WO2022158880A1 - 신규 플라스틱 분해효소 및 플라스틱의 분해 방법 - Google Patents

신규 플라스틱 분해효소 및 플라스틱의 분해 방법 Download PDF

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WO2022158880A1
WO2022158880A1 PCT/KR2022/001050 KR2022001050W WO2022158880A1 WO 2022158880 A1 WO2022158880 A1 WO 2022158880A1 KR 2022001050 W KR2022001050 W KR 2022001050W WO 2022158880 A1 WO2022158880 A1 WO 2022158880A1
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plastic
degrading enzyme
present
activity
enzyme
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PCT/KR2022/001050
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이승구
이대희
안정웅
염수진
권길광
방현배
성봉현
오석진
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한국생명공학연구원
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    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
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Definitions

  • the present invention relates to a novel plastic degrading enzyme and a plastic decomposition method using the same.
  • PET Polyethylene terephthalate
  • TPA terephthalic acid
  • EG ethylene glycol
  • PET Polyethylene terephthalate
  • TPA terephthalic acid
  • EG ethylene glycol
  • PET has high transparency and excellent thermal insulation properties, so it is a polymer material commonly used in electric wire coverings, household goods, toys, and packaging materials, and is particularly widely used in the manufacture of bottles.
  • PET has a chemical structure that is not easily decomposed in nature, environmental pollution caused by the accumulation of PET in ecosystems including soil, rivers, and oceans is recognized as a serious social problem.
  • the bioaccumulation problem caused by microplastics can adversely affect human health, so the need for recycling or environmentally friendly decomposition of PET is gradually increasing.
  • PETase an enzyme that can decompose PET in Ideonella sakaiensis .
  • Is PETase an enzyme that can decompose PET in Ideonella sakaiensis
  • the enzyme is unstable at high temperature and recombinant expression, so the PET decomposition efficiency is not high.
  • the disadvantage is that it takes a long time.
  • An object of the present invention is to provide a novel plastic-degrading enzyme, which is not easily decomposed in nature, causing destruction of the ecosystem, and has excellent activity for decomposing plastics that can be accumulated in living organisms.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector and a transformant that can be used to produce the plastic-degrading enzyme.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for decomposing plastics in an environmentally friendly manner and a method for decomposing plastics using the same.
  • one aspect of the present invention provides a plastic degrading enzyme comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the plastic degrading enzyme may include a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and may include an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the plastic may be PET, mono(2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET) or bis(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET).
  • MHET mono(2-hydroxyethyl) terephthalate
  • BHET bis(2-hydroxyethyl) terephthalate
  • another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme, or a recombinant vector comprising the polynucleotide, and a transformant transformed with the recombinant vector.
  • composition for decomposing plastics comprising at least one selected from the group consisting of the plastic-degrading enzyme and microorganisms capable of producing the same.
  • Another aspect of the present invention in order to achieve the above object, provides a method for decomposing plastics, comprising the step of treating the plastic with the composition for decomposing plastics.
  • the recombinant expression is better compared to PETase ( Is PETase) derived from Ideonella saciensis, which is known to have an activity to degrade PET, and thus the production efficiency is excellent, and the Is PETase for multimeric PET Not only does it exhibit a significant decomposition activity that is 6 times higher than that, but also it has excellent thermal stability, so it can maintain enzyme activity for a relatively long time even under high temperature conditions. .
  • PETase Is PETase derived from Ideonella saciensis
  • FIG. 1 shows the formation of a clear zone after culturing a Rhizobacter gummiphilus strain in a medium containing BHET at a concentration of 2.5 mM and 10 mM, respectively.
  • Figure 2 (A) is a photograph of the result of culturing Ryzobacter gumiphilus in a minimal medium that does not contain PET granules (left) and the result of culturing by adding PET granules to the minimal medium (right).
  • Figure 2 (B) is a graph measuring the change in the weight of PET over time while culturing Risobacter gumiphilus in a medium containing PET granules, and the square is the time in the medium containing Risobacter gumiphilus.
  • Figure 3 (A) is the surface of the PET granules in a state in which Ryzobacter gumiphilus is not added, and (B) of Figure 3 is after culturing by adding Ryzobacter gumiphilus in the medium containing the PET granules. The surface of the PET granules was observed and compared with each SEM.
  • FIG. 4 (A) shows that when Risobacter gumiphilus is cultured without adding PET, when Risobacter gumiphilus is cultured by adding PET, TPA (terephthalic acid), the final product of PET decomposition, is analyzed by HPLC. The results of the analysis are shown, and in FIG. 4 (B) is a component in the culture medium when Ryzobacter gumiphilus is not cultured in a medium containing BHET and when Ryzobacter gumiphilus is cultured in a medium containing BHET. shows the results of analysis by HPLC.
  • M is molecular weight marker
  • RC crude protein
  • IC is Is PETase crude protein
  • RP is purified Ryzobacter gumiphilus-derived plastic degrading enzyme
  • IP is purified Is PETase respectively.
  • plastic degradation enzyme of the present invention plastic degradation enzyme derived from Ryzobacter gumiphilus
  • Is PETase derived from Ideonella saciensis It is a graph comparing concentrations.
  • FIG. 7 shows the results of performing SDS-PAGE after transforming and expressing the nucleotide sequence encoding the plastic degrading enzyme of the present invention in E. coli, where M is a molecular weight marker, I is an inclusion body, and C is a crude protein. (crude protein) and P denote purified enzymes.
  • FIG. 8 shows the results of performing MALDI-TOF-MS after transforming and expressing the nucleotide sequence encoding the plastic degrading enzyme of the present invention in E. coli.
  • a plastics degrading enzyme (Wild-type, WT) of the present invention that does not induce mutation
  • a plastic degrading enzyme S158A, D203A, H234A, C200A, C236A
  • S158A, D203A, H234A, C236A a plastic degrading enzyme inducing a mutation replacing each of the five amino acid positions with alanine (S158A, D203A, H234A, C236A) , each position is based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) to perform a reaction with BHET (A), MHET (B) and PET granules (C) as a substrate, and then measure the concentration of the product and compare the results. It is a graph.
  • 11 is a result of measuring the relative activity at a condition of pH 7.5 to pH 10 for the plastic degrading enzyme of the present invention (A), the result of measuring the relative activity at a condition of 25 °C to 50 °C (B), NiCl 2 , FeCl 2 , CaCl 2 , CoCl 2 , CuCl 2 , MgCl 2 , MnSO 4 , K 2 SO 4 , ZnSO 4 , or EDTA was added respectively to perform the reaction and the result of comparing the relative activity measured (C ) and calcium ions (Ca 2+ ) are graphs showing the results (D) respectively comparing the relative activities measured after the reaction was carried out under the conditions of adding 0 mM to 12 mM, respectively.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of measuring and comparing the changes in the activity of the enzyme of the present invention over time under the condition that calcium ions are added or not added at a temperature of 30 °C or 50 °C.
  • One aspect of the present invention provides a novel plastic degrading enzyme.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention includes a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and within a range that does not affect the function of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a variant having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or a combination thereof of amino acid residues It may contain a peptide, or it may be in the form of a protein fragment having the same function.
  • Amino acid modifications at the protein and peptide level, which do not entirely change the activity according to the inclusion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are known in the art, and in some cases phosphorylation, sulfation , acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like.
  • the peptide region includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as well as a peptide having an amino acid sequence substantially identical thereto or a variant thereof.
  • the peptide having the substantially identical amino acid sequence is 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • It may be a peptide comprising an amino acid sequence having 99.5% or more homology, but is not limited thereto, and a protein having the same enzymatic activity while including a peptide region having an amino acid sequence homology of 80% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 If so, it is included in the scope of the present invention.
  • the peptide region composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a region that plays an important role in the catalytic activity of the plastic degradation reaction exhibited by the plastic degradation enzyme of the present invention. Therefore, the plastics degrading enzyme of the present invention includes a peptide region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and thus has superior plastic degradation activity than a protein that does not include the peptide region or includes a peptide having a different amino acid sequence from the peptide region. can represent
  • the plastic degrading enzyme may include an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 while including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the plastic-degrading enzyme may include a mutant protein having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or a combination of amino acid residues within the range that does not affect the function of the protein, or a protein fragment having the same function may be in the form of Amino acid modifications at the protein and peptide level that do not entirely change the activity of the plastic degrading enzyme are known in the art, and in some cases phosphorylation, sulfation, acrylation, and glycosylation.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 as well as a protein having an amino acid sequence substantially identical thereto, a variant thereof, or an active fragment thereof.
  • the substantially identical protein means 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more,
  • a protein comprising an amino acid sequence having at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or at least 99.5% homology. means, but is not limited thereto, and any protein having the same enzymatic activity as the enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 while having at least 80% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is included in the scope of the present invention.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention includes an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is a region that plays an important role in the activity of catalyzing the plastic degradation reaction Since it contains a polypeptide that becomes
  • the plastic-degrading enzyme may be a protein derived from or isolated from a microorganism of the genus Rhizobacter .
  • Rhizobacter genus microorganism is Rhizobacter gummiphilus ( Rhizobacter gummiphilus ), Rhizobacter bergeniae ), Rhizobacter dauci ( Rhizobacter dauci ), Rhizobacter dauci ), Rhizobacter daucus grass, Rhizobacter ( Rhizobacter fulvus ), Rhizobacter profundi ( Rhizobacter profundi ) and the like.
  • the plastic may be polyethylene terephthalate (PET), mono(2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET), bis(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET), or a derivative thereof.
