KR102584139B1

KR102584139B1 - 리조박터 구미필러스로부터 유래한 신규한 PETase 및 이의 변이체

Info

Publication number: KR102584139B1
Application number: KR1020210027266A
Authority: KR
Inventors: 김경진
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2023-10-04
Also published as: KR20220123831A

Abstract

리조박터 구미필러스로부터 유래한 PETase, 이의 활성을 증가시킨 변이체, 이를 발현하는 대장균 변이균주 및 이를 포함하는 PET 분해용 조성물을 제공한다.

Description

리조박터 구미필러스로부터 유래한 신규한 PETase 및 이의 변이체{Novel PETase derived from Rhizobacter gummiphilus and its variants}

본 발명은 리조박터 구미필러스로부터 유래한 신규한 PETase 및 이의 변이체에 관한 것이다.

폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)는 포장제, 용기, 및 합성섬유에 널리 사용되는 플라스틱으로 에틸린글리콜(EG) 및 테레프탈레이트(TPA)를 중합하여 생산된다. PET은 자연적으로 분해되는 속도가 너무 느리기 때문에 매립지 및 해양 등에 축적되어 심각한 환경 문제를 초래하고 있다.

PET을 탄소원으로 사용하는 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)는 PET 분해 연구 분야에서 각광받았다. 이데오넬라 사카이엔시스는 중온성(mesophilic) 박테리아이며, PET에 대한 내향 가수분해효소(endo-hydrolase)인 IsPETase 및 MHET에 대한 가수분해효소인 IsMHETase(mono(2-hydroxyethyl)terephthalate hydrolase)를 생산한다.

우수한 PET(Polyethylene terephthalate) 가수분해효소를 개발하기 위해서는 PET 분해 메커니즘에 대한 정확한 이해가 필요하다. 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)에서 유래한 PET 가수분해효소(IsPETase)를 비롯한 여러 종류의 PET 분해효소에 대한 연구가 진행되었으나, 이들이 기질을 분해하는 분자 메커니즘에 대한 이해는 여전히 충분하지 않다.

미세결정성 PET(microcrystalline PET)에 대해 IsPETase와 유사한 가수 분해 활성을 가지고 있지만 저결정도 PET 필름(low crystallinity PET film)에 대해서는 구별되는 활성을 갖는 Rhizobacter gummiphilus (RgPETase) 유래 신규 PET 가수 분해 효소를 보고한다. RgPETase의 구조 분석에 따르면, RgPETase는 높은 PET 가수분해 활성을 위한 IsPETase의 주요 구조적 특징을 공유하지만 표면노출 영역(surface-exposed region)에서 구별되는 구조를 가지고 있다. RgPETase는 워블 트립토판 함유 루프 (wobbling tryptophan containing loop, WW-loop)의 고유한 형태를 가지며 루프의 정전기 표면 전하가 변화함으로써 PET 분해 활성에 큰 영향을 미친다. 또한 정전기 표면 전하의 활성에 대한 영향은 위치에 따라 달라진다. 이 결과는 아직 미확인된 PET 분해 메커니즘의 규명에 기초가 되는 중요한 정보를 제공한다.

대한민국 공개공보 제10-2020-0017321호(2020.02.18)

일 구체예에 따르면 리조박터 구미필러스에서 유래한 PETase 및 이의 활성이 증가한 변이체를 제공한다.

일 양상은 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus)로부터 유래한 RgPETase의 변이체로서, 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해서 하기 (a) 내지 (f)의 변이 중 하나의 변이를 포함하는 서열로 이루어지는 RgPETase 변이체를 제공한다.

서열번호 1의 서열에 대한 (a) 내지 (f)의 변이는 다음과 같다. (a) 45번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (b) 57번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (c) 130번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (d) 169번째 K가 A로 치환; (e) 221번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (f) 281번째 R이 A, D 또는 E로 치환.

상기 (a), (b), (c), (e)는 활성부위 고원에서 먼 곳에 위치한 아르기닌(R) 잔기로서, 양전하를 가지는 아르기닌을 중성의 알라닌, 음전하를 가지는 아스파라트산(D), 또는 음전하를 가지는 글루탐산(E)로 치환한 것이다. 일 실시예에 따르면 (a), (b), (c), 또는 (e)의 치환에 의해 PET 분해 활성이 1.6 배 내지 1.7배로 현저히 상승하였으며, 음전하를 가지는 글루탐산으로 치환한 것의 활성이 가장 높았다. 상기 위치에서 양전하를 중성 또는 음전하를 가지는 아미노산 치환에 의해 활성이 상승하였으므로, 글루탐산과 구조 및 전하가 유사한 아스파르트산의 치환도 활성 상승 효과를 예상할 수 있다.

상기 (f)는 활성부위 고원에 인접한 아르기닌(R) 잔기로서, 양전하를 가지는 아르기닌을 중성의 알라닌, 음전하를 가지는 아르파라트산(D), 또는 음전하를 가지는 글루탐산(E)로 치환한 것이다. 일 실시예에 따르면 (f) 치환에 의해 PET 분해 활성이 1.5 배 내지 1.9배로 현저히 상승하였으며, 중성인 알라닌으로 치환한 것의 활성이 가장 높았다. 상기 위치에서 양전하를 중성 또는 음전하를 가지는 아미노산 치환에 의해 활성이 상승하였으므로, 글루탐산과 구조 및 전하가 유사한 아스파르트산의 치환도 활성 상승 효과를 예상할 수 있다.

상기 (d)는 음전하를 가지는 Glu186과 염다리를 형성하는 양전하를 가지는 라이신(K) 잔기를 중성의 알라닌으로 치환한 것이다. 일 실시예에 따르면, 염다리를 형성하는 Lys169와 Glu186을 각각 또는 모두 알라닌으로 치환한 변이체들 중에서 오직 Lys169의 알라닌 치환만 PET 분해 활성이 증가하였다.

다른 양상은 리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus)로부터 유래한 RgPETase의 변이체로서, 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해서 하기 (i) 내지 (vi)의 변이 중 하나의 변이를 포함하는 서열로 이루어지는 RgPETase 변이체를 제공한다.

서열번호 2의 서열에 대한 (i) 내지 (vi)의 변이는 다음과 같다. (i) 20번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (ii) 32번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (iii) 105번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (iv) 144번째 K가 A로 치환; (v) 196번째 R이 A, D 또는 E로 치환; (vi) 256번째 R이 A, D 또는 E로 치환.

상기 서열번호 2의 서열은 서열번호 1에서 본래의 신호펩티드를 암호화하는 서열 25개를 제외한 서열이며, 자세한 내용은 상술한 바와 동일하다.

상기 RgPETase 변이체는 N-말단에 신호펩티드로서 SP_DSbA, SP_PelB, SP_LamB, SP_SurA, SP_MalE, 또는 SP_TolB의 아미노산 서열이 연결된 것일 수 있다.

상기 신호 펩티드(Signal peptide; SP)는 세포내에서 합성된 단백질이 정확한 위치로 이동할 수 있게 도와주는 짧은 서열로, 주로 해당 단백질의 N-말단에 5~16개의 아미노산 길이로 붙어있으며 단백질이 정확한 위치로 이동하면 제거되는 서열이다.

상기 SP_DSbA는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 SP_PelB는 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 SP_LamB는 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 SP_SurA는 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 SP_MalE는 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있고, 상기 SP_TolB는 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 신호펩티드에 의하면 RgPETase 또는 이의 변이체를 주변세포질(periplasm)에 발현시킬 수 있으며, 세포질에 발현시키는 것보다 가용성 발현을 증가시킬 수 있다. 특히, SP_PelB, SP_LamB, 또는 SP_MalE가 연결되면 주변 세포질 발현이 현저히 우수할 수 있다.

또 다른 양상은 야생형 RgPETase 및 제1항 내지 제4항의 RgPETase 변이체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 야생형 RgPETase는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 야생형 RgPETase 및 상기 RgPETase 변이체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 발현하는 대장균 변이균주를 제공한다.

상기 변이균주는 PETase 생산 균주일 수 있다.

상기 야생형 RgPETase 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열은 대장균에 대해 코돈 최적화된 서열일 수 있다.

