JP7260468B6 - 新規エステラーゼ及びその使用 - Google Patents
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Description
エステラーゼは、ポリエステルをはじめとする様々なポリマーの加水分解を触媒することができる。この脈絡において、エステラーゼは、例えば、食器洗浄及び洗濯に適用するための洗浄剤として、バイオマス及び食品を加工するための分解酵素として、環境汚染物質の解毒における又は繊維工業におけるポリエステル織物の処理のための生体触媒としてなどの、多くの工業的適用において有望な効果を示している。同じように、ポリエチレンテレフタラート(PET)を加水分解するための分解酵素としてのエステラーゼの使用は、特に関心が高い。実際に、PETは、数多くの技術分野において、例えば、服、カーペットの製造などにおいて、あるいは包装又は自動車用プラスチック若しくは他のパーツの製造のための熱硬化性樹脂の形で使用され、埋立地におけるPETの蓄積は、増加しつつあるエコロジー的問題となっている。
本発明は、親エステラーゼ又は野生型エステラーゼと比較して、向上した熱安定性を示す新規なエステラーゼ変異体を提供する。これらのエステラーゼは、プラスチック材料及び製品、例えばPETを含有しているプラスチック材料及び製品を分解するためのプロセスにおいて特に有用である。より特定すると、本発明は、Sulaiman et al., Appl Environ Microbiol. 2012 Marに記載のメタゲノム解析から導かれたクチナーゼのアミノ酸配列のアミノ酸36~293、又はスイスプロットのG9BY57に参照されたアミノ酸配列のアミノ酸36~293に対応する、配列番号1に示されているようなアミノ酸配列を有する、エステラーゼ変異体を提供する。
-少なくとも1つの追加のジスルフィド架橋;及び/又は
-少なくとも1つの追加の塩橋;及び/又は
-エステラーゼの空隙の溶媒排除空洞に位置するアミノ酸残基の少なくとも1つの突然変異;並びに/あるいは
-少なくとも1つのN末端及び/又はC末端アミノ酸残基の抑制
を含み得る。
(a)エステラーゼをコードしている核酸を発現するに適した条件下で、本発明に記載の宿主細胞を培養する工程;及び場合により、
(b)細胞培養から該エステラーゼを回収する工程
を含む、エステラーゼを生成する方法を提供することである。
(a)プラスチック製品を、本発明に記載のエステラーゼ又は宿主細胞と接触させることにより、プラスチック製品を分解する工程;及び場合により
(b)モノマー及び/又はオリゴマーを回収する工程
を含む、少なくとも1つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解する方法にも関する。
定義
本開示は、以下の定義への参照によって最善に理解されるだろう。
本発明は、改善された熱安定性を有する新規エステラーゼを提供する。より特定すると、本発明者らは、工業的プロセスに使用するための優れた特性を有する新規酵素の設計を可能とする、高温における、有利には50℃を超える温度におけるエステラーゼの安定性を改善するための様々な方法を開発した。
(i)G53, L104, L107, L119, A121, L124;
(ii)I54, M56, L70, L74, A127, V150, L152, T221, M225;
(iii)V150, L152, L168, V170, V200, T221 ;
(iv)P196, V198, W224, T252, N253, H256 ;
(v)V219, Y220, S223, L239
本発明のさらなる目的は、配列番号1のエステラーゼと比較して、向上した熱安定性及び向上したポリエステル分解活性の両方を示す新規エステラーゼを提供することである。
T61M, Y92G/P, F208W, Y92P + F208W, 及び F208W + V170Iから選択された少なくとも1つの置換を含み、配列番号1のエステラーゼと比較して向上した熱安定性及び向上した活性の両方を示す。
F208W + D203C + S248C 及び F208I + D203C + S248Cから選択された少なくとも置換(群)を含み、配列番号1のエステラーゼと比較して向上した熱安定性及び向上した活性の両方を示す。
本発明の目的は、エステラーゼ活性を有する新規酵素を提供することである。特定の実施態様では、本発明の酵素はさらに、クチナーゼ活性を示す。
本発明のさらなる目的は、上記に定義されているようなエステラーゼをコードしている核酸を提供することである。
本発明の別の目的は、エステラーゼをコードしている核酸を発現させる工程及び場合により該エステラーゼを回収する工程を含む、本発明のエステラーゼ変異体を生成する方法を提供することである。
