KR102261596B1 - 말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수분해 활성을 가지는 MHETase 변이체 - Google Patents

말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수분해 활성을 가지는 MHETase 변이체 Download PDF

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Abstract

말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수 분해 활성을 가지고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 411번째 아미노산이 아르기닌에서 라이신으로 치환되고, 424번째 아미노산이 페닐알라닌에서 이소루신, 발린, 또는 아스파라긴으로 치환된 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 MHETase 변이체가 개시된다.

Description

말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수분해 활성을 가지는 MHETase 변이체{MHETase Variants with Exo-PETase Activity to PET Having Terminals}
본 발명은 말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수분해 활성을 가지는 MHETase 변이체에 관한 것이다.
폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate; PET)는 보편적으로 생산 및 사용되는 플라스틱 중 하나이다. 지난 수십 년 동안 PET은 저렴한 가격, 가벼운 무게, 높은 가공성 및 생체 비활성으로 인하여 2015년에는 사용량이 전 세계적으로 3억 2천만톤에 이를 정도로 증가하였다. 그러나 PET은 자연적으로 분해되는 속도가 450년에 달할 정도로 매우 느리기 때문에 많은 양의 폐기물이 축적되고 있으며 2050년까지 축적된 폐기물의 양은 330억톤에 달할 것으로 예상되고 있다.
이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)는 PET을 분해하여 에너지원 및 탄소원으로 사용할 수 있는 균주로서, PET 가수분해 효소인 PETase 및 MHET(Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid) 가수분해 효소인 MHETase에 의해 PET을 분해한다. PETase는 PET을 단량체인 MHET으로 가수분해하며, MHETase는 MHET을 에틸렌글리콜(Ethylene glycol; EG) 및 테레프탈레이트(Terephthalate; TPA)로 분해한다. PET으로부터 EG 및 TPA까지 분해되는데 걸리는 시간은 PET으로부터 MHET으로 분해되는 속도에 좌우된다. 이는 PETase에 의해 PET에서 MHET으로 분해되는 속도가 상대적으로 느리기 때문이다. PET은 PETase에 의해 가수 분해되면 MHET 뿐만 아니라 TPA 말단 또는 EG 말단을 가지는 PET 고분자를 생성한다. 말단을 가지는 PET 고분자는 다시 PETase에 의해 MHET으로의 분해되고 비로소 MHETase에 의해 TPA 및 EG로의 분해된다.
따라서 PET의 분해 효율을 높이기 위해서는 TPA 말단 또는 EG 말단을 가지는 PET 고분자를 PETase에 의한 분해를 거치지 않고 바로 TPA 및 EG로 최종 분해할 수 있는 MHETase 변이체가 필요하다.
KJ Kim et, Structural insight into molecular mechanism of poly(ethylene terephthalate) degradation, Nature Communications 9, 382, 2018
일 구체예는 말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수 분해 활성을 가지는 MHETase 변이체를 제공한다.
일 양상은 말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수 분해 활성을 가지고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 411번째 아미노산이 아르기닌(Arginine)에서 리신(lysine)으로 치환되고, 424번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine)에서 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 또는 아스파라긴(asparagine)으로 치환된 폴리펩티드로 이루어지는 MHETase 변이체를 제공한다.
상기 외부 가수분해 활성은 exo-type을 의미하는 것으로서, 고분자 기질의 내부가 아닌 말단으로부터 분해하는 활성을 의미한다. 도 1에 따르면, 상기 MHETase 변이체는 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PETn) 고분자의 TPA 말단(TPA terminus)을 가수분해하여 TPA 및 EG 말단(EG terminus)을 가지는 PETn-1을 생성하거나(도 1의 A), 또는 EG 말단을 가수분해하여 MHET 및 EG 말단을 가지는 PETn-1을 생성할 수 있다(도 1의 B). TPA 말단과 EG 말단 모두 가수분해되면 EG 말단을 가지는 PET을 생성한다. MHETase 변이체는 생성된 EG 말단 및 MHET를 다시 가수분해할 수 있으므로, 연속적인 가수분해에 의해 PET이 EG 및 TPA로 완전히 분해될 수 있다.
도 2에 따르면, MHET(Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid)은 1개의 TPA 모이어티에 1개의 EG 모이어티가 결합된 형태이며, BHET(Bis(2-Hydroxyethyl) terephthalate)는 1개의 TPA 모이어티의 para 위치에 2개의 EG 모이어티(제 1 EG 모이어티 및 제 2 EG 모이어티)가 결합된 형태이다. MHETase와 MHET는 TPA 모이어티를 효소 내부에 수용하고 EG 모이어티는 효소 외부에 노출되는 형태로 결합하고 MHET를 TPA와 EG로 분해한다. 이와 다르게, MHETase와 BHET는 TPA 모이어티 및 제 1 EG 모이어티(내부 EG 모이어티)를 효소 내부에 수용하고 제 2 EG 모이어티(외부 EG 모이어티)가 효소 외부에 노출되는 형태로 결합하며 TPA 모이어티와 제 2 EG 모이어티 사이의 결합을 가수 분해한다. BHET 분해 활성은 내부 EG 모이어티에 의해 BHET에 대한 결합 친화도가 저하되므로 MHET 분해 활성에 비해 현저히 낮다. 따라서 같은 이유로 EG 말단을 가지는 PET 고분자에 대한 외부 가수분해 활성도 낮았다. 그러나 상기 MHETase 변이체는 411번째 아미노산 및 424번째 아미노산이 변형됨으로서 내부 EG 모이어티와 TPA 모이어티에 대한 수용력이 향상되어 EG 말단을 가지는 PET에 대한 외부 가수 분해 활성이 야생형 MHETase보다 현저히 향상되었다.
일 구체예에 따르면, 상기 말단은 테레프탈레이트 말단 또는 에틸렌 글라이콜 말단일 수 있다. 상기 MHETase 변이체는 EG 말단에 대한 외부 가수분해 활성이 높으면서도 MHETase 활성도 보유하므로 EG 말단 및 TPA 말단 모두 효과적으로 분해할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 외부 가수 분해 활성은 야생형 MHETase보다 높은 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면 MHETaseR411K/F424N, MHETaseR411K/F424V, 및 MHETaseR411K/F424I의 외부 가수분해 활성은 야생형보다 각각 8.7배, 10.5배, 및 11.1배 향상됨을 확인하였다.
다른 양상은 상기 MHETase 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포를 숙주 세포로 하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 당업계에서 주로 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)으로 제작될 수 있고, 바람직하게는 T7/lac 프로모터를 가지고 있어 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의해 단백질의 발현이 유도되는 pET-22b(+)가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터는 암호화된 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 예를 들면 tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, 또는 T7 프로모터일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 벡터는 발현된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 C-말단에 다른 서열이 연결될 수도 있다. 상기 연결될 수 있는 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열로 인하여, MHETase 변이체를 생산하는 생산 균주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고 용이하게 정제될 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들면 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결된 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있고, 상기 신호 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 염기 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로서, 직접 연결되어 있거나 또는 일정 거리를 두고 연결되어 있을 수 있고, 목적하는 단백질의 전사, 번역, 폴딩, 분비, 또는 다른 기능적 양상을 제어할 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 예를 들면 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열이 목적하는 단백질을 암호화하는 염기 서열과 작동가능하게 연결되면, 목적하는 단백질이 발현되어 세포 외로 분비될 수 있다.
