KR102298651B1 - 고온에서 PET 분해 활성을 갖는 PETase 변이체 - Google Patents

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Abstract

서열번호 1의 아미노산 서열에서 233번째 아미노산이 아스파라긴에서 시스테인으로 치환되고, 282번째 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환됨으로서 50℃ 이상의 고온에서도 안정성 및 PET 분해 활성이 증가한 PETase 변이체가 개시된다.

Description

고온에서 PET 분해 활성을 갖는 PETase 변이체{PETase Varient Having PET Decomposition Activity at High Temperature}
본 발명은 고온에서 PET 분해 활성을 가지는 PETase 변이체에 관한 것이다.
폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate; PET)는 보편적으로 생산 및 사용되는 플라스틱 중 하나이다. 지난 수십 년 동안 PET은 저렴한 가격, 가벼운 무게, 높은 가공성 및 생체 비활성으로 인하여 2015년에는 사용량이 전 세계적으로 3억 2천만톤에 이를 정도로 증가하였다. 그러나 PET은 자연적으로 분해되는 속도가 450년에 달할 정도로 매우 느리기 때문에 많은 양의 폐기물이 축적되고 있으며 2050년까지 축적된 폐기물의 양은 330억톤에 달할 것으로 예상되고 있다.
이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)는 PET을 분해하여 에너지원 및 탄소원으로 사용할 수 있는 균주로서, PET 가수분해 효소인 PETase 및 MHET(Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid) 가수분해 효소인 MHETase에 의해 PET을 분해한다. PETase는 PET을 단량체인 MHET으로 가수분해하며, MHETase는 MHET을 에틸렌글리콜(Ethylene glycol; EG) 및 테레프탈레이트(Terephthalate; TPA)로 분해한다.
A. Arkhireyeva & S. Hashemi에 따르면 PET의 기질적인 측면에서 분해 효율은 50℃ 이상의 높은 온도에서 증가할 수 있다.(Effect of temperature on fracture properties of an amorphous poly(ethylene terephthalate) (PET) film, Journal of Materials Science volume 37, pages3675-3683, 2002) 그러나 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)는 50℃ 이상의 온도에서 생존이 어려우며, 정제된 PETase 또한 50℃ 이상의 온도에서 활성이 크게 약화되는 문제가 있다. 따라서 50℃ 이상의 높은 온도에서도 PET 분해 활성을 가질 수 있는 PETase 변이체가 필요하다.
대한민국 특허공개공보 KR 10-2020-0017321 (2020.02.18)
KJ Kim et, Structural insight into molecular mechanism of poly(ethylene terephthalate) degradation, Nature Communications 9, 382, 2018 A. Arkhireyeva & S. Hashemi, Effect of temperature on fracture properties of an amorphous poly(ethylene terephthalate) (PET) film, Journal of Materials Science volume 37, pages3675-3683, 2002
일 구체예에 따르면 서열번호 1의 아미노산 서열에서 233번째 아미노산이 아스파라긴에서 시스테인으로 치환되고, 282번째 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환됨으로서 50℃ 내지 70℃ 온도에서 안정성 및 PET 분해 활성이 우수한 PETase 변이체를 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 233번째 아미노산이 아스파라긴에서 시스테인으로 치환되고, 282번째 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 PETase 변이체를 제공한다.
도 1에 따르면, 서열번호 1의 233번째 아미노산이 아스파라긴에서 시스테인으로 치환되고(N233C), 282번째 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환(S282C)됨으로서 N233C와 S282C가 이황화 결합(Disulfide bond)를 형성할 수 있다. 또한 일 실시예에 따르면 N233C및 S282C 위치에서 이황화 결합이 형성된 PETase 변이체는 고온에서도 열안정성 및 PET 분해 활성이 크게 증가함이 확인되었다.
일 구체예에 따르면, 상기 PETase 변이체는 서열번호 1의 204번째 아미노산이 글루탐산에서 아르기닌으로 치환되고, 서열번호 1의 234번째 아미노산이 글리신에서 아스파르트산로 치환된 것일 수 있다.
