CN108588052B - Pet降解酶的突变体及其应用 - Google Patents

Pet降解酶的突变体及其应用 Download PDF

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    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
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    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
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    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/20—Organic substances
    • A62D2101/28—Organic substances containing oxygen, sulfur, selenium or tellurium, i.e. chalcogen

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了PET降解酶的突变体及其应用。本发明所述PET降解酶的突变体是在所述IsPETase的底物结合位点位置发生点突变，包括在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸的IsPETase突变体M1，在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸且117位亮氨酸突变为苯丙氨酸的IsPETase突变体M2，在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸且208位异亮氨酸突变为苯丙氨酸的IsPETase突变体M3。实验表明相比野生型IsPETase，本发明所述三种PETase的突变体水解的活性有明显的提高，能够在中等温度(30℃)下高效降解PET。

Description

PET降解酶的突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说涉及PET降解酶突变体、编码基因及其应用。
背景技术
聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene terephthalate，简称PET)是由酯键连接的对苯二甲酸酯(TPA)和乙二醇(EG)组成的高分子量聚合物。在较宽的温度范围内具有优良的物理机械性能，长期使用温度可达120℃，电绝缘性优良，甚至在高温高频下，其电性能仍较好，但耐电晕性较差，抗蠕变性，耐疲劳性，耐摩擦性、尺寸稳定性都很好。耐用性和其他有利的物理特性使PET成为最广泛使用的塑料之一。然而，进入并积聚在生态系统中的大量PET对环境构成了巨大挑战，塑料污染问题极为严重，甚至对海洋生命带来致命性的影响。
各种细菌水解酶，如角质酶，脂肪酶，羧酸酯酶和酯酶已被证明能够在不同程度上降解PET。在迄今为止鉴定的PET降解酶中，来自Thermobifida fusca DSM43793的TfH和TfHBTA-2，来自T.fusca KW3的TfCut1和TfCut2，来自植物堆肥中的宏基因组的LC角质酶，来自Saccharomonora viridis AHK190的角质酶，来自Thermomyces insolens的HiC，以及来自Candida antarctica的脂肪酶B已显示具有相对较高的降解性。但由于这些酶需要在较高的温度下才能发挥最大的生物活性，导致工业应用价值较低。
2016年，Ideonella sakaiensis一个新的细菌物种，它能够以PET为唯一碳源。I.sakaiensis分泌出来的PETase(IsPETase)可以在中等温度(30℃)下降解PET，并且具有比其他PET降解酶(如角质酶和脂肪酶)相对更高的活性。因而具有潜在的工业应用价值。虽然IsPETase能够在30℃下降解PET，但是降解速率还是较低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是为了克服原始IsPETase活性较低的问题，提供了新的PETase的突变体。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
本发明提供的PET降解酶的突变体，是在所述IsPETase的底物结合位点位置发生点突变。
在一些实施方案中，所述PET降解酶的突变体是在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸(R89A)，命名为IsPETase突变体M1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施方案中，所述PET降解酶的突变体是在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸(R89A)，且IsPETase的117位亮氨酸突变为苯丙氨酸(L117F)，命名为IsPETase突变体M2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施方案中，所述PET降解酶的突变体是在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸(R89A)，且IsPETase的208位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(I208F)，命名为IsPETase突变体M3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明所述三个突变体的突变位点都处于IsPETase的底物结合位点，三个氨基酸的改变都使得酶底物结合位点区域疏水性提高。