용어 "신호 펩티드(signal peptide)"는 주로 분비 단백질의 전구체의 N-말단 상부(upstream)에 존재하며 분비된 단백질에는 제거되어 존재하지 않는 것을 의미한다. 신호 펩티드는 이를 발현하는 염기 서열과 인 프레임(in frame)으로 연결된 유전자 발현 산물을 세포 외로 분비되도록 하는 활성을 갖는다. 일반적으로 분비 단백질은 단백질 전구체에서 신호 펩티드 부분이 절단된 상태로 세포 외로 분비된다.
상기 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 5'상부에 위치할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 말토포린 신호 펩티드(SPlamb 신호 펩티드로 지칭할 수 있음)가 작동 가능하게 연결된 MHETase 변이체는 다른 신호 펩티드를 연결한 경우보다 외부로 분비가 원활할 수 있다. SPlamb 신호 펩티드는 그람 음성 세균의 세포 내에서 합성된 단백질이 세포 내막을 통해 세포주변질(periplasm), 즉 세포 내막과 외막 사이의 공간으로 분비하는 Sec-의존적 경로의 신호 펩티드이다.
또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 상기 형질전환된 미생물은 MHETase 변이체를 발현할 수 있는 균주이므로, 본 명세서에서는 MHETase 변이체 생산 균주로 정의한다. 본 발명의 생산 균주를 얻기 위한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환을 위해 벡터 등을 숙주 세포 내로 운반하는 방법으로는, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등이 있다.
일 구체예에 따르면 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 MHETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 분해 방법을 제공한다. 반응 조건은 상기 MHETase 변이체의 효소 활성이 나타날 수 있도록 온도가 30
Figure 112020001322352-pat00001
이상이고, 시간이 24시간 이상인 것이 바람직하다. 상기 방법은 PET 고분자의 말단 생성을 위해 PETase를 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 방법을 통해, PET은 EG 및 TPA로 최종 분해될 수 있다.
일 구체예에 따른 MHETase 변이체는 PET 고분자의 말단에 대한 외부 가수분해 능력이 우수하므로 PET을 보다 효과적으로 분해할 수 있다.
도 1은 TPA 말단을 가지는 PET 중합체 또는 EG 말단을 가지는 PET 중합체에 대한 MHETase의 가수 분해 과정을 개략적으로 나타낸 것이다. 말단의 종류와 상관없이 가수 분해 후에는 EG 말단을 가지는 PET 중합체가 생성된다.
도 2는 신호 펩티드 종류에 따른 MHETase 분비량 차이를 확인한 결과이다.
도 3은 SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase와 세포기질(cytosol)에서 생산된 MHETase의 결정 구조를 중첩하여 비교한 결과이다. SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase는 촉매(catalytic) 도메인과 Lid 도메인을 각각 청록색과 분홍색으로 표시하였다. 세포기질(cytosol)에서 생산된 MHETase는 회색으로 표시하였다. 원으로 강조 표시된 부분은 이황화 결합 부위이다.
도 4는 MHETase 농도에 따른 MHET 가수 분해 활성을 나타낸 것이다. A는 다양한 농도의 MHETase 처리에 의해 생성된 잔류 MHET을 나타낸 것이고, B는 0.5 nM MHETase 처리에 의한 잔류 MHET 및 TPA 생산을 LC 크로마토그램으로 나타낸 것이다. C는 SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase와 세포기질(cytosol)에서 생산된 MHETase의 가수 분해 활성을 비교한 결과이다.
도 5는 MHETase와 BHET이 결합한 구조를 나타낸 것이다. A는 MHETase와 BHET가 결합한 복합체(complex)의 구조이다. BHET 결합과 관련된 잔기는 스틱 모델로 표시되어 있다. B는 MHETase와 BHET이 공유결합성 중간체를 이룬 MHET intermediate가 결합한 복합체의 구조이다. MHET intermediate 결합에 관여하는 잔기는 스틱 모델로 표시되어 있다. 공유 결합은 녹색 화살표로 표시되어 있다.
도 6은 효소 활성 및 기질 결합에 관여하는 것으로 예상되는 잔기들을 위치 지정 돌연변이시켜 MHETase 활성 감소를 확인한 결과이다.
도 7에서 A는 다양한 농도의 MHETase를 처리하여 BHET 가수분해 활성을 확인한 결과이다. B는 2 μM의 MHETase에 의해 생성된 잔류 BHET 및 TPA 생성에 대한 LC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 8에서 A는 다양한 농도의 MHETase를 처리하여 PET5에 대한 외부 가수분해 활성을 확인한 결과이다. B는 0.6 μM의 MHEtase 처리에 의해 생성된 잔류 PET5 및 TPA 생성에 대한 LC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 MHETase 변이체의 MHET 및 BHET에 대한 가수분해 활성을 야생형과 비교한 결과이다.
도 10은 다양한 MHETase 변이체의 PET5에 대한 외부 가수분해 활성을 야생형과 비교한 결과이다.
도 11은 MHETaseR411K/F424I 변이체와 야생형(Wildtype; WT) MHETase의 PET 필름 분해 능력을 비교한 결과이다.
도 12는 PETaseS121E/D186H/R280A, MHETaseWT 및 MHETaseR411K/F424N 변이체로 처리된 비정질 PET 필름의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. MHETase의 세포외 생산(Extracellular production)
구체적으로 MHETase를 암호화하는 코돈 최적화된(codon optimizing) 유전자를 합성하고, 자체적인 신호 펩타이드가 없는 pET22b(+)(Novagen/Merck)-modified vector로 서브 클로닝(Nco I 및 Xho I)하였다. 제작된 발현 벡터로 E.coli BL21(DE3)-T1R 균주를 형질전환시키고, 200 mg/L 암피실린을 포함하는 1L lysogeny broth medium가 담긴 플라스크에서 37℃ 조건으로 600nm에서 0.6의 광학 밀도(optical density)로 배양하였다.
0.1 mM 이소프로필 베타-디-1-티오갈락토피라노사이드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)을 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 130 rpm의 진탕하에 18℃에서 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어서 4℃에서 20분동안 4000g에서 원심분리하여 세포를 수확하였다.
각 1L의 배지 분획(medium fraction)의 200ml 분취량(aliquots)을 Amicon® Ultra-15 10K 원심분리 필터(Milipore)를 사용하여 1mL(200배)로 농축시켰다. 이어서 농축된 분획을 빙냉(ice cold) 40mM Tris-HCL(pH8.0)으로 투석하고, Ni-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen)에 로딩하였다.