  • PET is a long-chain plastic polymer
  • the plastic degrading enzyme of the present invention has the activity of catalyzing a reaction in which smaller molecules of BHET or MHET or the final degradation product, TPA (terephthalic acid), are produced by decomposing PET. have.
  • the plastic-degrading enzyme may have an activity to catalyze a reaction in which MHET or TPA is produced by decomposing MHET or a reaction in which TPA is produced by decomposing BHET.
  • the plastic degrading enzyme may have a molecular weight of 55 kDa to 60 kDa, specifically, 56 kDa to 59 kDa, 56 kDa to 58 kDa, or 57 kDa.
  • the plastic degrading enzyme may be in the form of a homodimer in which two units of the same structure are bonded, and the molecular weight of one unit is 25 kDa to 30 kDa, specifically, 25 kDa to 29 kDa, 26 kDa to 28 kDa. , or 27 kDa.
  • the plastic-degrading enzyme may be one in which a disulfide bond is formed at the 43rd cysteine, the 79th cysteine, or both of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a disulfide bond is formed at the cysteine at the above position, the structural stability of the protein or the activity of catalyzing the degradation reaction of plastic may be higher compared to that of an enzyme in which the disulfide bond is not formed.
  • the plastic-degrading enzyme may be one in which a disulfide bond is formed at the 200th cysteine, the 236th cysteine, or both of the amino acid sequence of SEQ ID NO:3.
  • a disulfide bond is formed at the cysteine at the above position, the structural stability of the protein or the activity of catalyzing the degradation reaction of plastic may be higher compared to that of an enzyme in which the disulfide bond is not formed.
  • the plastic degradation activity of the plastics degrading enzyme of the present invention can be more than doubled compared with the MHET, BHET and PET degradation activity exhibited by Is PETase derived from Ideonella saciensis.
  • the plastic degradation activity of the present invention plastic degrading enzyme is 2.5 times or more, 3 times or more, 3.5 times or more, 4 times or more, 4.5 times or more, 5 times or more, 5.5 times or more, the activity of PETase derived from Ideonella saciensis.
  • the plastic-degrading enzyme of the present invention has significantly superior activity to decompose PET than Is PETase derived from Ideonella saciensis, so high efficiency It has the characteristic of being able to decompose plastic with
  • the plastic-degrading enzyme of the present invention may have a half-life at 50° C. of 2 hours or more, and thus may have thermostability.
  • the half-life means the time it takes for the activity of the enzyme to decrease to 50% of the initial enzyme activity over time, and in the case of the present invention, it takes until the activity of decomposing the plastic is reduced to a level of half compared to the initial means time to be
  • the plastic degrading enzyme of the present invention may have a half-life of 2 hours or more, for example, 2.5 hours or more or 3 hours or more under high temperature conditions, such as 50° C., where proteins are usually denatured and lose activity.
  • Is PETase derived from Ideonella saciensis is characterized in that the activity is reduced to 20% or less when 5 minutes elapsed at 50 °C, and the activity disappears when 10 minutes elapse (Son et al. , ACS Catal. , 9 (4): 3519-3526 (2019)), unlike this, the plastic degrading enzyme of the present invention has excellent thermal stability because the half-life is more than 2 hours even at a high temperature of 50 ° C.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention has better thermal stability compared to the existing IsPETase derived from Ideonella saciensis, so it can perform a continuous decomposition reaction for a longer period of time, and a high temperature condition of 50 ° C or higher Since the catalytic effect of a stable decomposition reaction is shown even in
  • the plastic-degrading enzyme may exhibit the maximum activity at pH 9.5 and/or 45°C. Specifically, the plastic-degrading enzyme may exhibit an activity of 80% or more of the maximum activity in a pH condition ranging from pH 8.5 to pH 10.5. In addition, the plastic-degrading enzyme may exhibit 80% or more of the maximum activity under a temperature condition in the range of 35 °C to 50 °C.
  • the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from the Ryzobacter gumiphilus has an activity of decomposing it using BHET, MHET and PET as substrates, and degradation-related activity of MHET, BHET and PET was confirmed to be more than 6 times the activity of Is PETase derived from Ideonella saciensis, confirming that it exhibits a very good PET decomposition effect.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the plastic degrading enzyme.
  • the polynucleotide of the present invention may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and typically include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • various modifications can be made to the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the plastic degrading enzyme, its variant or its active fragment, and the plastic degradation is also performed in parts other than the coding region.
  • Various mutations can be made within a range that does not affect the activity of the enzyme or the expression of the polynucleotide, and such mutated genes are also included in the scope of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may include a nucleotide sequence substantially identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the substantially identical nucleotide sequence means 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more means a nucleotide sequence having homology , but not limited thereto.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 has at least 80% homology, and the protein expressed therefrom has the same enzymatic activity as the plastic degrading enzyme, it is included in the polynucleotide of the present invention do.
  • another aspect of the present invention provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.
  • the recombinant vector may be one in which the polynucleotide encoding the plasticase is cloned into an expression vector, and the expression vector may be a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, a viral vector, and the like, but is not limited thereto.
  • the recombinant vector is an expression control sequence such as a promoter, a terminator, an enhancer, etc., or a sequence for secretion according to the type of host cell in which the plastic degradation enzyme of the present invention is to be produced. can do.
  • the recombinant vector may further include a selection marker for selecting a host cell into which the vector is introduced, and in the case of an expression vector capable of replication, it may include an origin of replication.
  • the recombinant vector may include a sequence for facilitating the purification of the plastic-degrading enzyme, specifically, a polynucleotide encoding a tag for separation and purification so as to be operable on the polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme of the present invention.
  • a sequence for facilitating the purification of the plastic-degrading enzyme specifically, a polynucleotide encoding a tag for separation and purification so as to be operable on the polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme of the present invention.
  • the tag for separation and purification GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag, c-myc, etc. may be used alone or two or more of them may be sequentially used.
  • the polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme may be cloned through a restriction enzyme cleavage site, and when a gene encoding a protein-cleaving enzyme recognition site is used in the vector, it is in conformity with the plastic-degrading enzyme gene ( in frame), when cleaving with a protein cleaving enzyme after obtaining the enzyme, it is possible to produce a plastic degrading enzyme in its original form.
  • a recombinant cloning vector was prepared by inserting a polynucleotide encoding a plastics degrading enzyme of the present invention into a plasmid vector pET-28a.
  • pET-28a used in the preparation of the cloning vector, various vectors for prokaryotic cells or eukaryotic cells (pPIC and pPICZ, etc.) are known, and thus various expression vectors other than the above vectors can be used depending on the purpose of expression.
  • the recombinant vector of the present invention contains a polynucleotide encoding a plastic degrading enzyme, and thus can be usefully used as a vector capable of producing it.
  • Another aspect of the present invention provides a transformant comprising a polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme or a recombinant vector containing the polynucleotide.
  • the transformant may be one in which the polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme is transduced into a host cell.
  • the polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme may itself be introduced into a host cell, and in this case, the polynucleotide may be present in the cytoplasm of the host cell or may be introduced into the chromosome of the host cell.
  • polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme may be introduced into a host cell in the state of a recombinant vector contained in an expression vector.
  • the host cell may be any one selected from the group consisting of bacteria, yeast, E. coli, fungi, plant cells and animal cells depending on the purpose of expression.
  • the host cell may be E. coli ( E. coli BL21(DE3), DH5 ⁇ , etc.) or yeast cells ( Saccharomyces genus, Pichia genus, etc.).
  • E. coli E. coli BL21(DE3), DH5 ⁇ , etc.
  • yeast cells Saccharomyces genus, Pichia genus, etc.
  • an appropriate culture method and medium conditions according to the type of host cell can be easily selected by those skilled in the art from known techniques in the art.
  • the polynucleotide or the recombinant vector may be introduced into the host cell through a known technique, ie, a heat shock method, an electric shock method, or the like.
  • a transformant was prepared by transforming E. coli with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a plastics degrading enzyme of the present invention using E. coli as a host cell.
  • the plastic-degrading enzyme expressed from the transformant is a protein of a novel sequence having enzymatic activity
  • the plastic-degrading enzyme can be easily mass-produced by mass-culturing the transformant to express the polynucleotide.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for decomposing plastics.
  • the composition for decomposing plastic includes at least one selected from the group consisting of the plastic degrading enzyme of the present invention and microorganisms capable of producing the same.
  • the plastic may be MHET, BHET, PET, or the like, or a derivative thereof.
  • the microorganism capable of producing the plastic-degrading enzyme may be a transformant transduced with a microorganism of the genus Rhizobacter or a polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme or a recombinant vector containing the same.
  • the microorganism of the genus Risobacter is a microorganism that can be produced by expressing the plastic-degrading enzyme of the present invention, and as long as it has the ability to produce the plastic-degrading enzyme, it can be used regardless of whether it is a wild-type strain or a mutant strain.
  • the microorganisms of the genus Rhizobacter are Rhizobacter gummiphilus, Rhizobacter bergeniae , Rhizobacter dauci, Rhizobacter dauci , Rhizobacter daucus , Rhizobacter grass Rhizobacter fulvus ), Rhizobacter profundi , and the like.
  • the microorganisms of the genus Ryzobacter are known microorganisms, which can be obtained without difficulty by those skilled in the art and are available for public use.
  • the microorganisms of the genus Risobacter may be included in the composition for decomposing plastics of the present invention in the form of a culture solution culturing them.
  • the microorganisms of the genus Risobacter can be grown using them in a medium containing plastic, and the plastic components can be decomposed and used as a carbon source. Therefore, the microorganism of the genus Ryzobacter or a culture solution thereof can be usefully used for decomposing the plastic.
