CN114480343B - 具提升活性的pet水解酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具提升活性的PET水解酶，其氨基酸序列为将SEQ ID NO.4第344个位置及第348个位置或与SEQ ID NO.4具有80％以上序列同源性的序列中对应位置的组氨酸及苯丙氨酸分别突变成丝氨酸及异亮氨酸的序列。改造后的酶成功地提高其PET水解活性，从而得到具提升活性的PET水解酶，进而提升PET水解酶的工业应用价值。

Description

具提升活性的PET水解酶

技术领域

本发明关于一种PET水解酶，尤指一种具提升活性的PET水解酶。

现有技术

塑料制品因其可塑性以及稳定性高，目前已被广泛应用到生活的诸多方面，给人类生活带来了许多便利，但同时引起的白色污染已经严重威胁全球生态系统。目前全球合成塑料年生产量已超4亿吨，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)由对苯二甲酸(terephthalic acid,TPA)和乙二醇(ethylene glycol,EG)通过酯键聚合而成，性质稳定不易分解，常用于矿泉水瓶、涤纶衣服和吸塑包装等，其产生的废弃物数量巨大，是白色污染的重要来源。由于合成塑料废弃物在自然状态下需要数百年时间才能完全分解，在环境中已持续积累并侵入人类食物链，严重威胁到地球生态和人类健康，已成为全球关注的污染问题之一。

目前对PET废弃物的处理方法主要有填埋、焚烧、回收利用及生物降解等。其中填埋和焚烧虽然最简单，但产生的废气、废水会对环境造成二次污染；回收利用则因为回收成本的经济性和回收塑料的性能问题，导致现阶段回收利用率较低。而利用生物降解技术(酶降解或微生物降解)则能将PET降解成小的组成分子，然后再回收利用来合成PET。因此，生物降解法不但解决了PET废弃物的问题，并且能够回收利用PET的合成原料。目前，生物降解技术因其环境友好特性已逐渐成为研究热点。长久以来科学界一直在寻找有效的PET生物降解方法，现已经从酯酶(esterase)、脂肪酶(lipase)和角质酶(cutinase)等水解酶中发现了它们对PET降解的活力，证明了PET生物降解的可能性。例如来自Thermobifida fusca的TfH和TfH BTA-2水解酶，来自植物堆肥中的LC角质酶，以及来自Candida antarctica的脂肪酶B等，已证实对PET有降解活性。但由于PET不是这些酶的主要反应物，且这些酶都需要在高温下才能发挥最大的酶活性，因此造成上述酶的工业应用价值较低。

近期，日本的研究团队报道了一种可以“吃塑料”的神奇细菌大阪堺菌(Ideonellasakaiensis)，此细菌能分泌一种新型的PET水解酶(IsPETase)，在30℃条件下就能将PET分解成小片段的单(2-羟乙基)对苯二甲酸(mono(2-hydroxyethyl)terephthalic acid,MHET)，并将分解后的产物运入体内进一步“消化”，最终转化为对苯二甲酸(terephthalicacid,TPA)和乙二醇(ethylene glycol,EG)这两种结构相对简单的PET组成分子。虽然IsPETase水解PET的活性高于其它酯酶或角质酶，具有潜在的工业应用价值，但其水解PET效率还是较低，离商业化应用还有些差距。因此科学家们后续也做了很多的研究，不论是从大自然中筛选新基因或是改造现有的酶，都是为了找到更适合于工业应用的PET水解酶。在许多改造酶的策略中，根据酶蛋白结构分析，进而逻辑性地设计突变点来提升酶活性是改造酶的主要方法之一。酶活性愈高就代表成本的下降以及利润的提高，也较有利于工业应用。

因此，本发明欲进一步改造现有的酶，以增加对PET的水解活性，进而提升PET水解酶在产业上的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于利用结构分析及点突变技术来改造现有的酶，以增加对PET的水解活性，进而提升PET水解酶在产业上的应用价值。

为达上述目的，本发明的一个较广义的实施方案提供一种PET水解酶，其氨基酸序列为将SEQ ID NO.4第344个位置及第348个位置或与SEQ ID NO.4具有80％以上序列同源性的序列中对应位置的组氨酸及苯丙氨酸分别突变成丝氨酸及异亮氨酸的序列，所述序列同源性优选地为85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％。