40 mM Tris-HCl 및 9mM 이미다졸을 포함하는 버퍼로 세척한 후 결합된 단백질을 300 mM 이미다졸을 함유한 완충액 A 10mL로 용출시켰다. 각 샘플의 용출 분획을 원심분리 필터를 이용하여 2 mL만큼 농축시켜 SDS-PAGE를 실시하였다. 정제된 단백질은 BioTekTM Epoch 마이크로플레이트 분광광도계 및 Gen5TM 마이크로플레이트 데이터 분석 소프트웨어로 정량화하였다.
단백질 흡광계수값(Extinction coefficient value)은 ExPASy 서버의 ProtParam tool로부터 얻었다. 결정분석(crystallography)을 위해 20L의 대규모 배양(large-scale cultivation)을 수행하였다.
위치지정 돌연변이(site-directed mutagenesis) 실험은 QuikChange site-directed mutagenesis Kit(Agilent)를 사용하여 수행하였다. 변이체의 발현 및 정제는 야생형 MHETase와 동일한 과정으로 수행하였다. 클로닝 및 위치지정 돌연변이 유발에 사용한 프라이머는 하기 표 1에 개시되어 있다.
Seq ID Name Primer
4 Is MHETase_F 5'-GCGCCCATGG CGTGTGCTGGCGGTGGGTCCACGC-3'
5 Is MHETase_R 5'-GCGCCTCGAGGGGAGGAGCCGCGCAGGCGAAGTT-5'
6 Is MHETase S225A _F 5'-CTATTTCATTGGGTGTGCCGAGGGTGGCCGCGAA-3'
7 Is MHETase S225A _R 5'-TTCGCGGCCACCCTCGGCACACCCAATGAAATAG-3'
8 Is MHETase D492A _F 5'-GTACCACGGCATGTCCGCTGCCGCGTTCTCAGC-3'
9 Is MHETase D492A _R 5'-GCTGAGAACGCGGCAGCGGACATGCCGTGGTAC-3'
10 Is MHETase H528A _F 5'-GTGCCGGGTATGAATGCTTGCTCAGGCGGTCC-3'
11 Is MHETase H528A _R 5'-GGACCGCCTGAGCAAGCATTCATACCCGGCAC-3'
12 Is MHETase L254A _F 5'-CACCAGGTTATCAGGCGCCGAAAGCAGGGATAAG-3'
13 Is MHETase L254A _R 5'-CTTATCCCTGCTTTCGGCGCCTGATAACCTGGTG-3'
14 Is MHETase W397A _F 5'-GGGGTGGCGCAGTGCGTGGTTAGGTTCTTTC-3'
15 Is MHETase W397A _R 5'-GAAAGAACCTAACCACGCACTGCGCCACCCC-3'
16 Is MHETase F415A _F 5'-GAGAGTAAGCGGCGCCAGTGCGCGCTCCTG-3'
17 Is MHETase F415A _R 5'-CAGGAGCGCGCACTGGCGCCGCTTACTCTC-3'
18 Is MHETase F495A _F 5'-CATGTCCGATGCCGCGGCCTCAGCCCTGGATAC-3'
19 Is MHETase F495A _R 5'-GTATCCAGGGCTGAGGCCGCGGCATCGGACATG-3'
20 Is MHETase R411A _F 5'-GCTAACAACGCCCAGGCTGTAAGCGGCTTCAG-3'
21 Is MHETase R411A _R 5'-CTGAAGCCGCTTACAGCCTGGGCGTTGTTAGC-3'
22 Is MHETase S416A _F 5'-GAGTAAGCGGCTTCGCTGCGCGCTCCTGGCTGG-3'
23 Is MHETase S416A _R 5'-CCAGCCAGGAGCGCGCAGCGAAGCCGCTTACTC-3'
24 Is MHETase F415S _F 5'-GAGAGTAAGCGGCAGTAGTGCGCGCTCCTG-3'
25 Is MHETase F415S _R 5'-CAGGAGCGCGCACTACTGCCGCTTACTCTC-3'
26 Is MHETase R411K _F 5'-GCTAACAACGCCCAGAAAGTAAGCGGCTTCAG-3'
27 Is MHETase R411K _R 5'-CTGAAGCCGCTTACTTTCTGGGCGTTGTTAGC-3'
28 Is MHETase F424N _F 5'-CTGGCTGGTCGATAACGCCACACCGCCCG-3'
29 Is MHETase F424N _R 5'-CGGGCGGTGTGGCGTTATCGACCAGCCAG-3'
30 Is MHETase F424H _F 5'-CTGGCTGGTCGATCATGCCACACCGCCCG-3'
31 Is MHETase F424H _R 5'-CGGGCGGTGTGGCATGATCGACCAGCCAG-3'
32 Is MHETase F424D _F 5'-CTGGCTGGTCGATGACGCCACACCGCCCG-3'
33 Is MHETase F424D _R 5'-CGGGCGGTGTGGCGTCATCGACCAGCCAG-3'
34 Is MHETase F424E _F 5'-CTGGCTGGTCGATGAGGCCACACCGCCCG-3'
35 Is MHETase F424E _R 5'-CGGGCGGTGTGGCCTCATCGACCAGCCAG-3'
36 Is MHETase F424T _F 5'-CTGGCTGGTCGATACCGCCACACCGCCCG-3'
37 Is MHETase F424T _R 5'-CGGGCGGTGTGGCGGTATCGACCAGCCAG-3'
38 Is MHETase F424V _F 5'-CTGGCTGGTCGATGTGGCCACACCGCCCG-3'
39 Is MHETase F424V _R 5'-CGGGCGGTGTGGCCACATCGACCAGCCAG-3'
40 Is MHETase F424L _F 5'-CTGGCTGGTCGATTTGGCCACACCGCCCG-3'
41 Is MHETase F424L _R 5'-CGGGCGGTGTGGCCAAATCGACCAGCCAG-3'
42 Is MHETase F424I _F 5'-CTGGCTGGTCGATATCGCCACACCGCCCG-3'
43 Is MHETase F424I _R 5'-CGGGCGGTGTGGCGATATCGACCAGCCAG-3'
2. MHETase의 결정화, 데이터 획득, 및 구조 결정
정제된 SeMet(Selenomethionine)-치환 MHETase 및 천연 MHETase의 결정화(crystallization)는 spares-matrix screen(Rigaku) 및 20℃에서 시팅 드롭 증기 확산법(sitting-drop vapor diffusion)을 이용한 molecular dimension으로 수행되었다. 각 실험은 1.0 μL의 단백질 용액(40 mM Tris 중 29 mg/mL, pH 8.0)을 1.0μL의 저장용액(reservoir solution)과 혼합하고 0.5 mL의 저장용액에 대해 drop을 평형화하여 실시되었다.
