CN116286727A - 一种角质酶变体及其制备方法和在塑料降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶工程和塑料降解技术领域，具体涉及一种角质酶变体及其制备方法和在塑料降解中的应用。本发明以角质酶ICCG为出发酶利用生物信息学及蛋白质工程技术进行工程改造，获得一系列底物PET亲和力提高的突变体，经试验验证，所获得的角质酶变体对PET具有更高亲和力，同时对于PET的水解活性更高，只需要3.7小时或更短就可以水解90％的PET底物；同时超过99％的水解产物是对苯二甲酸和乙二醇单体，几乎没有不完全降解的BHET和MHET，水解更加彻底，从而更加有利于满足PET废弃物的解聚再利用的实际应用需求，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种角质酶变体及其制备方法和在塑料降解中的应用
技术领域
本发明属于酶工程和塑料降解技术领域，具体涉及一种角质酶变体及其制备方法和在塑料降解中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是由对苯二甲酸和乙二醇两种单体通过酯键聚合而成的聚酯型塑料，是最丰富的石油基合成聚合物之一，具有重量轻、绝缘性好、强度及透明度高等优良性能，已被广泛用于一次性饮料瓶、包装、服装和电气配件等领域，极大地方便了人们的生活。全球每年消耗超过3亿吨PET，消费后的PET仅少部分被回收，大部分被丢弃到环境中，造成了严重的环境污染和资源浪费。目前主要的处理方式为填埋和焚烧，容易造成资源浪费和二次污染。
近年来，使用酶法催化PET废弃物解聚为解决PET污染问题提供了一条绿色环保的途径。目前已经发现多种角质酶、脂肪酶、羧酸脂酶可以将非特异性底物PET水解为低聚物(BHET，MHET)及单体(对苯二甲酸和乙二醇)。例如2016年，Yoshida等人从细菌Ideonellasakaigenesis 201-F69中发现了两种PET水解酶IsPETase和MHETase，这两种酶优先识别PET而不是脂肪族酯类作为底物，能够在室温下降解PET。但催化活性和热稳定性较低，目前难以实际应用于PET废弃物的回收处理。而2013年从枝叶堆肥宏基因组中鉴定出的嗜热叶枝堆肥角质酶(LCC)，PET虽然不是其特异性底物，但LCC具有更高的热稳定性，可以在较高温度下非特异性地结合PET底物，水解酯键释放对苯二甲酸和乙二醇单体，解聚效率明显高于IsPETase和MHETase。
对这些水解酶进行蛋白质工程改造是提升PET酶法解聚及升级利用的关键，目前改造方向集中在提高酶的热稳定性上，由于PET是一种半结晶聚合物，因此酶难以与高结晶区的底物接触，但是当温度上升到70℃左右时，PET会发生玻璃化转变，由坚硬的固体变成柔软的弹性体，同时分子热运动加剧，链间相互作用减弱、流动性增加，呈现出更易于生物降解的活跃形态。因此，提高酶的热稳定性更加有利于PET水解。例如通过基于蛋白质结构理性设计的ThermoPETase突变体、通过GRAPE计算方法辅助进化获得的DuraPETase突变体、通过机器学习辅助进化获得的FAST-PETase突变体以及通过添加额外的二硫键提高LCC的热稳定性等。目前热稳定性最高的PET水解酶是来源于LCC的突变体ICCG，其Tm值达到了99℃。并且可以在72℃时10h内降解90％的PET，是目前已报道的催化活性最高的PET水解酶突变体。但是，当反应温度高于72℃时，PET的重结晶速度会明显加快，而现有酶的催化速率不足，一部分PET尚未被降解就发生了重结晶，无法被降解。ICCG在75℃下的PET降解率只有60％。因此，除了热稳定性外，提高酶的催化速率是进一步提高PET酶解效率的关键。
ICCG不同于IsPETase，后者是专一性的PET降解酶(EC3.1.1.101)，ICCG属于角质酶(EC3.1.1.79)，它的天然底物是长链、短链脂肪酸酯，而不是含有苯环的对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。因此，ICCG的底物结合口袋并不完全适配PET，其与PET的亲和力有进一步提升的空间。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种角质酶变体及其制备方法和在塑料降解中的应用。本发明利用生物信息学及蛋白质工程技术改造角质酶ICCG，从而提高其对于PET底物的亲和力，进而提升PET的酶法水解效率，增强其在塑料降解等实际产业应用中的价值。基于上述研究，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种角质酶变体，选自下组中的任意一个或多个位点发生突变：
T176A、T176N、H183W、A62D、T176Q、H183F、T176K、H183Y、S212E、N213Q、S65K、S65I、N213D、S65H、W69C、Q182F、D63E、S212A、I208Q、W69Y、S212R、N211Y、Q182D、Q182G、S206A、S212H、I208V、Q182W、D91S、Y60W、D91C、I208P、I208S、Q182T、Q182V、S206R、W69V、I208N、I208R；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1(角质酶ICCG的氨基酸序列，SNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGGIAMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDGPDSRASQLSAALNYLRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPSLKAAVPLTPWHTDKTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQHAIPFYQNLPSTTPKVYVELCNASHIAPNSNNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALCDFRTNNRHCQ)所示的编号。
所述角质酶变体在上述所示的角质酶ICCG基础上进行突变，并且所述角质酶变体选自下组中的突变体：
LCC-A1：H183Y；
LCC-A2：H183Y/N213D；
LCC-A3：H183Y/N213D/S212A。
为便于后续蛋白纯化，所述角质酶变体可在羧基端修饰有His标签(LEHHHHHH，SEQID NO.2)。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述第一方面所述的角质酶变体。
本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述第二方面所述的多核苷酸。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第三方面所述的载体或染色体整合有上述第二方面所述的多核苷酸或表达上述第一方面所述角质酶变体。
本发明的第五方面，提供了一种制备上述角质酶变体的方法，包括步骤：培养上述第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的角质酶变体；以及分离纯化获得角质酶变体。
本发明的第六个方面，提供上述第一方面所述角质酶变体、第二方面所述多核苷酸、第三方面所述重组表达载体、第四方面所述宿主细胞在塑料制品水解、解聚、降解和催化领域中的应用。
其中，所述塑料制品为包含聚酯型塑料的制品，所述聚酯型塑料具体为聚对苯二甲酸乙二醇酯。
本发明的第七个方面，提供一种降解聚酯的方法，所述方法包括：向聚酯中施用第一方面所述角质酶变体或第四方面所述宿主细胞进行反应。
本发明的第八个方面，提供第一方面所述角质酶变体的筛选方法，所述筛选方法包括使用出发酶的晶体结构与3PET小分子底物进行分子对接，获得酶-底物复合物的三维结构；通过分子动力学模拟分析了ICCG角质酶与3PET模型底物随时间变化的动态蛋白质构象，对关键氨基酸位点进行计算机虚拟饱和突变，并通过同源建模获得突变体的三维结构；利用分子对接技术分析了不同位点的突变体对于PET底物的亲和能，从中选择亲和力提高的突变体进行实验验证。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供了一种角质酶变体及其制备方法和在塑料降解中的应用，具体的，上述技术方案以角质酶突变体ICCG为出发酶利用生物信息学及蛋白质工程技术进行工程改造，获得一系列底物PET亲和力提高的突变体，经试验验证，所获得的角质酶变体对PET具有更高亲和力，同时对于PET的水解活性更高，具体表现为：1、PET底物的水解速度更快，只需要3.7小时或更短就可以水解90％的PET底物。2、超过99％的水解产物是对苯二甲酸和乙二醇单体，几乎没有不完全降解的BHET和MHET，水解更加彻底，从而更加有利于满足PET废弃物的解聚再利用的实际应用需求，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中第一轮蛋白质工程改造中活性提高的突变体的PET水解产物浓度。
图2为本发明实施例1中第二轮蛋白质工程改造中活性提高的突变体的PET水解产物浓度。
图3为本发明实施例1中第三轮蛋白质工程改造中活性提高的突变体的PET水解产物浓度。
图4为出发酶ICCG，单位点突变体H183Y、N213D和S212A及位点组合LCC-A2和LCC-A3的PET水解产物浓度。
图5为本发明实施例2中出发酶ICCG、双突变体LCC-A2和三突变体LCC-A3对于高浓度(200g/L)消费后PET废弃物的水解曲线。
图6为本发明实施例2中出发酶ICCG、双突变体LCC-A2和三突变体LCC-A3经过6小时反应后的PET水解产物组成。
图7为本发明实施例2中双突变体LCC-A2在不同反应温度下对于高浓度(200g/L)消费后PET废弃物的水解曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种角质酶变体，所述角质酶变体选自下组中的任意一个或多个位点发生突变：
T176A、T176N、H183W、A62D、T176Q、H183F、T176K、H183Y、S212E、N213Q、S65K、S65I、N213D、S65H、W69C、Q182F、D63E、S212A、I208Q、W69Y、S212R、N211Y、Q182D、Q182G、S206A、S212H、I208V、Q182W、D91S、Y60W、D91C、I208P、I208S、Q182T、Q182V、S206R、W69V、I208N、I208R；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1(角质酶ICCG的氨基酸序列，SNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGGIAMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDGPDSRASQLSAALNYLRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPSLKAAVPLTPWHTDKTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQHAIPFYQNLPSTTPKVYVELCNASHIAPNSNNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALCDFRTNNRHCQ)所示的编号。
本发明的又一具体实施方式中，所述角质酶变体的氨基酸序列具有与SEQ IDNO.1相比至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同源性。
本发明的又一具体实施方式中，所述角质酶变体中的突变位点的数量为1-5个，进一步优选为1-3个，如1个、2个或3个。
本发明的又一具体实施方式中，所述角质酶变体在SEQ ID NO.1所示的角质酶ICCG基础上进行突变，并且所述角质酶变体选自下组中的突变体：
LCC-A1：H183Y；
LCC-A2：H183Y/N213D；
LCC-A3：H183Y/N213D/S212A。
本发明的又一具体实施方式中，为便于后续蛋白纯化，所述角质酶变体可在羧基端修饰有His标签(LEHHHHHH，SEQ ID NO.2)。
本发明通过实验证明，与现有角质酶ICCG相比，突变体LCC-A1、LCC-A2和LCC-A3活性分别提高了27％，56％和61％。为了表征三个突变位点各自对于酶活性提高的作用，比较了单位点突变体H183Y、N213D和S212A及位点组合突变体LCC-A2和LCC-A3相对于ICCG的酶活性提高的程度。H183Y、N213D和S212A的活性分别比ICCG提高了35.7％，13.7％和8.1％，而双突变体LCC-A2(H183Y/N213D)的活性比ICCG提高了57.2％，三突变体LCC-A3(H183Y/N213D/S212A)的活性比ICCG提高了71.7％。即双位点突变及三位点突变的酶活性明显高于对应单位点突变酶活性的叠加，考虑到不同突变体具有不同序列，因而具备不同结构，但双位点突变及三位点突变的酶活性明显高于对应单位点突变酶活性的叠加仍然是难以预期的。
在72℃的反应温度下，双突变体H183Y/N213D在5.8h内降解了90％的PET废弃物，比目前报道的活性最高的ICCG突变体少用时3.5h。三突变体催化降解80％的消费后PET废物仅需9.7h，而ICCG需要6h。同时，两个突变体对于PET底物的亲和力明显提高，酶的动力学结果显示LCC-A2的Km值为2.13nM，LCC-A3为1.96nM，明显低于ICCG的3.99nM，说明突变体对PET底物的亲和力显著提高。由于亲和力的提高，突变体LCC-A2和突变体LCC-A3超过99％的降解产物都是末端降解产物对苯二甲酸和乙二醇，几乎不存在中间降解产物BHET和MHET。而ICCG的降解产物中还包含了18％的中间体羟乙基对苯二甲酸酯。
另外，经过进一步的反应温度优化，双突变体H183Y/N213D的催化效率进一步提升，在最佳反应温度下，降解90％的PET废弃物仅需3.7h，比目前报道的活性最高的ICCG突变体少用时5.6h，并且突破了底物重结晶的限制，最终PET废弃物降解率达到了100％。
总之，上述角质酶变体对PET具有更高亲和力，同时对于PET的水解活性更高，具体表现为1、PET底物的水解速度更快，只需要3.7小时或更短就可以水解90％的PET底物。2、超过99％的水解产物是对苯二甲酸和乙二醇单体，几乎没有不完全降解的BHET和MHET，水解更加彻底，从而更加有利于满足PET废弃物的解聚再利用的实际应用需求。特别地，如前所述，发明人在试验研究中意外发现，双位点突变及三位点突变的酶活性均明显高于对应单位点突变酶活性的叠加，考虑到不同突变体具有不同序列，因而具备不同结构，但双位点突变及三位点突变的突变体其酶活性均明显高于对应单位点突变酶活性的叠加，表现为某种“协同”效应，取得了预料不到的效果。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述角质酶变体。
本发明的又一具体实施方式中，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有本发明上述多核苷酸。
本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达载体通过上述多核苷酸有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体；优选的，所述表达载体为质粒，在本发明的一个具体实施方式中，所述质粒为PET-26b。
本发明的又一具体实施方式中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体整合有上述多核苷酸。
所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。
本发明的又一具体实施方式中，所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞中的任意一种或多种；
其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种；
本发明的又一具体实施方式中，所述细菌细胞为大肠杆菌(如大肠杆菌BL21(DE3))、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌等。