상기 변이균주는 야생형 RgPETase 또는 이의 변이체를 암호화하는 벡터를 도입함으로써 제작할 수 있다. 상기 벡터는 암호화된 단백질의 발현을 조절하는 프로모터(promoter)를 더 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있다. 또한, 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터) 등이 조절 부위로서 이용될 수 있다.

상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들면 T7/lac 프로모터를 가지고 있어 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의해 단백질의 발현이 유도되는 pET-22b(+)가 사용될 수 있다.

상기 벡터는 발현된 효소의 정제를 용이하게 하기 위하여, C-말단에 다른 서열이 연결될 수도 있다. 상기 연결될 수 있는 서열은 예를 들면, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열로 인하여, 재조합 PETase를 생산하는 생산 균주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제될 수 있다. 한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

상기 벡터를 도입하기 위한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 이용될 수 있다.

형질전환 과정에 있어서 벡터 등을 숙주 세포 내로 운반하는 방법으로는, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al.,Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac.Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 또는 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988))을 이용할 수 있다.

상기 변이 균주를 이용하여 재조합 PETase를 생산할 수 있다. 구체적으로, 상기 변이 균주를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주로부터 RgPETase 또는 이의 변이체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 변이 균주의 배양 조건은 형질전환된 숙주 세포의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 온도가 25 내지 40℃이고, pH가 6 내지 8인 것이 바람직하다. 이러한 조건에서 생산된 PET 분해효소는 PET 분해 활성이 우수하며, 높은 수율로 대량 생산이 가능하다.

또 다른 양상은 야생형 RgPETase 및 상기 RgPETase 변이체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해용 조성물, 또는 상기 RgPETase 또는 이의 변이체를 생산하는 대장균 변이균주를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해용 조성물을 제공한다.

상기 PET 분해용 조성물은 상기 RgPETase 또는 이의 변이체를 생산하는 균주를 포함할 수 있으며, 상기 균주로부터 생산된 RgPETase 및/또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 PET 분해용 조성물은 MHET를 분해하는 효소 또는 이를 생산하는 균주를 더 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 PET 분해용 조성물 및 PET을 접촉시키는 단계를 포함하는 PET 분해 방법을 제공한다. 상기 접촉을 통해 RgPETase가 PET과 반응하게 된다. 반응 조건은 효소 활성이 나타날 수 있도록 온도가 30℃이상이고, 시간이 24시간 이상인 것이 바람직하다. 특히, 상기 재조합 효소들은 높은 온도에서도 장시간 동안 활성이 유지되므로, PET의 분해능을 가장 향상시키기 위해 효소와 PET를 40℃이상에서 72시간 이상 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 이러한 방법을 통해, PET는 에틸렌글리콜과 테레프탈레이트로 분해될 수 있다.

일 구체예에 따른 RgPETase 및 이의 변이체는 PET을 효과적으로 분해할 수 있다.

도 1은 RgPETase의 생산 및 PET 분해 활성을 확인한 결과이다. 도 1A는 RgPETase의 생산을 나타낸다. 세포질 및 주변 세포질 발현 시스템을 이용하여 생산되고 정제된 RgPETase를 SDS-PAGE로 확인하였다. 도 1B는 BHET에 대한 RgPETase의 Kinetic 분석 결과이다. 도 1C는 30℃ 및 40℃에서 미세 결정성 PET(mc-PET) 에 대한 분해 활성을 나타낸 것이고, 도 1 D는 30℃ 및 40℃에서 저결정성 PET 필름에 대한 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 2A는 A4W93_RS06010의 크기 배제 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다. 표준 샘플은 회색 점선으로 표시되어 있다. (a)는 Void volume, (b)는 페리틴(440kDa), (c)는 알돌라제(158kDa), (d)는 오발부민(44kDa), (e)는 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase)(29kDa) 및 리보뉴클레아제 A(13.7kDa)이다.
도 2B는 A4W93_RS06010의 시차주사형광(Differential scanning fluorimetry) 측정결과이다. 세포질(cytoplasmic) 및 주변 세포질(periplasmic) A4W93_RS06010의 용융 온도(Tm)가 표시되어 있다.
도 3은 PET 가수 분해 반응의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다. 3일 동안 30℃에서 mc-PET(왼쪽) 및 lcPET 필름(오른쪽)에 대한 RgPETase(빨간선) 및 IsPETase(검은선)의 PET 가수분해 반응에 대한 HPLC 분석 결과이다.
도 4는 RgPETase의 구조를 나타낸 것이다. RgPETase의 단량체 구조를 리본 다이어그램으로 표시하였다. 촉매 작용 잔기(Ser158, Asp203 및 His234)과 두 개의 이황화결합은 연어색 막대기로 표시하였다. 오른쪽 그림은 왼쪽 그림을 수평으로 90도 회전한 것이다.
도 5는 RgPETase의 구조적 특징을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 5A는 RgPETase와 IsPETase의 구조를 비교한 것이다. 두 효소의 결정구조는 각각 짙은 회색과 회색으로 표현되어 중첩되었다. RgPETase의 고유한 표면 노출 영역은 다른 색상으로 강조 표시되고 레이블을 지정하였다. IsPETase에 도킹된 2-HE(MHET)₄ 분자는 구형 모델로 표시하였다. DS는 이황화결합(disulfide bond)을 나타내며 DS*는 유형 IIb 효소에서만 발견되는 추가 이황화결합을 나타낸다. 도 5B는 RgPETase와 IsPETase를 비교한 개략도이다.
도 6의 C 내지 F는 RgPETase와 IsPETase를 비교하여 구조적으로 비유사한 영역을 나타낸 것이다. 6A는 VR1, 6B는 WW-loop, 6C는 VR2, 6D는 C-말단 영역이다. RgPETase와 IsPETase 사이의 비유사잔기는 물리화학적 특성에 따라 색상이 다른 스틱 모델로 표시하였다. 돌연변이에 적용된 잔기는 상자로 강조 표시하였다.
도 7은 RgPETase에서 고도로 보존된 주요 구조적 특징을 나타낸 것이다. RgPETase와 IsPETase의 구조는 각각 청록색과 회색의 카툰으로 표시하여 서로 겹쳐져 있다. 촉매 트라이어드(catalytic triad), 기질 결합 부위, 연장된 β8-α6 연결 루프 및 추가 이황화 결합을 형성하는 잔기를 스틱 모델로 표시하였다. IsPETase에 도킹된 2-HE(MHET)₄ 분자는 스틱 모델로 표시되어 있다.
도 8은 RgPETase 및 IsPETase의 WW-loop의 안정화 방식을 비교한 것이다. RgPETase와 IsPETase의 구조가 중첩하였다. RgPETase의 WW-루프와 VR2는 노란색과 마린색으로, IsPETase는 마젠타색과 오렌지색으로 구분하였다. WW-루프의 안정화에 관련된 잔기는 스틱 모델로 표시하고 RgPETase 및 IsPETase의 네트워크는 각각 빨간 점선과 검은 점선으로 표시하였다. IsPETase에 도킹된 2-HE(MHET)₄ 분자는 구형 모델로 표시하였다.
도 9는 PET 분해 활동에 대한 WW-루프의 영향을 나타낸 것이다. 도 9A는 PET 가수분해 효소 사이의 WW-루프 형태를 비교한 것이다. 다양한 PET 가수분해 효소의 흔들리는 트립토판(wobbling tryptophan)은 다양한 색상의 스틱 모델로 표시되어 있다. 도 9B는 RgPETase의 WW-루프의 안정화 모드를 나타낸 것이다. WW-루프와 VR2는 각각 노란색과 파란색으로 구분하였다. WW-루프의 형태에 관련된 주요 잔기는 스틱 모델로 표시하고 수소 결합 및 염다리 네트워크는 빨간색 점선으로 표시하였다. 도 9C는 WW-루프에 위치한 돌연변이된 잔기를 갖는 RgPETase 변이체의 PET 분해 활성을 나타낸 것이다. 도 9D, 도 9E, 도 9F는 RgPETase^WT (D), RgPETase^E186A (E) 및 RgPETase^K169A (F)의 WW-루프에서 정전기 표면 전하를 나타낸 것이다.
도 10은 RgPETase 변이체의 열 안정성 측정결과이다. RgPETase의 WW-루프 안정화에 관여하는 잔기의 Tm을 측정하고 RgPETaseWT의 Tm과 비교하였다.
도 11은 RgPETase^K169A 및 RgPETase^E186A 변이체에서 WW-루프의 전자 밀도 맵을 나타낸 것이다. RgPETase^K169A 및 RgPETase^E186A 변이체의 구조는 각각 마젠타 및 청록색 카툰 모델로 표시하였다. Lys169 및 Glu186 잔기는 스틱 모델로 표시하였다. WW-loop와 Lys169 및 Glu186 잔기의 전자 밀도 맵은 2.0σ 윤곽선으로 표시하였다.
도 12는 PET 분해 활성에 대한 표면 전하의 영향을 확인한 결과이다. 도 12A는 RgPETase의 정전기 표면 전하이다. 활성 부위 고원에서 멀리 떨어진 4 개의 아르기닌 잔기는 주황색 원으로 표시되고 활성 부위 고원 부근에 위치한 2 개의 아르기닌 잔기는 녹색 원으로 표시되어있다. 활성 사이트 고원은 녹색으로 표시되어 있다. 도 12B는 표면 노출된 아르기닌의 돌연변이된 잔기를 갖는 RgPETase 변이체의 PET 분해 활성을 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 단백질 생산