(a)本発明のエステラーゼをコードしている核酸を含む宿主細胞を、該核酸を発現するに適した条件下で培養する工程;及び場合により
(b)該エステラーゼを細胞培養から回収する工程
を含む。
本発明のさらなる目的は、本発明のエステラーゼ又は宿主細胞を含む組成物を提供することである。本発明の脈絡において、「組成物」という用語は、本発明のエステラーゼをが含む任意の種類の組成物を包含する。特定の実施態様では、エステラーゼは、単離された形態又は少なくとも部分的に精製された形態である。
本発明のさらなる目的は、ポリエステルから作製されるか又は含有しているプラスチック製品などのポリエステル含有材料を好気的及び/又は嫌気的条件で分解するために、並びに/あるいはリサイクルするために、本発明のエステラーゼを使用する方法を提供することである。本発明のエステラーゼ変異体は、PETを含むプラスチック製品を分解するのに特に有用である。
実施例1-エステラーゼの構築、発現、及び精製
-構築
エステラーゼ変異体は、プラスミド構築物pET26b-LCC-Hisを使用して作製された。このプラスミドは、NdeI制限酵素部位とXhoI制限酵素部位との間に、エシェリヒア・コリにおける発現のために最適化された、配列番号1のエステラーゼをコードしている遺伝子をクローニングすることからなる。エステラーゼ変異体を作製するために、2つの部位特異的突然変異誘発キットが業者の推奨に従って使用された:アジレント社(サンタクララ、カリフォルニア州、米国)製のQuikChange II Site-Directed Mutagenesisキット及びQuikChange Lightning Multi Site-Directed。
Stellar(商標)株(クロンテック社、カリフォルニア州、米国)及びE.coli One Shot(登録商標)BL21 DE3(ライフテクノロジーズ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)が、50mLのLB-Miller培地又はZYM自己誘導性培地中でのクローニング及び組換え発現を実施するために成功裡に使用された(Studier et al., 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234)。LB-Miller培地中での誘導は、0.5mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG、ユーロメディックス社、ゾウフェルヴァイヤースハイム、フランス)を用いて16℃で実施された。AvantiJ-26XP遠心機(ベックマンコールター社、ブレア、米国)での遠心分離(8000rpm、10℃で20分間)によって培養を停止した。細胞を、20mLのTalon緩衝液(トリス-HCl20mM、NaCl 300mM、pH8)に懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、30%の振幅で(2秒オン、1秒OFFのサイクル)FB705超音波発生器(フィシャーブランド社、イルキルシュ、フランス)によって、2分間、超音波処理にかけた。次いで、遠心分離工程を実現した:エッペンドルフ遠心機で11000rpmで10℃で30分間。可溶性画分を回収し、アフィニティクロマトグラフィーにかけた。この精製工程は、Talon(登録商標)金属アフィニティ樹脂(クロンテック社、CA州、米国)を用いて完了させた。タンパク質の溶出は、イミダゾールの補充されたTalon緩衝液の勾配を用いて実施された。精製されたタンパク質を、Talon緩衝液に対して透析し、その後、製造業者の説明書(ライフサイエンスバイオラッド社、フランス)に従ってバイオラッドタンパク質アッセイを使用して定量し、+4℃で保存した。
エステラーゼ変異体の熱安定性を決定し、配列番号1のエステラーゼの熱安定性と比較した。
(1)溶液中のタンパク質の円二色性;
(2)所与の温度、時間、及び緩衝液の条件においてタンパク質をインキュベートした後の残留エステラーゼ活性;
(3)所与の温度、時間、及び緩衝液の条件においてタンパク質をインキュベートした後の残留ポリエステル脱重合活性;
(4)所与の温度、時間、及び緩衝液の条件においてタンパク質をインキュベートした後の、寒天プレートに分散させた固体ポリエステル化合物(例えばPET又はPBAT又は類似体)を分解する能力;
(5)所与の温度、緩衝液、タンパク質濃度、及びポリエステル濃度の条件において複数回のポリエステル脱重合アッセイを実施する能力;
(6)示差走査蛍光定量法(DSF)。
配列番号1のエステラーゼと本発明のエステラーゼ変異体の融点(Tm)を比較するためにJasco815機器(イーストン社、米国)を用いて円二色性(CD)を実施した。Tmは、タンパク質の50%が変性する温度に相当する。