在一个实施方案中，SEQ ID NO.4的基因是从伯克氏菌(Burkholderialesbacterium)所分离出来的角质酶基因BurPL。

在一个实施方案中，PET水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

在一个实施方案中，PET水解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO.7具有80％以上序列同源性，例如所述序列同源性优选地为85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％。

本发明的另一个较广义的实施方案提供一种编码如前述的PET水解酶的核酸分子。

本发明的又一个较广义的实施方案提供一种重组质粒，其包含如前述的核酸分子。

附图说明

图1显示IsPETase的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图2显示BurPL的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图3显示点突变技术所采用的引物序列。

图4显示BurPL DM的核苷酸序列以及氨基酸序列。

图5显示PET降解产物的HPLC检测结果。

图6显示标准品TPA的HPLC检测图。

图7显示标准品MHET的HPLC检测图。

图8显示IsPETase、BurPL及BurPL DM的PET降解活性分析。

具体实施方案

体现本发明特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的方案上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图式在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。

本发明中的角质酶基因BurPL是从伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)RIFCSPLWO2菌株分离出来的，其蛋白序列与IsPETase有63.1％同源性。BurPL蛋白也具有水解PET的活性，且可以大量地表达在工业上常用的毕赤酵母中，拥有潜在的工业应用价值。为了进一步将角质酶BurPL改造成高活性PET水解酶，本发明利用X-ray结晶学技术解析了BurPL的蛋白三级结构，并阐明其详细的结构信息，接着针对其活性区或具有关键性特性的位点进行改造。经由结构分析及跟其它相似结构比对后，挑选位于活性区附近的第344位置的组氨酸(His344)及第348位置的苯丙氨酸(Phe348)，并分别将其突变成丝氨酸(Serine)及异亮氨酸(Isoleucine)。本发明成功地提高其PET水解活性，也成功将此角质酶经由理性设计方法改造成高活性的PET水解酶，提升其工业应用价值。以下将详述本发明的角质酶改造方法及其所得到的具提升活性的PET水解酶。

首先，通过全基因合成的方法获得IsPETase及BurPL基因，并利用NcoI及XhoI限制酶分别将基因构建到pET32a载体，接着将该重组质粒转化到感受态细胞(competent cell)中，得到IsPETase及BurPL重组质粒。

图1即显示IsPETase的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，IsPETase基因包含870个碱基(核苷酸序列以SEQ ID NO.1标示)，且编码290个氨基酸(氨基酸序列以SEQ ID NO.2标示)。图2则显示BurPL的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，BurPL基因包含1278个碱基(核苷酸序列以SEQ ID NO.3标示)，且编码426个氨基酸(氨基酸序列以SEQ ID NO.4标示)。

为了增加PET水解活性，本发明利用点突变技术(site-directed mutagenesis)，以野生型BurPL基因做为模版进行聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)，当中所用的突变引物(SEQ ID NO.5)列于图3。原始的模板DNA则利用DpnI移除掉。接着把突变质粒送入大肠杆菌感受态细胞中，并藉由DNA测序确认突变基因。在此，本发明构建了一个突变株H344S/F348I，意指为BurPL的第344个位置的组氨酸突变成丝氨酸(H344S)，且BurPL的第348个位置的苯丙氨酸突变成异亮氨酸(F348I)。本发明将此双突变基因命名为BurPLDM，图4即显示BurPL DM的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，BurPL DM基因包含1278个碱基(核苷酸序列以SEQ ID NO.6标示)，且编码426个氨基酸(氨基酸序列以SEQ ID NO.7标示)。

接着在大肠杆菌中表达及纯化蛋白。首先，将构建好的上述重组质粒IsPETase、BurPL及BurPL DM经由转化作用转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含有100μg/ml氨苄西林的LB培养盘中筛选菌株。接着把菌株接种到5ml LB内培养过夜，再放大至200ml LB培养，最终放大到10L的LB培养基。在OD值到达0.6至0.8时，将培养温度冷却至16℃后加入0.3mM的IPTG诱导酶蛋白的大量表达。在经过16小时的蛋白质诱导表达之后，将菌液以6000rpm离心10分钟将细胞收集下来。接着用缓冲液(25mM tris，150mM NaCl，pH7.5)将菌体重悬，并利用细胞破碎机进行破菌，再以16000rpm离心30分钟，并收集上清液用以下一步的纯化。为了得到高纯度的酶蛋白，本发明藉由快速蛋白质液相层析仪(fast proteinliquid chromatography,FPLC)依序利用镍离子层析柱洗脱目的蛋白，接着将目的蛋白透析在5L(25mM tris,150mM NaCl,pH 7.5)中4℃透析过夜，同时加入200微升TEV蛋白酶进行酶切来去掉蛋白上的His标签。酶切过后的目的蛋白再过一次镍柱，收集流穿中不含His标签的目的蛋白。最后将纯化的目的蛋白浓缩在50mM Tris-HCl,pH 8.0缓冲液中并保存于-80℃。