本发明还提供了编码本发明所述PET降解酶的突变体的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的PET降解酶的突变体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一些实施方案中，编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在一些实施方案中，编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在某一具体实施例中，本发明分别采用野生型IsPETase及各突变体蛋白水解PET膜，实验表明，相比野生型IsPETase，本发明所述三种PETase的突变体(M1-M3)的活性有明显的提高。
因此本发明还提供了所述PET降解酶的突变体在降解PET中的应用。
由上述技术方案可知，本发明提供了PET降解酶的突变体及其应用，本发明所述PET降解酶的突变体是在所述IsPETase的底物结合位点位置发生点突变。包括在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸(R89A)的IsPETase突变体M1，在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸(R89A)且IsPETase的117位亮氨酸突变为苯丙氨酸(L117F)的IsPETase突变体M2，在IsPETase的89位精氨酸突变为丙氨酸(R89A)且IsPETase的208位异亮氨酸突变为苯丙氨酸(I208F)的IsPETase突变体M3。实验表明相比野生型IsPETase，本发明所述三种PETase的突变体(M1-M3)水解的活性有明显的提高，能够在中等温度(30℃)下高效降解PET。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例3PETase各突变体的相对活性；
图2示实施例3PETase各突变体的降解PET的效果比较。
具体实施方式
本发明公开了PET降解酶突变体、编码基因及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中野生型IsPETase及突变体的氨基酸及核苷酸序列如下：
野生型IsPETase的氨基酸序列(SEQ ID NO.1):
MNFPRASRLMQAAVLGGLMAVSAAATAQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTRAQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTRVSDFRTANCS；
IsPETase突变体M1的氨基酸序列(SEQ ID NO.2):
MNFPRASRLMQAAVLGGLMAVSAAATAQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTAAQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTRVSDFRTANCS；
IsPETase突变体M2的氨基酸序列(SEQ ID NO.3):
MNFPRASRLMQAAVLGGLMAVSAAATAQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTAAQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTFDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTRVSDFRTANCS；
IsPETase突变体M3的氨基酸序列(SEQ ID NO.4):
MNFPRASRLMQAAVLGGLMAVSAAATAQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTAAQSSIKW WGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGWSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSFAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHSCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTRVSDFRTANCS。
野生型IsPETase的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：
ATGAACTTCCCCCGCGCCTCTCGCTTGATGCAGGCAGCCGTGCTGGGAGGTCTGATGGCCGTGTCTGCAGCAGCCACCGCCCAGACCAATCCTTACGCTCGCGGGCCGAATCCAACGGCAGCCTCCTTGGAGGCATCGGCGGGACCCTTCACGGTACGCTCCTTCACGGTATCCCGTCCGTCGGGTTATGGGGCGGGTACAGTGTATTATCCAACTAATGCCGGCGGCACAGTAGGCGCGATTGCAATCGTGCCGGGTTACACACGCGCACAGAGCAGCATTAAATGGTGGGGGCCCCGCTTAGCTAGTCACGGTTTCGTTGTCATCACTATTGACACAAATAGCACTTTGGACCAACCAAGTTCCCGTTCATCCCAACAAATGGCGGCGTTACGCCAGGTAGCTTCGCTGAATGGGACGAGCAGCTCGCCCATTTATGGCAAGGTGGACACGGCGCGCATGGGAGTCATGGGCTGGTCTATGGGGGGAGGAGGCTCGCTTATCTCTGCTGCCAATAATCCTTCATTGAAGGCTGCCGCACCTCAAGCGCCGTGGGATAGCTCTACCAACTTTTCCTCCGTTACCGTGCCTACTTTGATCTTTGCGTGTGAAAACGATAGCATCGCTCCGGTAAACTCTTCGGCCTTACCCATTTACGACTCGATGTCCCGTAACGCAAAGCAATTTCTGGAAATCAACGGTGGTAGCCATTCTTGTGCCAACTCGGGGAATTCAAACCAGGCTCTTATCGGTAAAAAAGGGGTCGCTTGGATGAAGCGTTTCATGGACAATGATACACGTTATTCTACCTTTGCGTGCGAAAATCCCAACTCCACCCGCGTTAGCGACTTCCGTACAGCTAACTGTTCA；