  • plastic-degrading enzyme The description of the plastic-degrading enzyme is described above in '1. It is the same as that described in ' New Plastic Degrading Enzyme , and the description of the transformant transduced with the polynucleotide encoding the plastic-degrading enzyme or the recombinant vector containing the same is described above in ' 2. Poly-encoding the plastic-degrading enzyme nucleotides, and expression vectors and transformants containing the same.
  • the plastic-degrading enzyme has excellent activity for decomposing plastics
  • the enzyme and/or a transformant that can be produced by expressing the enzyme and/or the transformant can be usefully used for decomposing plastics.
  • the composition for decomposing plastics of the present invention may further include calcium ions (Ca 2+ ). Since the calcium ion can improve the plastics degrading activity of the plastics degrading enzyme of the present invention, the microorganism of the genus Risobacter that can produce the plastics degrading enzyme or the plastics degrading enzyme and / or the plastics degrading enzyme can be produced. When calcium ions are included together with the transformant, the decomposition efficiency of the composition of the present invention, such as MHET, BHET, or PET, may be further improved.
  • Ca 2+ calcium ions
  • the calcium ion may be included in the composition of the present invention in the form of CaCl 2 but is not limited thereto, and the calcium ion may be included in the composition of the present invention in a dissolved form in a buffer, for example, a CHES buffer.
  • the calcium ion may be included in the composition of the present invention at a concentration of 0.5 mM to 15 mM.
  • the calcium ion is 0.5 mM to 15 mM, 1 mM to 15 mM, 3 mM to 12 mM, 5 mM to 12 mM, 6 mM to 11 mM, 6 mM to 10 mM, 7 mM to 10 mM, or It may be included at a concentration of 7 mM to 9 mM.
  • the activity of the plastics degrading enzyme of the present invention can be improved, for example, when the enzyme activity when calcium ions are not included is 100%, 110 % or more, 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, or 160% or more of activity, there is an advantage that can significantly improve the plastic degradation efficiency of the composition of the present invention.
  • the composition for decomposing plastics of the present invention is at least one ion selected from the group consisting of Ni 2+ , Fe 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , K + , Zn 2+ and EDTA It may be included in the composition of the present invention at a concentration of 10 mM or less. Specifically, the ions are 10 mM or less, 8 mM or less, 6 mM or less, 5 mM or less, 3 mM or less, 2 mM or less, 1 mM or less, 0.5 mM or less, 0.1 mM or less, 0.01 mM or less in the composition of the present invention.
  • the plastic degradation composition of the present invention may not contain the ions or may contain the ions at a minimum concentration.
  • Another aspect of the present invention provides a method for decomposing plastics.
  • the plastic decomposition method includes the step of treating the plastics with the composition for decomposing plastics of the present invention.
  • the plastic may be MHET, BHET, PET, or the like, or derivatives thereof.
  • the step of treating the composition on the plastic may be performed under conditions of pH 8.5 to pH 10.5.
  • the pH may be in the range of pH 9.0 to pH 10.5, 8.5 to pH 10.0, or 9.0 to pH 10.0.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention can exhibit a higher activity in the above pH range, thereby exhibiting an activity of 80% or more of the maximum activity.
  • the step of treating the composition on the plastic may be performed at a temperature of 35 °C to 50 °C.
  • the temperature may be in the range of 35 °C to 50 °C, 40 °C to 50 °C, or 42 °C to 48 °C.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention can exhibit a higher activity in the above temperature range and thus 80% or more of the maximum activity.
  • Risobacter gumiphilus Rhizobacter gummiphilus
  • Rhizobacter gummiphilus has an activity to degrade PET (polyethylene terephthalate, CAS 25038-59-9, Sigma-Aldrich, St Louis, USA), using Rhizobacter gummiphilus A clear zone assay was performed on a solid medium containing BHET (bis(2-hydroxyethyl)terephthalate, CAS 959-26-2, Sigma-Aldrich), and a liquid medium containing PET granules. It was confirmed whether PET was degraded after incubation in
  • Ryzobacter gumiphilus uses PET or BHET as a carbon source
  • Ryzobacter gumiphilus was cultured in a 100 ml glass tube containing 15 ml of minimal medium, and the minimal medium was KH 2 PO 4 1.7 g, Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O 9.8 g, (NH 4 ) 2 SO 4 1.0 g, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.1 g, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O 9.5 mg, MgO 10.75 mg, CaCO 3 2 mg, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.44 mg, MnSO 4 ⁇ 4H 2 O 1.12 mg, CuSO 0.25 mg of 4 ⁇ 5H 2 O and 0.06 mg of CoSO 4 ⁇ 7H 2 O were included, and HCl of 51.3 ⁇ l concentration was diluted with 1 liter of water and used.
  • Ryzobacter gumiphilus has the activity of decomposing PET
  • its activity was confirmed using the plastic degrading enzyme of the present invention isolated from the Ryzobacter gumiphilus.
  • the activity of Is PETase derived from Ideonella saciensis which was known to have a conventional PET degradation activity, was also measured, and the expression levels of these enzymes were confirmed and compared from the cells in which the genes of each enzyme were recombined.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention was produced in a larger amount than Is PETase (FIG. 5). Therefore, it was confirmed that the production efficiency of the plastic degrading enzyme of the present invention was superior to that of Is PETase when the two enzymes were expressed and produced under the same conditions using recombinant cells in which the sequences encoding each enzyme were transformed. , it was confirmed that there is a more advantageous advantage when producing and using an enzyme for the purpose of decomposing PET, so that it has better industrial applicability.
  • MHET mono(2-hydroxyethyl)terephthalate, CAS 1137-99-1, Acrotein Chembio inc, Hoover, USA
  • BHET and PET granules were reacted as substrates, and then the Activity was confirmed by measuring the concentration of MHET or TPA, which is the final product, which appears when the polymer is decomposed.
  • MHET and BHET were included in a 50 mM CHES buffer (pH 9.5) at a concentration of 1 mM and reacted with 90 ⁇ g/ml plasticase at 45 ° C. for 30 minutes.
  • 50 mM CHES buffer pH 9.5
  • 25 mg was added to 50 mM CHES. It was included in a buffer solution (pH 9.5) and reacted with 90 ⁇ g/ml of plastic degrading enzyme at 45° C. for 24 hours.
  • the novel plastic degrading enzyme of the present invention is an enzyme having an activity capable of degrading MHET and BHET as well as PET, and the recombinant expression efficiency is also higher than that of Is PETase, which is known in the prior art. It was found that not only better, but also the decomposition activity for granular PET was remarkably superior compared to Is PETase.
  • the amino acid sequence of the plastic degrading enzyme of the present invention as well as various biochemical properties such as molecular weight and molecular form were analyzed.
  • the plastic degrading enzyme is a protein comprising a peptide region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 . And, based on the amino acid sequence of the enzyme of the present invention, it was compared with the amino acid sequence information of Is PETase derived from Ideodella sakaienesis , which is known to have PET degradation activity.
  • the amino acid sequence of the plastic-degrading enzyme of the present invention and Is PETase had 72% identity, and from this, the plastic-degrading enzyme of the present invention had a completely different amino acid sequence different from that of the conventional Is PETase enzyme. It was confirmed that it was a plastic degrading enzyme.
  • the molecular weight of the plastic degrading enzyme of the present invention was measured.
  • the pET-28a expression vector was recombined based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the plastic-degrading enzyme, and it was transformed into E. coli BL21pLysS, and then protein expression was induced.
  • SDS-PAGE was performed on the purified plastic degrading enzyme after expression using a molecular weight marker protein (Sigma Aldrich).
  • a molecular weight marker protein Sigma Aldrich
  • the molecular weight of the plastic-degrading enzyme was measured by size exclusion chromatography using MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometer) and HPLC system. As a result, the molecular weight of the total protein was measured to be 57 kDa ( FIGS. 8 and 9 ), and compared with the analysis result through the SDS-PAGE, the plastic degrading enzyme of the present invention may exist in the form of a homodimer. was able to confirm
  • the DNA template encoding the enzyme was amplified through PCR, and then the primers and site-directed mutagenensis kit (Quick-Change kit, Stratagene, La Jolla, USA) produced by requesting Macrogen (Macrogen, Seoul, Korea) were used. Mutations were induced at specific positions in the DNA template.
  • the mutated DNA was transformed into Escherichia coli BL21pLysS using the pET-28a vector, and the MHET, BHET and PET granules were reacted with a substrate using the mutant plasticase expressed therefrom. Enzyme activity was confirmed.
  • MHET and BHET were included in 50 mM CHES buffer (pH 9.5) at a concentration of 1 mM and reacted with 90 ⁇ g/ml of the mutant plasticase at 45° C. for 30 minutes, and 25 mg of PET granules. It was included in 50 mM CHES buffer (pH 9.5) and reacted with 90 ⁇ g/ml of the mutant plasticase at 45° C. for 24 hours. As a result, it was found that the activity was significantly reduced in the reaction using the five mutant proteins as compared with the wild-type (WT) plasticase (FIG. 10).
  • the reaction was performed by changing the pH from pH 7.5 to pH 10.
  • 50 mM HEPES buffer (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl] ethanesulfonic acid, pH 7.5-8.0
  • 50 mM EPPS buffer (3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-propanesulfonic acid, pH 8.0-8.5)
  • 50 mM CHES buffer pH 8.5
  • the reaction was performed by increasing the temperature from 25 °C to 50 °C while the pH conditions were fixed using 50 mM CHES buffer (pH 9.5). The reaction was carried out by including 1 mM BHET and 90 ⁇ g/ml of enzyme as substrates in the buffer solution.