도 1에 따르면, 서열번호 1의204번째 아미노산이 글루탐산에서 아르기닌으로 치환되고(E204R), 234번째 아미노산이 글리신에서 아스파르트산로 치환되면(G234D) E204R 및 G234D가 염다리(salt bridge)를 형성할 수 있다. 또한 일 실시예에 따르면 E204R 및 G234D 위치에서 염다리가 형성된 PETase 변이체는 50 내지 70℃의 고온에서도 열안정성 및 PET 분해 활성이 더욱 증가함이 확인되었다.
일 구체예에 따르면, 상기 PETase 변이체는 하기 (a) 내지 (d)의 아미노산 치환 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 상기 (a) 내지 (d)의 아미노산 치환은 (a) 서열번호 1의 121번째 아미노산이 세린에서 글루탐산으로 치환(S121E); (b) 서열번호 1의 186번째 아미노산이 아스파르트산에서 히스티딘으로 치환(D186H); (c) 서열번호 1의 242번째 아미노산이 세린에서 트레오닌으로 치환(S242T); (d) 서열번호 1의 246번째 아미노산이 아스파라긴에서 아스파르트산으로 치환(N246D)이다.
2020.02.18에 공개된 대한민국 공개공보 10-2020-0017321에 따르면 상기 (a)의 S121E 및 (b)의 D186H 아미노산 치환은 PETase의 활성 증가 및 열안정성 증가 효과가 있음이 개시되어 있다. 구체적으로 β6-β7 연결 루프와 확장된 서브사이트 IIc에 의해 열안정성과 효소 활성이 모두 증가하는 상승 효과(synergetic effect)를 가질 수 있다.
또한 도 2에 따르면, PETase S242T 변이체 및 PETase N246D 변이체는 PETase WT보다 PET 분해 활성이 현저히 증가된 것으로 확인되었다.
일 구체예에 따르면, 상기 PETase 변이체는 서열번호 2 의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 PETase 변이체는 서열번호 3 의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 PETase 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
예를 들면 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포를 숙주 세포로 하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 당업계에서 주로 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)으로 제작될 수 있고, 바람직하게는 T7/lac 프로모터를 가지고 있어 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)에 의해 단백질의 발현이 유도되는 pET-22b(+)가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터는 암호화된 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 예를 들면 tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, 또는 T7 프로모터일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 벡터는 발현된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 C-말단에 다른 서열이 연결될 수도 있다. 상기 연결될 수 있는 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열로 인하여, PETase 변이체를 생산하는 생산 균주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고 용이하게 정제될 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들면 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결된 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 염기 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로서, 직접 연결되어 있거나 또는 일정 거리를 두고 연결되어 있을 수 있고, 목적하는 단백질의 전사, 번역, 폴딩, 분비, 또는 다른 기능적 양상을 제어할 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 예를 들면 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열이 목적하는 단백질을 암호화하는 염기 서열과 작동가능하게 연결되면, 목적하는 단백질이 발현되어 세포 외로 분비될 수 있다.
용어 "신호 펩티드(signal peptide)"는 주로 분비 단백질의 전구체의 N-말단 상부(upstream)에 존재하며 분비된 단백질에는 제거되어 존재하지 않는 것을 의미한다. 신호 펩티드는 이를 발현하는 염기 서열과 인 프레임(in frame)으로 연결된 유전자 발현 산물을 세포 외로 분비되도록 하는 활성을 갖는다. 일반적으로 분비 단백질은 단백질 전구체에서 신호 펩티드 부분이 절단된 상태로 세포 외로 분비된다.
상기 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 5'상부에 위치할 수 있다.
예를 들면, 상기 신호 펩티드는 말토포린 신호 펩티드(SPlamb 신호 펩티드로 지칭할 수 있음)일 수 있다. SPlamb가 작동 가능하게 연결된 PETase 변이체는 다른 신호 펩티드를 연결한 경우보다 외부로 분비가 원활할 수 있다. SPlamb 신호 펩티드는 그람 음성 세균의 세포 내에서 합성된 단백질이 세포 내막을 통해 세포주변질(periplasm), 즉 세포 내막과 외막 사이의 공간으로 분비하는 Sec-의존적 경로의 신호 펩티드이다.