SeMet 치환 MHETase 결정 및 천연 MHETase 결정은 1 % PEG 3350, 0.1M Na-HEPES (pH 6.5) 및 15 % Tacsimate (pH 7.0)에서 가장 품질이 우수한 것으로 나타났다. BHET/MHET 중간체와 복합체를 이룬 MHETase의 결정은 동일하나 조건하에서 결정화시키고, 50 μM BHET를 2시간 동안 결정에 침지(soak)시켰다. SeMet 치환 MHETase 및 천연 MHETase 결정은 30%(v/v)의 글리세롤을 포함한 동결 방지용 용액(cryoprotectant solution)으로 옮기고 결정보다 큰 루프로 마무리한 후 질소 스트림에서 즉시 동결시켰다. 모든 데이터는 Quantum 270 CCD 검출기(ADSC, USA)를 사용하여 포항 가속기 연구소의 7A 빔라인에서 수집되었다.
회절 데이터(Diffraction data)는 HKL 2000 소프트웨어 패키지를 사용하여 색인화, 통합, 및 스케일링 되었다. Se-Met 치환된 MHETase 결정은 공간군(Space group) C2에 속하며, 단위 셀 파라미터(unit cell parameter)는 a = 215.26Å, b = 173.8Å, c = 106.67Å, α = γ = 90 °, β = 119.51 °이다.
비대칭 단위(asymmetric unit) 에는 SeMet이 치환된 3분자의 MHETase가 포함되며, 매튜 상관계수(matthews coefficient)는 4.71 Å3 Da-1이며, 용매 함량은 약 73.92%에 해당한다.
셀레늄 위치 결정(selenium site determination), 위상(phasing), 초기 모델 구축은 Autosol(PHENIX package)을 사용하여 수행했다. 모델 구축은 Wincoot 프로그램을 사용하여 수행하였고 수정은 CCP4 refmac5를 사용하여 수행하였다.
네이티브 MHETase 결정은 2.1Å 분해능으로 회절되었고, 공간군 C2에 속하며 단위 셀 파라미터는 a = 214.93 Å, b = 173.16 Å, c = 107.22 Å, α = γ = 90 ° 및 β = 119.86 °이다.
비대칭 단위당 MHETase 3개의 분자인 경우 매튜 상관 계수는 4.71 Å3 Da-1이며, 용매 함량은 약 73.83%에 해당한다. MHETase의 고유 구조는 SeMET 치환 MHETase의 구조를 사용하여 MOLREP의 CCP4 버전에 의한 분자 대체를 통해 결정되었다. 모델 구축은 Wincoot 프로그램을 사용하여 수행하였고 수정은 CCP4 refmac5를 사용하여 수행하였다.
BHET/MHET 중간체와의 복합체를 이룬 MHETase의 구조는 검색 모델로서 MHETase의 구조를 이용한 분자 대체(molecular replacement)에 의해 결정되었다. 모델 구축 및 수정은 전술한 바와 같다. 수집된 데이터 및 수정에 대한 통계는 하기 표 2에 요약되어 있다. Apo 및 BHET/MHET 중간체가 결합된 MHETase의 구조는 각각 PDB 코드 6JTU 및 6JTT으로 Protein Data Bank에 기탁되었다.
Figure 112020001322352-pat00002
3. MHET 및 BHET 가수분해능 측정
MHET의 제조를 위해 4mM의 BHET(sigma-aldrich)를 30mC에서 1시간 동안 pH9.0의 50mM glycine-HCl에서 1μM PETase와 함께 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 85℃에서 15분간 가열함으로서 효소 반응을 종결시킨 후, 샘플을 13500xg에서 10분간 원심분리하였다. HPLC를 사용하여 BHET의 MHET로의 완전한 가수 분해를 확인하고, 3.5mM MHET 용액을 제조하였다. 다양한 농도의 MHETase(0.1 내지 2.0 nM)을 30℃에서 50 mM Na2HPO4-HCl, pH 8.0에서 100 μM의 MHET와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 85℃에서 15분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 13000g에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 LC 분석하였다.
유사하게, BHET 가수 분해 활성을 측정하기 위해 다양한 농도의 MHETase(0.1 내지 2.0 μM)를 30℃에서 50mM 50 mM Na2HPO4-HCl, pH 8.0에서 100 μM의 BHET와 함께 인큐베이션시켰다. 85℃에서 15분간 가열하여 반응을 종결시킨 후, 반응 혼합물을 13500g에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 LC를 사용하여 분석하였다.
4. PET의 in situ 중합 및 특성 확인
PET을 기계적 교반기, 응축기, 및 트랩을 가지는 300 mL 유리 반응기에서 중합시켰다. 에스테르 교환 반응을 위해 반응기를 질소 가스로 퍼지하여 잔류 산소를 제거하였다. DMT(dimethyl terephthalate)(97.09g, 0.5 몰), EG(62.07g, 1.0 몰), 및 titanium(IV) butoxide(단량체 총 중량 대비 100ppm)을 반응기 내로 칭량(weigh)하였다. DMT, EG, 및 titanium(IV) butoxide 는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였으며 추가 정제없이 사용하였다.
반응 혼합물을 150℃에서 30분간 유지하여 완전히 용해시켰다. 반응 온도를 10℃/5분의 속도로 210℃까지 상승시키고 2시간 동안 유지하여 에스테르 교환 반응(ester interchange reaction)의 종말점(end point)에 도달하였다. Mn 및 샘플 분포는 0.7 mL/min의 속도에서 o-chlorophenol/chloroform(1/3)을 이동상으로 하여 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)에 의해 측정하였다. Malvern TDA 305 굴절률 검출기가 장착된 40℃(혼합층, 최대 기공 크기 3000Å)에서 2개의 shodex LF 804 컬럼으로 분리를 수행하였다.
이어서 30 mg의 샘플을 o-클로로페놀에 150℃에서 15분간 용해시키고, 9 mL의 클로로포름을 실온에서 첨가하였다. 샘플 용액을 인젝션하기 전에 0.45 μm 기공의 폴리테트라플루오로에틸렌 미세다공막(polytetrafluoroethylene microporous membrane)으로 여과하였다. 폴리스티렌 표준 물질로 범용 보정(universal calibration)한 후 Mn 및 중량 평균 분자량(Mw)/Mn을 계산하였다. PET 올리고머는 Mn=860, Mw=1100, 다분산지수(polydispersity index; PDI)=1.28로 확인되었다.
5. PET5 가수분해 활성 측정
PET5 가수분해 활성 측정은 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 합성된 PET 올리고머의 주성분(PET5)를 액체 크로마토 그래피로 정제하고 동결 건조시켜 준비하였다. 다양한 농도의 MHETase(0.2 내지 2.0 μM)를 30℃에서 50 mM Na2HPO4-HCl, pH 8.0에서 2.5 μM의 PET5와 인큐베이션시켰다. 85 ℃에서 15분간 가열하여 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 13,000g에서 10분간 원심분리한 후 상청액으로 LC 분석을 수행하였다.