所述真菌细胞包括酵母菌(如毕赤酵母)等。
本发明的又一具体实施方式中，提供了一种制备上述角质酶变体的方法，包括步骤：培养本发明上述宿主细胞，从而表达出所述的角质酶变体；以及分离纯化获得角质酶变体。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述角质酶变体、多核苷酸、重组表达载体、宿主细胞在在塑料制品水解、解聚、降解和催化领域中的应用。
其中，所述塑料制品可以为包含聚酯的塑料制品，所述聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸异山梨酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些材料的掺合物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。
其中，所述应用中，反应温度控制为不低于70℃，进一步为不低于72℃，发明人研究发现，在一定温度范围内，随着反应温度提高，所述角质酶对塑料制品的催化降解效率进一步提高，因此所述反应温度可以为72-89℃，如72℃，75℃，78℃，81℃以及89℃，且在89℃时，催化降解效率最佳。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种降解聚酯的方法，所述方法包括：向聚酯中施用上述角质酶变体或宿主细胞进行反应。
其中，所述聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸异山梨酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚乙烯呋喃酸酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)和这些材料的掺合物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯。
反应温度控制为不低于70℃，进一步为不低于72℃，发明人研究发现，在一定温度范围内，随着反应温度提高，所述角质酶对塑料制品的催化降解效率进一步提高，因此所述反应温度可以为72-89℃，如72℃，75℃，78℃，81℃以及89℃，且在89℃时，催化降解效率最佳。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述角质酶变体的筛选方法，所述筛选方法包括使用出发酶的晶体结构与3PET小分子底物进行分子对接，获得酶-底物复合物的三维结构；通过分子动力学模拟分析了角质酶ICCG与3PET模型底物随时间变化的动态蛋白质构象，对关键氨基酸位点进行计算机虚拟饱和突变，并通过同源建模获得突变体的三维结构；利用分子对接技术分析了不同位点的突变体对于PET底物的亲和能，从中选择亲和力提高的突变体进行实验验证。
其中，所述关键氨基酸位点判定标准为与3PET底物相互作用时间持续超过20％的位点即被认为属于关键氨基酸位点；
所述筛选方法中，首轮使用的出发酶为角质酶ICCG(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
而通过试验验证后筛选水解效率更佳或最佳的突变体出发酶可作为第二轮的出发酶重复上述筛选方法，不断循环重复至第三轮、第四轮等。
在本发明的一个具体实施方式中，在第一轮改造中，验证了33个与PET底物亲和力提高的突变体，其中8个突变体的PET水解效率增加。效率最高的突变体H183Y，作为出发酶进行第二轮蛋白质工程改造。在第二轮改造中，验证了99个与PET底物亲和力提高的突变体，其中9个突变体的水解效率比ICCG高。以效率最高的H183Y/N213D突变体为出发酶进行第三轮突变，在72个与PET底物亲和力提高的突变体中，有17个水解效率高于ICCG。经过三轮蛋白质改造后，筛选出了降解速率最高的两个突变体，分别为双突变体H183Y/N213D(LCC-A2)和三突变体H183Y/N213D/S212A(LCC-A3)。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1、以角质酶ICCG为出发酶进行工程改造，获得一系列底物PET亲和力提高的突变体，并检测其对PET的水解活性
一、通过生物信息学技术预测对于PET底物亲和力提高的角质酶突变体
为了获得对于PET底物亲和力更高的角质酶突变体，本发明开发了一种预测蛋白质突变体对于PET底物亲和力的生物信息学策略。将从PDB上获取的ICCG晶体结构及ChemOffice 2019绘制的3PET分子使用Autodock vina 1.1.2进行分子对接，获得酶与底物复合体的三维结构。使用NAMD 2.12的OPLS-AA/M力场对复合物进行分子动力学分析，根据分子动力学轨迹中的动态蛋白质构象信息，确定在底物结合中发挥重要作用的关键氨基酸残基。通过计算机虚拟饱和突变及同源建模，获得所有突变体的三维结构。利用分子对接技术评估不同位点的突变体对于PET底物的亲和能，从中选择亲和力提高的突变体进行实验验证，检测其对PET纳米颗粒的降解能力。水解效率最佳突变体作为出发酶用于下一轮的蛋白质工程改造。
共进行了三轮蛋白质工程改造，第一轮以角质酶ICCG为出发酶，通过计算预测到了33个对于PET底物亲和力增加的突变体，它们与3PET的亲和能见表1。
表1：第一轮改造中预测到的对于PET底物亲和力增加的突变体及其实际催化PET纳米颗粒水解的相对活性
Figure SMS_1
Figure SMS_2