또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 상기 형질전환된 미생물은 PETase 변이체를 발현할 수 있는 균주이므로, 본 명세서에서는 PETase 변이체 생산 균주로 정의한다. 본 발명의 생산 균주를 얻기 위한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환을 위해 벡터 등을 숙주 세포 내로 운반하는 방법으로는, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등이 있다.
또 다른 양상은 상기 PETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 분해 방법을 제공한다. 반응 조건은 PET의 분해 효율을 높임과 동시에 상기 PETase 변이체의 효소 활성이 나타날 수 있도록 온도가 40℃이상, 50℃이상, 60℃이상, 또는 70℃이상일 수 있으며, 시간은 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 8시간 이상, 9시간 이상, 10시간 이상, 11시간 이상, 12시간 이상, 15시간 이상, 18시간 이상, 21시간 이상, 또는 24시간 이상일 수 있다. 본 발명의 PETase 변이체는 40℃ 내지 70℃에서의 고온에서도 활성이 우수하므로, 고온 조건에서 PET을 원활히 분해할 수 있다.
일 구체예에 따른 PETase 변이체는 40 내지 70℃ 조건에서도 안정성 및 PET에 대한 가수분해 능력이 우수하므로 PET을 고온에서 효과적으로 분해할 수 있다.
도 1은 일 실시에 따른 PETase 변이체의 S282C 및 N233C 변이 도입에 의한 이황화 다리(disulfide bond), E204R 및 G234D 변이 도입에 의한 염다리(salt bridge)를 나타낸 것이다.
도 2는 25℃ 및 35℃에서 PETase Wild Type, PETase S242T 변이체, 및 PETase N246D 변이체의 활성을 비교한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C, 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 단백질의 50℃에서의 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 일 실시예에 따른 IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C, 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 단백질의 60℃에서의 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 일 실시예에 따른 IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C, 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 단백질의 70℃에서의 활성을 나타낸 것이다.
상기 도 3 내지 도 5의 X축은 시간(hour)이며, Y축은 분해산물인 MHET 및 TPA가 합산된 농도(μM)를 나타낸다.
도 6은 IsPETase에서 N233C 및 S282C 변이만으로 Disulfide bond가 형성되어 열안정성 및 고온 활성이 증가하는지를 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: IsPETase WT 및 변이체 단백질의 제조
IsPETase 변이체는 Quick Change 키트(Stratagene)를 이용하여 위치지정 변이 실험을 수행하여 제작하였다.
IsPETase WT 및 IsPETase변이체의 발현 및 정제는 다음 조건으로 수행하였다.
E. coli에 대해 코돈 최적화된 (codon optimizing) 유전자를 합성하고, 이를 중합 효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction; PCR) 을 통해 증폭시켰다. 신호 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 합성 DNA로부터 제거하였다. 이 후, PCR 산물을 자체적인 신호 펩타이드가 없는 pET22b(+)(Novagen/Merck)-modified vector로 서브 클로닝(Nco I 및 Xho I)하였다. 생성된 발현 벡터 pET 15a: IsPETase로 E.coli BL21(DE3)-T1R 균주를 형질전환(transform)시켰다. 상기 E.coli 균주는 200 mg/L 암피실린을 포함하는 1 L의 lysogeny broth 배지가 담긴 플라스크에서 37℃ 조건으로 600nm에서 0.6 광학밀도(optical density)로 배양하였다.
0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)의 첨가를 통해 단백질 발현을 유도하고 상기 배양 배지를 18℃에서 16시간 추가로 배양하였다. 이어서 4℃에서 20분동안 4000 xg에서 원심분리하여 세포를 수확하였다.
