法，其中，在向经接种的培养基中添加PET前，将该PET研磨。

29.一种用于降解聚合物的试剂盒，该试剂盒包含：

一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种。

30.如权利要求29所述的试剂盒，其中，该一种或多种假单胞菌是假单胞菌属物种SWI36或假单胞菌属物种B10。

31.如权利要求29所述的试剂盒，其中，该一种或多种假单胞菌选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10、或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。

32.如权利要求29所述的试剂盒，其中，该芽孢杆菌属物种是苏云金芽孢杆菌或白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

33.如权利要求29所述的试剂盒，其中，该芽孢杆菌属物种选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。

34.如权利要求29所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含：

用于培养该一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种的培养箱。

35.如权利要求29所述的试剂盒，其中，该一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种为脂肪酶阳性和/或酯酶阳性。

36.一种用于降解含有聚合物的底物的方法，该方法包括：

获得含有聚合物的底物；

机械分解该含有聚合物的底物的至少一部分；

使该含有聚合物的底物经受紫外线(UV)照射；以及

用一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种孵育该含有聚合物的底物。

37.一种用于降解含有聚合物的底物的组合物，该组合物包含一种或多种假单胞菌属或芽孢杆菌属物种，

其中该一种或多种假单胞菌是假单胞菌属物种SWI36或假单胞菌属物种B10；并且

其中该一种或多种芽孢杆菌属物种是苏云金芽孢杆菌菌株C15或白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

38.一种用于降解含有聚合物的底物的组合物，该组合物包含一种或多种假单胞菌，

其中该一种或多种假单胞菌选自保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2、保藏为NRRL号B-67630的分离株10，或保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2中的至少一种。

39.一种用于降解含有聚合物的底物的组合物，该组合物包含一种或多种芽孢杆菌属物种，

其中该一种或多种芽孢杆菌属物种选自保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1或保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1中的至少一种。

40.如权利要求37-39中任一项所述的组合物，其中，该组合物为脂肪酶阳性和/或酯酶阳性。

41.一种降解聚合物的方法，该方法包括用细菌聚生体孵育该聚合物，该细菌聚生体包含：

保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1；以及

保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2。

42.如权利要求41所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67630的分离株10。

43.如权利要求42所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1和保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2。

44.一种降解聚合物的方法，该方法包括用细菌聚生体孵育该聚合物，该细菌聚生体包含：

苏云金芽孢杆菌菌株C15；以及

假单胞菌属物种B10。

45.如权利要求44所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含假单胞菌属物种SWI36。

46.如权利要求45所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

47.一种降解聚合物的方法，该方法包括用细菌聚生体孵育该聚合物，该细菌聚生体包含：

一种或多种假单胞菌属物种；

一种或多种苏云金芽孢杆菌；以及

一种或多种白色芽孢杆菌。

48.如权利要求41-47中任一项所述的方法，其中，该聚合物选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)、或聚丙烯(PP)中的至少一种。

49.如权利要求41-47中任一项所述的方法，其中，该聚合物是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。

50.如权利要求41-47中任一项所述的方法，其中，将该聚合物和细菌聚生体在液体无碳基础培养基(LCFBM)中孵育。

51.如权利要求41-50中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

将该聚合物暴露于紫外线(UV)照射。

52.如权利要求51所述的方法，其中，在用该细菌聚生体孵育该聚合物前，将该聚合物暴露于UV照射。

53.如权利要求51或权利要求52所述的方法，其中，将该聚合物暴露于UV照射持续约15分钟至约10小时、约30分钟至约5小时、或约1小时至约3小时。

54.如权利要求41-53中任一项所述的方法，该方法进一步包括用生物表面活性剂和/或生物催化剂孵育该聚合物和该细菌聚生体。

55.如权利要求54所述的方法，其中，该生物表面活性剂选自矿物油、海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、肽脂、粘液菌素、表面活性素、沙雷湿润素、节杆菌纤维型肌动蛋白、枯草杆菌蛋白酶、鸟氨酸脂、乳化剂、生物分散剂、或甲壳素中的至少一种。

56.如权利要求41-55中任一项所述的方法，该方法进一步包括研磨该聚合物。

57.如权利要求56所述的方法，其中，在用该细菌聚生体孵育该聚合物前，将该聚合物研磨。

58.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法，该方法包括：

用细菌聚生体接种该培养基，该细菌聚生体包含：

保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1；以及

保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2，并且

向该经接种的培养基中添加PET。

59.如权利要求58所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67630的分离株10。

60.如权利要求58或59所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1和保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2。

61.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法，该方法包括用细菌聚生体孵育该聚合物，该细菌聚生体包含：

苏云金芽孢杆菌菌株C15；以及

假单胞菌属物种B10。

62.如权利要求61所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含假单胞菌属物种SWI36。

63.如权利要求61或62所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

64.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法，该方法包括用细菌聚生体孵育该聚合物，该细菌聚生体包含：