IsPETase突变体M1的核苷酸序列(SEQ ID NO.6):
ATGAATTTTCCCCGCGCGAGTCGCCTGATGCAGGCCGCAGTTTTGGGAGGATTGATGGCAGTTTCTGCAGCTGCTACAGCCCAGACAAATCCGTACGCCCGCGGTCCGAATCCCACGGCGGCCTCATTAGAAGCCTCTGCCGGACCCTTCACAGTCCGCTCGTTCACCGTGAGTCGCCCGTCCGGTTATGGTGCAGGGACAGTCTATTACCCGACAAACGCGGGTGGGACGGTTGGTGCGATTGCAATTGTTCCCGGTTATACCGCCGCGCAAAGCTCTATTAAATGG TGGGGGCCTCGTTTGGCTTCACATGGATTTGTTGTTATTACTATCGACACCAATTCTACCCTTGACCAACCTTCTTCCCGCAGCTCCCAACAGATGGCTGCCTTGCGCCAAGTCGCAAGTCTGAACGGGACTTCCTCCTCCCCAATTTATGGGAAGGTTGATACCGCACGCATGGGGGTAATGGGTTGGAGTATGGGTGGAGGGGGCTCACTTATCTCGGCGGCTAATAATCCGTCACTTAAGGCCGCAGCACCGCAGGCTCCATGGGATAGCTCTACTAATTTCTCTTCCGTGACGGTCCCTACCTTGATCTTTGCGTGTGAAAACGACAGTATTGCTCCGGTAAACTCTAGTGCCCTGCCTATCTACGATTCAATGTCTCGTAACGCGAAGCAATTCTTGGAGATCAATGGGGGTTCCCATAGTTGTGCCAACTCTGGGAATTCCAACCAGGCCCTTATTGGCAAAAAGGGAGTCGCGTGGATGAAGCGTTTCATGGACAACGACACCCGTTACAGCACGTTCGCTTGCGAAAATCCAAACTCGACTCGTGTGTCGGACTTTCGCACCGCGAACTGCTCG；
IsPETase突变体M2的核苷酸序列(SEQ ID NO.7):
ATGAACTTCCCGCGTGCAAGTCGCTTAATGCAGGCCGCTGTGTTAGGCGGGCTGATGGCGGTCTCCGCGGCAGCTACAGCACAGACAAATCCTTACGCCCGTGGGCCCAATCCGACGGCGGCAAGCCTTGAAGCGAGTGCCGGACCATTCACAGTGCGTTCTTTCACTGTTTCGCGCCCCTCCGGTTACGGTGCGGGAACAGTTTATTATCCAACTAATGCGGGTGGAACCGTAGGAGCCATTGCGATCGTACCGGGCTACACTGCAGCGCAATCATCTATCAAATGGTGGGGACCGCGCTTGGCGTCACATGGTTTTGTTGTCATTACGATCGATACTAACTCAACATTCGACCAGCCCTCTTCGCGTAGCTCCCAGCAAATGGCTGCTCTGCGCCAAGTGGCATCATTGAACGGAACATCTTCGTCGCCTATCTATGGGAAGGTGGATACTGCGCGCATGGGAGTTATGGGTTGGTCAATGGGTGGAGGTGGCTCGTTGATCTCAGCTGCCAATAATCCATCGTTAAAGGCCGCAGCTCCGCAGGCTCCCTGGGACTCGAGTACGAACTTTTCGAGCGTGACGGTTCCAACACTGATTTTCGCGTGCGAAAATGATAGCATCGCTCCTGTCAATTCTAGTGCGCTGCCTATCTATGATTCCATGTCGCGCAATGCGAAACAATTTCTTGAGATTAACGGCGGCTCCCACAGTTGTGCCAATTCAGGAAACAGTAACCAGGCCCTGATTGGCAAGAAGGGGGTTGCATGGATGAAGCGTTTCATGGACAACGATACTCGTTACTCAACCTTTGCATGTGAGAACC CAAACAGCACACGCGTCAGCGACTTCCGTACAGCCAACTGTTCT；
IsPETase突变体M3的核苷酸序列(SEQ ID NO.8):
ATGAACTTTCCCCGTGCCTCGCGCTTAATGCAGGCGGCAGTTTTGGGCGGACTGATGGCAGTAAGTGCAGCAGCTACAGCGCAAACGAACCCATACGCCCGCGGTCCAAACCCAACGGCCGCCAGCCTGGAAGCTAGTGCCGGTCCTTTCACCGTTCGCTCCTTCACTGTATCACGCCCCTCGGGATACGGGGCCGGTACTGTCTACTATCCGACCAATGCAGGTGGGACTGTTGGGGCGATTGCTATTGTTCCTGGCTACACTGCCGCACAATCTTCAATCAAATGGTGGGGTCCCCGTCTTGCTAGTCATGGGTTCGTCGTTATCACAATTGACACTAATTCAACTCTGGACCAGCCGTCAAGCCGCTCGAGCCAGCAAATGGCCGCATTGCGCCAGGTTGCGAGTCTGAACGGTACGTCAAGTAGCCCAATTTATGGCAAGGTGGACACTGCACGTATGGGCGTAATGGGTTGGTCTATGGGAGGGGGCGGCAGCCTGATTTCTGCTGCCAATAACCCGTCTCTTAAAGCAGCAGCACCGCAGGCGCCCTGGGATTCGTCTACCAACTTCTCCAGCGTCACCGTACCCACATTAATTTTTGCATGTGAAAACGACTCATTCGCGCCTGTAAACAGTAGTGCATTACCTATTTATGATTCTATGTCGCGTAATGCCAAGCAATTCTTGGAAATTAACGGTGGTAGTCATTCCTGCGCCAATTCAGGAAATTCAAATCAGGCACTGATCGGAAAGAAGGGTGTCGCTTGGATGAAACGTTTCATGGACAACGATACACGTTATTCGACCTTCGCCTGTGAGAACCCTAATAGTACCCGCGTGTCAGACTTTCGCACGGCGAATTGTTCA。