세포 펠렛을 버퍼 A(50mM Na2HPO4-HCl, pH 7.0)에 재현탁시킨 후, 초음파처리를 통해 분쇄하였다. 세포 잔사(cell debris)를 25분간 13500xg로 원심분리하여 제거하고, 상등액(supernatant)을 Ni-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen)에 적용하였다. 30 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼 A로 세척한 후, 결합 단백질을 버퍼 A 중의 300 mM 이미다졸로 용출시켰다. 마지막으로, 미량의 오염물질을 버퍼 A로 평형화된(equilibrated) Superdex 200 prep-grade column(320 ㎖, GE Healthcare)을 이용하여 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 통해 제거하였다. 모든 정제 단계는 4℃에서 수행하였다. 단백질의 순도는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(electrophoresis)로 확인하였다. 정제된 단백질은 50 mM Na2HPO4-HCl(pH 7.0) 및 100 mM NaCl에 28 ㎎/㎖로 농축시켰다.
상기 방법으로 IsPETaseWT, IsPETaseS242T, IsPETaseN246D, IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D를 제조하였다. 클로닝 및 위치지정 돌연변이 유발에 사용한 프라이머는 하기 표 1에 기재되어 있다.
서열번호 프라이머 서열
5 IsPETase S121E F 25 nmole Bio-RP ACGTTAGACCAGCCAGAAAGTCGGAGTTCGCAA
6 IsPETase S121E R 25 nmole Bio-RP TTGCGAACTCCGACTTTCTGGCTGGTCTAACGT
7 IsPETase D186H F 25 nmole Bio-RP CCTCAAGCACCATGGCATTCTTCGACAAATTTT
8 IsPETase D186H R 25 nmole Bio-RP AAAATTTGTCGAAGAATGCCATGGTGCTTGAGG
9 IsPETase S242T/N246D F 25 nmole Bio-RP CATTCCTGTGCGAATACCGGCAATTCTGACCAA
10 IsPETase S242T/N246D R 25 nmole Bio-RP TTGGTCAGAATTGCCGGTATTCGCACAGGAATG
실시예 2: IsPETase S242T 변이체 및 IsPETase N246D 변이체의 활성 분석
IsPETaseS242T 변이체 및 IsPETaseN246D 변이체를 제작하고 25℃ 및 37℃에서의 PET film 분해 활성을 측정하였다.
IsPETaseS242T 변이체 및 IsPETaseN246D 변이체는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제작하였다.
온도에 따른 PET 분해 활성 측정은 다음 방법으로 진행하였다. 시판되는 PET 필름(UBIGEO, Korea)을 효소 분석을 위한 기질로 사용하고, PET 필름은 직경 6 mm의 원형 형태로 준비하였다. PET 필름을 300 ㎕의 pH 9.0 글리신-NaOH 버퍼와 200 nM의 IsPETase 효소로 접촉시키고, 반응 혼합물을 각각 25℃ 및 37℃에서 각각 24시간, 72시간 동안 인큐베이션하였다.
반응은 85℃에서 15분 동안 가열하여 종결시켰다. 이 후, 샘플을 13,200 rpm에서 원심분리하고, 상등액은 LC를 통해 분석하였다. 효소 반응 후, 필름을 증류수 중 1% SDS 및 20% 에탄올로 세척하였다.
도 2에 따르면, PETase S242T 변이체 및 PETase N246D 변이체는 PETase WT보다 PET 분해 활성이 현저히 증가되었다. 이는 기질결합부위 주변 잔기인 S242가 소수성이 더 강한 잔기인 Threonine(T)으로 치환되어 소수성이 강한 PET 기질과의 결합력이 증가하였고, N246가 음전하를 갖는 Aspartate(D)로 치환됨으로서 양전하를 띈 R280 잔기와 salt-bridge를 형성하여 효소의 열안정성이 증가하였기 때문으로 판단된다.
또한 2020.02.18에 공개된 대한민국 공개공보 10-2020-0017321에 따르면 PETase에 S121E 및 D186H 변이가 부가됨으로서 PETase의 활성 및 열안정성이 증가함을 확인한 바 있다.
이하에서는 PETase의 활성을 증가시키는 것으로 확인된 S121E, D186H, S242T, 및 N246D 4개의 변이를 부가함으로서 활성이 증가한 PETaseS121E/D186H/S242T/N246D 변이체를 기초로 열안정성을 증가시키기 위한 실험을 진행하였다.