6. 비정질(Amorphous) PET 필름 분해 실험
비정질 PET 필름은 250 μM 두께의 것으로 Goodfellow Ltd사의 제품을 사용하였다. PET 필름을 6 mm 직경의 원형으로 준비하고, pH 9.0, 50 mM 글리신-NaOH 을 함유하고 PETaseS121E/D186H/R280A 500 nM을 포함하거나, 또는 포함하지 않도록 용액을 준비하여 37 ℃에서 10일간 처리하였다. 처리 후 PET 필름을 1% SDS, 증류수, 및 에탄올로 세척한 후 건조시켰다.
이어서 처리된 PET 필름을 2 μM의 야생형 MHETase 또는 MHETaseR411K/F424I 변이체와 함께 500μL의 Na2HPO4-HCl(pH 8.0) 완충액에 침지시켰다. 반응 혼합물을 30℃에서 24h, 48h, 및 72h 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물로부터 PET 필름을 제거한 후 85℃에서 15 분간 가열하여 효소 반응을 종결시키고, 13500xg에서 10분간 원심분리한 후 상청액을 LC 분석에 이용하였다.
7. 반응성 염료(reactive dye)에 의한 PET 필름 표면 라벨링
효소 처리한 PET 필름을 100 μM Alexa Fluor 488-hydrazide에 침지시킨 후 10 μM의 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide를 용액에 첨가하였다. 암실에서 24시간 동안 인큐베이션하고 필름을 증류수 및 에탄올로 세척한 후 공기 건조시켰다. 라벨링 후에 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, Carl Zeiss LSM700)을 이용하여 공초점 이미지를 획득하였다.
8. HPLC 분석
In vitro assay 샘플은 UV/Vis detector가 연결된 CBM-20A 및 C18 컬럼(Shimadzu Shim-pack GIS ODS-I C18, 5 μm, 4.6 x 150 mm)으로 분석하였다. 이동상 A(mobile phase A)는 0.1%의 포름산을 함유한 물로 이루어졌으며, 이동상 B는 20% 아세토니트릴을 사용하였다. 유속은 1 ml/min으로 고정하고, BHET, MHET, 및 TPA는 260 nm의 파장에서 검출하였다.
용리(elution)는 0-2 분, 60-80% 완충액 B, 선형 구배; 2-8 분, 80-100% 완충액 B, 선형 구배; 8-16 분, 100% 버퍼 B. 100 % 완충액 B;로 이루어진 프로그램에 따라 수행하였다. PET5 분석을 위해 100% 완충액 B를 22 분(8-30 분) 동안 사용했다. 모든 실험은 3 회 수행 하였다.
실험결과
1. MHETase 분비의 최적의 신호 펩티드 확인
대장균으로부터 MHETase를 생산하기 위해서, Pectobacterium carotovorum으로부터 유래한 pectate lyase II의 신호펩티드(SPpelB), 그리고 E.Coli로부터 유래한 maltose/maltodextrin binding periplasmic protein의 신호펩티드(SPMalE), maltoporin 신호펩티드(SPLamB), periplasmic molecular chaperone SurA의 신호펩티드 (SPSurA), thiol:disulfide interchange protein의 신호펩티드 (SPDsbA), Tol-Pal system protein의 신호펩티드(SPTolB)를 pET vector system에서 시험하였다. 그리고 각각 형질전환된 대장균의 배양액으로부터 분비된 MHETase를 정제하고 분비량(secretion level)을 확인하였다.
도 2에 따르면, SPPelB 및 SPSurA를 사용한 경우에는 유의한 수준의 MHETase 단백질이 검출되지 않았지만, SPMalE, SPLamB, SPDsbA 및 SPTolB를 사용한 경우에는 SDS-PAGE 상에서 MHETase에 대한 밴드가 명확히 관찰되었다. MHETase 분비량(secretion level)은 SPMalE, SPLamB, SPDsbA 및 SPTolB 시스템에서 각각 1.2, 2.5, 0.7 및 0.9 mg / L로 측정되었으며, MHETase 분비량이 가장 높은 신호 펩티드는 SPLamB로 확인되었다.
2. 분비된 MHETase의 폴딩(Folding) 확인
SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase의 결정 구조를 측정하여 적절히 폴딩되었는지 확인하였다. 결정 구조는 단일파장이상분산방법(single wavelength anomalous dispersion, SAD)에 의한 SeMet-치환 결정을 이용하여 2.1 Å 분해능(resolution)에서 확인되었다.
SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase와 세포기질(cytosol)에서 생산된 MHETase의 결정 구조를 중첩하여 비교하였다. 도 3에 따르면, 두 MHETase는 결정 구조가 동일하고, 특히 α/β-hydrolase-fold catalytic domain 구조와 lid domain 구조가 일치하며, 5개의 이황화결합(cys51- cys92, cys320-cys303, cys340- cys348, cys224-cys529, 및 cys577-cys599)이 일치하므로 SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase가 적절히 폴딩되었음을 알 수 있었다.
도 4에 따르면 SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase는 농도 의존적으로 MHET를 가수 분해하였으며(도 4의 A, B), 세포기질에서 발현된 MHETase와 유사한 MHET 가수분해 활성을 나타내었다(도 4의 C). 따라서 SPlamB 신호펩티드에 의해 분비된 MHETase가 본래 활성을 발휘하므로 적절히 폴딩되었음을 알 수 있다.
3. MHETase의 BHET 유사체 결합 구조 확인
MHETase 결정에 MHET의 유사체(analogue)로서 BHET를 첨가하고 MHETase와 BHET이 결합된 상태의 결정 구조를 확인하였다. 그 결과 BHET과 MHETase가 공유결합 없이 결합된 구조(도 5의 A) 및 BHET의 MHET 모이어티(moiety)가 MHETase에서 촉매활성을 가지는 225번째 Serine기와 에스테르 결합(ester bond)을 함으로서 공유결합성 중간체(covalent intermediate) 를 이루는 MHET intermediate 결합 구조(도 5의 B)가 확인되었다. 이는 BHET이 MHETase에 의해 가수 분해될 수 있음을 암시한다.
그러나 도 5의 A 및 B 모두 MHETase와 결합한 부분의 전자 밀도는 명확히 관찰되는 반면 MHETase 내부에 위치하는 EG 모이어티(이하 내부 EG 모이어티 또는 EG-moietyin로 지칭할 수 있음)의 전자 밀도가 명확히 파악되지 않았다. 그러므로 MHETase와 내부 EG 모이어티의 결합은 최적이 아님을 알 수 있다. 종합하면, MHETase는 BHET에 대해서 가수 분해 활성을 가질 수 있으나, MHET에 대한 활성보다는 약할 것으로 예상된다.