  • the plastic degrading enzyme of the present invention exhibited at least 40% activity in the above pH range, about 80% activity at pH 8.5, and 90% or more activity at pH 9.0 to pH 10, and at pH 9.5. It showed maximal activity (FIG. 11 (A)). In addition, it exhibited an activity of 60% or more in the above temperature range, exhibited an activity of about 80% or more in the range of 35 °C to 50 °C, and showed the maximum activity at 45 °C (FIG. 11 (B)). Therefore, it was confirmed that the enzyme of the present invention has the most excellent activity at pH 9.5 and 45 °C conditions.
  • the activity of the plastic degrading enzyme of the present invention changes depending on the type of metal ion added.
  • NiCl 2 , FeCl 2 , CaCl 2 , CoCl 2 , CuCl 2 , MgCl 2 , MnSO 4 , K in 50 mM CHES buffer (pH 9.5) containing 1 mM BHET and 90 ⁇ g/ml enzyme 2 SO 4 , ZnSO 4 , or EDTA was added, respectively, and the reaction was performed at 45° C. for 30 minutes, and the metal ions were added at different concentrations to 1 mM or 10 mM.
  • the optimal calcium ion concentration was confirmed by measuring the activity of the plastic degrading enzyme of the present invention while changing the concentration of calcium ions and adding them. Specifically, calcium ions were added to 50 mM CHES buffer (pH 9.5) by increasing the concentration from 0 mM to 12 mM, and the reaction was performed at a temperature of 45° C. for 30 minutes to confirm the activity. As a result, when the enzyme activity when no calcium ion was added was 100%, when 0.8 mM calcium ion was added, it was confirmed that the relative activity of the enzyme increased to a level of about 160%, showing maximum activity ( 11(D)).
  • the half-life of the plastics degrading enzyme of the present invention which is the time it takes for its enzyme activity to be half, was measured to be at least 20 hours even in the absence of calcium ions at 30 ° C. It was confirmed that it was longer than the time, and it was confirmed that the thermal stability was excellent.
  • calcium ions were added, it was confirmed that the activity of the enzyme was maintained for a longer time at both the temperature of 30 °C and 50 °C, and it was confirmed that the stability of the enzyme was significantly increased according to the calcium ion.
  • the half-life was significantly increased, and it was confirmed that 50% or more of the activity was maintained even after 25 hours had elapsed, indicating high stability (FIG. 12).

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Abstract

본 발명은 신규한 플라스틱 분해효소와 이를 이용한 플라스틱의 분해 방법에 관한 것이다. 본 발명의 플라스틱 분해효소는 종래 알려졌던 PETase와는 다른 신규한 효소이면서, MHET, BHET, PET 등의 플라스틱을 분해하는 활성이 우수한 특징이 있는바, 본 발명에서는 이를 이용하여,높은 효율로 플라스틱을 분해할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

신규 플라스틱 분해효소 및 플라스틱의 분해 방법
본 발명은 신규한 플라스틱 분해효소 및 이를 이용한 플라스틱의 분해 방법에 관한 것이다.
PET(Polyethylene terephthalate)는 TPA(terephthalic acid)와 EG(ethylene glycol)의 중합에 의해 만들어지는 열가소성 플라스틱의 일종이다. PET는 투명도가 높고 단열성이 우수한 특징이 있어, 전선 피복재, 생활용품, 장난감, 포장재 등에 보편적으로 이용되는 고분자 물질로, 특히 병의 제조에 일반적으로 널리 이용된다. 그러나, PET는 자연적으로 쉽게 분해되지 않는 화학 구조로 이루어져 있으므로, 토양, 강, 해양을 비롯한 생태계에서 PET의 축적으로 인해 발생하는 환경 오염이 심각한 사회적 문제로 인식되고 있다. 특히, 미세 플라스틱에 의한 생물 축적 문제로 인해 사람의 건강에까지 악영향을 줄 수 있어 PET의 재활용이나 친환경적인 분해의 필요성이 점차 높아지고 있다.
하지만, PET를 산업적으로 재활용하는 경우 품질이 좋지 않고 비용이 많이 들어 재활용률이 높지 않으며, 물리적, 화학적 방법을 통해 PET를 분해할 경우 다이옥신과 같은 내분비계 교란 화학 물질이 만들어질 수 있어 2차적인 문제가 발생한다는 문제점이 있다.
이에, 최근 미생물을 이용한 PET의 친환경적 분해 방법으로, 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)에서 PET를 분해할 수 있는 효소인 PETase가 발견됨에 따라 이를 이용하고자 하는 연구가 있어 왔다(Yoshida et al., Science, 351(6278): 1196-1199 (2016) 및 Joo et al., Nat. Commun.,9(1): 382 (2018)). 그러나, 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 PETase(IsPETase)를 이용한 PET 분해 방법이 친환경적이라는 장점이 있음에도 불구하고, 상기 효소는 재조합 발현 및 높은 온도에서 불안정하여 PET 분해 효율이 높지 않아 여전히 PET의 분해에 오랜 시간이 필요하다는 단점이 있다.
이에, 친환경적인 PET 분해를 수행할 수 있으면서도, PET의 분해 반응을 촉매하는 활성이 종래 알려졌던 IsPETase 보다 우수하여 높은 효율로 PET를 분해할 수 있는 새로운 효소의 개발을 위한 연구의 필요성이 높아지고 있다. 종래 알려져 있던 효소와는 다른 새로운 효소를 개발함으로써 이에 대한 후속적인 개량, 응용 연구의 가능성도 높일 수 있는 바, 신규하면서도 PET 분해 효율이 우수한 플라스틱 분해효소의 개발이 시급하다.
본 발명은 자연계에서 쉽게 분해되지 않아 생태계의 파괴를 유발하고 생물체 내에 축적될 수 있는 플라스틱을 분해하는 활성이 우수한 특징이 있는 신규한 플라스틱 분해효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 플라스틱 분해효소를 생산하기 위해 이용될 수 있는 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 플라스틱을 친환경적으로 분해하기 위한 조성물과 이를 이용한 플라스틱의 분해 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 플라스틱 분해효소를 제공한다.
상기 플라스틱 분해효소는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함하고, 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 플라스틱은 PET, MHET(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate) 또는 BHET(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate) 등일 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 플라스틱 분해효소 및 이를 생산할 수 있는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 플라스틱 분해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기 플라스틱 분해용 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계를 포함하는, 플라스틱의 분해 방법을 제공한다.
본 발명에서는 종래 PET를 분해하는 활성이 있는 것으로 알려져 있던 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 PETase(IsPETase)에 비하여 재조합 발현이 더 잘 되어 생산 효율이 우수하고, 다량체 형태의 PET에 대하여 상기 IsPETase보다 6배 이상 높은 현저한 분해 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 열안정성이 우수하여 고온 조건에서도 상대적으로 오랜 시간 동안 효소 활성을 유지할 수 있는바, 종래의 IsPETase를 유효하게 개선 및 대체할 수 있는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 BHET가 각각 2.5 mM, 10 mM의 농도로 함유된 배지에서 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus) 균주를 배양한 후 클리어 존의 형성을 확인한 것이다.
도 2의 (A)는 리조박터 구미필러스를 PET 과립(granule)이 포함되지 않은 최소배지에서 배양한 결과(왼쪽)와 최소배지에 PET 과립을 첨가하여 배양한 결과(오른쪽)에 관한 사진이다. 도 2의 (B)는 PET 과립이 포함된 배지에서 리조박터 구미필러스를 배양하면서 시간에 따른 PET의 무게 변화를 측정한 그래프로, 사각형은 리조박터 구미필러스를 첨가한 배지에서의 시간의 경과에 따른 PET 과립의 무게 변화를, 원은 리조박터 구미필러스를 첨가하지 않은 배지(대조군)에서의 시간의 경과에 따른 PET 과립의 무게 변화를, 그리고 삼각형은 리조박터 구미필러스의 세포 성장을 각각 나타낸 것이다.
도 3의 (A)는 리조박터 구미필러스를 첨가하지 않은 상태의 PET 과립의 표면을, 그리고 도 3의 (B)는 PET 과립이 포함된 배지에서 리조박터 구미필러스를 첨가하여 배양한 이후 PET 과립의 표면을, 각각 SEM으로 관찰하여 비교한 것이다.
도 4의 (A)는 PET를 첨가하지 않고 리조박터 구미필러스를 배양한 경우, PET를 첨가하여 리조박터 구미필러스를 배양한 경우, PET 분해의 최종산물인 TPA(terephthalic acid)를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 4의 (B)는 BHET가 포함된 배지에서 리조박터 구미필러스를 배양하지 않은 경우와 BHET가 포함된 배지에서 리조박터 구미필러스를 배양한 경우의 배양액 내의 성분을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 리조박터 구미필러스 유래의 플라스틱 분해효소와, 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase 유전자를 대장균에 형질전환시켜 재조합 발현시킨 후, 분리 및 정제하여 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 것으로서, M은 분자량 마커, RC는 리조박터 구미필러스에서 분리한 플라스틱 분해효소 조단백질(crude protein), IC는 IsPETase 조단백질, RP는 정제된 리조박터 구미필러스 유래 플라스틱 분해효소 및 IP는 정제된 IsPETase를 각각 의미한다.
도 6은 본 발명의 플라스틱 분해효소(리조박터 구미필러스 유래의 플라스틱 분해효소) 및 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase를 이용하여, MHET, BHET 및 PET 과립을 각각 기질로 반응시킨 후의 생성물의 농도를 비교한 그래프이다..