实施例1：
将野生型的IsPETase通过酶切连接的方式克隆到市售的pET28a+载体上。然后利用市售的定点突变试剂对IsPETase进行定点突变，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中得到PET降解酶的大肠杆菌菌株。
实施例2：
为了得到野生型IsPETase及其突变体蛋白，在37℃下在LB加氨苄青霉素的培养基中培养实施例1得到的野生型IsPETase及突变体的大肠杆菌菌株，生长至大约0.6-0.8的OD600。之后，将培养物冷却至16℃，并在16℃和160rpm下用终浓度为0.1mM的IPTG诱导20小时。通过离心(25分钟，10℃，4,000rpm)收获细胞。将来自200mL细胞培养物的细胞沉淀重悬于10mL Ni-NTA裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8)中。通过在冰上超声破碎细胞并将裂解物离心(30分钟，10℃，4,000rpm)。将上清液施加到His-Accept镍柱(Beyotime)上。用10mL裂解缓冲液洗涤未结合的蛋白质后，用洗脱缓冲液(50mM Tris-HClpH7.5,300mM NaCl，200mM咪唑)洗脱结合的蛋白质，缓冲液交换为50mM Na2HPO4-HCl，pH7.0和100mM NaCl使用PD-10凝胶过滤柱(GE Healthcare)得到野生型IsPETase及各突变体蛋白。
实施例3：相对活性比较
在用野生型IsPETase及各突变体蛋白PETase水解PET膜之前，将所有PET膜在三个连续步骤中洗涤：首先在1％SDS溶液中，然后用乙醇，并最后用去离子水洗涤。每一步持续30分钟。
水解PET膜：取四份PET膜(1.5cm×1.0cm，约36mg)分别置于含有50μg野生型IsPETase及三种突变体蛋白PETase各自与1.5ml 50mM Bicine-NaOH(pH8.5)组成的反应溶液中，在30℃下反应48小时。用1.0M NaOH稀释水溶液，然后热处理(50℃，10分钟)终止反应。各组最终产物通过反相HPLC分析，结果见图1。各组PET膜质量变化情况如图2(PET膜质量变化/mg)。
图1结果显示，相比野生型IsPETase而言，三种PETase的突变体的活性有明显的提高。
图2结果显示，相比野生型IsPETase而言，三种PETase的突变体导致PET膜的质量损失更加明显，也说明三种突变体的活性也有明显的提升。
序列表
<110> 天津大学
<120> PET降解酶的突变体及其应用
<130> MP1805940
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 290
<212> PRT
<213> Ideonella sakaiensis
<400> 1
Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly
50 55 60
Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala
65 70 75 80
Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Arg Ala Gln Ser Ser Ile Lys Trp
85 90 95
Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp
100 105 110
Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met
115 120 125
Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro
130 135 140
Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser
145 150 155 160
Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu
165 170 175
Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser
180 185 190
Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile
195 200 205
Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg
210 215 220
Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala
225 230 235 240
Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Cys Ser
290
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> Ideonella sakaiensis
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85 90 95
Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp
100 105 110
Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met
115 120 125
Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro
130 135 140
Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser
145 150 155 160
Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu
165 170 175
Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser
180 185 190
Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Phe
195 200 205
Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg
210 215 220
Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala
225 230 235 240
Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala
245 250 255
Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala
260 265 270
Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn
275 280 285
Cys Ser
290
<210> 5
<211> 870
<212> DNA
<213> Ideonella sakaiensis
<400> 5
atgaacttcc cccgcgcctc tcgcttgatg caggcagccg tgctgggagg tctgatggcc 60
gtgtctgcag cagccaccgc ccagaccaat ccttacgctc gcgggccgaa tccaacggca 120
gcctccttgg aggcatcggc gggacccttc acggtacgct ccttcacggt atcccgtccg 180
tcgggttatg gggcgggtac agtgtattat ccaactaatg ccggcggcac agtaggcgcg 240
attgcaatcg tgccgggtta cacacgcgca cagagcagca ttaaatggtg ggggccccgc 300
ttagctagtc acggtttcgt tgtcatcact attgacacaa atagcacttt ggaccaacca 360
agttcccgtt catcccaaca aatggcggcg ttacgccagg tagcttcgct gaatgggacg 420
agcagctcgc ccatttatgg caaggtggac acggcgcgca tgggagtcat gggctggtct 480
atggggggag gaggctcgct tatctctgct gccaataatc cttcattgaa ggctgccgca 540
cctcaagcgc cgtgggatag ctctaccaac ttttcctccg ttaccgtgcc tactttgatc 600
tttgcgtgtg aaaacgatag catcgctccg gtaaactctt cggccttacc catttacgac 660
tcgatgtccc gtaacgcaaa gcaatttctg gaaatcaacg gtggtagcca ttcttgtgcc 720
aactcgggga attcaaacca ggctcttatc ggtaaaaaag gggtcgcttg gatgaagcgt 780
ttcatggaca atgatacacg ttattctacc tttgcgtgcg aaaatcccaa ctccacccgc 840
gttagcgact tccgtacagc taactgttca 870
<210> 6
<211> 870
<212> DNA
<213> Ideonella sakaiensis
<400> 6
atgaattttc cccgcgcgag tcgcctgatg caggccgcag ttttgggagg attgatggca 60
gtttctgcag ctgctacagc ccagacaaat ccgtacgccc gcggtccgaa tcccacggcg 120
gcctcattag aagcctctgc cggacccttc acagtccgct cgttcaccgt gagtcgcccg 180
tccggttatg gtgcagggac agtctattac ccgacaaacg cgggtgggac ggttggtgcg 240
attgcaattg ttcccggtta taccgccgcg caaagctcta ttaaatggtg ggggcctcgt 300
ttggcttcac atggatttgt tgttattact atcgacacca attctaccct tgaccaacct 360
tcttcccgca gctcccaaca gatggctgcc ttgcgccaag tcgcaagtct gaacgggact 420
tcctcctccc caatttatgg gaaggttgat accgcacgca tgggggtaat gggttggagt 480
atgggtggag ggggctcact tatctcggcg gctaataatc cgtcacttaa ggccgcagca 540
ccgcaggctc catgggatag ctctactaat ttctcttccg tgacggtccc taccttgatc 600
tttgcgtgtg aaaacgacag tattgctccg gtaaactcta gtgccctgcc tatctacgat 660
tcaatgtctc gtaacgcgaa gcaattcttg gagatcaatg ggggttccca tagttgtgcc 720
aactctggga attccaacca ggcccttatt ggcaaaaagg gagtcgcgtg gatgaagcgt 780