E. coli에 대해 코돈 최적화된 A4W93_RS06010을 코딩하는 유전자를 합성하고, 세포질 발현을 위해 pET-21a 벡터로 서브 클로닝하고, 고유의 신호 펩티드가 없는 pET22b(+)(Novagen/Merck) 변형 벡터 1에 서브 클로닝했다. 생성된 발현 벡터를 E.coli 균주 Rosetta gami-B에 도입하여 형질전환시키고, 200mg L-1 암피실린을 함유하는 1L의 terrific broth medium에 37℃에서 OD₆₀₀ 0.8로 성장시켰다. 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 A4W93_RS06010 발현을 유도하고, 배양물을 18℃에서 22시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 배양물을 4℃에서 20분 동안 4,000xg에서 원심 분리하여 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 냉각시킨(ice-cold) 버퍼 A(50mM Na₂HPO₄-HCl, pH 7.0)에서 초음파처리했다. 초음파처리한 세포 펠렛을 13,500xg에서 30 분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 데브리스(debris)를 제거하고 용해물을 Ni-NTA 아가로스 컬럼 (Qiagen)에 로딩했다. 컬럼을 30mM 이미다졸을 포함하는 버퍼 A로 세척한 후, 결합된 단백질을 버퍼 A에서 10mL의 300mM 이미다졸로 용리했다. 정제된 단백질은 BioTek™ Epoch 마이크로 플레이트 분광 광도계 및 Gen5™ 마이크로 플레이트 데이터 분석 소프트웨어로 정량화되었다. 결정화(crystallography)를 위해 10L의 대규모 배양이 수행되었다.

QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent)를 사용하여 부위 지정 돌연변이 유발 실험을 수행했다. RgPETase 변이체의 발현 및 정제는 야생형 RgPETase와 동일한 과정으로 수행하였다. 클로닝 및 부위 지정 돌연변이 유발에 사용되는 프라이머는 표 1에 기재되어 있다.

Name	Primer
RgPETase_F	5'-GCGCCCATGG CGCAGAC CAATCCTTAT CAGCGG-3'
RgPETase_R	5'-GCGCCTCGAGATAAGGACAATTCTCTTTATAAGC-3'
RgPETase^H211S_F	5'-GCACCGAACAGCTCATCTTCATTTCCTTTCTAC-3'
RgPETase^H211S_R	5'-GTAGAAAGGAAATGAAGATGAGCTGTTCGGTGC-3'
RgPETase^F215I_F	5'-TCACATTCATTTCCTATCTACAATCAGATGACC-3'
RgPETase^F215I_R	5'-GGTCATCTGATTGTAGATAGGAAATGAATGTGA-3'
RgPETase^Q218S_F	5'-CCTTTCTACAATTCCATGACCCGCAAC-3'
RgPETase^Q218S_R	5'-GTTGCGGGTCATGGAATTGTAGAAAGG-3'
RgPETase^K169A_F	5'-CACTGATTTCCGCGGCTAACAATCCGAGTC-3'
RgPETase^K169A_R	5'-GACTCGGATTGTTAGCCGCGGAAATCAGTG-3'
RgPETase^E186A_F	5'-GCACCATGGGCCCAAGCATCCTTCTCTTCTGTT-3'
RgPETase^E186A_R	5'-AACAGAAGAGAAGGATGCTTGGGCCCATGGTGC-3'
RgPETase^R45A_F	5'-CCCTTGAAGCCACGGCTGGTCCGTTTAGTAC-3'
RgPETase^R45A_R	5'-GTACTAAACGGACCAGCCGTGGCTTCAAGGG-3'
RgPETase^R45E_F	5'-CCCTTGAAGCCACGGAAGGTCCGTTTAGTAC-3'
RgPETase^R45E_R	5'-GTACTAAACGGACCTTCCGTGGCTTCAAGGG-3'
RgPETase^R57A_F	5'-CTTTTACTGTGAGCGCGCCATCTGGGTATGG-3'
RgPETase^R57A_R	5'-CCATACCCAGATGGCGCGCTCACAGTAAAAG-3'
RgPETase^R57E_F	5'-CTTTTACTGTGAGCGAACCATCTGGGTATGG-3'
RgPETase^R57E_R	5'-CCATACCCAGATGGTTCGCTCACAGTAAAAG-3'
RgPETase^R130A_F	5'-CAAATGGCTGCTTTGGCGCAGGTCGTGAGTTTA-3'
RgPETase^R130A_R	5'-TAAACTCACGACCTGCGCCAAAGCAGCCATTTG-3'
RgPETase^R130E_F	5'-CAAATGGCTGCTTTGGAACAGGTCGTGAGTTTA-3'
RgPETase^R130E_R	5'-TAAACTCACGACCTGTTCCAAAGCAGCCATTTG-3'
RgPETase^R221A_F	5'-CAATCAGATGACCGCGAACAAAAAAGCAAAT-3'
RgPETase^R221A_R	5'-ATTTGCTTTTTTGTTCGCGGTCATCTGATTG-3'
RgPETase^R221E_F	5'-TCAGATGACCGAAAACAAAAAAGCAAAT-3'
RgPETase^R221E_R	5'-ATTTGCTTTTTTGTTTTCGGTCATCTGATTG-3'
RgPETase^R88A_F	5'-CCGGTTATACCGCTGCGCAGTCTAGCATTAAT-3'
RgPETase^R88A_R	5'-ATTAATGCTAGACTGCGCAGCGGTATAACCGG-3'
RgPETase^R88E_F	5'-CCGGTTATACCGCTGAACAGTCTAGCATTAAT-3'
RgPETase^R88E_R	5'-ATTAATGCTAGACTGTTCAGCGGTATAACCGG-3'
RgPETase^R281A_F	5'-GCAGATTTATCGAAAGCTGCAGTTGAAGCTTAT-3'
RgPETase^R281A_R	5'-ATAAGCTTCAACTGCAGCTTTCGATAAATCTGC-3'
RgPETase^R281E_F	5'-GCAGATTTATCGAAAGAAGCAGTTGAAGCTTAT-3'
RgPETase^R281E_R	5'-ATAAGCTTCAACTGCTTCTTTCGATAAATCTGC-3'

2. 크기 배제 크로마토그래피 분석

A4W93_RS06010의 올리고머 상태를 확인하기 위해 40mM Tris-HCl, pH 8.0 및 150mM NaCl로 평형화된 Superdex 200 increase 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 분석 크기 배제 크로마토그래피를 수행했다. 농도가 1 mg/ml인 0.5 mL의 단백질 샘플을 분석하였다. 용출된 A4W93_RS06010 샘플의 분자량을 계산하기 위해 표준 샘플 (GE Healthcare Life Sciences)인 페리틴(440kDa), 알돌라아제(158kDa), 오발부민(44kDa), 탄산탈수효소(29kDa) 및 리보뉴클레아제 A(13.8kDa)를 사용하여 calibration curve를 생성했다.