도 7은 본 발명의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 염기서열을 대장균에 형질전환하여 발현시킨 후 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 것으로서, M은 분자량 마커, I는 봉입체(inclusion body), C는 조단백질(crude protein) 및 P는 정제된 효소를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 염기서열을 대장균에 형질전환하여 발현시킨 후 MALDI-TOF-MS를 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 염기서열을 대장균에 형질전환하여 발현시킨 후 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 수행 및 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 돌연변이를 유도하지 않은 본 발명의 플라스틱 분해효소(Wild-type, WT)와, 5가지 아미노산 위치에서 각각 알라닌으로 치환시키는 돌연변이를 유도한 플라스틱 분해효소(S158A, D203A, H234A, C200A, C236A, 각 위치는 서열번호 3의 아미노산 서열 기준임)를 이용하여 BHET(A), MHET(B) 및 PET 과립(C)을 기질로 반응을 수행한 후 생성물의 농도를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 플라스틱 분해효소를 대상으로, pH 7.5 내지 pH 10의 조건에서의 상대적 활성을 측정한 결과(A), 25 ℃ 내지 50 ℃의 조건에서 상대적 활성을 측정한 결과(B), NiCl2, FeCl2, CaCl2, CoCl2, CuCl2, MgCl2, MnSO4, K2SO4, ZnSO4, 또는 EDTA를 각각 첨가하여 반응을 수행한 후 측정한 상대적 활성을 비교한 결과(C) 및 칼슘 이온(Ca2+)을 0 mM 내지 12 mM의 농도로 각각 첨가한 조건에서 반응을 수행한 후 측정한 상대적 활성을 비교한 결과(D)를 각각 나타낸 그래프이다.
도 12 는 30 ℃ 또는 50 ℃의 온도에서 칼슘 이온을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건으로 시간의 경과에 따른 본 발명 효소의 활성 변화를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 플라스틱 분해효소
본 발명의 일 측면은 신규한 플라스틱 분해효소를 제공한다.
상기 본 발명의 플라스틱 분해효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다.
상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체 펩티드를 포함할 수 있으며, 또는 동일한 기능을 가지는 단백질 단편의 형태일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함에 따른 활성을 전체적으로 변경시키지 않는, 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 변형은 본 발명의 기술분야에 공지되어 있으며, 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 상기 펩티드 영역은 서열번호 1의 아미노산 서열뿐만 아니라 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86%이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지는 펩티드 영역을 포함하면서 동일한 효소 활성을 가지는 단백질이라면 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 영역은, 본 발명의 플라스틱 분해효소가 나타내는 플라스틱 분해 반응의 촉매 활성에 중요한 역할을 하는 영역이다. 따라서 본 발명의 플라스틱 분해효소는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 영역을 포함함에 따라, 상기 펩티드 영역을 포함하지 않거나 상기 펩티드 영역과 아미노산 서열이 상이한 펩티드를 포함하는 단백질보다 우수한 플라스틱 분해 활성을 나타낼 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하면서, 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 플라스틱 분해효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 가지는 변이체 단백질을 포함할 수 있으며, 또는 동일한 기능을 가지는 단백질 단편의 형태일 수 있다. 상기 플라스틱 분해효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 변형은 본 발명의 기술분야에 공지되어 있으며, 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서, 본 발명의 플라스틱 분해효소는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질뿐만 아니라 이와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86%이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지면서 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 효소와 동일한 효소 활성을 가지는 단백질이라면 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 플라스틱 분해효소는 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 한편, 플라스틱 분해 반응을 촉매하는 활성에 중요한 역할을 하는 영역인 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 것이므로, 우수한 플라스틱 분해 활성을 나타내는 특징이 있다. 상기 플라스틱 분해효소는 리조박터(Rhizobacter) 속 미생물로부터 유래하거나 분리되는 단백질일 수 있다. 구체적으로, 상기 리조박터 속 미생물은 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus), 리조박터 베르게니애(Rhizobacter bergeniae), 리조박터 다우시(Rhizobacter dauci), 리조박터 다우쿠스 (Rhizobacter daucus), 리조박터 풀부스(Rhizobacter fulvus), 리조박터 프로펀디(Rhizobacter profundi) 등일 수 있다.
상기 플라스틱은 PET(polyethylene terephthalate), MHET(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate), BHET(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate) 등이거나, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 상기 PET는 긴 사슬의 플라스틱 고분자로, 본 발명의 플라스틱 분해효소는 PET를 분해함으로써, 보다 작은 분자의 BHET 또는 MHET나 최종 분해물인 TPA(terephthalic acid)가 생성되는 반응을 촉매하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 상기 플라스틱 분해효소는 MHET를 분해하여 MHET 또는 TPA가 생성되는 반응이나 BHET를 분해하여 TPA가 생성되는 반응을 촉매하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소는 분자량이 55 kDa 내지 60 kDa일 수 있으며, 구체적으로, 56 kDa 내지 59 kDa, 56 kDa 내지 58 kDa 또는 57 kDa일 수 있다. 상기 플라스틱 분해효소는 동일한 구조의 단위체 2개가 결합된 동종이합체(homodimer) 형태일 수 있으며, 상기 하나의 단위체의 분자량이 25 kDa 내지 30 kDa, 구체적으로, 25 kDa 내지 29 kDa, 26 kDa 내지 28 kDa, 또는 27 kDa일 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 43 번째 시스테인, 79 번째 시스테인 또는 이들 모두에서 각각 이황화결합이 형성된 것일 수 있다. 상기 위치의 시스테인에서 이황화결합이 형성되어 있는 경우, 그렇지 않은 효소와 비교할 때, 단백질의 구조적 안정성이 증가하거나 플라스틱의 분해 반응을 촉매하는 활성이 더 높게 나타날 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열의 200 번째 시스테인, 236 번째 시스테인 또는 이들 모두에서 각각 이황화결합이 형성된 것일 수 있다. 상기 위치의 시스테인에서 이황화결합이 형성되어 있는 경우, 그렇지 않은 효소와 비교할 때, 단백질의 구조적 안정성이 증가하거나 플라스틱의 분해 반응을 촉매하는 활성이 더 높게 나타날 수 있다.
본 발명의 플라스틱 분해효소의 플라스틱 분해 활성, 구체적으로 MHET, BHET 및/또는 PET의 분해 활성은 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase가 나타내는 MHET, BHET 및 PET 분해 활성과 비교할 때, 2배 이상일 수 있다. 구체적으로, 본 발명 플라스틱 분해효소의 플라스틱 분해 활성은 이데오넬라 사카이엔시스 유래 PETase의 활성의 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 5.5배 이상 또는 6배 이상일 수 있으며, 동량의 효소를 동일한 시간 동안 플라스틱에 처리하였을 때 본 발명의 플라스틱 분해효소는 상기 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase보다 PET를 분해하는 활성이 현저하게 우수하므로, 높은 효율로 플라스틱을 분해할 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 플라스틱 분해효소는 50 ℃에서의 반감기가 2시간 이상인 것일 수 있으며, 이에 따라 열안정성(thermostability)을 가지는 것일 수 있다. 상기 반감기란 시간의 경과에 따라 효소의 활성이 최초 효소 활성의 50%로 감소되기 까지 걸리는 시간을 의미하며, 본 발명의 경우, 플라스틱을 분해하는 활성이 최초에 비해 절반의 수준으로 감소되는 데까지 소요되는 시간을 의미한다. 본 발명의 플라스틱 분해효소는 통상적으로 단백질이 변성되어 활성을 잃기 쉬운 고온 조건, 예컨대 50 ℃에서의 반감기가 2시간 이상일 수 있으며, 예를 들어 2.5시간 이상 또는 3시간 이상일 수 있다. 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase는 50 ℃ 조건에서 5분이 경과하였을 때 활성이 20% 이하로 감소되고, 10분이 경과하였을 때 활성이 사라지게 되는 특징이 있는데(Son et al., ACS Catal., 9(4): 3519-3526 (2019)), 이와는 달리 본 발명 플라스틱 분해효소는 50 ℃의 고온 조건에서도 반감기가 2시간 이상이므로 열안정성이 우수한 특징이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명 플라스틱 분해효소를 30 ℃ 및 50 ℃의 온도 조건에 두면서 활성을 측정한 결과, 30 ℃에서는 활성의 반감기가 20시간 이상으로, 50 ℃에서는 활성의 반감기가 2시간 이상인 것으로 나타났다(도 9의 c). 따라서, 본 발명의 플라스틱 분해효소는 기존의 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase와 비교할 때 열안정성이 더 우수한 특징이 있으므로 더 오랜 시간 동안 연속적인 분해 반응을 수행할 수 있으며, 50 ℃ 이상의 고온 조건에서도 안정적인 분해 반응의 촉매 효과가 나타나는 바 분해 공정의 조건을 다양하게 설정할 수 있고 반응 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다.
상기 플라스틱 분해효소는 pH 9.5 조건 및/또는 45 ℃에서 최대 활성을 나타내는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 플라스틱 분해효소는 pH 8.5 내지 pH 10.5 범위의 pH 조건에서 최대 활성의 80% 이상의 활성을 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 플라스틱 분해효소는 35 ℃ 내지 50 ℃ 범위의 온도 조건에서 최대 활성의 80% 이상의 활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 리조박터 구미필러스를 PET 성분이 포함된 배지에서 배양하거나 리조박터 구미필러스의 배양액에 PET를 투입하였을 때 PET가 분해되어 PET의 구성 단량체인 TPA가 생성되고, TPA를 이용하여 세포 생육이 관찰 되는 바 리조박터 구미필러스가 PET를 분해시켜 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 리조박터 구미필러스로부터 유래하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 BHET, MHET 및 PET를 기질로 하여 이를 분해하는 활성이 있음을 확인하였으며, MHET, BHET 및 PET의 분해 관련 활성은 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase의 활성의 6배 이상인 것으로 확인되어 매우 우수한 PET 분해 효과를 나타냄을 확인하였다.