为比对IsPETase、BurPL及BurPL DM活性的差异，本发明进一步测定三种酶水解PET的活性。PET水解酶的活性测试方法如下所述：每个反应的混合物(1mL)处于50mM甘氨酸,pH 9.0的缓冲液中，包括底物3mg/ml PET粉末和10μL酶(1mg/mL)。混合后置于震荡金属浴30℃、800rpm反应18小时，每个反应均做3次重复。反应后混合物先通过热休克(80℃,10min)来终止酶反应，然后以12000rpm离心10分钟，取上清反应液通过0.22μm滤膜进行过滤。接着各组反应通过高效液相色谱(HPLC)进行产物测定与分析，其分析柱为InertSustain C18 column(4.6×250mm,5μm)，流动相为甲醇/磷酸盐(20mM,pH 2.5)，流速1ml/min，检测波长254nm，洗脱条件为0-15min，甲醇线性梯度为35-70％。

图5显示PET降解产物的HPLC检测结果，其中，a为IsPETase的HPLC检测图，b为BurPL的HPLC检测图，c为BurPL DM的HPLC检测图。如图5所示，各液相检测皆于保留时间8.18min和保留时间8.97min分别出峰。其中，保留时间8.18min的出峰时间与标准品TPA(图6)一致，因此，保留时间8.18min的物质为TPA；而保留时间8.97min的出峰时间则与标准品MHET(图7)一致，因此，保留时间8.97min的物质为MHET。接着通过比较IsPETase、BurPL及BurPL DM水解产物MHET和TPA的峰面积，来计算活性差异。

从图5数据显示，IsPETase、BurPL及BurPL DM水解PET的产物均有MHET和TPA。因此，本发明将IsPETase的水解产物MHET或TPA的峰面积值当作100％，比较BurPL及BurPL DM水解产物MHET或TPA的峰面积，作为相对酶活。图8显示IsPETase、BurPL及BurPL DM的PET降解活性分析。如图8所示，在不同反应天数下，BurPL DM对PET降解活性均高于IsPETase及BurPL。在反应第二天时，野生型BurPL的MHET及TPA产量仅为IsPETase的43.6％及43.2％，而经由H344S/F348I双突变位点改造后，BurPL DM其MHET及TPA产量分别为IsPETase的113.5％及204.2％。在反应第三天时，BurPL DM的MHET及TPA产量为IsPETase的142.6％及351.1％，而野生型BurPL的MHET及TPA产量为IsPETase的51.8％及46.3％。另一方面，在反应第三天时，BurPL DM其MHET及TPA产量为野生型BurPL的275.1％及758.1％，其水解PET活性明显高于野生型BurPL。因此，本发明藉由结构分析与理性设计改造，成功地将角质酶BurPL改造成高活性的PET水解酶BurPL DM，也提升了BurPL DM在PET降解产业上的应用价值。

综上所述，为了将角质酶BurPL改造成高活性PET水解酶，本发明利用结构分析及点突变技术来改造BurPL，所改造的突变株H344S/F348I(SEQ ID NO.7)成功地提高其PET水解活性，从而得到具提升活性的PET水解酶，进而提升PET水解酶的工业应用价值。又，酶在不同物种间通常存在一些变异，但仍具有相同功能，且彼此间大多具有80％或90％以上的氨基酸序列同源性，显见要保有酶功能，亦可容许有部分氨基酸序列的变异。换言之，本发明改造的PET水解酶序列当不仅限于SEQ ID NO.7，亦可包含与SEQ ID NO.7具有80％以上序列同源性的序列，如与SEQ ID NO.7具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％序列同源性的序列，且在对应位置上进行相同的改造。

纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由熟悉本技艺人士任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如所附权利要求书所欲保护者。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 具提升活性的PET水解酶

<130> 2011753TW01

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> 大阪堺菌(Ideonella sakaiensis)