一种或多种假单胞菌属物种；

一种或多种苏云金芽孢杆菌；以及

一种或多种白色芽孢杆菌。

65.根据权利要求58-64中任一项所述的方法，其中，该培养基是液体无碳基础培养基(LCFBM)。

66.如权利要求58-65中任一项所述的方法，该方法进一步包括：

将该PET暴露于紫外线(UV)照射。

67.如权利要求66所述的方法，其中，在向经接种的培养基中添加该PET前，将该PET暴露于UV照射。

68.如权利要求66或权利要求67所述的方法，其中，将该PET暴露于UV照射持续约15分钟至约10小时、约30分钟至约5小时、或约1小时至约3小时。

69.如权利要求58-68中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该经接种的培养基中添加生物表面活性剂和/或生物催化剂。

70.如权利要求69所述的方法，其中，该生物表面活性剂选自矿物油、海藻糖脂、鼠李糖脂、槐糖脂、肽脂、粘液菌素、表面活性素、沙雷湿润素、节杆菌纤维型肌动蛋白、枯草杆菌蛋白酶、鸟氨酸脂、乳化剂、生物分散剂、或甲壳素中的至少一种。

71.如权利要求58-70中任一项所述的方法，该方法进一步包括研磨该PET的一部分。

72.如权利要求71所述的方法，其中，在向经接种的培养基中添加该PET前，将该PET研磨。

73.一种用于降解聚合物的试剂盒，该试剂盒包含：

细菌聚生体，该细菌聚生体包含：

保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1；以及

保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2。

74.如权利要求73所述的试剂盒，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67630的分离株10。

75.如权利要求73或74所述的试剂盒，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1和保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2。

76.一种用于降解聚合物的试剂盒，该试剂盒包含：

细菌聚生体，该细菌聚生体包含：

苏云金芽孢杆菌菌株C15；以及

假单胞菌属物种B10。

77.如权利要求76所述的试剂盒，其中，该细菌聚生体进一步包含假单胞菌属物种SWI36。

78.如权利要求76或77所述的试剂盒，其中，该细菌聚生体进一步包含白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

79.一种用于降解聚合物的试剂盒，该试剂盒包含：

细菌聚生体，该细菌聚生体包含：

一种或多种假单胞菌属物种；

一种或多种苏云金芽孢杆菌；以及

一种或多种白色芽孢杆菌。

80.如权利要求73-79中任一项所述的试剂盒，该试剂盒进一步包含：

用于培养该细菌聚生体的培养箱。

81.如权利要求73-80中任一项所述的试剂盒，其中，(i)该细菌聚生体中的物种中的至少一种为脂肪酶阳性和/或酯酶阳性，或(ii)该细菌聚生体为脂肪酶阳性和/或酯酶阳性。

82.一种用于降解含有聚合物的底物的方法，该方法包括：

机械分解该含有聚合物的底物的至少一部分；

使该含有聚合物的底物经受紫外线(UV)照射；以及

用细菌聚生体孵育该含有聚合物的底物，该细菌聚生体包含：

保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1；以及

保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2。

83.如权利要求82所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67630的分离株10。

84.如权利要求82或83所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1和保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2。

85.一种用于降解含有聚合物的底物的方法，该方法包括：

机械分解该含有聚合物的底物的至少一部分；

使该含有聚合物的底物经受紫外线(UV)照射；以及

苏云金芽孢杆菌菌株C15；以及

假单胞菌属物种B10。

86.如权利要求85所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含假单胞菌属物种SWI36。

87.如权利要求85或86所述的方法，其中，该细菌聚生体进一步包含白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

88.一种用于降解含有聚合物的底物的方法，该方法包括：

机械分解该含有聚合物的底物的至少一部分；

使该含有聚合物的底物经受紫外线(UV)照射；以及

一种或多种假单胞菌属物种；

一种或多种苏云金芽孢杆菌；以及

一种或多种白色芽孢杆菌。

89.一种用于降解含有聚合物的底物的组合物，该组合物包含：

细菌聚生体，该细菌聚生体包含：

保藏为NRRL号B-67632的分离株9.1；以及

保藏为NRRL号B-67633的分离株9.2。

90.如权利要求89所述的组合物，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67630的分离株10。

91.如权利要求89或90所述的组合物，其中，该细菌聚生体进一步包含保藏为NRRL号B-67631的分离株13.1和保藏为NRRL号B-67634的分离株13.2。

92.一种用于降解含有聚合物的底物的组合物，该组合物包含：

细菌聚生体，该细菌聚生体包含：

苏云金芽孢杆菌菌株C15；以及

假单胞菌属物种B10。

93.如权利要求92所述的组合物，其中，该细菌聚生体进一步包含假单胞菌属物种SWI36。

94.如权利要求92或93所述的组合物，其中，该细菌聚生体进一步包含白色芽孢杆菌菌株PFYN01。

95.一种用于降解含有聚合物的底物的组合物，该组合物包含：

细菌聚生体，该细菌聚生体包含：

一种或多种假单胞菌属物种；

一种或多种苏云金芽孢杆菌；以及

一种或多种白色芽孢杆菌。

96.如权利要求89-95中任一项所述的组合物，其中，该组合物为脂肪酶阳性和/或酯酶阳性。