실시예 3: IsPETase 변이체 단백질의 열안정성 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PETaseS121E/D186H/S242T/N246D에 변이가 부가된 IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C, IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 를 제조하였다. 클로닝 및 위치지정 돌연변이 유발에 사용한 프라이머는 하기 표 2에 기재되어 있다.
서열번호 프라이머 서열
11 IsPETase N233C F 25 nmole Bio-RP CAGTTTCTCGAAATTTGCGGTGGCTCACATTCC
12 IsPETase N233C R 25 nmole Bio-RP GGAATGTGAGCCACCGCAAATTTCGAGAAACTG
13 IsPETase S282C F 25 nmole Bio-RP AATAGCACCAGAGTGTGCGATTTTCGTACAGCG
14 IsPETase S282C R 25 nmole Bio-RP CGCTGTACGAAAATCGCACACTCTGGTGCTATT
15 IsPETase E204R F 25 nmole Bio-RP CTGATCTTCGCATGTCGTAACGATAGTATAGCC
16 IsPETase E204R R 25 nmole Bio-RP GGCTATACTATCGTTACGACATGCGAAGATCAG
17 IsPETase N233C, G234D F 25 nmole Bio-RP CAGTTTCTCGAAATTTGCGATGGCTCACATTCC
18 IsPETase N233C, G234D R 25 nmole Bio-RP GGAATGTGAGCCATCGCAAATTTCGAGAAACTG
도 1은 컴퓨터 시뮬레이션 프로그램 WinCoot 및 PyMOL을 사용하여 서열번호 3의 아미노산 서열(IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 의 아미노산 서열)의 구조를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 1에 따르면, N233C와 S282C 변이가 부가되면 Disulfide bond를 형성하며, G234D와 E204R 변이가 부가되면 salt bridge를 형성하는 것으로 확인되었다.
IsPETase 변이체의 녹는 온도(단백질 변형이 일어나는 온도, Tm)를 측정함으로서 열안정성을 확인하였다. 녹는 온도는 Protein thermal shift dye (Applied Biosystems)를 이용하여 StepOnePlus Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific)로 용융 곡선을 측정하였다. 구체적으로는, IsPETase 5 ㎍를 protein thermal shift dye 20 ㎕와 혼합한 후 20℃ 내지 90℃까지 온도를 1도씩 변화를 주면서 단백질 변형이 시작되는 신호변화를 모니터링하였다. 용융 곡선을 바탕으로, IsPETaseWT 및 이의 변이체의 녹는 온도(Tm)를 결정하였다.
하기 표 3에 따르면, IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C, IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 는 IsPETaseWT보다 높은 열안정성이 부여된 것을 알 수 있었다. 특히 IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C, IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C는 Tm값이 8℃ 이상 상승하였는데, 이는 N233C 변이 및 S282C 변이에 의한 Disulfide bond 형성, 그리고 E204R 변이 및 G234D 변이에 의한 salt bridge 형성에 의한 것으로 판단된다.
IsPETase 단백질 및 변이체 Tm
Is PETase WT 48.8
Is PETase S121E/D186H/S242T/N246D 60.07
Is PETase S121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C 68.7
Is PETase S121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C 69.8
실시예 4: IsPETase 변이체 단백질의 고온 활성 분석
50℃ 이상의 고온 조건에서 IsPETase에 의한 PET의 분해율을 분석하였다. 분석은 이전에 보고된 논문(Yosida, S. et al. Science 351, 1196-1199, 2016.)을 기반으로 약간 변형(하기 기재)하여 수행하였다. 시판되는 PET 필름(UBIGEO, Korea)을 효소 분석을 위한 기질로 사용하고, PET 필름은 직경 6 mm의 원형 형태로 준비하였다. PET 필름을 300 ㎕의 pH 9.0 글리신-NaOH 버퍼와 200 nM의 IsPETase 효소로 접촉시키고, 반응 혼합물을 각각 50℃에서 8시간, 60℃에서 12시간, 70℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 반응은 85℃에서 15분 동안 가열하여 종결시켰다. 이 후, 샘플을 13,200 rpm에서 원심분리하고, 상등액은 LC를 통해 분석하였다. 효소 반응 후, 필름을 증류수 중 1% SDS 및 20% 에탄올로 세척하였다.