<400> 1

atgaactttc cccgcgcttc ccgcctgatg caggccgccg ttctcggcgg gctgatggcc 60

gtgtcggccg ccgccaccgc ccagaccaac ccatacgcta gaggaccaaa ccctactgct 120

gcttcattgg aggcttccgc tggtccattc actgttagat cctttactgt ttcaagacca 180

tccggatacg gagctggaac tgtttactac ccaactaacg cgggtggaac tgttggagct 240

attgctattg ttccaggtta cactgctaga caatcctcaa ttaagtggtg gggacctaga 300

ttggcttcac atggttttgt tgttattact attgatacta actctacttt ggatcaacca 360

tcatccagat catctcaaca aatggctgct ttgagacaag ttgcttcctt gaacggtact 420

tcctcttcac ctatctatgg caaagttgat actgctagaa tgggtgttat gggatggtct 480

atgggtggcg ggggttcctt gatttcagct gctaacaacc catcattgaa ggctgctgct 540

ccacaagctc cttgggattc ctccactaac ttttcatccg ttactgttcc tactttgatt 600

tttgcttgtg aaaacgattc tattgctcca gttaactctt ccgctttgcc aatatacgat 660

tctatgtcaa gaaacgctaa gcaatttttg gaaattaacg gaggatcaca ttcatgtgct 720

aactcaggaa actcaaacca ggctttgatt ggcaaaaagg gagttgcttg gatgaagcgc 780

tttatggata acgatactag atactccact tttgcttgtg aaaacccaaa ctccactaga 840

gtttctgatt ttagaactgc taactgttct 870

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 大阪堺菌(Ideonella sakaiensis)

<400> 2

Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly

1 5 10 15

Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr

20 25 30

Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly

35 40 45

Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly

50 55 60

Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala

65 70 75 80

Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp

85 90 95

Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp

100 105 110

Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met

115 120 125

Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro

130 135 140

Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser

145 150 155 160

Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu

165 170 175

Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser

180 185 190

Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile

195 200 205

Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg

210 215 220

Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala

225 230 235 240

Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala

245 250 255

Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala

260 265 270

Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn

275 280 285

Cys Ser

290

<210> 3

<211> 1278

<212> DNA

<213> 伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)

<400> 3

atggccgtgg gttctatgtt actgagcatg gcagcacagg cccaggttgt ggtgtttgaa 60

gaaaccttta gtacgggctt aggcaaattt accgcagccg gtagcgttgt gacatcttct 120

ggtgcagctc gtctggatgg ctgttatggc tgtaccgatg gttctatcac gagcaccgcg 180

atctctacag ttgattttac gggcttacgc ctgtcatttg atcgcgtgac ctcaggcctg 240

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gaaagtattc gtaccgcgtc aggtcgtgtg acgtttaatc tgccgacaag tgcggaaaat 360

cagagcggtc tgcgcctgcg ctttcgcatt aatgctagtc tgagttcaga aacgtataca 420

gttgataata tccgcttaga aggtacaagc ggtagtggtg gcggcacgac caacccattt 480

gaaaagggac ctgatccaac taagactatg ttggaagcct caactggacc atttacttac 540

actactacta ctgtttcatc cactactgct tccggttaca gacaaggtac tatttaccat 600

cctactaacg ttactggacc atttgctgct gttgctgttg ttccaggata cttggcttct 660

caatcttcta ttaactggtg gggtcctaga ttggcttctc atggttttgt tgttattact 720

attgatacta actccacttc cgatcaacca ccatcgagag ctactcaatt gatggctgct 780

ttgaaccaat taaagacttt ttcaaacact tcttcacatc caatttacag aaaggttgat 840

ccaaacagat tgggagttat gggatggtct atgggaggag gtggtacttt gattgctgct 900

agagataacc caactttgaa ggctgctatt ccttttgctc cttggaactc ctccactaac 960

ttttccactg tttcagttcc tactttgatt attgcttgtg aatccgattc cactgctcca 1020

gttaactcac atgcttcccc tttttacaac tccttgccat caactactaa gaaggcttac 1080

ttggaaatga acaacggatc acattcatgt gctaactcag gaaactctaa cgctggtttg 1140

attggtaagt acggagtttc ttggatgaag agatttatgg ataacgatac tagattttca 1200

ccttacttgt gtggcgcgcc tcatcaagct gatttgtcat tgactgctat tgatgaatac 1260

agagaaaact gtccatac 1278

<210> 4

<211> 426

<212> PRT

<213> 伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)