3. A4W93_RS06010의 Tm 측정

A4W93_RS06010의 열안정성은 StepOnePlus Real-Time PCR(Thermo Fisher Scientific)에서 단백질 열이동 염료 키트(protein thermal shift dye kit, Applied Biosystems)로 제조업체의 지침에 따라 용융 곡선을 측정하여 결정되었다. 반응 혼합물은 5㎍ 단백질, 0.1M Na₂HPO₄-HCl, pH 7.0 및 1x단백질 열이동 염료를 포함하는 20㎕이다. 단백질 변성을 반영하는 신호 변화는 온도를 25℃에서 99℃로 증가시켜 모니터링했다. 용융 온도는 1 차 미분 곡선을 사용하여 계산되었다.

4. BHET에 대한 반응속도분석(Kinetic analysis)

A4W93_RS06010의 BHET 가수분해 활성을 조사하기 위해 효소를 50mM 글리신/NaOH, pH 9.0, 및 30 ℃에서 다양한 농도의 BHET(0.04-0.8μM)와 함께 배양했다. 85℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 중단하고 샘플을 10 분 동안 13,500xg에서 원심 분리했다. 상청액을 HPLC로 분석하였다.

5. PET 분해 활성 측정

A4W93_RS06010의 PET 분해활성을 분석하기 위해 미세결정성(microcrystalline) PET(mc-PET)와 저결정성 PET 필름(lcPET)을 기판으로 사용했다.

mc-PET는 상용 PET 병으로부터 얻었으며 샘플을 5 x 5mm 조각으로 자르고 Micro Ball Mill을 사용하여 미분화했다. 미분화된 mc-PET를 체로 거른 후(sieving) 입도 분포 분석기로 mc-PET의 크기를 분석한 결과 mc-PET의 평균 크기는 약 251.03 ㎛였다. 15mg의 mc-PET, 50mM 글리신/NaOH, pH 9.0 및 500nM의 효소를 포함하는 반응 혼합물을 30℃ 및 40℃에서 1 일 및 3 일 동안 배양하였다. 잔류 PET 분말과 효소는 0.22μm PVDF 주사기 필터를 통해 여과하여 제거했다. 상청액을 HPLC 분석에 적용했다.

lcPET에 대한 PET 분해활성을 측정하기 위해 두께 0.25mm의 lcPET 필름 (Goodfellow Ltd., 제품 번호 ES301445)을 직경 6mm의 원형 형태로 준비했다. lcPET를 300㎕의 50mM 글리신/NaOH (pH 9.0)에 500nM의 효소를 포함하거나, 또는 효소를 포함하지 않고 침지시켰다. 반응 혼합물을 1 일 및 3 일 동안 30℃ 및 40℃에서 배양하였다. 반응 혼합물에서 lcPET를 제거한 후, 85℃에서 10분 동안 가열하여 효소 반응을 종료하였다. 이후 시료를 13,500xg에서 10분 동안 원심분리한 후 상청액을 HPLC로 분석하였다.

6. HPLC 분석 절차

UV/Vis 검출기 (SPD-20A)에 연결된 CBM-20A (Shimadzu)를 사용하여 샘플을 분석하고 C18 컬럼 (Shimadzu Shim-pack GIS ODS-I C18, 5 μm, 4.6 x 150 mm)을 사용했다. 이동상의 경우 완충액 A (증류수 중 0.1 % 포름산)와 완충액 B (20 % 아세토니트릴)를 1ml/min의 유속으로 사용했다. 용출 프로그램은 다음과 같다: 0-2 분, 60-80% 버퍼 B, 선형 구배; 2-8 분, 80-100% 버퍼 B, 선형 구배; 8-16 분, 100% 버퍼 B. MHET 및 TPA는 260nm에서 검출하였다. 모든 실험은 세 번 수행되었다.

7. 결정화, 데이터 수집, 및 구조 결정

정제된 단백질의 결정화는 처음에 시판되는 spares-matrix screens: Index, PEG / ION (Hampton Research) 및 Wizard I 및 II (Rigaku)로 20℃에서 sitting-drop 증기확산법을 실시하여 수행되었다. 각 실험은 1.0 ㎕의 단백질 용액 (50 mM Na₂HPO₄-HCl, pH 7.0에서 12 mg/mL)과 1.0㎕의 저장용액(reservoir solution)으로 구성되고 50㎕의 저장용액에 대해 평형화되었다. 최고 품질의 RgPETase 결정은 19% PEG 3350 및 0.1 M Bis-tris, pH 5.0에서 나타났다. 결정을 21 % PEG 3350, 0.1 M Bis-tris, pH 5.0 및 25%(v/v) 글리세롤을 포함하는 동결보호용액으로 옮기고 결정보다 큰 루프로 마무리하고 액체 질소에 침지시켜 급속냉동시켰다. 데이터는 포항 가속기 연구소(PAL, 대한민국)의 7A 빔라인에서 100K 미만으로 수집되었다. 데이터는 HKL2000 소프트웨어 패키지 3를 사용하여 인덱싱, 통합 및 확장되었다. RgPETase 결정은 단위 세포 매개 변수 a=69.27Å, b=75.51Å, c=200.71Å 및 α=β=γ=90° 인 공간그룹 C222₁에 속했다. RgPETase의 두 분자는 비대칭 유닛이었고, Matthews 계수는 2.31 Å³ Da^-1로, 이는 용매함량 46.79%에 해당한다.

RgPETase의 구조는 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis) 의 PETase 구조(PDB code 5XJH)를 검색 모델로 사용하여 MOLREP5의 CCP4 버전으로 분자 대체하여 결정되었다. WinCoot6 프로그램을 사용하여 모델 구축을 수행하고 CCP4 REFMAC5을 사용하여 개선했다. RgPETase^K169A 변이체의 최고 품질 결정은 3.0 M NaCl 및 0.1 M HEPES, pH 7.5에서 나타났다. 동결방지용액은 동일한 조건의 결정 용액과 30%(v/v) 글리세롤을 포함했다. RgPETase^K169A 결정은 a=51.13Å, b=54.07Å, c=110.10Å 및 α=β=γ=90°의 단위 세포 매개 변수를 갖는 공간 그룹 P2₁2₁2₁에 속한다. 비대칭 단위당 한 분자의 RgPETase^K169A를 가정할 때, 단백질 질량 단위당 결정 부피는 2.68 Å³ Da^-1로서, 이는 용매 함량 54.18%에 해당한다. RgPETase^E186A 변이체의 결정은 1M 구연산 나트륨, 0.1M Tris-HCl, pH 7.0 및 0.2M NaCl에서 나타났다. 동결 방지제 용액은 위에 기술된 해당 조건과 30%(v/v) 글리세롤의 혼합물이었다. RgPETase^E186A 결정은 a=50.99Å, b=54.62Å, c=108.89Å 및 α=β=γ= 90 °의 단위 셀 매개 변수를 갖는 공간 그룹 P2₁2₁2₁에 속한다. 비대칭 단위당 RgPETase^E186A 분자 1 개를 사용하는 경우 Matthews 계수는 2.67 Å³ Da^-1로 용매 함량 53.96%에 해당한다. RgPETase^E186A 및 RgPETase^E186A 변이체의 구조는 정제된 RgPETase 구조를 사용한 분자 대체에 의해 결정되었다. 모델은 위에서 설명한 절차에 따라 제작되었다. 데이터 통계는 표 2에 요약되어 있다.