第二轮以突变体H183Y为出发酶，通过计算预测到了99种对于PET底物亲和力提升的突变体，它们与3PET底物的亲和能见表2。
表2：第二轮改造中预测到的对于PET底物亲和力增加的突变体及其实际催化PET纳米颗粒水解的相对活性
Figure SMS_3
第三轮以突变体H183Y/N213D为出发酶，通过计算预测到了72种对于PET底物亲和力提升的突变体，它们与3PET底物的亲和能见表3。
表3：第三轮改造中预测到的对于PET底物亲和力增加的突变体及其实际催化PET纳米颗粒水解的相对活性
Figure SMS_4
Figure SMS_5
二、构建角质酶突变体的表达载体
1、ICCG表达载体的构建
ICCG的氨基酸序列由Tournier et al.在2020年9月的Nature期刊中首次描述。去掉信号肽的角质酶核苷酸序列经过密码子优化和商业合成后被连接在表达载体pET26b(+)的酶切位点NdeI(5’末端)and XhoI(3’末端)之间，在XhoI酶切位点下游含有由6个组氨酸组成的His标签，以便使用亲和层析的方法进行蛋白纯化。被插入载体后的角质酶氨基酸序列见SEQ ID NO.3，核苷酸序列见SEQ IDNO.9。
2、角质酶突变体的表达载体的构建
通过PCR技术和Gibson无缝克隆技术将突变引入野生型角质酶的DNA序列中，获得突变体的表达载体。表达角质酶突变体的质粒载体被转导入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，并涂布含有卡那霉素抗生素的LB琼脂平板。经过DNA序列检测，从中挑选正确的转化子。
三、角质酶突变体水解PET纳米颗粒的相对活性检测
将含有ICCG及角质酶突变体的大肠杆菌接种至含有1ml LB培养基的96深孔板中，添加诱导剂IPTG诱导蛋白质分泌表达。取50ul含角质酶突变体的发酵上清液加入950ul含有0.2mg PET纳米颗粒的磷酸缓冲液中。72℃温浴9h后，取200ul上清液检测在290nm处吸光度。PET的水解产物对苯二甲酸含有苯环，在290nm出具有特征吸收峰，因此可以根据290nm处的吸光度评估突变体的催化活性。以出发酶ICCG的吸光度为1计算突变体的相对PET水解活性。每一轮蛋白质工程改造的突变体的相对PET水解活性分别见表1，表2和表3。
值得注意的是，专利CN 109692221 A中报道的A62、S65、R89、D91、P93、M131、T153、H156、T157、T176、A178、P179和N211位点突变都可能有助于提高角质酶的聚酯降解活性，而本发明通过实验证明这些位点的突变使PET的水解活性显著降低。
四、角质酶突变体的表达纯化
1、角质酶突变体的表达
将上述表达ICCG或角质酶突变体的大肠杆菌接种到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在37℃和220rpm的条件下过夜培养。将1ml培养物转接到50ml新鲜的含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，在37℃和220rpm的条件下培养到OD600到0.8-1.0。加入终浓度0.5mM的IPTG后，将菌株继续培养16h使蛋白表达并分泌到胞外。
2、角质酶突变体的纯化
将培养好的角质酶发酵液以12000rpm离心10min，收集到的上清液用0.95μm的滤膜过滤。将过滤好的上清液通过镍离子层析柱进行纯化。使用wash buffer(20mM Tris-HCl，pH8.0，300mM NaCl，20mM咪唑)洗掉杂蛋白后，使用elution buffer(20mM Tris-HCl，pH8.0,300mM NaCl，250mM咪唑)将目的蛋白洗脱下来。收集到的纯化蛋白使用10KDA的超滤管将buffer置换为storage buffer(20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl)，并浓缩至浓度大于1mg/ml。浓缩好的酶使用蛋白质浓度检测试剂盒确定浓度，并放在9℃保存。
五、测试角质酶突变体的PET水解活性
1、使用ICCG和角质酶突变体水解PET粉末
将50μg ICCG或角质酶突变体和10mg PET粉末(Goodfellow，ES301995)添加到1ml磷酸缓冲液中混匀。在72℃温浴反应5h，加入1ml乙腈终止反应。每个反应做3组平行。
2、检测PET水解产物浓度
将终止反应后的反应液用0.22μm的滤膜过滤，使用高效液相色谱(Shimadzu LA-20AT)检测产物浓度，分析柱为ZORBAX extend-c18 column(150×9.6mm,5μm,Agilent)，A流动相为稀释的三氟乙酸(0.1％v/v)，B流动相为乙腈，A流动相占比80％，流速为0.6ml/min，检测波长为290nm。使用商品化的PET水解产物对苯二甲酸双羟乙酯(BHET，sigma)、羟乙基对苯二甲酸酯(MHET，aladdin)和对苯二甲酸(TPA，sigma)制作标准曲线。根据标准曲线确定反应液中的水解产物浓度。
第一轮蛋白质工程改造中活性提高的角质酶突变体的PET降解产物浓度检测结果见图1。活性最高的突变体H183Y比ICCG的活性提高了27％。
第二轮蛋白质改造中活性提高的角质酶突变体的PET降解产物浓度检测结果见图2。活性最高的角质酶突变体H183Y/N213D比ICCG的活性提高了56％。
第三轮蛋白质改造中活性提高的角质酶突变体的PET降解产物浓度检测结果见图3。活性最高的角质酶突变体H183Y/N213D/S212A比ICCG的活性提高了61％。
