CN107674866B - 高催化活性的pet水解酶突变体 - Google Patents

高催化活性的pet水解酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白工程领域，具体涉及一种PET水解酶突变体。本发明要解决的技术问题是目前来源于Ideonella sakaiensis 201‑F6菌株中的PET水解酶(PETase)的活性还不理想。本发明解决技术问题的技术方案是提供了PET水解酶突变体。本发明通过对PET水解酶(PETase)的大量研究，共获得5个突变热点；应用定点突变技术构建了14个突变体，最终筛选出2个突变体ETase酶的活性较野生型Ec_PETase得到了提高，具有很好的应用前景。

Description

高催化活性的PET水解酶突变体
技术领域
本发明属于大肠杆菌基因工程技术领域，具体涉及催化活性提高的来源于大肠杆菌工程菌中PET水解酶(Ec_PETase)突变体。
背景技术
聚对苯二甲酸乙酯(polyethylene terephthalate，PET)是最常见的塑料材料之一，2013年PET年产量达到了5.6千万吨，约占全球塑料产量的1/5。据统计，PET在目前回收最多的塑料材料，其再美国及欧盟的回收率分别为31％、50％。虽然PET聚合物仅由两个简单单体通过酯键连接，但该酯键较为牢固，难以自然降解，每年有数千万吨PET塑料废弃物难以得到有效处置，对环境危害巨大。
目前已有的PET废弃物的处理方案包括：回收利用、填埋处理、焚烧处理以及化学方法水解，但这些处理方式均存在明显局限，如回收利用成本高；填埋处理对土地资源浪费较大、污染严重；焚烧处理严重污染环境；化学方法效率低下。面对日益增长的塑料需求，科学家们一直在努力寻找塑料废弃物的生物降解方法。
目前已知的微生物降解法，大多属于革兰氏阴性微生物假单胞菌属[1]。1977年，Tokiwa和Suzuki等人研究发现，一些能够裂解油脂中酯类的胞外脂肪酶，也可以破坏脂肪族聚酯的酯键并且能解聚部分材料[2]。艾伦[3]等人探索了自然条件下聚酯材料的降解情况，发现PET塑料瓶在相对湿度45—100％、20℃条件下，30-40年后特性损失一半。2005年，Rolf-Joachim Muller等人沿着前人工作，探索水解酶Tfh降解PET的最适温度、培养时间、结晶度等条件[5]，推动了微生物降解PET塑料的工作。随着研究深入，PET的分解路径逐渐清晰[6]——PET能够被分解为ethylene glycol(EG)和terephthalic acid(TPA)，两条代谢通路最终参与三羧酸循环，为细胞供能。今年初，研究者报道了一种可以水解代谢PET塑料，将其作为碳源的新型细菌(Ideonellasakaiensis201-F6)[7]，该细菌的出现，为PET降解工作带来飞跃式地发展，相信在不久的将来，全球塑料问题将得到有效缓解。
今年初，研究者报道了一种可以水解代谢PET塑料，将其作为碳源的新型细菌(Ideonella sakaiensis 201-F6)(Yoshida S,Hiraga K,Takehana T,Taniguchi I,Yamaji H,Maeda Y,Toyohara K,Miyamoto K,Kimura Y,Oda K.2016.A bacterium thatdegrades and assimilates poly(ethylene terephthalate).Science,351(6278):1196-1199.)。
尽管Ideonella sakaiensis 201-F6菌株的发现以及关键酶PET水解酶(PETase)的功能分析为PET塑料的生物降解带来了希望，但Ideonella sakaiensis 201-F6野生型菌株对PET塑料降解的效率较低，参与PET降解代谢的关键酶Ec_PETase的催化功能也还不够高。难以直接实现在PET塑料生物降解的工业化应用。
发明内容
针对PET塑料废弃物迅速增长对环境产生的巨大威胁及加快新构建的载有PETase基因的分泌型常表达pUC57-EcPETase重组DNA载体可以进行PET塑料降解的基因工程大肠杆菌对PET塑料生物降解的工业化应用的步伐，本发明解决的技术问题是提供高催化活性的Ec_PETase突变体。
本发明的技术方案是：提供一种Ec_PET水解酶突变体，为在野生型Ec_PET水解酶的基础上进行位点突变获得的突变体。
其中，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的野生型Ec_PET水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
其中，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的突变位点为Gln182或Ile208的至少一个位点。
进一步的，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的突变体为Gln182Leu突变体或Ile208Val突变体中的至少一种。
其中，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的Gln182Leu突变体的氨基酸序列见SEQID No.2所示；所述的Ile208Val突变体的序列见SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了编码上述的Ec_PET水解酶突变体的基因。
优选的，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4或SEQ ID No.5中的至少一条所示。
进一步的，本发明还提供了一种含有上述Ec_PET水解酶突变体基因的载体。
优选的，所述载体包括真核载体或者原核载体。更优选的，所述载体为质粒载体或者病毒载体。
本发明还提供了一种包含上述Ec_PET水解酶突变体基因载体的宿主细胞。优选的，上述宿主细胞为细菌。更优选的，所述细菌为大肠杆菌MC1061、BL21(DE3)、Top10或DH5α。
进一步的，本发明还提供了含有Ec_PET水解酶突变体基因的载体，含有上述载体的宿主细胞，上述基因、载体、宿主细胞在降解PET中的用途。
本发明还提供了一种PET降解剂，含有上述Ec_PET水解酶突变体或其宿主细胞。
本发明的有益效果为：本发明通过对来源于前期构建的可以进行PET塑料降解的基因工程大肠杆菌中关键酶PET水解酶(Ec_PETase)进行同源建模，底物对接，突变体虚拟筛选及定点突变技术获得了2个突变热点Gln182和Ile208，进而获得2个突变体Gln182Leu和Ile208Val，Ec_PET水解酶突变体酶活性相比野生型PETase提高了1.2-1.5倍。本发明得到的Ec_PET水解酶突变体具有更高的酶活，用在生物降解PET塑料废弃物上更高效，简化了降解步骤，降低了降解成本，具有明显的经济效益。
具体实施方式
本发明提供了一种Ec_PET水解酶突变体，为在野生型Ec_PET水解酶的基础上进行位点突变获得的突变体。
其中，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的野生型Ec_PET水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
其中，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的突变位点为Gln182或Ile208的至少一个位点。优选的，所述的突变体为Gln182Leu突变体或Ile208Val突变体中的至少一种。
其中，上述Ec_PET水解酶突变体中，所述的Gln182Leu突变体的氨基酸序列见SEQID No.2所示；所述的Ile208Val突变体的序列见SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了编码上述的Ec_PET水解酶突变体的基因。优选的，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4或SEQ ID No.5中的至少一条所示。