	RgPETase^WT	RgPETase^K169A	RgPETase^E186A
PDB code	7DZT	7DZU	7DZV
Data collection
Wavelength (Å)	0.97934	0.97934	0.97934
Space group	C222₁	P2₁2₁2₁	P2₁2₁2₁
Unit cell dimensions
a, b, c (Å)	69.27, 75.51, 200.71	51.13, 54.07, 110.10	50.99, 54.62, 108.89
α, β, γ (°)	90.0, 90.0, 90.0	90.0, 90.0, 90.0	90.0, 90.0, 90.0
Solvent content (%)	46.79	54.18	53.96
Protein chains in AU	2	1	1
Resolution range (Å)	50.0-2.35	50.0-2.40	50.0-1.60
Highest resolution shell (Å)	2.39-2.35	2.44-2.40	1.63-1.60
Unique reflections	22066	12259	40798
Redundancy	6.5 (6.7)	5.8 (6.3)	12.4 (12.9)
Completeness (%)	99.2 (100)	98.1 (98.3)	99.4 (97.5)
R _merge (%)	11.4 (28.9)	11.3 (41.4)	9.6 (36.5)
Average I/s(I)	47.24 (21.0)	30.78 (7.5)	58.77 (18.7)

Refinement
R (%)	20.0	18.3	13.3
R _free (%)	26.5	25.3	15.7
Mean B value (Å²)*	40.0	34.0	14.0
B from Wilson plot (Å²)	34.3	31.8	12.7
RMS deviation bond lengths (Å)	0.007	0.008	0.015
RMS deviation bond angles (°)	1.548	1.620	2.006
Number of amino acid residues	534	268	268
Number of water molecules	125	104	307
*Mean B value is for both protein atoms and the solvent molecules

RgPETase, RgPETase^E186A 및 RgPETase^E186A 변이체의 정제된 구조는 각각 PDB 코드가 7DZT, 7DZU 및 7DZV 인 Protein Data Bank에 보관되었다.

실시예 1: A4W93_RS06010의 PETase 활성 규명

A4W93_RS06010의 PET 분해 능력을 조사하기 위해 먼저 pET-21a 시스템을 사용하여 단백질을 세포질에 발현하고 낮은 수율로 정제된 단백질을 얻었다. (도 1A) 하기 표 3은 A4W93_RS06010의 서열, 대장균에 대해 코돈 최적화된 서열, 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

Codon optimized DNA sequence used for expression of A4W93_RS06010	ATGTTTGGAAAACTCCCATTTGCACGAGCGAGCCTCGCGGTAGGCGCACTGCTGCTGTCCGCTGCCGCGGTAGCCCAGACCAATCCTTATCAGCGGGGCCCGGATCCAACCGTTTCTTCCCTTGAAGCCACGCGTGGTCCGTTTAGTACATCGTCTTTTACTGTGAGCCGCCCATCTGGGTATGGTGCGGGGACGGTTTATTATCCCACCAATGCAGGCGGCAAAGTGGGAGCCATAGCTGTAGTTCCCGGTTATACCGCTAGGCAGTCTAGCATTAATTGGTGGGGTCCCCGGTTAGCGAGCCATGGTTTTGTCGTTATCACTATTGATACAAACTCAACGTTAGATCAACCTTCCAGTCGTTCTTCACAGCAAATGGCTGCTTTGCGTCAGGTCGTGAGTTTAGCCGGCACATCTTCTAGCCCGATCTACAATAAAGTGGACACTGCCAGACTAGGAGTGATGGGCTGGTCGATGGGTGGTGGTGGTTCACTGATTTCCGCGAAAAACAATCCGAGTCTTCGCGCTGCCGCGCCGCAGGCACCATGGGCCCAAGAATCCTTCTCTTCTGTTACAGTGCCTACGCTGATAGTCTCGTGCGAGAATGATTCGATTGCACCGAACAGCTCACATTCATTTCCTTTCTACAATCAGATGACCCGCAACAAAAAAGCAAATCTTGTAATCAATGGCGGTAGCCATAGTTGCGCCAACAGTGGAAACTCCGACGCTGGCTTGATTGGCAAGTATGGAGTTGCCTGGATGAAGCGCTTTATGGATGATGATACAAGATATAGTAAGTTCCTGTGTGGCGCCGAACACCAAGCAGATTTATCGAAACGTGCAGTTGAAGCTTATAAAGAGAATTGTCCTTATTAA
NZ_CP015118.1:c1325479-1324601 Rhizobacter gummiphilus strain NS21, complete genome (A4W93_RS06010)	ATGTTCGGAAAACTCCCCTTCGCGCGAGCCAGCCTCGCGGTCGGTGCGCTGCTGCTGTCCGCGGCCGCCGTCGCCCAGACCAACCCGTACCAGCGCGGCCCGGATCCCACGGTGTCCTCGCTCGAGGCCACCCGCGGCCCGTTCAGCACCAGCTCGTTCACCGTGAGCCGCCCGAGCGGCTACGGCGCGGGCACGGTGTACTACCCCACCAACGCCGGCGGCAAGGTCGGCGCCATCGCGGTGGTGCCCGGCTACACCGCGCGCCAGAGCAGCATCAACTGGTGGGGCCCGCGGCTCGCGTCGCATGGCTTCGTCGTGATCACGATCGACACCAACTCGACGCTCGACCAGCCGTCCAGCCGTTCTTCCCAGCAGATGGCGGCGTTGCGCCAGGTGGTGTCGCTCGCCGGCACCAGCAGCAGCCCGATCTACAACAAGGTGGACACCGCCCGCCTCGGCGTGATGGGCTGGTCGATGGGCGGCGGCGGTTCGCTGATCTCCGCGAAGAACAACCCGTCGCTGCGCGCGGCCGCACCGCAGGCGCCATGGGCCCAGGAGAGCTTCTCGTCGGTCACCGTGCCGACGCTGATCGTCTCGTGCGAGAACGACAGCATCGCGCCCAACAGCTCGCACTCGTTCCCGTTCTACAACCAGATGACCCGCAACAAGAAGGCCAACCTGGTCATCAACGGCGGCAGCCACTCCTGCGCCAACAGCGGCAACTCGGACGCCGGTCTCATCGGCAAGTACGGCGTGGCGTGGATGAAGCGCTTCATGGACGACGACACGCGCTACAGCAAGTTCCTGTGCGGCGCCGAACACCAGGCCGACCTGAGCAAGCGTGCCGTCGAGGCCTACAAGGAGAACTGCCCCTACTGA
RgPETase amino acid sequence	MFGKLPFARASLAVGALLLSAAAVAQTNPYQRGPDPTVSSLEATRGPFSTSSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGKVGAIAVVPGYTARQSSINWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVVSLAGTSSSPIYNKVDTARLGVMGWSMGGGGSLISAKNNPSLRAAAPQAPWAQESFSSVTVPTLIVSCENDSIAPNSSHSFPFYNQMTRNKKANLVINGGSHSCANSGNSDAGLIGKYGVAWMKRFMDDDTRYSKFLCGAEHQADLSKRAVEAYKENCPY
* 밑줄 서열은 A4W93_RS06010의 signal peptide임

또한, A4W93_RS06010은 적절한 폴딩을 위해 산화 조건을 선호하는 IsPETase로서 추가적인 이황화결합을 가질 것으로 예측되었기 때문에, 단백질 폴딩을 증가시키기 위해 주변 세포질 분비 발현을 수행했다.

하기 표 4는 주변세포질 발현을 위해 N-말단과 C-말단에 부가된 추가 아미노산 서열(Extra amino acids)을 나타낸 것이다. N-말단에 부가된 서열은 신호 펩티드를 포함하며, 기존 신호펩티드를 치환하였다.

Vector	Extra amino acids at N-terminus	Extra amino acids at C-terminus
pET21a		LEHHHHHH
pET22b:SP_DSbA	MKKIWLALAGLVLAFSASAMA	LEHHHHHH
pET22b:SP_PelB	MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMA	LEHHHHHH
pET22b:SP_LamB	MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMAMA	LEHHHHHH
pET22b:SP_SurA	MKNWKTLLLGIAMIANTSFAMA	LEHHHHHH
pET22b:SP_MalE	MKIKTGARILALSALTTMMFSASALAMA	LEHHHHHH
pET22b:SP_TolB	MKQALRVAFGFLILWASVLHAMA	LEHHHHHH
* 밑줄 서열은 signal peptide(SP) 서열임

6 개의 신호 펩티드(DsbA, PelB, LamB, SurA, MalE 및 TolB) 중에서 (표 4), PelB, LamB 또는 MalE의 신호 펩티드에 의할 때 A4W93_RS06010의 주변세포질(periplasmic)의 가용성 발현이 증가하는 것을 확인했다. 가장 많은 양의 단백질은 MalE 시스템을 통해 얻어졌으며, 세포질 시스템보다 4 배 더 높은 가용성 발현을 나타냈다. (도 1A)

정제된 세포질 및 주변 세포질 A4W93_RS06010 단백질 모두 크기 배제 크로마토그래피에서 단량체로 용리되었으며(도 2A) 용융 온도(Tm)가 48.5℃로 IsPETase보다 약간 낮았다.(도 2B)

bis(2-hydroxyethyl)terephthalate(BHET)에 대한 세포질 A4W93_RS06010의 kcat 및 km 값은 각각 28.5 s^-1 및 148.8 nM 이었으며, 주변 세포질 단백질의 값은 각각 30.1 s^-1 및 151.6 nM으로 유사한 값을 나타내었다 (도 1B).