2. 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 다른 측면은 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 대표적으로 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열은, 상기 플라스틱 분해효소, 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 상기 플라스틱 분해효소의 활성이나 상기 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열이란 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86%이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 상동성을 가지는 염기서열을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.
결국, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 4의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 가지면서, 이로부터 발현되는 단백질이 상기 플라스틱 분해효소와 동일한 효소 활성을 가진다면, 이는 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함된다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터에 클로닝된 것일 수 있고, 상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 벡터는 본 발명의 플라스틱 분해효소를 생산하고자하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 조합할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선별하기 위한 선별 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 플라스틱 분해효소의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 플라스틱 분해효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 플라스틱 분해효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 플라스미드 벡터인 pET-28a에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET-28a 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면, 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체는 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내로 형질도입된 것일 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체가 숙주세포 내로 도입된 것일 수 있고, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 숙주세포의 세포질에 존재하거나 또는 상기 숙주세포의 염색체 내로 도입될 수도 있다.
또한, 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터에 포함된 재조합 벡터의 상태로 숙주세포 내로 도입될 수도 있다.
상기 숙주세포는 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α 등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 통상의 기술자가 용이하게 선택할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드나 상기 재조합 벡터는 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기충격법 등을 통해 상기 숙주세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 대장균에 형질 전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현되는 플라스틱 분해효소는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 상기 플라스틱 분해효소를 용이하게 대량 생산 할 수 있다.
3. 플라스틱 분해용 조성물 및 플라스틱의 분해 방법
본 발명의 또 다른 일 측면은, 플라스틱 분해용 조성물을 제공한다.
상기 플라스틱 분해용 조성물은, 본 발명의 상기 플라스틱 분해효소 및 이를 생산할 수 있는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
상기 플라스틱은 MHET, BHET, PET 등이나, 또는 이들의 유도체일 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소를 생산할 수 있는 미생물은 리조박터(Rhizobacter) 속 미생물 또는 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터가 형질도입된 형질전환체일 수 있다.
상기 리조박터 속 미생물은 본 발명의 플라스틱 분해효소를 발현시켜 생산할 수 있는 미생물로, 상기 플라스틱 분해효소를 생산할 수 있는 능력이 있는 균주라면 야생형 균주이든 변이체 균주이든 무관하게 이용될 수 있다. 예컨대, 상기 리조박터 속 미생물은 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus), 리조박터 베르게니애(Rhizobacter bergeniae), 리조박터 다우시(Rhizobacter dauci), 리조박터 다우쿠스 (Rhizobacter daucus), 리조박터 풀부스(Rhizobacter fulvus), 리조박터 프로펀디(Rhizobacter profundi) 등일 수 있다. 상기 리조박터 속 미생물들은 공지의 미생물로, 통상의 기술자가 어렵지 않게 얻을 수 있어 공중의 이용이 가능한 미생물이다. 상기 리조박터 속 미생물은 이를 배양한 배양액의 형태로 본 발명의 플라스틱 분해용 조성물에 포함될 수 있다. 상기 리조박터 속 미생물은 플라스틱이 포함된 배지에서 이들을 이용해 성장이 가능하며 상기 플라스틱 성분들을 분해하여 탄소원으로 이용할 수 있는 특징이 있다. 따라서, 리조박터 속 미생물 또는 이의 배양액은 상기 플라스틱를 분해하기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 플라스틱 분해효소에 관한 설명은 앞서 '1. 신규 플라스틱 분해효소 '에서 이에 대해 설명한 것과 동일하며, 상기 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터가 형질도입된 형질전환체에 관한 설명은 앞서 '2. 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체 '에서 이들에 대해 설명한 것과 동일하다.
상기 플라스틱 분해효소는 플라스틱을 분해하는 활성이 우수하므로 상기 효소 및/또는 이를 발현시켜 생산할 수 있는 형질전환체는 플라스틱을 분해하기 위한 용도로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 플라스틱 분해용 조성물은 칼슘 이온(Ca2+)을 더 포함할 수 있다. 상기 칼슘 이온은 본 발명의 상기 플라스틱 분해효소의 플라스틱 분해 활성을 향상시킬 수 있으므로, 상기 플라스틱 분해효소를 생산할 수 있는 상기 리조박터 속 미생물이나 상기 플라스틱 분해효소 및/또는 상기 플라스틱 분해효소를 생산할 수 있는 상기 형질전환체와 함께 칼슘 이온이 포함될 경우, 상기 본 발명의 조성물은 MHET, BHET 또는 PET 등의 분해 효율이 더욱 향상될 수 있다. 상기 칼슘 이온은 CaCl2의 형태로 본 발명의 조성물에 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 칼슘 이온은 완충용액, 예컨대 CHES 완충용액에 용해된 형태로 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
상기 칼슘 이온은 0.5 mM 내지 15 mM의 농도로 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 칼슘 이온은 0.5 mM 내지 15 mM, 1 mM 내지 15 mM, 3 mM 내지 12 mM, 5 mM 내지 12 mM, 6 mM 내지 11 mM, 6 mM 내지 10 mM, 7 mM 내지 10 mM, 또는 7 mM 내지 9 mM의 농도로 포함될 수 있다. 칼슘 이온이 상기와 같은 범위의 농도로 본 발명의 조성물에 포함될 경우, 본 발명의 플라스틱 분해효소의 활성이 향상될 수 있으며 예컨대 칼슘 이온이 포함되지 않는 경우의 효소 활성을 100%라고 할 때, 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 또는 160% 이상의 활성을 나타낼 수 있어, 본 발명의 조성물의 플라스틱 분해 효율을 현저하게 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 플라스틱 분해용 조성물은 Ni2+, Fe2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, K+, Zn2+ 및 EDTA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 이온이 10 mM 이하의 농도로 본 발명 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 이온은 본 발명의 조성물에 10 mM 이하, 8 mM 이하, 6 mM 이하, 5 mM 이하, 3 mM 이하, 2 mM 이하, 1 mM 이하, 0.5 mM 이하, 0.1 mM 이하, 0.01 mM 이하, 0.001 mM 이하 또는 0 mM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 이온들은 본 발명의 플라스틱 분해효소의 플라스틱 분해 반응의 촉매 활성을 감소시킬 수 있으므로, 본 발명의 플라스틱 분해용 조성물은 상기 이온들을 포함하지 않거나, 최소의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 플라스틱의 분해 방법을 제공한다.
상기 플라스틱의 분해 방법은 본 발명의 상기 플라스틱 분해용 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계를 포함한다.
상기 플라스틱은 MHET, BHET, PET 등이나, 이들의 유도체일 수 있다
상기 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계는, pH 8.5 내지 pH 10.5인 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 pH는 pH 9.0 내지 pH 10.5, 8.5 내지 pH 10.0 또는 9.0 내지 pH 10.0의 범위일 수 있다. 본 발명의 플라스틱 분해효소는 상기 pH 범위에서 보다 높은 활성을 나타내어 최대 활성의 80% 이상의 활성을 나타낼 수 있는바, 상기 pH 범위의 조건에서 본 발명의 조성물을 플라스틱에 처리할 경우, 플라스틱의 분해 효율을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
상기 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계는, 35 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 온도는 35 ℃ 내지 50 ℃, 40 ℃ 내지 50 ℃ 또는 42 ℃ 내지 48 ℃의 범위일 수 있다. 본 발명의 플라스틱 분해효소는 상기 온도 범위에서 보다 높은 활성을 나타내어 최대 활성의 80% 이상의 활성을 나타낼 수 있는바, 상기 온도 범위의 조건에서 본 발명의 조성물을 플라스틱에 처리할 경우, 플라스틱의 분해 효율을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
[실험예 1]
리조박터 구미필러스( Rhizobacter gummiphilus )의 PET 분해 활성 확인
리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus)가 PET(polyethylene terephthalate, CAS 25038-59-9, Sigma-Aldrich, St Louis, 미국)를 분해하는 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 리조박터 구미필러스를 이용해 BHET(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate, CAS 959-26-2, Sigma-Aldrich)가 함유된 고체 배지에서 클리어 존 어세이(clear zone assay)를 수행하였고, PET 과립(granule)이 포함된 액체 배지에서 배양 후 PET의 분해 여부를 확인하였다.