进一步的，本发明还提供了一种含有上述Ec_PET水解酶突变体基因的载体。优选的，所述载体包括真核载体或者原核载体。更优选的，所述载体为质粒载体或者病毒载体。
本发明还提供了一种包含上述Ec_PET水解酶突变体基因载体的宿主细胞。优选的，上述宿主细胞为细菌。更优选的，所述的细菌为大肠杆菌MC1061、BL21(DE3)、Top10或DH5α。
本发明提供了上述的Ec_PET水解酶突变体在降解PET中的用途。
进一步的，本发明还提供了含有Ec_PET水解酶突变体基因的载体，含有上述载体的宿主细胞，上述基因、载体、宿主细胞在降解PET中的用途。
本发明还提供了一种PET降解剂，含有上述Ec_PET水解酶突变体或其宿主细胞。
下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下结合具体实施例对本发明进行一步描述，以便更好理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限定于以下描述。
实施例中涉及到的培养基配方如下：1L LB液体培养基中含：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，pH7.0。酶催化活性的提高可以用比酶活单位(μmol/mg/min单位时间内每毫克酶分子酶催化活性中心催化底物转换为产物的摩尔数)来表示。因此，比酶活的提高即代表了酶催化活性的提高。
实施例1、大肠杆菌分泌型常表达PET水解酶(Ec_PETase)的突变热点筛选
1.PETase的3D模型构建
将PETase的氨基酸序列：(GenBank accession number，GAP38373.1)分别输入三个网站I-TASSER,MULTICOM,and ROBETTA获取PETase的3D模型，应用Rampage对所获得的模型进行评价，选取3个模型进行后续对接实验。
2.应用Auto Dock软件进行底物对接
由于pNPB法是一种常用的脂肪酶活性检测方法，pNPB经脂肪酶水解的产物pNP在34℃，pH＝7.4的条件下，在405nm有吸收峰。因此我们采用pNPB作为底物进行分子对接。用GaussView绘制其3D结构，并进行动力学优化，最终得到pNPB在空间中的最稳定构象。经对接模拟分析后获得最优结果。
3突变热点筛选
基于底物不能很好结合到活性位点这一事实，我们需对活性位点进行改造。选择突变位点，以对接底物pNPB为中心，统计
Figure BDA0001436531470000041
距离内的氨基酸，并与LCC的对应序列进行比对。确定Trp159，Gln182，Ala183，Ile208和Ser238作为筛选的突变热点。
实施例2、突变热点Trp159，Gln182，Ala183，Ile208和Ser238的定点突变体构建。
实验所用引物如下表1所示：
表1定点突变体构建所用引物
引物 序列号 引物序列(5'-3')
W159H-Forward SEQ ID No.9 TATGGGTCATAGCATGGGTGGCGGTGGCAGC
W159H-Reverse SEQ ID No.10 CACCCATGCTATGACCCATAACGCCCATACG
Q182L-F SEQ ID No.11 GGCGCCGCTGGCGCCGTGGGACAGCAGCTTC
Q182L-R SEQ ID No.12 CACGGCGCCAGCGGCGCCGCAGCTTTCAGGCT
A183T-F SEQ ID No.13 CGCCGCAAACCCCGTGGGACAGCAGCTTCAGC
A183T-R SEQ ID No.14 TCCCACGGGGTTTGCGGCGCCGCAGCTTTCAG
I208V-F SEQ ID No.15 ACGATAGCGTTGCGCCGGTGAACAGCAGCGCG
I208V-R SEQ ID No.16 ACCGGCGCAACGCTATCGTTCTCGCACGCAAA
S238F-F SEQ ID No.17 GCAGCCACTTCTGCGCGAACAGCGGTAACAGC
S238F-R SEQ ID No.18 GTTCGCGCAGAAGTGGCTGCCACCGTTAATTTC
通过PCR技术在pUC57-EcPETase重组DNA载体中引入核苷酸序列突变，PCR反应条件如下：
98℃先停留3分钟，之后10个循环(98℃停留10秒,58℃停留45秒,72℃停留2min),接着20个循环(98℃停留10秒,68℃停留45秒,72℃停留2min),最后在72℃停留10min。经测序结果证明上述突变位点成功引入到pUC57-EcPETase重组DNA载体中。转化到大肠杆菌JM109感受态细胞，涂LB板(100μg/ml Amp)37℃培养14小时获得转化子，将转化子在液体LB培养基中扩大培养获得质粒，构建了5个pUC57-EcPETase基因工程大肠杆菌突变体，分别命名为Trp159His(氨基酸序列如SEQ ID No.6所示)，Gln182Leu(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，Ala183Thr(氨基酸序列如SEQ ID No.7所示)，Ile208Val(氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示)和Ser238Phe(氨基酸序列如SEQ ID No.8所示)。
实施例3、EcPETase重组表达及活性评价
1、分别取pUC57-EcPETase基因工程大肠杆菌突变体，在LB液体培养基、37℃、180rpm条件下，震荡培养4小时(OD600＝1.5)，离心分离分泌到胞外的蛋白质并将其浓缩至0.025mg/ml用于酶催化活性测定。
2、获得pUC57-EcPETase基因工程大肠杆菌菌株过夜培养产物上清浓缩样品，以pNPB为底物，参考考文献：“oshida S,Hiraga K,Takehana T,Taniguchi I,Yamaji H,Maeda Y,Toyohara K,Miyamoto K,Kimura Y,Oda K.2016.A bacterium that degradesand assimilates poly(ethylene terephthalate).Science,351(6278):1196-1199.”中公开的实验方法，测试pUC57-EcPETase基因工程大肠杆菌菌株培养液中EcPETase的催化活性。在96孔板中每个孔加入100μl 2mM的pNPB。底物中加入30μl样品，每个样品做三个重复，然后酶标仪中34℃孵育30分钟以上，每分钟测量405nm处吸收值。通过计算酶活单位U(μmol/min)，得到了如下表2所示的实验结果。其中，酶催化活性(U)的定义为：在一定条件下每分钟产生1μmol底物的酶量为1个PETase水解酶的酶活国际单位。
表2不同Ec_PETase突变体的酶活结果
Figure BDA0001436531470000061
由表2的实验结果可知：只有当突变发生在Gln182或Ile208两个位点的至少一个，或突变体氨基酸为Gln182Leu或Ile208Val的至少一个时，才能够显著提高突变体水解酶的活性，相比野生型PETase提高了1.2-1.5倍。突变发生在其他位点时，不能提高突变体水解酶的活性，甚至会降低突变体水解酶活性。
上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明相关细节进行非实质性各种修改和替换，均应落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 电子科技大学
<120> 高催化活性的PET水解酶突变体
<130> A170929K
<141> 2017-10-17
<150> 201610909058.7
<151> 2016-10-18
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp
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Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp
100 105 110
Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met
115 120 125
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130 135 140
Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala
225 230 235 240
Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala
245 250 255
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260 265 270
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<211> 290
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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275 280 285
Cys Ser
290
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ctggcgagcc acggttttgt ggttatcacc attgatacca acagcaccct ggaccagccg 360
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<211> 876
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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aacagcggta acagcaacca agcgctgatt ggcaagaaag gtgtggcgtg gatgaaacgt 780
ttcatggata acgacacccg ttatagcacc tttgcgtgcg aaaacccgaa cagcacccgt 840
gttagcgatt ttcgtaccgc gaattgcagc taataa 876
<210> 6
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly
35 40 45
Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly
50 55 60
Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala
65 70 75 80
Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp
85 90 95
Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp
100 105 110
Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met
115 120 125
Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro
130 135 140
Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly His Ser
145 150 155 160
Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu
165 170 175
Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser
180 185 190
Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile
195 200 205
Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg
210 215 220
Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala
225 230 235 240
Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala
245 250 255
Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala
260 265 270
Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn
275 280 285
Cys Ser
290
<210> 7
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly
1 5 10 15
Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr
20 25 30
Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile
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225 230 235 240
Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala
245 250 255
Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala
260 265 270
Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn
275 280 285
Cys Ser
290
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tatgggtcat agcatgggtg gcggtggcag c 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacccatgct atgacccata acgcccatac g 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcgccgctg gcgccgtggg acagcagctt c 31
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacggcgcca gcggcgccgc agctttcagg ct 32
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgccgcaaac cccgtgggac agcagcttca gc 32
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcccacgggg tttgcggcgc cgcagctttc ag 32
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acgatagcgt tgcgccggtg aacagcagcg cg 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
accggcgcaa cgctatcgtt ctcgcacgca aa 32
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcagccactt ctgcgcgaac agcggtaaca gc 32
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttcgcgcag aagtggctgc caccgttaat ttc 33