도 5의 A에 따르면, BHET의 TPA 모이어티 및 외부 EG 모이어티(EG-moietyout)는 MHETase의 Leu254, Trp397, Phe415, 및 Phe495와 같은 소수성 잔기(residue)들에 의해 형성된 포켓에 강하게 고정된다(embedded). 외부 EG 모이어티의 카르보닐 산소 원자는 MHETase의 Gly132 및 Glu226의 질소원자와 수소 결합되어 사면체 중간체(tetrahedral intermediate)를 안정화시키는 옥시음이온 구멍(oxyanion hole)을 형성한다. 그리고 TPA 모이어티와 외부 EG 모이어티의 에스테르 결합은 MHETase의 촉매 부분인 Ser225 근처에 위치한다. BHET의 내부 EG 모이어티와 MHETase는 주로 극성 상호 작용(polar interaction)을 통해 매개된다. 내부 EG 모이어티의 하이드록실 그룹은 MHETase의 Leu254 및 Gly258의 주쇄(main chain)에 수소 결합하고, TPA 모이어티와 내부 EG 모이어티 사이의 에스테르 결합의 2개의 산소 원자는 Arg411 및 Ser416의 측쇄(side chain)와의 수소 결합에 의해 안정화될 수 있다.
효소 활성 및 기질 결합에 있어서 상기 잔기들의 역할은 구조뿐만 아니라 부위 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해서도 확인되었다. 도 6에 따르면, 상기 잔기들이 다른 잔기로 치환되면 MHETase 활성이 저하됨을 확인하였다.
도 5의 B에 의하면, MHETase과 BHET이 공유결합성 중간체를 이룬 구조(MHET intermediate)에서 TPA 모이어티와 외부 EG 모이어티 사이의 에스테르 결합이 절단되고 TPA 모이어티와 내부 EG 모이어티 결합체는 TPA 모이어티의 카르복실 그룹과 Ser225 촉매 잔기 사이에 에스테르 결합을 형성함으로서 MHETase에 공유 결합한다. 도 5의 A와 B를 참조하면, MHET intermediate의 TPA 모이어티 및 내부 EG 모이어티는 BHET의 MHET 부분(TPA 모이어티 및 내부 EG 모이어티)이 안정화되는 것과 유사한 방식으로 안정화된다.
활성부위의 입구에 위치한 Phe415 잔기는 Fo-Fc 전자밀도 지도 분석결과 구조상에서 이중 점유(dual occupancy)를 나타내었다. Phe415 잔기는 기질 유사체 결합시 유도-적합 입체 구조 변화(induced-fit conformational change)를 일으키는 것으로 알려져 있으므로, MHETase는 MHET과 결합하면 개방/폐쇄 형태 변화(open/closed conformational change)를 일으키는 것으로 예상된다.
4. MHETase의 BHETase 활성 및 PET 말단 분해 활성(exo-PETase activity) 확인
MHETase는 MHET 분자에 대해서만 가수 분해 활성을 가지는 것으로 알려져 있었으나, 상기 구조 분석 결과는 MHETase가 BHET에 대해 가수 분해 활성을 가질 수 있음을 시사하고 있다.
이를 확인하기 위해, MHETase가 BHET에 대해 가수분해 활성을 가지는지 측정하였다. 도 7에 따르면, MHETase는 BHET에 대해 농도 의존적으로 가수분해 활성을 가지는 것이 확인되었다. 다만, BHET에 대한 활성은 MHET에 대한 활성보다 상당히 낮았다.
나아가, MHETase와 BHET의 결합된 구조 분석을 통해 BHET의 외부 EG 모이어티의 하이드록실 그룹이 MHETase의 외부 공간에 위치한다는 사실에 기초하여, MHETase가 PET 고분자의 말단을 가수 분해할 수 있을 것으로 예상하였다.
이를 확인하기 위해 5개의 MHET 모노머(monomer)들을 이용하여 양 말단에 EG 모이어티를 갖는 PET 올리고머(이하 PET5로 지칭할 수 있다)를 합성하였다. 도 8에 따르면, PET5에 MHETase을 처리하면 농도 의존적으로 PET5를 가수 분해할 수 있었다. 이로서 MHETase는 말단이 존재하는 PET 고분자에 대해 외부 가수 분해활성(exo-PETase 활성)이 있음을 확인하였다.
5. MHETase 변이체의 BHET 분해 활성 증가 확인
MHETase의 exo-PETase 활성을 고려하면, 기질로서 사용된 PET 중합체의 말단 유형(EG 말단 또는 TPA 말단)에 관계없이 EG 말단을 가지는 PETn-1 중합체를 생성한다. 따라서 EG 말단과 유사한 BHET에 대한 가수 분해 활성을 증가시키도록 변형된 MHETase는 exo-PETase로서 이용이 가능하며, 연속적으로 PET을 분해할 수 있을 것으로 예상하였다.
MHETase의 PET에 대한 외부 가수분해 활성을 증가시키기 위해 2가지 위치의 아미노산을 변형시켰다.
첫번째로 MHETase의 411번째 잔기(residue)를 아르기닌(Arginine)에서 리신(Lysine)으로 변형하였다. BHET가 MHETase와 결합할 때, Arg411 잔기는 BHET의 TPA 모이어티 및 내부 EG 모이어티 사이에 위치한 에스테르 구조의 카보닐 산소와 수소결합을 형성한다. 따라서 정전기적으로 아르기닌(Arginine)보다 양전하가 약한 리신(lysine)으로 교체하면 TPA 모이어티와 내부 EG 모이어티 사이의 에스테르 결합을 더 안정화시킴으로서 MHETase의 BHET 기질에 대한 친화도를 향상시킬 수 있을 것으로 예상하였다.
두번째로 MHETase의 424번째 잔기를 페닐알라닌에서 히스티딘, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 류신, 아스파라긴, 발린, 또는 이소류신 중 하나로 변형하였다. Phe424 잔기는 내부 기질 결합 부위(inner substrate binding site)에 위치하며 기질 결합 포켓(substrate binding pocket)의 크기를 작게 형성하므로 내부 EG 모이어티의 결합에 적합하지 않다. 따라서 페닐알라닌을 더 작은 아미노산 잔기로 변형함으로서 내부 기질 결합 부위를 확장하였다.
설계한 MHETase 변이체가 BHET에 대한 가수분해 활성을 향상시키는지 조사하기 위해 야생형 MHETase와 MHETase 변이체의 BHET 가수분해 활성을 비교하였다.
도 9에 따르면, MHETaseR411K 변이체는 야생형(wild type)보다 BHET 가수분해 활성이 1.7배 증가하였다. MHETaseF424 변이체는 모든 변이체가 야생형보다 BHET 가수분해 활성이 증가하였다. 특히 MHETaseF424N, MHETaseF424V, 및 MHETaseF424I는 야생형과 비교하여 BHET 가수분해 활성이 각각 3.9배, 3.0배, 및 3.4배 증가하였다. (BHET 가수분해 활성이 MHETaseF424V(3.0배) < MHETaseF424I(3.4배) < MHETaseF424N(3.9배) 순으로 확인됨)
그리고 MHETase의 R411K 변이 및 F424변이를 모두 포함하는 변이체(double mutant)는 411 또는 424 단일 변이보다 훨씬 높은 BHET 가수분해 활성을 나타내었다. 또한 MHETaseR411K/F424N, MHETaseR411K/F424V 및 MHETaseR411K/F424I 변이체의 BHET 가수분해 활성을 확인한 결과, 야생형과 비교하여 각각 8.7배, 10.5배, 11.1배로 크게 향상되었다. (BHET 가수분해 활성이 MHETaseR411K/F424N(8.7배) < MHETaseR411K/F424V(10.5배) < MHETaseR411K/F424I(11.1배) 순으로 확인됨)
또한, 도 9에 따르면 MHETaseS416A/F424N 변이체는 야생형과 비교하여 BHET 가수분해 활성이 10.2배로 나타났으며, MHETaseR411K/F424V 및 MHETaseR411K/F424I보다 낮은 활성을 나타내었다.