먼저, 야생형의 리조박터 구미필러스 NS21(NBRC 109400, Tokyo, 일본) 균주를 BHET(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate) 함유 영양 아가 플레이트(nutrient-BHET agar plate)에서 30 ℃ 온도 조건에서 21일 동안 배양하면서 클리어 존이 형성되는지 여부를 확인하였다. BHET는 배지 내에 각각 2.5 mM 또는 10 mM의 농도로 함유되도록 수행하였다. 그 결과, 배양 후 21일이 경과한 시점에 리조박터 구미필러스의 콜로니 주변의 BHET가 소모되어 클리어 존이 관찰되기 시작하였으며, BHET가 2.5 mM의 농도인 경우 클리어 존이 더 넓게 형성되었다(도 1). 이는 BHET의 농도가 더 적을 경우 이를 이용하기 위해 더 멀리 존재하는 BHET까지 이용함에 따라 나타난 결과로, 상기와 같은 실험 결과를 통해 리조박터 구미필러스가 BHET를 이용하거나 분해하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 리조박터 구미필러스가 PET나 BHET를 탄소원으로 이용하는지 여부를 확인하기 위해, 최소배지(minimal medium, MM)에 PET 과립 또는 BHET를 첨가한 배지 또는 첨가하지 않은 배지에서 리조박터 구미필러스를 배양하고 그 결과를 확인하였다. 15 ㎖의 최소배지가 포함된 100 ㎖ 글래스 튜브에서 리조박터 구미필러스를 배양하였으며, 상기 최소배지는 KH2PO4 1.7 g, Na2HPO4·12H2O 9.8 g, (NH4)2SO4 1.0 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, FeSO4·7H2O 9.5 mg, MgO 10.75 ㎎, CaCO3 2 ㎎, ZnSO4·7H2O 1.44 ㎎, MnSO4·4H2O 1.12 ㎎, CuSO4·5H2O 0.25 ㎎ 및 CoSO4·7H2O 0.06 ㎎가 포함되고 HCl이 51.3 ㎕ 농도인 것을 1 ℓ의 물로 희석하여 이용하였다. 30 ℃, 200 rpm의 조건으로 28일 동안 배양하였으며, PET 과립을 첨가한 배지의 경우 25 ㎎의 PET를 더 첨가한 배지를 이용하였다. 그 결과, 28일 경과 후의 시점에서 PET가 첨가된 배지에서만 리조박터 구미필러스가 성장하였다(도 2의 (A)). 또한, 리조박터 구미필러스를 첨가하지 않은 PET 과립 첨가 배지(대조군)에서는 PET 양의 변화가 거의 없었던 것과는 달리, 리조박터 구미필러스를 PET 첨가 배지에서 배양한 경우에는 리조박터 구미필러스가 성장함에 따라 PET의 양이 7일차부터 감소하여 28일 후에는 최종적으로 10 ㎎ 정도까지 감소된 것으로 확인되었다(도 2의 (B)). 그리고 상기 배지에 첨가되었던 PET 과립을 PBS로 3회 세척한 후 65 ℃에서 24시간 건조시킨 후 60초간 금 코팅을 수행한 다음, 이의 표면을 SEM(field-emission scanning electron microscope, FE-SEM, Quanta250 FEG)으로 관찰한 결과, 리조박터 구미필러스를 첨가하여 배양하였던 PET 과립의 경우에만 표면이 훨씬 더 손상된 것으로 확인되어, 상기 PET 과립의 표면이 리조박터 구미필러스에 의해 분해되었음을 알 수 있었다(도 3). 나아가, 배양이 끝난 후의 배지를 원심분리하여 상층액을 HPLC(Agilent 1260)로 분석하였다. 그 결과, PET를 첨가하지 않고 리조박터 구미필러스를 배양시킨 경우에는 PET의 최종 분해 산물인 TPA(terephthalic acid)가 검출되지 않았으나, PET와 함께 리조박터 구미필러스를 배양시킨 상층액에서는 TPA가 검출되었다(도 4의 (A)). 또한,
리조박터 구미필러스를 첨가하지 않은 BHET 첨가 배지(대조군)와 리조박터 구미필러스를 PET 첨가 배지에서 배양한 후의 배지를 원심분리하여 상층액을 HPLC(Agilent 1260)로 분석하였다. 그 결과, 리조박터 구미필러스를 첨가하지 않은 BHET 첨가 배지(대조군)에서는 BHET 외의 다른 화합물이 검출되지 않았으나, 리조박터 구미필러스를 BHET 첨가 배지에서 배양한 경우에는 BHET 외에 MHET와 TPA가 함께 검출되었다(도 4의 (B)).
[실험예 2]
본 발명 플라스틱 분해효소의 PET 분해 활성 확인 및 종래 PETase와의 활성 비교
리조박터 구미필러스가 PET를 분해하는 활성이 있음을 확인한 것에 더하여, 상기 리조박터 구미필러스로부터 분리한 본 발명의 플라스틱 분해효소를 이용해 이의 활성을 확인하였다. 이때, 종래 PET 분해 활성이 있는 것으로 알려져 있던 이데오넬라 사카이엔시스 유래의 IsPETase의 활성을 함께 측정하였고, 각 효소의 유전자를 재조합시킨 세포로부터 이들 효소의 발현 정도를 확인하여 비교하였다.
먼저, 본 발명의 리조박터 구미필러스 유래 플라스틱 분해효소 및 IsPETase의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 바탕으로 pET-28a 발현 벡터에 재조합하고 이를 대장균 BL21pLysS에 형질전환시킨 후 단백질의 발현을 유도하였다. 발현된 총 단백질을 대상으로 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 블루 염색을 통해 발현/정제된 각 효소의 양을 비교하였다. 분자량 마커 단백질로는 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20 및 15 kDa의 단백질을 이용하였다. 그 결과, 본 발명의 플라스틱 분해효소가 IsPETase에 비해 더 많은 양으로 생성된 것으로 확인되었다(도 5). 따라서, 각 효소를 암호화하는 서열이 형질전환된 재조합 세포를 이용하여 동일한 조건에서 두 효소를 발현시켜 생산하고자 할 때, 본 발명의 플라스틱 분해효소의 생산 효율이 IsPETase에 비해 더 우수한 것임을 확인할 수 있었으며, PET 분해를 위한 목적으로 효소를 생산하여 이용하고자 할 때 더 유리한 장점이 있어 산업적 이용가능성이 더 우수한 특징이 있음을 확인할 수 있었다.
그리고, 본 발명의 플라스틱 분해효소를 이용하여 실제로 PET 성분을 분해시키는 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 효소를 이용하여 MHET(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate, CAS 1137-99-1, Acrotein Chembio inc, Hoover, 미국), BHET 및 PET 과립을 기질로 반응을 진행시킨 다음, 긴 중합체가 분해되어 나타나는 MHET나 최종 생성물인 TPA의 농도를 측정함으로써 활성을 확인하였다. MHET, BHET는 1 mM의 농도로 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 포함시켜 90 ㎍/㎖의 플라스틱 분해효소와 45 ℃에서 30분 동안 반응시켰고, PET 과립은 25 ㎎을 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 포함시켜90 ㎍/㎖의 플라스틱 분해효소와 45 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 그 결과, 본 발명의 플라스틱 분해효소를 이용해 MHET를 기질로 반응을 진행하였을 때 TPA가 생성되었고, BHET 또는 PET 과립을 기질로 반응을 진행하였을 때 MHET 및 TPA가 생성되어, 이들을 분해하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 플라스틱 분해효소의 경우 MHET나 BHET에 대해서는 종래 Is PETase에 비해 분해 활성이 낮은 것으로 확인되었으나(도 6의 (A), (B)), PET 과립에 대해서는 종래 IsPETase에 비하여 6배 이상 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 6의 (C)).
상기와 같은 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 신규한 플라스틱 분해효소는 PET를 비롯해 MHET, BHET를 분해할 수 있는 활성이 있는 효소임이 분명하고, 종래 알려져 있던 IsPETase와 비교할 때에도 재조합 발현 효율이 더 우수할 뿐만 아니라, 과립 상태의 PET에 대한 분해 활성 역시 IsPETase에 비해 현저하게 우수한 특징이 있는 것임을 알 수 있었다.
[실험예 3]
본 발명 플라스틱 분해효소의 생화학적 특징 확인
[3-1] 플라스틱 분해효소의 아미노산 서열 분석 및 분자량 확인
본 발명의 플라스틱 분해효소의 아미노산 서열을 비롯하여 분자량 및 분자 형태 등 각종 생화학적 특성을 분석하였다.
먼저, 본 발명의 플라스틱 분해효소의 아미노산 서열을 분석한 결과, 상기 플라스틱 분해효소는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 영역을 포함하며, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질인 것으로 확인되었다. 그리고 본 발명 효소의 아미노산 서열을 바탕으로, 종래 PET 분해 활성이 있는 것으로 알려진 이데오넬라 사카이엔시스(Ideodella sakaienesis) 유래의 IsPETase의 아미노산 서열 정보와 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 플라스틱 분해효소와 IsPETase의 아미노산 서열은 72%의 동일성이 있음을 확인하였고, 이로부터 본 발명의 플라스틱 분해효소는 종래 알려졌던 IsPETase 효소와는 아미노산 서열이 상이한 전혀 다른 새로운 플라스틱 분해효소임을 확인할 수 있었다.