<400> 4

Met Ala Val Gly Ser Met Leu Leu Ser Met Ala Ala Gln Ala Gln Val

1 5 10 15

Val Val Phe Glu Glu Thr Phe Ser Thr Gly Leu Gly Lys Phe Thr Ala

20 25 30

Ala Gly Ser Val Val Thr Ser Ser Gly Ala Ala Arg Leu Asp Gly Cys

35 40 45

Tyr Gly Cys Thr Asp Gly Ser Ile Thr Ser Thr Ala Ile Ser Thr Val

50 55 60

Asp Phe Thr Gly Leu Arg Leu Ser Phe Asp Arg Val Thr Ser Gly Leu

65 70 75 80

Asp Ser Gly Glu Ala Gly Ile Ala Glu Phe Ser Thr Asn Gly Ser Thr

85 90 95

Tyr Thr Ala Val Glu Ser Ile Arg Thr Ala Ser Gly Arg Val Thr Phe

100 105 110

Asn Leu Pro Thr Ser Ala Glu Asn Gln Ser Gly Leu Arg Leu Arg Phe

115 120 125

Arg Ile Asn Ala Ser Leu Ser Ser Glu Thr Tyr Thr Val Asp Asn Ile

130 135 140

Arg Leu Glu Gly Thr Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Thr Asn Pro Phe

145 150 155 160

Glu Lys Gly Pro Asp Pro Thr Lys Thr Met Leu Glu Ala Ser Thr Gly

165 170 175

Pro Phe Thr Tyr Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala Ser Gly

180 185 190

Tyr Arg Gln Gly Thr Ile Tyr His Pro Thr Asn Val Thr Gly Pro Phe

195 200 205

Ala Ala Val Ala Val Val Pro Gly Tyr Leu Ala Ser Gln Ser Ser Ile

210 215 220

Asn Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr

225 230 235 240

Ile Asp Thr Asn Ser Thr Ser Asp Gln Pro Pro Ser Arg Ala Thr Gln

245 250 255

Leu Met Ala Ala Leu Asn Gln Leu Lys Thr Phe Ser Asn Thr Ser Ser

260 265 270

His Pro Ile Tyr Arg Lys Val Asp Pro Asn Arg Leu Gly Val Met Gly

275 280 285

Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Ile Ala Ala Arg Asp Asn Pro

290 295 300

Thr Leu Lys Ala Ala Ile Pro Phe Ala Pro Trp Asn Ser Ser Thr Asn

305 310 315 320

Phe Ser Thr Val Ser Val Pro Thr Leu Ile Ile Ala Cys Glu Ser Asp

325 330 335

Ser Thr Ala Pro Val Asn Ser His Ala Ser Pro Phe Tyr Asn Ser Leu

340 345 350

Pro Ser Thr Thr Lys Lys Ala Tyr Leu Glu Met Asn Asn Gly Ser His

355 360 365

Ser Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asn Ala Gly Leu Ile Gly Lys Tyr