为了表征三个突变位点各自对于酶活性提高的作用，构建了单位点突变体N213D和S212A。比较了单位点突变体H183Y、N213D和S212A及位点组合突变体LCC-A2和LCC-A3相对于ICCG的酶活提高程度。各突变体在72℃反应2小时降解PET产生的产物浓度见图4。H183Y、N213D和S212A的活性分别比ICCG提高了35.7％，13.7％和8.1％，而双突变体LCC-A2(H183Y/N213D)的活性比ICCG提高了57.2％，三突变体LCC-A3(H183Y/N213D/S212A)的活性比ICCG提高了71.7％。即双位点突变及三位点突变的突变体其酶活性明显高于对应单位点突变酶活性的叠加。
实施例2、角质酶突变体水解高浓度的消费后PET废弃物
为了验证本发明中的角质酶突变体回收消费后PET废弃物的实际应用潜力，我们以日常生活中常见的PET矿泉水瓶作为底物，选择LCC-A2和LCC-A3突变体进行了规模化的PET解聚实验。双突变体LCC-A2的氨基酸序列见SEQ IDNO.5，核苷酸序列见SEQ ID NO.6。三突变体LCC-A3的氨基酸序列见SEQ IDNO.7，核苷酸序列见SEQ ID NO.8。
具体实施方案为：
将PET材质的矿泉水瓶去掉标签和瓶盖，并剪成小块。在280℃下融化并没入冷水中去结晶，使用液氮冷冻并研磨成粉末。将10g PET粉末和30mg PET水解酶(ICCG、LCC-A2或LCC-A3)加入含有磷酸盐缓冲液的生物反应器中，至终体积50ml。通过水浴加热维持反应温度，使用5M氢氧化钠水溶液维持pH为8.5。保持300rpm转速搅拌12h，记录氢氧化钠的消耗量。每生成1M酸性产物TPA将消耗2M氢氧化钠。因此，可以通过氢氧化钠的消耗量计算产物TPA的生成量。再根据TPA的生成量计算PET的降解量。
根据氢氧化钠的消耗曲线计算出PET的水解曲线。在72℃下，突变体LCC-A2和LCC-A3对于消费后PET废弃物的解聚速率显著提升，见图5。ICCG降解80％的PET需要6小时，而双突变体LCC-A2仅需要3.8小时，比ICCG节省了2.2小时。在5.8h内LCC-A2降解了90％的PET废弃物，比目前报道的活性最高的PET水解酶ICCG少用时3.5h。三突变体LCC-A3降解80％的PET废弃物仅需要9.6小时，比ICCG节省了1.9小时。更重要的是，由于底物亲和力的提高，在反应进行6h时，LCC-A2和LCC-A3的PET水解产物中超过99％都是末端水解产物TPA和EG，几乎没有中间产物降解产物MHET和BHET，而出发酶ICCG的水解产物中有18％是中间降解产物MHET，见图6。
另外，经过进一步的反应温度优化，双突变体H183Y/N213D的催化效率进一步提升，见图7。在最佳反应温度(89℃)下，降解90％的PET废弃物仅需3.7h，比目前报道的活性最高的ICCG突变体少用时5.6h，并且突破了底物重结晶的限制，最终PET废弃物降解率达到了100％。
这说明了我们设计的突变体不仅对于PET底物的水解速度更快，水解反应也更加彻底，更加有利于满足PET废弃物的解聚再利用的实际应用需求。本发明中所涉及的核苷酸与氨基酸序列
SNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGGI
AMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDGPDSRASQLSAALNY
LRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPSLKAAVPLTPWHTD
KTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQHAIPFYQNLPSTTPKVYVELCNASHIAPNSNNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALCDFRTNNRHCQ(SEQ IDNO.1)
LEHHHHHH(SEQ ID NO.2)
SNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGGI
AMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDGPDSRASQLSAALNY
LRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPSLKAAVPLTPWHTD
KTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQHAIPFYQNLPSTTPKVYVELCNASHIAPNS
NNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALCDFRTNNRHCQLEHHHHHH(SEQ ID NO.3)
AGCAACCCGTACCAGCGTGGCCCGAATCCGACCCGCAGCGCACTGACCGC
AGATGGCCCGTTTAGCGTGGCAACCTACACCGTCTCACGCCTGTCAGTCTC
GGGTTTTGGCGGTGGCGTGATTTATTACCCGACCGGCACGTCTCTGACGTT
CGGTGGCATCGCGATGAGTCCGGGTTATACCGCAGATGCTAGCTCTCTGGC
ATGGCTGGGTCGTCGCCTGGCTTCCCATGGCTTTGTGGTTCTGGTGATTAAC
ACGAATTCACGTTTCGATGGTCCGGACAGCCGCGCCTCTCAGCTGAGTGCC