도 3을 참조하면, 50℃에서 IsPETaseWT 는 PET 분해산물(MHET 및 TPA)의 농도가 거의 증가하지 않았고, IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D는 분해산물의 농도가 200μM 이하였으나, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C는 8시간 동안 지속적으로 분해산물의 농도가 1200μM 이상으로 증가하는 것으로 나타났다.
도 4를 참조하면, 60℃에서 IsPETaseWT는 분해산물의 농도가 거의 증가하지 않았고, IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D는 분해산물의 농도가 100 μM 이하였으나, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C는 분해산물의 농도가 12시간만에 300 μM 이상, IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C는 분해산물의 농도가 12시간만에 400 μM 이상으로 증가하는 것으로 나타났다.
도 5를 참조하면, 70℃에서 IsPETaseWT는 분해산물의 농도가 거의 증가하지 않았고, IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D는 분해산물의 농도가 40 μM 이하였으나, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C는 분해산물의 농도가 5시간 만에 160 μM 이상으로 증가하는 것으로 나타났다.
결과적으로, IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C는 열안정성과 효소 활성이 모두 증가하는 상승 효과(synergetic effect)를 보인다는 것을 알 수 있었다.
상기 열안정성 평가는 IsPETaseS121E/D186H/S242T/N246D를 기초로 N233C 및 S282C 변이 부가에 의한 Disulfide bond 형성, 그리고 E204R 및 G234D 변이 부가에 의한 salt bridge 형성 결과이지만, IsPETase WT 또는 다른 IsPETase 변이체에 N233C 및 S282C 변이 및/또는 E204R 및 G234D 변이를 부가하는 경우에도 Disulfide bond 및/또는 salt bridge를 형성하여 열안정성 및 고온 활성이 증가할 것으로 판단된다.
실시예 5: IsPETase N233C/S282C 변이체와 IsPETase WT 의 고온 활성 비교
앞서 IsPETaseS121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C 및 IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C가 열안정성과 효소 활성이 모두 증가함을 확인하였으나, Disulfide bond를 형성하는 N233C/S282C 위치 변이 만으로도 고온 활성이 증가하는지를 확인하였다. 실험은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 진행하였다.
도 6에 따르면, IsPETase 야생형(WT)은 40℃의 조건에서 매우 낮은 PET 분해 활성을 나타내었으나, IsPETaseN233C/S282C 변이체는 24시간 반응시켰을 때 야생형보다 3배 이상의 PET 분해활성을 나타내고, 특히 72시간이 경과한 후에도 지속적으로 PET 분해활성을 나타내었다.
상기 실험결과를 종합하면, IsPETaseN233C/S282C 변이체는 Disulfide bond가 형성되어 열안정성 및 고온에서의 PET 분해활성이 증가하며, E204R/G234D 변이의 추가에 의해 Salt bridge가 형성됨으로서 적어도 70℃의 고온에서는 PET 분해 활성이 더 증가할 수 있다. 또한 IsPETaseN233C/S282C 에 S121E/D186H 변이 및/또는 S242T/N246D 변이가 부가되면 고온에서의 PET 분해 활성이 더욱 증가될 수 있다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> PETase Varient Having PET Decomposition Activity at High Temperature <130> PN200087 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ISPETase Native amino acid sequence <400> 1 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ISPETase S121E/D186H/N233C/S242T/N246D/S282C amino acid sequence <400> 2 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Glu Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp His Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Cys Gly Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Thr Gly Asn Ser Asp Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Cys Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290 <210> 3 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ISPETase S121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C amino acid sequence <400> 3 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Glu Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp His Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Arg Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Cys Asp Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Thr Gly Asn Ser Asp Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Cys Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290 <210> 4 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETaseS121E/D186H/E204R/N233C/G234D/S242T/N246D/S282C Nucleic acid SEQ <400> 4 atgaattttc ctcgcgcttc acgactgatg caggctgccg ttcttggagg gctgatggcc 60 gttagcgcgg ccgccaccgc