Claims (11)

1.Ec_PET水解酶突变体，其特征在于：所述的突变体为在野生型Ec_PET水解酶的基础上进行位点突变获得的突变体，所述的野生型Ec_PET水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的突变体为Gln182Leu突变体或Ile208Val突变体中的至少一种。
2.编码权利要求1所述的Ec_PET水解酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4或SEQ ID No.5中的至少一条所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体为真核载体或者原核载体。
6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述的载体为质粒载体或者病毒载体。
7.含有权利要求4-6任一项所述的载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为细菌。
9.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌MC1061、BL21（DE3）、Top10或DH5α。
10.权利要求1所述的Ec_PET水解酶突变体、权利要求4-6任一项所述的载体、权利要求7-9任一项所述的宿主细胞在降解PET中的用途。
11.PET降解剂，其特征在于：含有权利要求1所述的Ec_PET水解酶突变体、权利要求4-6任一项所述的载体、权利要求7-9任一项所述的宿主细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019168811A1 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 Alliance For Sustainable Energy, Llc Enzymes for polymer degradation
CN108467857B (zh) * 2018-03-14 2020-11-03 四川大学 Pet水解酶突变体及其应用
CN108588052B (zh) * 2018-05-11 2020-06-12 天津大学 Pet降解酶的突变体及其应用
CN110241097B (zh) * 2019-05-24 2022-05-17 山东大学 Pet降解酶突变体及其应用
CN111100835B (zh) * 2020-01-07 2021-12-31 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 Pet降解生物催化剂及其应用
CN114480342B (zh) * 2021-06-22 2024-08-02 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 突变型pet水解酶、重组载体、重组工程菌及其应用
CN116606873B (zh) * 2023-05-06 2024-03-01 天津大学 分解聚酯的酯酶突变体基因及该基因表达的蛋白与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1579652A (zh) * 2003-08-04 2005-02-16 陈重光 一种利用昆虫T.m酶降解有机塑料的方法
EP1992700A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-19 FUJIFILM Corporation Method for producing dry analytical element for pancreatic lipase measurement
WO2015173265A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Carbios Process of recycling mixed pet plastic articles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1579652A (zh) * 2003-08-04 2005-02-16 陈重光 一种利用昆虫T.m酶降解有机塑料的方法
EP1992700A1 (en) * 2007-05-16 2008-11-19 FUJIFILM Corporation Method for producing dry analytical element for pancreatic lipase measurement
WO2015173265A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Carbios Process of recycling mixed pet plastic articles

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A bacterium tha degrades and assimilates poly(enthylene terephthalate).;Yoshida S等;《Science》;20160311;第351卷(第6278期);第1196-1199页 *
lipase[Ideonella sakaiensis];Yoshida S等;《GenBank Database》;20160316;Accession number:GAP38373 *
酶对DTP及PET纤维的降解性能探讨;张健飞等;《东华大学学报(自然科学版)》;20030630(第03期);第105-109页 *

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