상기 MHETaseR411K/F424N, MHETaseR411K/F424V 및 MHETaseR411K/F424I 변이체의 MHET 가수분해 활성은 야생형 MHETase보다는 감소하였으나, 411 또는 424 잔기에 대한 단일 돌연변이보다 높은 MHET 가수분해 활성을 나타내었다.
모든 MHETase 변이체는 야생형보다 MHET 가수분해 활성이 감소하였으나, 411 또는 424 위치만 변이시킨 단일 점 돌연변이(single point mutant)보다 411 및 424 위치 모두를 변이시킨 이중 돌연변이(double mutant)의 MHET 가수 분해 활성이 더 높았다. 이는 R411K 돌연변이가 424위치의 돌연변이에 의해 감소한 MHET 분해 활성을 회복시키는 역할을 하였음을 의미한다.
PET의 분해는 PETase에 의한 1차 분해(PET -> MHET) 및 MHETase에 의한 2차 분해(MHET -> TPA, EG)로 이루어진다. PET의 전체 분해 시간은 1차 분해 속도에 좌우되므로 MHETase 변이체의 MHETase 활성이 다소 약화되더라도 exo-PETase 활성 증가에 의해 1차 분해 속도가 증가할 수 있다면 전체 분해 속도가 증가할 수 있다.
6. MHETase 변이체의 PET 고분자에 대한 활성 확인
말단을 가지는 PET 고분자에 대한 가수분해 활성을 확인하기 위해 PET5 올리고머를 기질로 사용하여 MHETaseR411K/F424N, MHETaseR411K/F424V 및 MHETaseR411K/F424I 변이체의 가수 분해 활성을 측정하였다. 도 10에 따르면, 상기 3가지 MHETase 변이체들은 야생형보다 가수분해 활성이 크게 향상되었다.
또한, 말단이 없는 비정질 PET 필름(amorphous PET film)을 기질로 사용하여 MHETase 변이체의 가수 분해능을 확인하였다. MHETase 야생형 및 변이체 모두 말단이 없는 비정질 PET 필름에 대해 가수 분해 활성을 나타내지 않았다.
그러나 비정질 PET 필름에 PETase을 500nM 처리하여 말단을 생성시키고 MHETase 변이체를 2μM 처리하면 가수 분해 활성을 나타냈으며, 도 11에 따르면 MHETaseR411K/F424I는 가장 높은 가수 분해 활성을 나타내었다.
추가적으로 카르복실기 라벨링 실험을 수행하여 말단을 가지는 PET 필름에 대한 MHETase의 가수 분해 활성을 조사하였다. 도 12에 따르면, PETaseS121A/D186H/R280A 처리에 의해 생성된 카르복실기는 야생형 MHETase의 첨가에 의해 크게 감소하였고, MHETaseR411K/F424I 변이체의 첨가에 의해서는 더욱 현저히 감소하였다.
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Ala Thr Ile 145 150 155 160 Ala Thr Asp Gly Gly His Asp Asn Ala Val Asn Asp Asn Pro Asp Ala 165 170 175 Leu Gly Thr Val Ala Phe Gly Leu Asp Pro Gln Ala Arg Leu Asp Met 180 185 190 Gly Tyr Asn Ser Tyr Asp Gln Val Thr Gln Ala Gly Lys Ala Ala Val 195 200 205 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Ala Ala Asp Lys Ser Tyr Phe Ile Gly Cys 210 215 220 Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly Met Met Leu Ser Gln Arg Phe Pro Ser 225 230 235 240 His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Gln Leu Pro Lys 245 250 255 Ala Gly Ile Ser Gly Ala Trp Thr Thr Gln Ser Leu Ala Pro Ala Ala 260 265 270 Val Gly Leu Asp Ala Gln Gly Val Pro Leu Ile Asn Lys Ser Phe Ser 275 280 285 Asp Ala Asp Leu His Leu Leu Ser Gln Ala Ile Leu Gly Thr Cys Asp 290 295 300 Ala Leu Asp Gly Leu Ala Asp Gly Ile Val Asp Asn Tyr Arg Ala Cys 305 310 315 320 Gln Ala Ala Phe Asp Pro Ala Thr Ala Ala Asn Pro Ala Asn Gly Gln 325 330 335 Ala Leu Gln Cys Val Gly Ala Lys Thr Ala Asp Cys Leu Ser Pro Val 340 345 350 Gln Val Thr Ala Ile Lys Arg Ala Met Ala Gly Pro Val Asn Ser Ala 355 360 365 Gly Thr Pro Leu Tyr Asn Arg Trp Ala Trp Asp Ala Gly Met Ser Gly 370 375 380 Leu Ser Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Ser Trp Trp Leu Gly 385 390 395 400 Ser Phe Asn Ser Ser Ala Asn Asn Ala Gln Arg Val Ser Gly Phe Ser 405 410 415 Ala Arg Ser Trp Leu Val Asp Phe Ala Thr Pro Pro Glu Pro Met Pro 420 425 430 Met Thr Gln Val Ala Ala Arg Met Met Lys Phe Asp Phe Asp Ile Asp 435 440 445 Pro Leu Lys Ile Trp Ala Thr Ser Gly Gln Phe Thr Gln Ser Ser Met 450 455 460 Asp Trp His Gly Ala Thr Ser Thr Asp Leu Ala Ala Phe Arg Asp Arg 465 470 475 480 Gly Gly Lys Met Ile Leu Tyr His Gly Met Ser Asp Ala Ala Phe Ser 485 490 495 Ala Leu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Glu Arg Leu Gly Ala Ala Met Pro 500 505 510 Gly Ala Ala Gly Phe Ala Arg Leu Phe Leu Val Pro Gly Met Asn His 515 520 525 Cys Ser Gly Gly Pro Gly Thr Asp Arg Phe Asp Met Leu Thr Pro Leu 530 535 540 Val Ala Trp Val Glu Arg Gly Glu Ala Pro Asp Gln Ile Ser Ala Trp 545 550 555 560 Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Phe Gly Val Ala Ala Arg Thr Arg Pro Leu 565 570 575 Cys Pro Tyr Pro Gln Ile Ala Arg Tyr Lys Gly Ser Gly Asp Ile Asn 580 585 590 Thr Glu Ala Asn Phe Ala Cys Ala Ala Pro Pro 595 600 <210> 2 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MHETase R411K/F424I <400> 2 Met Gln Thr Thr Val Thr Thr Met Leu Leu Ala Ser Val Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Pro Leu Pro Gln Gln Gln 20 25 30 Pro Pro Gln Gln Glu Pro Pro Pro Pro Pro Val Pro Leu Ala Ser Arg 35 40 45 Ala Ala Cys Glu Ala Leu Lys Asp Gly Asn Gly Asp Met Val Trp Pro 50 55 60 Asn Ala Ala Thr Val Val Glu Val Ala Ala Trp Arg Asp Ala Ala Pro 65 70 75 80 Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Leu Pro Glu His Cys Glu Val Ser Gly 85 90 95 Ala Ile Ala Lys Arg Thr Gly Ile Asp Gly Tyr Pro Tyr Glu Ile Lys 100 105 110 Phe Arg Leu Arg Met Pro Ala Glu Trp Asn Gly Arg Phe Phe Met Glu 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Thr Asn Gly Ser Leu Ser Ala Ala Thr Gly Ser Ile 130 135 140 Gly Gly Gly Gln Ile Ala Ser Ala Leu Ser Arg Asn Phe Ala Thr Ile 145 150 155 160 Ala Thr Asp Gly Gly His Asp Asn Ala Val Asn Asp Asn Pro Asp Ala 165 170 175 Leu Gly Thr