A4W93_RS06010의 PET 분해 활성을 검증하기 위해 30℃ 및 40℃ 주변 온도에서 미세결정성 PET (mc-PET)에 대한 단백질의 가수분해 활성을 측정하고 IsPETase와 비교했다. A4W93_RS06010은 mc-PET를 MHET 및 테레프탈레이트(TPA)로 가수 분해했으며, 이 활성은 동일 온도에서 IsPETase와 거의 동일하였으므로 A4W93_RS06010가 Type IIb PET 가수분해 효소임을 시사한다. (도 1C 및 도 3의 좌측) A4W93_RS06010 및 IsPETase 모두 40℃에서 1 일 동안 활성이 유지되지 않았으며, 40℃보다 30℃에서의 활성이 높았다. (도 1C)

본 발명자는 A4W93_RS06010의 PETase 활성을 새롭게 규명하였으며, RgPETase로 명명하였다. RgPETase는 주변 온도에서 IsPETase와 유사한 수준으로 PET 분해 활성을 가지며, 리조박터 구미필러스에서 유래한 것으로는 최초로 발견한 PETase이다.

다음으로, 낮은 결정도 PET 필름(lcPET, Goodfellow Ind)에 대한 RgPETase 및 IsPETase의 가수 분해 활성을 측정하였다. lcPET 필름에 대한 RgPETase의 분해 활성은 IsPETase에 비해 현저하게 낮았다 (도 1D, 도 3).

상기 결과는 상동성이 매우 높은 두 개의 PET 가수분해 효소가 서로 다른 PET 샘플에 대해 다른 활성을 가질 수 있음을 시사한다.

실시예 2: RgPETase의 구조

RgPETase에서 PET 분해 활성에 관여하는 주요 구조 영역을 식별하기 위해 2.3Å 해상도에서 결정 구조를 결정했다. (도 4 및 상기 표 2). RgPETase는 알파-탄소 root 평균 제곱 편차가 0.291Å로써 IsPETase와 매우 유사한 구조를 나타냈으며, 활성 부위에서 높은 PET 가수 분해 활성을 나타내기 위한 IsPETase의 주요 구조적 특징을 공유하는 것으로 나타났다. 도 5A, 도 5B, 도 7, 및 RgPETase, IsPETase, Thermobidifa fusca KW3 유래 큐티나제(TfCut2), 잎-가지 퇴비 메타게놈(leaf-branch compost metagenome, LCC), Saccharomonospora viridis 유래 큐티나제(Cut190), Thermobifida cellulostica 유래 cutinases (Thc_Cut)에 대한 서열정렬 결과에 따르면, 촉매 삼합체(catalytic triad)를 구성하는 잔기, 기질 결합부위, 확장된 8-α6 연결루프, 및 IsPETase의 두 개의 이황화결합은 RgPETase에서 거의 동일하거나 고도로 보존되어 있었다. 따라서 30℃에서 mc-PET에 대한 RgPETase의 높은 활성은 이러한 구조적 특성에서 비롯된 것으로 판단된다.

그러나, 이 두 효소는 표면 노출 영역에서 실질적인 구조적 차이가 있었다.(도 5A 및 도 5B). 첫째, RgPETase의 가변영역 1(VR1, Q26-S51)은 N-말단 루프와 α1-나선에 있고, IsPETase의 해당 영역과 비교하면 65.4% 아미노산 동일성을 나타낸다(도 6A). 둘째, RgPETase의 워블 트립토판 함유 루프(WW-루프, W183-S187)는 IsPETase의 6 개 잔기(W185-N190) 대신 5 개 잔기 카세트가 있는 별개의 아미노산으로 구성되어 있어 두 효소간에 현저한 구조적 차이가 발생한다 (도 6B). 셋째, RgPETase의 가변영역 2(VR2, P207-V228)는 α5-β7 영역에 있으며 IsPETase의 Ser214에 상응하는 위치에 His211를 포함한다(도 6C). 넷째, C-말단 영역(G271-Y292)에는 보존된 잔기가 거의 없으며 RgPETase의 추가 아미노산은 추가 α나선(α8)을 형성한다(도 6D). WW- 루프, VR2 및 C-터미널 영역은 표면 노출 영역을 형성하고 활성 사이트 고원(plateau) 근처에 위치하는 점에 주목하여(도 5A), 이들 영역이 lcPET에 대한 RgPETase 및 IsPETase의 활성 차이에 영향을 미친 것으로 추측하였다.

실시예 3: WW-루프의 PET 분해 활성에 대한 영향

앞서 설명했듯이 RgPETase의 WW-루프 형태는 IsPETase와 다르다.(도 6B 및 도 8) RgPETase의 WW-루프는 Thermobidifa fusca KW3(TfCut2), leaf-branch compost metagenome(LCC), Saccharomonospora viridis(Cut190) 및 Thermobifida cellulosilytica(Thc_Cut) 등의 큐티나제(cutinase)와 같은 기존에 알려진 PET 가수분해 효소와 비교해도 유일무이한 형태를 나타낸다.(도 9A)

RgPETase의 WW-루프의 형태는 루프 및 VR2를 포함한 이의 인접 영역 사이의 상호 작용에 의해 유지되는 것을 관찰했다(도 9B). IsPETase의 흔들리는 트립토판 메커니즘(wobbling tryptophan mechanism)이 IsPETase의 고유한 Ser214 잔기를 기반으로 제안되었다는 점을 고려하면, 상기 네트워크는 PET 분해 활동과 관련이 있는 것으로 생각된다. RgPETase의 WW-루프는 주로 Phe215와의 Van der Waals 힘과 His211 및 Gln218과의 수소 결합에 의해 안정화되는 것으로 나타났다(도 9B). WW-루프의 Lys169 및 Glu186 사이의 염다리(salt-bridge) 또한 루프의 위치를 제한한다.

WW-loop의 형태에 대한 상기 인접영역(neighboring region)들의 효과를 확인하기 위해 His211, Phe215 및 Gln218 잔기를 IsPETase의 잔기로 교체하고 30℃에서 mc-PET에 대한 변이체의 PET 분해활성을 측정했다. RgPETase^F215I 및 RgPETase^Q218S 변이체는 활성이 감소하였으며, RgPETase^H211S 변이체는 95% 이상의 활성을 잃었다. (도 9C) 이러한 결과는 A184의 주쇄 sp² 질소와 τ-tautomer H211의 Nδ 사이의 수소 결합이 WW-루프에서 Trp183의 위치를 조절하고 RgPETase의 PET 분해 활성에 급격한 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

또한 Lys169와 Glu186 사이의 염다리를 제거하기 위해 RgPETase^K169A, RgPETase^E186A 및 RgPETase^K169A/E186A 변이체를 제작하였으며, 세 가지 변이체 모두 Tm 감소를 나타냈다.(도 10) RgPETase^E186A 및 RgPETase^K169A/E186A 변이체의 PET 분해활성은 각각 75 % 및 63 % 감소했다. (도 9C) 그러나 놀랍게도 RgPETase^K169A 변이체는 RgPETaseWT보다 PET에 대해 향상된 분해활성을 나타냈다. Tm 값의 감소를 고려하면, RgPETase^K169A 변이체의 증가된 활성은 효소 촉매작용 측면에서 더 중요한 의미를 갖는다.