配列番号1のエステラーゼ又はエステラーゼ変異体の(Talon緩衝液中)40mg/L溶液 1mLを、様々な温度(65、70、75、80、及び90℃)で10日間インキュベートした。定期的に試料を採取し、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で1~500倍に希釈し、パラニトロフェノール-ブチレート(pNP-B)アッセイを実現した。試料 20μLを、0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)175μL及びpNP-Bの2-メチル-2-ブタノール溶液(40mM)5μLと混合した。酵素反応を撹拌下で30℃で15分間実施し、405nmにおける吸光度をマイクロプレート分光光度計(Versamax、モレキュラーデバイス社、サニーベール、CA州、米国)によって取得した。pNP-B加水分解活性(初期速度は、1分あたりのpNPBのμmolで表現される)を、加水分解曲線の直線部分における遊離したパラニトロフェノールについての標準曲線を使用して決定した。所与の温度における酵素の半減期は、初期活性の50%を消失するのに必要な時間に相当する。
粉砕した結晶プリフォームを液体窒素に浸漬し、Ultra Centrifugal Mill ZM200システムを使用して500μm未満のサイズの微粉末へと微粒子化した。次いで、得られた粉末をふるいにかけた。250μm~500μmのサイズの画分のみを、脱重合試験のために使用した。この画分の結晶性を、10℃/分の加熱速度でMettler Toledo DSC3を使用して11.5%で測定した。
酵素調製物 20μLを、PETを含有している寒天プレートに作られたウェルに沈着させた。寒天プレートの調製は、HFIPに可溶化させたPET 500mgを可溶化することによって実現し、この培地を250mLの水溶液に注いだ。52℃でHFIPを蒸発させた後、溶液を、3%寒天を含有している0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH8)と混合(v/v)した。約30mLの混合物を使用して、各々のOmniTrayを調製し、4℃で保存する。
エステラーゼが連続回のポリエステルの脱重合アッセイを実施する能力を、酵素反応器において評価した。Minibio 500バイオリアクター(アプリコン・バイオテクノロジー社、デルフト、オランダ)を、無定形PET 3g、及びLC-エステラーゼ 3mgを含有している10mMリン酸カリウム緩衝液(pH8)100mLを用いて開始した。撹拌を、マリンインペラーを使用して250rpmに設定した。バイオリアクターは、外付けの水浴への浸漬によって65℃に温度制御された。pHは、3MのKOHの添加によって8に調節された。様々なパラメーター(pH、温度、撹拌、塩基の添加)を、BioXpertソフトウェアV2.95によりモニタリングした。無定形PET 1.8gを20時間毎に加えた。反応培地 500μLを定期的に試料採取した。
DSFを使用して、それらの融点(Tm)、すなわちタンパク質個体群の半分が折り畳まれていない温度を決定することによって、野生型タンパク質(配列番号1)及びその変異体の熱安定性を評価した。タンパク質試料を、14μM(0.4mg/mL)の濃度で調製し、20mMのトリスHCl(pH8.0)、300mMのNaClからなる緩衝液Aに保存した。SYPRO orange色素の5000倍のDMSO中ストック溶液をまず、水で250倍に希釈した。タンパク質試料を、白色透明の96ウェルのPCRプレート(バイオラッド社、製造番号HSP9601)に載せ、各ウェルは最終容量25μlを含有している。各ウェル中のタンパク質及びSYPRO orange色素の最終濃度は、それぞれ5μM(0.14mg/ml)及び10倍であった。1ウェルあたりに積載された容量は以下の通りであった:緩衝液A 15μL、0.4mg/mLのタンパク質溶液 9μL、及び250倍のSypro Orange希釈溶液 1μL。次いで、PCRプレートを、光学的品質のシールテープで封をし、室温で2000rpmで1分間遠心機にかけた。次いで、DSF実験を、450/490励起フィルター及び560/580発光フィルターを使用するために設定されたCFX96リアルタイムPCRシステムを使用して行なった。試料を、1.1℃/分の速度で25℃から100℃まで加熱した。0.3℃毎に1回の蛍光測定を行なった。融点は、曲線をボルツマン式にあてはめることによって決定された。
PETに関する、本発明のエステラーゼ変異体の分解比活性を評価し、配列番号1のエステラーゼの分解比活性と比較した。
Claims (20)