다음으로, 본 발명의 플라스틱 분해효소의 분자량을 측정하였다. 이를 위해 먼저 상기 플라스틱 분해효소의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 바탕으로 pET-28a 발현 벡터에 재조합하고 이를 대장균 BL21pLysS에 형질전환시킨 후 단백질의 발현을 유도하였다. 발현 후 정제시킨 플라스틱 분해효소를 대상으로 분자량 마커 단백질(Sigma Aldrich)을 이용하여 함께 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과, 가용성(soluble) 형태의 상기 플라스틱 분해효소는 SDS-PAGE 결과 28 kDa의 분자량을 가지는 하나의 밴드를 형성하여(도 7), 263개의 아미노산에 6개의 히스티딘 잔기가 더해진 형태임을 확인할 수 있었다. 이에 더하여, MALDI-TOF-MS(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometer)와 HPLC system을 이용한 크기 배제 크로마토그래피를 통해 플라스틱 분해효소의 분자량을 측정하였다. 그 결과, 전체 단백질의 분자량은 57 kDa으로 측정되어(도 8 및 도 9), 상기 SDS-PAGE를 통한 분석 결과와 비교할 때 본 발명의 플라스틱 분해효소는 동종이합체(homodimer)의 형태로 존재할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[3-2] 플라스틱 분해효소의 활성에 영향을 미치는 아미노산 잔기 확인
나아가, 본 발명 플라스틱 분해효소에서 촉매 활성을 나타내는 부위와 이황화결합 위치 등을 확인하였다. 상기 효소를 암호화하는 DNA 주형을 PCR을 통해 증폭시킨 다음, 마크로젠(Macrogen, Seoul, 대한민국)에 의뢰하여 제작한 프라이머와 site-directed mutagenensis 키트(Quick-Change kit, Stratagene, La Jolla, 미국)를 통해 상기 DNA 주형의 특정 위치에서 돌연변이를 유도하였다. 돌연변이된 DNA는 pET-28a 벡터를 이용해 대장균 BL21pLysS에 형질전환시켰고 이로부터 발현시킨 돌연변이 플라스틱 분해효소를 이용하여 MHET, BHET 및 PET 과립을 기질로 반응을 진행시킨 후 이들의 농도 변화를 확임함으로써 각 돌연변이 효소의 활성을 확인하였다. 반응의 촉매 활성과 관련된 잔기로 예상되는 서열번호 3의 서열을 기준으로 158번째 세린, 203번째 아스파르트산 및 234번째 히스티딘(서열번호 1의 서열을 기준으로 각각 1번째 세린, 46번째 아스파르트산, 77번째 히스티딘)을 각각 알라닌으로 치환시킨 형태의 S158A, D203A, H234A 돌연변이 단백질과, 이황화결합이 형성되는 위치로 예상되는 서열번호 3의 서열을 기준으로 200번째 및 236번째 시스테인(서열번호 1의 서열을 기준으로 각각 43번째 및 79번째 시스테인)을 각각 알라닌으로 치환시킨 형태의 C200A 및 C236A 돌연변이 단백질을 이용하였다. 반응은 MHET, BHET는 1 mM의 농도로 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 포함시켜 90 ㎍/㎖의 상기 돌연변이 플라스틱 분해효소와 45 ℃에서 30분 동안 반응시켰고, PET 과립은 25 ㎎을 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 포함시켜90 ㎍/㎖의 상기 돌연변이 플라스틱 분해효소와 45 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 그 결과, 야생형(WT)의 플라스틱 분해효소와 비교할 때 상기 5가지 돌연변이 단백질을 이용한 반응 시 활성이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다(도 10). 상기와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 플라스틱 분해효소의 경우 돌연변이를 유도했던 S158, D203 및 H234 잔기가 반응의 촉매 작용에 중요한 역할을 하며 C200 및 C236 위치의 이황화결합의 형성이 플라스틱 분해 활성에 큰 영향을 미친다는 점을 확인할 수 있었다.
[실험예 4]
본 발명 플라스틱 분해효소의 반응 조건에 따른 활성 확인
[4-1] pH 및 온도 조건에 따른 효소 활성 확인
본 발명의 플라스틱 분해효소의 활성이 pH 및 온도 변화에 따라 어떻게 변화하는지 여부를 확인하였다. 먼저 pH 변화에 따른 반응 활성을 확인하기 위하여, pH를 pH 7.5에서 pH 10까지 변화시켜 반응을 수행하였고 이를 위해 50mM의 HEPES 완충용액(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid, pH 7.5-8.0), 50 mM의 EPPS 완충용액(3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-propanesulfonic acid, pH 8.0-8.5) 그리고 50 mM의 CHES 완충용액(pH 8.5-10.0)을 이용해 온도를 45 ℃로 고정하여 반응을 진행시켰다. 온도 변화에 따른 활성을 확인하기 위하여, 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)을 이용해 pH 조건을 고정시킨 상태에서 온도를 25 ℃부터 50 ℃까지 높여 반응을 수행하였다. 상기 완충용액에는 기질로 1 mM의 BHET와 90 ㎍/㎖의 효소를 포함시켜 반응을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 플라스틱 분해효소는 상기 pH 범위에서 모두 40% 이상의 활성을 나타냈으며 pH 8.5에서 약 80%의 활성을, pH 9.0 내지 pH 10 범위에서 90% 이상의 활성을 나타냈고 pH 9.5 조건에서 최대 활성을 보였다(도 11의 (A)). 또한, 상기 온도 범위에서 60% 이상의 활성을 나타냈으며 35 ℃ 내지 50 ℃ 범위에서 약 80% 이상의 활성을 나타냈고 45 ℃에서 최대 활성을 보였다(도 11의 (B)). 따라서 본 발명의 효소는 pH 9.5, 45 ℃ 조건에서 가장 활성이 우수한 특징이 있음을 확인할 수 있었다.
[4-2] 금속 이온 첨가에 따른 효소 활성 확인
본 발명의 플라스틱 분해효소의 활성이 첨가되는 금속 이온의 종류에 따라 어떻게 변화하는지 확인하였다. 이를 위하여, 1 mM의 BHET와 90 ㎍/㎖의 효소를 포함하는 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 NiCl2, FeCl2, CaCl2, CoCl2, CuCl2, MgCl2, MnSO4, K2SO4, ZnSO4, 또는 EDTA를 각각 첨가하여 45 ℃에서 30분 동안 반응을 수행하였으며 상기 금속 이온들은 1 mM 또는 10 mM로 농도를 달리하여 첨가하였다.
그 결과, 10 mM의 칼슘 이온(Ca2+)을 첨가하여 반응을 수행한 경우 이외에 다른 금속 이온을 첨가한 경우에는, 아무런 금속 이온을 첨가하지 않고 반응을 수행한 대조군과 비교할 때 효소의 상대적 활성이 더 낮은 것으로 측정되었다(도 11의 (C)). 따라서, 칼슘 이온을 첨가하였을 경우에만 본 발명의 플라스틱 분해효소의 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 칼슘 이온의 농도를 변화시켜 첨가하면서 본 발명의 플라스틱 분해효소의 반응을 진행시켜 그 활성을 측정함으로써, 최적의 칼슘 이온 농도를 확인하였다. 구체적으로, 칼슘 이온을 0 mM부터 12 mM까지 그 농도를 증가시켜 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.5)에 첨가하여 45 ℃의 온도에서 30분 동안 반응을 수행하여 활성을 확인하였다. 그 결과, 칼슘 이온을 첨가하지 않은 경우의 효소 활성을 100%라고 할 때, 0.8 mM의 칼슘 이온을 첨가하는 경우 효소의 상대적 활성이 약 160% 수준까지 증가하여 최대 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 11의 (D)).
나아가, 칼슘 이온의 존재 하에 본 발명 플라스틱 분해효소의 안정성을 확인하기 위하여, 30 ℃ 또는 50 ℃의 온도에서 칼슘 이온을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건으로 시간의 경과에 따른 효소의 활성 변화를 측정함으로써, 효소의 안정성을 측정하였다.
그 결과, 먼저 본 발명의 플라스틱 분해효소는 이의 효소 활성이 절반이 되기까지 걸리는 시간인 반감기가, 30 ℃ 조건에서는 칼슘 이온이 존재하지 않을 때에도 20시간 이상인 것으로 측정되었고, 50 ℃의 고온 조건에서도 5시간 이상인 것으로 확인되어 열안정성이 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 칼슘 이온을 첨가한 경우, 30 ℃와 50 ℃의 온도 모두에서 효소의 활성이 더 오래 유지되는 것을 확인하여 칼슘 이온에 따라 효소의 안정성이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었으며, 특히, 칼슘 이온을 첨가하여 50 ℃ 조건에서 25시간 동안 반응시킬 경우 반감기가 현저하게 증가하여 25시간이 경과한 시점에도 최초 대비 50% 이상의 활성을 유지함을 확인하여 높은 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 12).
상기에서는 본 발명의 대표적인 실험예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실험예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 영역을 포함하는 플라스틱 분해효소.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 플라스틱 분해효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 플라스틱 분해효소.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 플라스틱 분해효소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 플라스틱 분해효소.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 플라스틱 분해효소는 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus) 유래인 것인, 플라스틱 분해효소.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 플라스틱은 PET(polyethylene terephthalate), MHET(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate) 및 BHET(bis(2-hydroxyethyl)terephthalate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 플라스틱 분해효소.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 플라스틱 분해효소는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 43번째 시스테인 및 79 번째 시스테인에서 각각 이황화결합이 형성된 것인, 플라스틱 분해효소.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플라스틱 분해효소는 50 ℃에서의 반감기가 2시간 이상인 것으로 열안정성(thermostability)을 가지는 것인, 플라스틱 분해효소.
  8. 청구항 1의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  10. 청구항 8 또는 청구항 9의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  11. 청구항 1의 플라스틱 분해효소 및 이를 생산할 수 있는 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 플라스틱 분해용 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 플라스틱 분해효소를 생산할 수 있는 미생물은 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus) 또는 청구항 1의 플라스틱 분해효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체인 것인, 플라스틱 분해용 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 조성물은 칼슘 이온(Ca2+)을 더 포함하는 것인, 플라스틱 분해용 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 칼슘 이온(Ca2+)은 0.5 mM 내지 15 mM의 농도로 조성물에 포함되는 것인, 플라스틱 분해용 조성물.
  15. 청구항 11 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계를 포함하는, 플라스틱의 분해 방법.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계는, pH 8.5 내지 pH 10.5인 조건에서 수행되는 것인, 플라스틱의 분해 방법.
  17. 청구항 15에 있어서,
    상기 조성물을 플라스틱에 처리하는 단계는, 35 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 수행되는 것인, 플라스틱의 분해 방법.
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