ttcatggaca acgacacccg ttacagcacg ttcgcttgcg aaaatccaaa ctcgactcgt 840
gtgtcggact ttcgcaccgc gaactgctcg 870
<210> 7
<211> 870
<212> DNA
<213> Ideonella sakaiensis
<400> 7
atgaacttcc cgcgtgcaag tcgcttaatg caggccgctg tgttaggcgg gctgatggcg 60
gtctccgcgg cagctacagc acagacaaat ccttacgccc gtgggcccaa tccgacggcg 120
gcaagccttg aagcgagtgc cggaccattc acagtgcgtt ctttcactgt ttcgcgcccc 180
tccggttacg gtgcgggaac agtttattat ccaactaatg cgggtggaac cgtaggagcc 240
attgcgatcg taccgggcta cactgcagcg caatcatcta tcaaatggtg gggaccgcgc 300
ttggcgtcac atggttttgt tgtcattacg atcgatacta actcaacatt cgaccagccc 360
tcttcgcgta gctcccagca aatggctgct ctgcgccaag tggcatcatt gaacggaaca 420
tcttcgtcgc ctatctatgg gaaggtggat actgcgcgca tgggagttat gggttggtca 480
atgggtggag gtggctcgtt gatctcagct gccaataatc catcgttaaa ggccgcagct 540
ccgcaggctc cctgggactc gagtacgaac ttttcgagcg tgacggttcc aacactgatt 600
ttcgcgtgcg aaaatgatag catcgctcct gtcaattcta gtgcgctgcc tatctatgat 660
tccatgtcgc gcaatgcgaa acaatttctt gagattaacg gcggctccca cagttgtgcc 720
aattcaggaa acagtaacca ggccctgatt ggcaagaagg gggttgcatg gatgaagcgt 780
ttcatggaca acgatactcg ttactcaacc tttgcatgtg agaacccaaa cagcacacgc 840
gtcagcgact tccgtacagc caactgttct 870
<210> 8
<211> 870
<212> DNA
<213> Ideonella sakaiensis
<400> 8
atgaactttc cccgtgcctc gcgcttaatg caggcggcag ttttgggcgg actgatggca 60
gtaagtgcag cagctacagc gcaaacgaac ccatacgccc gcggtccaaa cccaacggcc 120
gccagcctgg aagctagtgc cggtcctttc accgttcgct ccttcactgt atcacgcccc 180
tcgggatacg gggccggtac tgtctactat ccgaccaatg caggtgggac tgttggggcg 240
attgctattg ttcctggcta cactgccgca caatcttcaa tcaaatggtg gggtccccgt 300
cttgctagtc atgggttcgt cgttatcaca attgacacta attcaactct ggaccagccg 360
tcaagccgct cgagccagca aatggccgca ttgcgccagg ttgcgagtct gaacggtacg 420
tcaagtagcc caatttatgg caaggtggac actgcacgta tgggcgtaat gggttggtct 480
atgggagggg gcggcagcct gatttctgct gccaataacc cgtctcttaa agcagcagca 540
ccgcaggcgc cctgggattc gtctaccaac ttctccagcg tcaccgtacc cacattaatt 600
tttgcatgtg aaaacgactc attcgcgcct gtaaacagta gtgcattacc tatttatgat 660
tctatgtcgc gtaatgccaa gcaattcttg gaaattaacg gtggtagtca ttcctgcgcc 720
aattcaggaa attcaaatca ggcactgatc ggaaagaagg gtgtcgcttg gatgaaacgt 780
ttcatggaca acgatacacg ttattcgacc ttcgcctgtg agaaccctaa tagtacccgc 840
gtgtcagact ttcgcacggc gaattgttca 870

Claims (7)

1.PET降解酶的突变体，其特征在于，是在所述IsPETase的底物结合位点位置发生单点突变；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2-4任一项所示。
2.编码权利要求1所述PET降解酶的突变体的DNA分子。
3.编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
4.编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
5.编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
6.包含权利要求1所述PET降解酶的突变体的宿主菌。
7.权利要求1所述PET降解酶的突变体在降解PET中的应用。
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