tcagacaaat ccctacgccc gcggtccgaa tccgacagcc 120 gccagtttgg aagcgagcgc tggtccattc accgttcgct cctttaccgt gagtagaccg 180 agcggttatg gcgctggcac cgtttactat ccaacaaatg ctgggggtac cgtgggcgcc 240 atagccatag ttcccgggta tacggcacgg cagtcatcaa ttaaatggtg gggaccgcgt 300 ctggcatccc acggtttcgt agtaattaca attgacacaa attccacgtt agaccagcca 360 gaaagtcgga gttcgcaaca aatggccgcg ctgcgccagg tggcgtcgtt aaacggtaca 420 agtagcagcc cgatttacgg aaaggtcgat accgctcgta tgggtgttat ggggtggagt 480 atgggaggtg gaggctccct gatctctgct gctaacaacc cttcgctgaa agcagcggcg 540 cctcaagcac catggcattc ttcgacaaat tttagttctg taactgtgcc cacgctgatc 600 ttcgcatgtc gtaacgatag tatagccccg gtcaactctt cagcacttcc tatctatgat 660 tctatgtcac gcaacgctaa gcagtttctc gaaatttgcg atggctcaca ttcctgtgcg 720 aataccggca attctgacca agcattaatc ggaaaaaaag gcgttgcatg gatgaaacgt 780 tttatggaca atgatactag gtattctact tttgcctgcg agaacccgaa tagcaccaga 840 gtgtgcgatt ttcgtacagc gaattgcagc 870 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase S121E F 25 nmole Bio-RP <400> 5 acgttagacc agccagaaag tcggagttcg caa 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase S121E R 25 nmole Bio-RP <400> 6 ttgcgaactc cgactttctg gctggtctaa cgt 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase D186H F 25 nmole Bio-RP <400> 7 cctcaagcac catggcattc ttcgacaaat ttt 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase D186H R 25 nmole Bio-RP <400> 8 aaaatttgtc gaagaatgcc atggtgcttg agg 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase S242T/N246D F 25 nmole Bio-RP <400> 9 cattcctgtg cgaataccgg caattctgac caa 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase S242T/N246D R 25 nmole Bio-RP <400> 10 ttggtcagaa ttgccggtat tcgcacagga atg 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase N233C F 25 nmole Bio-RP <400> 11 cagtttctcg aaatttgcgg tggctcacat tcc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase N233C R 25 nmole Bio-RP <400> 12 ggaatgtgag ccaccgcaaa tttcgagaaa ctg 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase S282C F 25 nmole Bio-RP <400> 13 aatagcacca gagtgtgcga ttttcgtaca gcg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase S282C R 25 nmole Bio-RP <400> 14 cgctgtacga aaatcgcaca ctctggtgct att 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase E204R F 25 nmole Bio-RP <400> 15 ctgatcttcg catgtcgtaa cgatagtata gcc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase E204R R 25 nmole Bio-RP <400> 16 ggctatacta tcgttacgac atgcgaagat cag 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase N233C, G234D R 25 nmole Bio-RP <400> 17 cagtttctcg aaatttgcga tggctcacat tcc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IsPETase N233C, G234D R 25 nmole Bio-RP <400> 18 ggaatgtgag ccatcgcaaa tttcgagaaa ctg 33

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 233번째 아미노산이 아스파라긴에서 시스테인으로 치환되고, 282번째 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지는,
    PETase 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PETase 변이체는 서열번호 1의 204번째 아미노산이 글루탐산에서 아르기닌으로 더 치환되고, 234번째 아미노산이 글리신에서 아스파르트산으로 더 치환된,
    PETase 변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PETase 변이체는 다음 아미노산 치환 중 적어도 하나를 더 포함하는 PETase 변이체:
    (a) 서열번호 1의 121번째 아미노산이 세린에서 글루탐산으로 치환
    (b) 서열번호 1의 186번째 아미노산이 아스파르트산에서 히스티딘으로 치환
    (c) 서열번호 1의 242번째 아미노산이 세린에서 트레오닌으로 치환
    (d) 서열번호 1의 246번째 아미노산이 아스파라긴에서 아스파르트산으로 치환
  4. 제1항의 PETase 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  7. 제1항의 PETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 분해 방법.
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