GCCCTGAACTACCTGCGTACCAGTTCCCCGAGCGCCGTTCGCGCACGTCTG
GATGCAAATCGTCTGGCGGTTGCCGGTCATTCTATGGGTGGCGGTGGCACC
CTGCGTATTGCAGAACAAAACCCGAGCCTGAAAGCGGCTGTCCCGCTGAC
CCCGTGGCACACCGATAAAACGTTTAATACCAGTGTCCCGGTGCTGATTGT
TGGCGCAGAAGCTGACACCGTGGCGCCGGTTTCGCAGCATGCCATCCCGTT
TTATCAAAACCTGCCGAGCACCACGCCGAAAGTTTACGTCGAACTGTGCA
ACGCATCGCACATTGCTCCGAATAGCAACAATGCGGCCATTTCCGTTTATAC
GATCTCATGGATGAAACTGTGGGTCGATAATGACACCCGTTACCGCCAGTT
CCTGTGTAATGTGAACGACCCGGCTCTGTGCGACTTCCGCACCAATAATCG
CCACTGCCAActcgagcaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO.9)
MSNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGG
IAMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDGPDSRASQLSAALNY
LRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPSLKAAVPLTPWHTD
KTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQYAIPFYQNLPSTTPKVYVELCNASHIAPNS
DNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALCDFRTNNRHCQLEHHH
HHH(SEQ ID NO.5)
atgAGCAACCCGTACCAGCGTGGCCCGAATCCGACCCGCAGCGCACTGACC
GCAGATGGCCCGTTTAGCGTGGCAACCTACACCGTCTCACGCCTGTCAGTC
TCGGGTTTTGGCGGTGGCGTGATTTATTACCCGACCGGCACGTCTCTGACG
TTCGGTGGCATCGCGATGAGTCCGGGTTATACCGCAGATGCTAGCTCTCTGG
CATGGCTGGGTCGTCGCCTGGCTTCCCATGGCTTTGTGGTTCTGGTGATTAA
CACGAATTCACGTTTCGATGGTCCGGACAGCCGCGCCTCTCAGCTGAGTGC
CGCCCTGAACTACCTGCGTACCAGTTCCCCGAGCGCCGTTCGCGCACGTCT
GGATGCAAATCGTCTGGCGGTTGCCGGTCATTCTATGGGTGGCGGTGGCAC
CCTGCGTATTGCAGAACAAAACCCGAGCCTGAAAGCGGCTGTCCCGCTGA
CCCCGTGGCACACCGATAAAACGTTTAATACCAGTGTCCCGGTGCTGATTG
TTGGCGCAGAAGCTGACACCGTGGCGCCGGTTTCGCAGTATGCCATCCCGT
TTTATCAAAACCTGCCGAGCACCACGCCGAAAGTTTACGTCGAACTGTGCA
ACGCATCGCACATTGCTCCGAATAGCGATAATGCGGCCATTTCCGTTTATAC
GATCTCATGGATGAAACTGTGGGTCGATAATGACACCCGTTACCGCCAGTT
CCTGTGTAATGTGAACGACCCGGCTCTGTGCGACTTCCGCACCAATAATCG
CCACTGCCAActcgagcaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO.6)
MSNPYQRGPNPTRSALTADGPFSVATYTVSRLSVSGFGGGVIYYPTGTSLTFGG
IAMSPGYTADASSLAWLGRRLASHGFVVLVINTNSRFDGPDSRASQLSAALNY
LRTSSPSAVRARLDANRLAVAGHSMGGGGTLRIAEQNPSLKAAVPLTPWHTD
KTFNTSVPVLIVGAEADTVAPVSQYAIPFYQNLPSTTPKVYVELCNASHIAPNA
DNAAISVYTISWMKLWVDNDTRYRQFLCNVNDPALCDFRTNNRHCQLEHHHHHH(SEQ ID NO.7)
atgAGCAACCCGTACCAGCGTGGCCCGAATCCGACCCGCAGCGCACTGACC
GCAGATGGCCCGTTTAGCGTGGCAACCTACACCGTCTCACGCCTGTCAGTC
TCGGGTTTTGGCGGTGGCGTGATTTATTACCCGACCGGCACGTCTCTGACG
TTCGGTGGCATCGCGATGAGTCCGGGTTATACCGCAGATGCTAGCTCTCTGG
CATGGCTGGGTCGTCGCCTGGCTTCCCATGGCTTTGTGGTTCTGGTGATTAA
CACGAATTCACGTTTCGATGGTCCGGACAGCCGCGCCTCTCAGCTGAGTGC
CGCCCTGAACTACCTGCGTACCAGTTCCCCGAGCGCCGTTCGCGCACGTCT