Val Ala Phe Gly Leu Asp Pro Gln Ala Arg Leu Asp Met 180 185 190 Gly Tyr Asn Ser Tyr Asp Gln Val Thr Gln Ala Gly Lys Ala Ala Val 195 200 205 Ala Arg Phe Tyr Gly Arg Ala Ala Asp Lys Ser Tyr Phe Ile Gly Cys 210 215 220 Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly Met Met Leu Ser Gln Arg Phe Pro Ser 225 230 235 240 His Tyr Asp Gly Ile Val Ala Gly Ala Pro Gly Tyr Gln Leu Pro Lys 245 250 255 Ala Gly Ile Ser Gly Ala Trp Thr Thr Gln Ser Leu Ala Pro Ala Ala 260 265 270 Val Gly Leu Asp Ala Gln Gly Val Pro Leu Ile Asn Lys Ser Phe Ser 275 280 285 Asp Ala Asp Leu His Leu Leu Ser Gln Ala Ile Leu Gly Thr Cys Asp 290 295 300 Ala Leu Asp Gly Leu Ala Asp Gly Ile Val Asp Asn Tyr Arg Ala Cys 305 310 315 320 Gln Ala Ala Phe Asp Pro Ala Thr Ala Ala Asn Pro Ala Asn Gly Gln 325 330 335 Ala Leu Gln Cys Val Gly Ala Lys Thr Ala Asp Cys Leu Ser Pro Val 340 345 350 Gln Val Thr Ala Ile Lys Arg Ala Met Ala Gly Pro Val Asn Ser Ala 355 360 365 Gly Thr Pro Leu Tyr Asn Arg Trp Ala Trp Asp Ala Gly Met Ser Gly 370 375 380 Leu Ser Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Gly Trp Arg Ser Trp Trp Leu Gly 385 390 395 400 Ser Phe Asn Ser Ser Ala Asn Asn Ala Gln Lys Val Ser Gly Phe Ser 405 410 415 Ala Arg Ser Trp Leu Val Asp Ile Ala Thr Pro Pro Glu Pro Met Pro 420 425 430 Met Thr Gln Val Ala Ala Arg Met Met Lys Phe Asp Phe Asp Ile Asp 435 440 445 Pro Leu Lys Ile Trp Ala Thr Ser Gly Gln Phe Thr Gln Ser Ser Met 450 455 460 Asp Trp His Gly Ala Thr Ser Thr Asp Leu Ala Ala Phe Arg Asp Arg 465 470 475 480 Gly Gly Lys Met Ile Leu Tyr His Gly Met Ser Asp Ala Ala Phe Ser 485 490 495 Ala Leu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Glu Arg Leu Gly Ala Ala Met Pro 500 505 510 Gly Ala Ala Gly Phe Ala Arg Leu Phe Leu Val Pro Gly Met Asn His 515 520 525 Cys Ser Gly Gly Pro Gly Thr Asp Arg Phe Asp Met Leu Thr Pro Leu 530 535 540 Val Ala Trp Val Glu Arg Gly Glu Ala Pro Asp Gln Ile Ser Ala Trp 545 550 555 560 Ser Gly Thr Pro Gly Tyr Phe Gly Val Ala Ala Arg Thr Arg Pro Leu 565 570 575 Cys Pro Tyr Pro Gln Ile Ala Arg Tyr Lys Gly Ser Gly Asp Ile Asn 580 585 590 Thr Glu Ala Asn Phe Ala Cys Ala Ala Pro Pro 595 600 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal Peptide lamb <400> 3 Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala Met Ala 20 25 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETase_F <400> 4 gcgcccatgg cgtgtgctgg cggtgggtcc acgc 34 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETase_R <400> 5 gcgcctcgag gggaggagcc gcgcaggcga agtt 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseS225A_F <400> 6 ctatttcatt gggtgtgccg agggtggccg cgaa 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseS225A_R <400> 7 ttcgcggcca ccctcggcac acccaatgaa atag 34 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseD492A_F <400> 8 gtaccacggc atgtccgctg ccgcgttctc agc 33 <210> 9 <211> 33 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Sequence <220> <223> IsMHETaseF415S_F <400> 24 gagagtaagc ggcagtagtg cgcgctcctg 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseF415S_R <400> 25 caggagcgcg cactactgcc gcttactctc 30 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseR411K_F <400> 26 gctaacaacg cccagaaagt aagcggcttc ag 32 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseR411K_R <400> 27 ctgaagccgc ttactttctg ggcgttgtta gc 32 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseF424N_F <400> 28 ctggctggtc gataacgcca caccgcccg 29 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseF424N_R <400> 29 cgggcggtgt ggcgttatcg accagccag 29 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseF424H_F <400> 30 ctggctggtc gatcatgcca caccgcccg 29 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsMHETaseF424H_R <400> 31 cgggcggtgt ggcatgatcg accagccag 29 <210> 32 <211> 29 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Claims (9)

  1. 말단을 가지는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 고분자에 대한 외부 가수 분해 활성을 가지고,
    서열번호 1의 아미노산 서열에서 411번째 아미노산이 아르기닌에서 라이신으로 치환되고, 424번째 아미노산이 페닐알라닌에서 이소루신, 발린, 또는 아스파라긴으로 치환된 폴리펩티드로 이루어지는,
    MHETase 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 말단은 테레프탈레이트 말단 또는 에틸렌 글라이콜 말단인,
    MHETase 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 가수 분해 활성은 야생형 MHETase보다 높은 것인,
    MHETase 변이체.
  4. 제1항의 MHETase 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결된 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 포함하고,
    상기 신호 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인,
    재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인, 미생물.
  9. 제1항의 MHETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 분해 방법.

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