370 375 380

Gly Val Ser Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Phe Ser

385 390 395 400

Pro Tyr Leu Cys Gly Ala Pro His Gln Ala Asp Leu Ser Leu Thr Ala

405 410 415

Ile Asp Glu Tyr Arg Glu Asn Cys Pro Tyr

420 425

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

ccagttaact catccgcttc ccctatctac aactccttgc cat 43

<210> 6

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变体

<400> 6

atggccgtgg gttctatgtt actgagcatg gcagcacagg cccaggttgt ggtgtttgaa 60

gaaaccttta gtacgggctt aggcaaattt accgcagccg gtagcgttgt gacatcttct 120

ggtgcagctc gtctggatgg ctgttatggc tgtaccgatg gttctatcac gagcaccgcg 180

atctctacag ttgattttac gggcttacgc ctgtcatttg atcgcgtgac ctcaggcctg 240

gatagcggcg aagccggtat tgctgaattt tcaaccaatg gctcaacata tacggcagtg 300

gaaagtattc gtaccgcgtc aggtcgtgtg acgtttaatc tgccgacaag tgcggaaaat 360

cagagcggtc tgcgcctgcg ctttcgcatt aatgctagtc tgagttcaga aacgtataca 420

gttgataata tccgcttaga aggtacaagc ggtagtggtg gcggcacgac caacccattt 480

gaaaagggac ctgatccaac taagactatg ttggaagcct caactggacc atttacttac 540

actactacta ctgtttcatc cactactgct tccggttaca gacaaggtac tatttaccat 600

cctactaacg ttactggacc atttgctgct gttgctgttg ttccaggata cttggcttct 660

caatcttcta ttaactggtg gggtcctaga ttggcttctc atggttttgt tgttattact 720

attgatacta actccacttc cgatcaacca ccatcgagag ctactcaatt gatggctgct 780

ttgaaccaat taaagacttt ttcaaacact tcttcacatc caatttacag aaaggttgat 840

ccaaacagat tgggagttat gggatggtct atgggaggag gtggtacttt gattgctgct 900

agagataacc caactttgaa ggctgctatt ccttttgctc cttggaactc ctccactaac 960

ttttccactg tttcagttcc tactttgatt attgcttgtg aatccgattc cactgctcca 1020

gttaactcat ccgcttcccc tatctacaac tccttgccat caactactaa gaaggcttac 1080

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agagaaaact gtccatac 1278

<210> 7

<211> 426

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变体

<400> 7

Met Ala Val Gly Ser Met Leu Leu Ser Met Ala Ala Gln Ala Gln Val

1 5 10 15

Val Val Phe Glu Glu Thr Phe Ser Thr Gly Leu Gly Lys Phe Thr Ala

20 25 30

Ala Gly Ser Val Val Thr Ser Ser Gly Ala Ala Arg Leu Asp Gly Cys

35 40 45

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50 55 60

Asp Phe Thr Gly Leu Arg Leu Ser Phe Asp Arg Val Thr Ser Gly Leu

65 70 75 80

Asp Ser Gly Glu Ala Gly Ile Ala Glu Phe Ser Thr Asn Gly Ser Thr

85 90 95

Tyr Thr Ala Val Glu Ser Ile Arg Thr Ala Ser Gly Arg Val Thr Phe

100 105 110

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115 120 125

Arg Ile Asn Ala Ser Leu Ser Ser Glu Thr Tyr Thr Val Asp Asn Ile

130 135 140

Arg Leu Glu Gly Thr Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Thr Asn Pro Phe

145 150 155 160

Glu Lys Gly Pro Asp Pro Thr Lys Thr Met Leu Glu Ala Ser Thr Gly

165 170 175

Pro Phe Thr Tyr Thr Thr Thr Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala Ser Gly

180 185 190

Tyr Arg Gln Gly Thr Ile Tyr His Pro Thr Asn Val Thr Gly Pro Phe

195 200 205

Ala Ala Val Ala Val Val Pro Gly Tyr Leu Ala Ser Gln Ser Ser Ile

210 215 220

Asn Trp Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr

225 230 235 240

Ile Asp Thr Asn Ser Thr Ser Asp Gln Pro Pro Ser Arg Ala Thr Gln

245 250 255

Leu Met Ala Ala Leu Asn Gln Leu Lys Thr Phe Ser Asn Thr Ser Ser

260 265 270

His Pro Ile Tyr Arg Lys Val Asp Pro Asn Arg Leu Gly Val Met Gly

275 280 285

Trp Ser Met Gly Gly Gly Gly Thr Leu Ile Ala Ala Arg Asp Asn Pro

290 295 300

Thr Leu Lys Ala Ala Ile Pro Phe Ala Pro Trp Asn Ser Ser Thr Asn

305 310 315 320

Phe Ser Thr Val Ser Val Pro Thr Leu Ile Ile Ala Cys Glu Ser Asp

325 330 335

Ser Thr Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Ser Pro Ile Tyr Asn Ser Leu

340 345 350

Pro Ser Thr Thr Lys Lys Ala Tyr Leu Glu Met Asn Asn Gly Ser His

355 360 365

Ser Cys Ala Asn Ser Gly Asn Ser Asn Ala Gly Leu Ile Gly Lys Tyr

370 375 380

Gly Val Ser Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Phe Ser

385 390 395 400

Pro Tyr Leu Cys Gly Ala Pro His Gln Ala Asp Leu Ser Leu Thr Ala

405 410 415

Ile Asp Glu Tyr Arg Glu Asn Cys Pro Tyr

420 425

Claims (5)

1.一种PET水解酶，其氨基酸序列为将SEQ ID NO.4第344个位置及第348个位置的组氨酸及苯丙氨酸分别突变成丝氨酸及异亮氨酸的序列。

2.如权利要求1所述的PET水解酶，其中SEQ ID NO.4的基因是从伯克氏菌(Burkholderiales bacterium)所分离出来的角质酶基因BurPL。

3.如权利要求1所述的PET水解酶，其中该PET水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种编码如权利要求1所述的PET水解酶的核酸分子。

5.一种重组质粒，其包含如权利要求4所述的核酸分子。

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