GGATGCAAATCGTCTGGCGGTTGCCGGTCATTCTATGGGTGGCGGTGGCAC
CCTGCGTATTGCAGAACAAAACCCGAGCCTGAAAGCGGCTGTCCCGCTGA
CCCCGTGGCACACCGATAAAACGTTTAATACCAGTGTCCCGGTGCTGATTG
TTGGCGCAGAAGCTGACACCGTGGCGCCGGTTTCGCAGTATGCCATCCCGT
TTTATCAAAACCTGCCGAGCACCACGCCGAAAGTTTACGTCGAACTGTGCA
ACGCATCGCACATTGCTCCGAATGCAGATAATGCGGCCATTTCCGTTTATAC
GATCTCATGGATGAAACTGTGGGTCGATAATGACACCCGTTACCGCCAGTT
CCTGTGTAATGTGAACGACCCGGCTCTGTGCGACTTCCGCACCAATAATCGCCACTGCCAActcgagcaccaccaccaccaccac(SEQ ID NO.8)
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种角质酶变体，其特征在于，所述角质酶变体选自下组中的任意一个或多个位点发生突变：T176A、T176N、H183W、A62D、T176Q、H183F、T176K、H183Y、S212E、N213Q、S65K、S65I、N213D、S65H、W69C、Q182F、D63E、S212A、I208Q、W69Y、S212R、N211Y、Q182D、Q182G、S206A、S212H、I208V、Q182W、D91S、Y60W、D91C、I208P、I208S、Q182T、Q182V、S206R、W69V、I208N、I208R；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。
2.如权利要求1所述的角质酶变体，其特征在于，所述角质酶变体在SEQ ID NO.1所示的角质酶ICCG基础上进行突变，并且所述角质酶变体选自下组中的突变体：
LCC-A1：H183Y；
LCC-A2：H183Y/N213D；
LCC-A3：H183Y/N213D/S212A。
3.如权利要求1-2任一项所述的角质酶变体，其特征在于，所述角质酶变体在羧基端修饰有His标签，所述His标签氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-3任一项所述的角质酶变体。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求4所述所述的多核苷酸；
所述重组表达载体通过所述多核苷酸有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；进一步的，所述表达载体为质粒，所述质粒为PET-26b。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的重组表达载体或染色体整合有权利要求5所述多核苷酸或表达权利要求1-3任一项所述的角质酶变体。
7.一种制备权利要求1-3任一项所述角质酶变体的方法，其特征在于，包括：培养权利要求6所述宿主细胞，从而表达出所述的角质酶变体；以及分离纯化获得角质酶变体。
8.权利要求1-3任一项所述角质酶变体、权利要求4所述多核苷酸、权利要求5所述重组表达载体、权利要求6所述宿主细胞在塑料制品水解、解聚、降解和催化领域中的应用；
其中，所述塑料制品为包含聚酯型塑料的制品，所述聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸异山梨酯、聚乳酸、聚羟基链烷酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚丁二酸己二酸丁二酯、聚己二酸对苯二甲酸丁二酯、聚乙烯呋喃酸酯、聚己内酯、聚(己二酸乙二醇酯)、聚萘二甲酸乙二醇酯和这些材料的掺合物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯；
反应温度控制为不低于70℃，进一步为不低于72℃，更进一步，所述反应温度为72-84℃。
9.一种降解聚酯的方法，其特征在于，向聚酯中施用权利要求1-3任一项所述角质酶变体或权利要求6所述宿主细胞进行反应；
进一步的，所述聚酯选自聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸异山梨酯、聚乳酸、聚羟基链烷酸酯、聚丁二酸丁二醇酯、聚丁二酸己二酸丁二酯、聚己二酸对苯二甲酸丁二酯、聚乙烯呋喃酸酯、聚己内酯、聚(己二酸乙二醇酯)、聚萘二甲酸乙二醇酯和这些材料的掺合物/混合物，优选聚对苯二甲酸乙二醇酯；
反应温度控制为不低于70℃，进一步为不低于72℃，更进一步，所述反应温度为72-84℃。
10.权利要求1-3任一项所述角质酶变体的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括使用出发酶的晶体结构与3PET小分子底物进行分子对接，获得酶-底物复合物的三维结构；通过分子动力学模拟分析了角质酶ICCG与3PET模型底物随时间变化的动态蛋白质构象，对关键氨基酸位点进行计算机虚拟饱和突变，并通过同源建模获得突变体的三维结构；利用分子对接技术分析了不同位点的突变体对于PET底物的亲和能，从中选择亲和力提高的突变体进行实验验证。
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