- (i)配列番号1に示される完全長アミノ酸配列に対して少なくとも90%、95%、又は99%の同一性を有し、
(ii)D203+S248、N204及びS212から選択された位置(群)に配列番号1と比較して1つ以上のアミノ酸の置換を有し(ここでの位置は配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる)、
(iii)ポリエステル分解活性を有し、及び
(iv)配列番号1のエステラーゼと比較して向上した熱安定性を示す、
エステラーゼ変異体。 - 位置D203+S248に置換を含む、請求項1のエステラーゼ変異体。
- 置換D203C+S248Cの組合せを含む、請求項1のエステラーゼ変異体。
- さらにE173、L202、N204及びF208から選択された位置に少なくとも1つの置換(ここでの位置は、配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされる)を含む、請求項2又は3のエステラーゼ変異体。
- E173A/R、L202R、N204D及びF208Wから選択される少なくとも1つの置換を含む、請求項4のエステラーゼ変異体。
- さらにT61、Y92、及びV177から選択された位置に配列番号1と比較して1つ以上のアミノ酸置換(群)を含み、ここでの位置は配列番号1に示されるアミノ酸配列への参照によって番号付けされ、ここでの置換は、T61A/G、Y92A、及びV177Aとは異なる、請求項1~5のいずれか一項のエステラーゼ変異体。
- 置換が、V171I、Y92G、Y92P、Y92P+F208W及びT61Mから選択される、請求項6のエステラーゼ変異体。
- D203+S248+E173, D203+S248+F208,及びD203+S248+E173+N204+L202から選択された位置に置換を含む、請求項1~7のいずれか一項のエステラーゼ変異体。
- D203C+S248C+E173R,D203C+S248C+E173A,D203C+S248C+F208W D203C+S248C+F208I,F208W+D203C+S248C+E173A,F208I+D203C+S248C+E173A及びD203C+S248C+E173R+N204D+L202Rから選択された置換を含む、請求項1~8のいずれか一項のエステラーゼ変異体。
- 請求項1~9のいずれか一項のエステラーゼをコードしている核酸。
- 請求項10の核酸を含む発現カセット又はベクター。
- 請求項10の核酸又は請求項11の発現カセット若しくはベクターを含む宿主細胞。
- (a)エステラーゼをコードしている核酸を発現するに適した条件下で、請求項12に記載の宿主細胞を培養する工程;及び
(b)細胞培養から該エステラーゼを回収する工程
を含む、該エステラーゼを生成する方法。 - 請求項1~9のいずれか一項記載のエステラーゼ及び/又は請求項10記載の核酸、及び/又は請求項11記載の発現カセット若しくはベクター、及び/又は請求項12記載の宿主細胞若しくはその抽出物を含む、プラスチック製品を分解するための組成物。
- 1つ又はいくつかの賦形剤又は添加剤を含む、請求項14の組成物。
- (a)プラスチック製品を、請求項1~9のいずれか一項記載のエステラーゼ、又は請求項12記載の宿主細胞、又は請求項14記載の組成物と接触させることにより、プラスチック製品を分解する工程
を含む、少なくとも1つのポリエステルを含有しているプラスチック製品を分解する方法。 - さらに(b)モノマー及び/又はオリゴマーを回収する工程を含む、請求項16の方法。
- プラスチック製品が、ポリエチレンテレフタラート(PET)、ポリトリメチレンテレフタラート(PTT)、ポリブチレンテレフタラート(PBT)、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート(PEIT)、ポリ乳酸(PLA)、ポリヒドロキシアルカン酸(PHA)、ポリブチレンサクシネート(PBS)、ポリブチレンサクシネートアジペート(PBSA)、ポリブチレンアジペートテレフタラート(PBAT)、ポリエチレンフラノアート(PEF)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ(エチレンアジペート)(PEA)、ポリエチレンナフタラート(PEN)、及びこれらの材料のブレンド/混合物から選択された少なくとも1つのポリエステルを含む、請求項16の方法。
- プラスチック製品が、ポリエチレンテレフタラートを含む、請求項16の方法。
- 工程(a)が、50℃~90℃の温度で実施される、請求項16~19のいずれか一項の方法。
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