상기 상충되는 결과는 전하-전하 상호 작용의 제거만으로 설명할 수 없다. 상기 현상을 설명하기 위해 RgPETase^K169A 및 RgPETase^E186A 변이체의 결정 구조를 결정했다. (도 11 및 표 2) 상기 돌연변이로 인해 WW-루프의 유연성이 증가하지만 루프의 형태는 여전히 유지된다 (도 9D, 도 9E, 및 도 9F). 그러나 돌연변이는 표면 영역의 정전기 전하의 현저한 변화를 일으켰다. RgPETase^WT에서 두 잔기의 정전기 전하는 염다리 형성에 의해 중성을 나타냈지만(도 9D), 대응되는 잔기(counterpart residue)의 돌연변이로 인해 하나의 잔기의 원래 전하가 드러나는 것으로 나타났다.(도 9E, 도 9F) 상기 결과를 바탕으로 RgPETase의 WW-루프 표면의 정전기 전하가 PET 가수 분해 활성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

실시예 4: PET 분해 활성에 대한 표면 전하의 영향

해중합효소(depolymerase)의 표면 소수성이 증가하면 고분자 표면에 대한 효소의 흡수 과정이 촉진될 수 있다고 알려져 있으며, 이는 PET 분해 연구에 적용되어 왔다. 그러나 상기 돌연변이 연구는 WW-루프의 표면 음전하가 PET 분해에 유리하며, RgPETase의 형태(conformational states)를 변경하지 않고도 표면의 정전기 전하를 변경함으로써 단백질의 PET 분해 활성을 조절할 수 있음을 시사한다.

따라서 RgPETase의 표면 노출 잔기를 분석하여, Arg45, Arg57, Arg88, Arg130, Arg221 및 Arg281과 같은 6 개의 양전하를 가진 잔기를 선택했다. (도 12A) 그 다음 각 잔기를 알라닌(A) 또는 글루타메이트(E)로 교체하고 30℃에서 mc-PET에 대한 PET 가수분해 효소 활성을 측정했다. 흥미롭게도, Arg45, Arg57, Arg130 및 Arg221과 같이 활성 부위 고원에서 먼 곳에 위치한 아르기닌 잔기의 돌연변이는 RgPETase^WT보다 PET에 대한 분해 활성이 증가하였다.(도 12B) 특히 RgPETase^R130A 및 RgPETase^R130E 변이체는 RgPETase^WT 보다 1일 동안 1.6 배 및 1.7 배 증가된 활성을 나타냈다. (도 12B) 더 흥미롭게도 음전하를 가지는 Glu로 치환된 변이체의 효소 활성은 중성인 Ala로 치환 된 변이체의 효소 활성보다 약간 더 높았다.(도 12B) 종합하면, 이 현상은 RgPETase^K169A 변이체에서 관찰된 결과와 일치하며, RgPETase 표면 영역은 PET 가수분해 활성에 있어서 양전하보다 음전하인 것이 더 유리함을 알 수 있다.

그러나 Arg88 및 Arg281과 같은 활성 부위 고원 부근에 위치한 양전하를 띤 잔기의 돌연변이는 완전히 다른 결과를 나타냈다. RgPETase^R88A 및 RgPETase^R88E 변이체는 RgPETase^WT에 비해 활성이 각각 24% 및 28% 감소했다. (도 12B). Arg88 잔기가 활성 부위 고원 형성에 직접 관여하기 때문에, 소수성 표면이나 음전하 표면은 PET 기질의 접근성(accessibility)에 적합하지 않다고 추측했다. 반면에, RgPETase^R281A 및 RgPETase^R281E 변이체는 RgPETase^WT에 비해 PET에 대한 분해활성이 1.9 배 및 1.5 배 향상되었다. (도 12B) 이러한 결과는 효율적인 PET 분해를 위해 활성 부위 고원에 인접한 잔기가 최적의 표면 전하를 가져야 함을 나타낸다. 종합하면 PET 가수 분해 효소의 정전기 표면 전하는 PET 분해에 중요한 역할을 하며 최적의 조건은 영역마다 다르다는 점을 알 수 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel PETase derived from Rhizobacter gummiphilus and its variants <130> PN210042 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETase <400> 1 Met Phe Gly Lys Leu Pro Phe Ala Arg Ala Ser Leu Ala Val Gly Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Ala Ala Ala Val Ala Gln Thr Asn Pro Tyr Gln Arg 20 25 30 Gly Pro Asp Pro Thr Val Ser Ser Leu Glu Ala Thr Arg Gly Pro Phe 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly Ala Gly 50 55 60 Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Lys Val Gly Ala Ile Ala 65 70 75 80 Val Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Asn Trp Trp Gly 85 90 95 Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp Thr Asn 100 105 110 Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met Ala Ala 115 120 125 Leu Arg Gln Val Val Ser Leu Ala Gly Thr Ser Ser Ser Pro Ile Tyr 130 135 140 Asn Lys Val Asp Thr Ala Arg Leu Gly Val Met Gly Trp Ser Met Gly 145 150 155 160 Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Lys Asn Asn Pro Ser Leu Arg Ala 165 170 175 Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Ala Gln Glu Ser Phe Ser Ser Val Thr 180 185 190 Val Pro Thr Leu Ile Val Ser Cys Glu Asn Asp Ser Ile Ala Pro Asn 195 200 205 Ser Ser His Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Met Thr Arg Asn Lys Lys 210 215 220 Ala Asn Leu Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala Asn Ser Gly 225 230 235 240 Asn Ser Asp Ala Gly Leu Ile Gly Lys Tyr Gly Val Ala Trp Met Lys 245 250 255 Arg Phe Met Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Ser Lys Phe Leu Cys Gly Ala 260 265 270 Glu His Gln Ala Asp Leu Ser Lys Arg Ala Val Glu Ala Tyr Lys Glu 275 280 285 Asn Cys Pro Tyr 290 <210> 2 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETase without SP <400> 2 Gln Thr Asn Pro Tyr Gln Arg Gly Pro Asp Pro Thr Val Ser Ser Leu 1 5 10 15 Glu Ala Thr Arg Gly Pro Phe Ser Thr Ser Ser Phe Thr Val Ser Arg 20 25 30 Pro Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly 35 40 45 Gly Lys Val Gly Ala Ile Ala Val Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Ile Asn Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val 65 70 75 80 Val Ile Thr Ile Asp Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg 85 90 95 Ser Ser Gln Gln Met Ala Ala Leu Arg Gln Val Val Ser Leu Ala Gly 100 105 110 Thr Ser Ser Ser Pro Ile Tyr Asn Lys Val Asp Thr Ala Arg Leu Gly 115 120 125 Val Met Gly Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Lys 130 135 140 Asn Asn Pro Ser Leu Arg Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Ala Gln 145 150 155 160 Glu Ser Phe Ser Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Val Ser Cys Glu 165 170 175 Asn Asp Ser Ile Ala Pro Asn Ser Ser His Ser Phe Pro Phe Tyr Asn 180 185 190 Gln Met Thr Arg Asn Lys Lys Ala Asn Leu Val Ile Asn Gly Gly Ser 195 200 205 His Ser Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asp Ala Gly Leu Ile Gly Lys 210 215 220 Tyr Gly Val Ala Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asp Asp Thr Arg Tyr 225 230 235 240 Ser Lys Phe Leu Cys Gly Ala Glu His Gln Ala Asp Leu Ser Lys Arg 245 250 255 Ala Val Glu Ala Tyr Lys Glu Asn Cys Pro Tyr 260 265 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A4W93_RS06010 codon optimized <400> 3 atgtttggaa aactcccatt tgcacgagcg agcctcgcgg taggcgcact gctgctgtcc 60 gctgccgcgg tagcccagac caatccttat cagcggggcc cggatccaac cgtttcttcc 120 cttgaagcca cgcgtggtcc gtttagtaca tcgtctttta ctgtgagccg cccatctggg 180 tatggtgcgg ggacggttta ttatcccacc aatgcaggcg gcaaagtggg agccatagct 240 gtagttcccg gttataccgc taggcagtct agcattaatt ggtggggtcc ccggttagcg 300 agccatggtt ttgtcgttat cactattgat acaaactcaa cgttagatca accttccagt 360 cgttcttcac agcaaatggc tgctttgcgt caggtcgtga gtttagccgg cacatcttct 420 agcccgatct acaataaagt ggacactgcc agactaggag tgatgggctg gtcgatgggt 480 ggtggtggtt cactgatttc cgcgaaaaac aatccgagtc ttcgcgctgc cgcgccgcag 540 gcaccatggg cccaagaatc cttctcttct gttacagtgc ctacgctgat agtctcgtgc 600 gagaatgatt cgattgcacc gaacagctca cattcatttc ctttctacaa tcagatgacc 660 cgcaacaaaa aagcaaatct tgtaatcaat ggcggtagcc atagttgcgc caacagtgga 720 aactccgacg ctggcttgat tggcaagtat ggagttgcct ggatgaagcg ctttatggat 780 gatgatacaa gatatagtaa gttcctgtgt ggcgccgaac accaagcaga tttatcgaaa 840 cgtgcagttg aagcttataa agagaattgt ccttattaa 879 <210> 4 <211> 879 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhizobacter gummiphilus strain NS21 A4W93_RS06010 original <400> 4 atgttcggaa aactcccctt cgcgcgagcc agcctcgcgg tcggtgcgct gctgctgtcc 60 gcggccgccg tcgcccagac caacccgtac cagcgcggcc cggatcccac ggtgtcctcg 120 ctcgaggcca cccgcggccc gttcagcacc agctcgttca ccgtgagccg cccgagcggc 180 tacggcgcgg gcacggtgta ctaccccacc aacgccggcg gcaaggtcgg cgccatcgcg 240 gtggtgcccg gctacaccgc gcgccagagc agcatcaact ggtggggccc gcggctcgcg 300 tcgcatggct tcgtcgtgat cacgatcgac accaactcga cgctcgacca gccgtccagc 360 cgttcttccc agcagatggc ggcgttgcgc caggtggtgt cgctcgccgg caccagcagc 420 agcccgatct acaacaaggt ggacaccgcc cgcctcggcg tgatgggctg gtcgatgggc 480 ggcggcggtt cgctgatctc cgcgaagaac aacccgtcgc tgcgcgcggc cgcaccgcag 540 gcgccatggg cccaggagag cttctcgtcg gtcaccgtgc cgacgctgat cgtctcgtgc 600 gagaacgaca gcatcgcgcc caacagctcg cactcgttcc cgttctacaa ccagatgacc 660 cgcaacaaga aggccaacct ggtcatcaac ggcggcagcc actcctgcgc caacagcggc 720 aactcggacg ccggtctcat cggcaagtac ggcgtggcgt ggatgaagcg cttcatggac 780 gacgacacgc gctacagcaa gttcctgtgc ggcgccgaac accaggccga cctgagcaag 840 cgtgccgtcg aggcctacaa ggagaactgc ccctactga 879 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETase_F <400> 5 gcgcccatgg cgcagaccaa tccttatcag cgg 33 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETase_R <400> 6 gcgcctcgag ataaggacaa ttctctttat aagc 34 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseH211S_F <400> 7 gcaccgaaca gctcatcttc atttcctttc tac 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseH211S_R <400> 8 gtagaaagga aatgaagatg agctgttcgg tgc 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseF215I_F <400> 9 tcacattcat ttcctatcta caatcagatg acc 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseF215I_R <400> 10 ggtcatctga ttgtagatag gaaatgaatg tga 33 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseQ218S_F <400> 11 cctttctaca attccatgac ccgcaac 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseQ218S_R <400> 12 gttgcgggtc atggaattgt agaaagg 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseK169A_F <400> 13 cactgatttc cgcggctaac aatccgagtc 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseK169A_R <400> 14 gactcggatt gttagccgcg gaaatcagtg 30 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseE186A_F <400> 15 gcaccatggg cccaagcatc cttctcttct gtt 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseE186A_R <400> 16 aacagaagag aaggatgctt gggcccatgg tgc 33 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR45A_F <400> 17 cccttgaagc cacggctggt ccgtttagta c 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR45A_R <400> 18 gtactaaacg gaccagccgt ggcttcaagg g 31 <210> 19 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR45E_F <400> 19 cccttgaagc cacggaaggt ccgtttagta c 31 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR45E_R <400> 20 gtactaaacg gaccttccgt ggcttcaagg g 31 <210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR57A_F <400> 21 cttttactgt gagcgcgcca tctgggtatg g 31 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR57A_R <400> 22 ccatacccag atggcgcgct cacagtaaaa g 31 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR57E_F <400> 23 cttttactgt gagcgaacca tctgggtatg g 31 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR57E_R <400> 24 ccatacccag atggttcgct cacagtaaaa g 31 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR130A_F <400> 25 caaatggctg ctttggcgca ggtcgtgagt tta 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR130A_R <400> 26 taaactcacg acctgcgcca aagcagccat ttg 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR130E_F <400> 27 caaatggctg ctttggaaca ggtcgtgagt tta 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR130E_R <400> 28 taaactcacg acctgttcca aagcagccat ttg 33 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR221A_F <400> 29 caatcagatg accgcgaaca aaaaagcaaa t 31 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR221A_R <400> 30 atttgctttt ttgttcgcgg tcatctgatt g 31 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR221E_F <400> 31 tcagatgacc gaaaacaaaa aagcaaat 28 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR221E_R <400> 32 atttgctttt ttgttttcgg tcatctgatt g 31 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR88A_F <400> 33 ccggttatac cgctgcgcag tctagcatta at 32 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR88A_R <400> 34 attaatgcta gactgcgcag cggtataacc gg 32 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR88E_F <400> 35 ccggttatac cgctgaacag tctagcatta at 32 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR88E_R <400> 36 attaatgcta gactgttcag cggtataacc gg 32 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR281A_F <400> 37 gcagatttat cgaaagctgc agttgaagct tat 33 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR281A_R <400> 38 ataagcttca actgcagctt tcgataaatc tgc 33 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR281E_F <400> 39 gcagatttat cgaaagaagc agttgaagct tat 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RgPETaseR281E_R <400> 40 ataagcttca actgcttctt tcgataaatc tgc 33 <210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP DSbA <400> 41 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP PelB <400> 42 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP LamB <400> 43 Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala 20 25 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP SurA <400> 44 Met Lys Asn Trp Lys Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Met Ile Ala Asn 1 5 10 15 Thr Ser Phe Ala 20 <210> 45 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP MalE <400> 45 Met Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Met Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala 20 25 <210> 46 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SP TolB <400> 46 Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Leu His Ala 20

Claims

리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus)로부터 유래한, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해 활성을 갖는 RgPETase의 변이체로서,
서열번호 1의 아미노산 서열에 대해서 하기 (a) 내지 (f)의 변이 중 하나의 변이를 포함하는 서열로 이루어지는 RgPETase 변이체:
(a) 45번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(b) 57번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(c) 130번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(d) 169번째 K가 A로 치환
(e) 221번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(f) 281번째 R이 A, D 또는 E로 치환.
리조박터 구미필러스(Rhizobacter gummiphilus)로부터 유래한, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해 활성을 갖는 RgPETase의 변이체로서,
서열번호 2의 아미노산 서열에 대해서 하기 (i) 내지 (vi)의 변이 중 하나의 변이를 포함하는 서열로 이루어지는 RgPETase 변이체:
(i) 20번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(ii) 32번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(iii) 105번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(iv) 144번째 K가 A로 치환
(v) 196번째 R이 A, D 또는 E로 치환
(vi) 256번째 R이 A, D 또는 E로 치환.
제2항에 있어서,
상기 RgPETase 변이체의 N-말단에 신호펩티드로서 SP_DSbA, SP_PelB, SP_LamB, SP_SurA, SP_MalE, 또는 SP_TolB의 아미노산 서열이 연결된,
RgPETase 변이체.
제3항에 있어서,
상기 SP_DSbA는 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 SP_PelB는 서열번호 42의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 SP_LamB는 서열번호 43의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 SP_SurA는 서열번호 44의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 SP_MalE는 서열번호 45의 아미노산 서열로 이루어지고,
상기 SP_TolB는 서열번호 46의 아미노산 서열로 이루어지는,
RgPETase 변이체.
야생형 RgPETase 및 제1항 내지 제4항의 RgPETase 변이체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
야생형 RgPETase 및 제1항 내지 제4항의 RgPETase 변이체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 발현하는 대장균 변이균주.
야생형 RgPETase 및 제1항 내지 제4항의 RgPETase 변이체로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 효소를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해용 조성물.
제6항의 대장균 변이균주를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 분해용 조성물.