KR20200017321A

KR20200017321A - IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법 및 IsPETase 변이체

Info

Publication number: KR20200017321A
Application number: KR1020190017256A
Authority: KR
Inventors: 김경진
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2019-02-14
Publication date: 2020-02-18
Also published as: KR102088340B1

Abstract

본 발명은 IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법, 상기 단백질의 입체구조를 이용하여 IsPETase 단백질 활성 조절제를 스크리닝하는 방법 및 IsPETase 변이체를 스크리닝하는 방법, 및 PETase 활성이 증가한 IsPETase 변이체 및 이를 이용한 PET 분해 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 IsPETase의 단백질 결정체를 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 규명하고, 이로부터 제조된 결정체를 획득하였다. 또한, 상기 결정체로부터 IsPETase의 3차 구조를 규명하여, 이러한 구조를 기반으로 PETase 활성이 증가된 변이체를 제조하였다. 상기 IsPETase 변이체는 PET 분해 분야에 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법 및 IsPETase 변이체 {Method for crystallization of IsPETase protein and IsPETase variants}

본 발명은 IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법, 상기 단백질의 입체구조를 이용하여 IsPETase 단백질 활성 조절제를 스크리닝하는 방법 및 IsPETase 변이체를 스크리닝하는 방법, 및 PETase 활성이 증가한 IsPETase 변이체 및 이를 이용한 PET 분해 방법에 관한 것이다.

플라스틱은 가벼움, 내구성, 저렴한 가격, 다양한 형태로의 용이한 가공성 및 비분해성과 같은 바람직한 특성으로 인해 생활에서 필수적인 재료이다. 그러나, 플라스틱을 사용하는 것의 큰 이점으로 여겨지던 비분해성으로 인해, 폐플라스틱이 매립지 및 해양에 축적되어 환경 문제의 주요 원인으로 고려되고 있다. 플라스틱의 생산은 지속적으로 증가하여 2015년에는 전 세계적으로 약 3억 2천만 톤이 생산되었다. 대부분의 플라스틱은 생분해에 강하고 분해 시간이 오래 걸리기 때문에 2050년까지 플라스틱 폐기물의 양은 축적되어 330억 톤에 달할 것으로 예상된다. 따라서 플라스틱 폐기물을 줄이기 위한 많은 노력이 이루어지고 있다. 플라스틱 폐기물을 제거하고 플라스틱-기반 물질을 재활용하기 위해 당분해(glycolysis), 메탄올분해(methanolysis), 가수분해(hydrolysis), 아미노분해(aminolysis) 및 암모니아분해(ammonolysis)와 같은 다양한 화학적 분해 방법이 개발되고 있다. 그러나 이러한 방법은 일반적으로 고온 조건을 필요로 하고 종종 추가적인 환경 오염물질을 생성한다. 이에, 생촉매 분해가 친환경적인 방법으로 적용되면, 대안적인 방법이 될 수 있다. 미생물은 물질 표면으로 집락화(colonization)를 하여, 에스터 결합의 효소적 가수분해를 통해 플라스틱을 분해할 수 있다. 플라스틱의 생분해도는 화학적 및 물리적 특성에 따라 다르다.

폴리(에틸렌 테레프탈레이트)(Poly(ethylene terephthalate); PET)는 광범위하게 널리 사용되는 폴리에스터이며 생분해에 강하다. 미국 국립 공원 관리국(US National Park Service)의 보고서에 따르면, PET 병은 분해되기까지 약 450년이 걸린다. PET는 테레프탈레이트(terephtalate; TPA) 및 에틸렌 글리콜(ethylene glycol; EG)의 에스터 결합을 통해 중합된다. 큐티나아제, 리파아제, 카르복실에스터라제, 및 에스터라제와 같은 다양한 박테리아 가수분해효소는, 정도는 상이하지만 모두 PET를 분해하는 것으로 나타난다. 현재까지 확인된 PET-분해효소 중, 써모비피다 푸스카 DSM43793(Thermobifida fusca DSM43793) 유래의 TfH 및 TfH BTA-2, 써모비피다 푸스카 KW3(Thermobifida fusca KW3) 유래의 TfCut1 및 TfCut2, 식물 퇴비 메타게놈 유래의 LC 큐티나아제, 사카로모노스포라 비리디스 AHK190(Saccharomonospora viridis AHK190) 유래의 큐티나아제, 써모마이세스 인솔렌스(Thermomyces insolens) 유래의 HiC, 및 칸디다 안타르크티카(Candida Antarctica) 유래의 리파아제 B는 상대적으로 높은 분해성을 갖는 것으로 나타난다. 그러나, 산업적 응용을 위한 분해 활성은 여전히 너무 낮다.

효소적 활성을 증가시키기 위해 몇 가지 전략이 채택되었다. 활성 부위의 부위-특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 통해, 큐티나아제는 더 높은 가수분해 활성을 나타낸다. 또한, 에스터라제에 Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 이온을 도입하거나 에스터라제에 디설피드 결합을 첨가하면 효소의 열안전성이 향상되고 이는 PET 분해성의 향상을 이끈다. 최근, T.푸스카 KW3 유래의 Tfcut2 및 LC 큐티나아제; 또는 C.안타르크티카 유래의 리파아제 및 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 유래의 큐티나아제로 구성된 이중 효소 시스템이 상승 효과를 나타내는 것이 발견되었다. 그러나 이러한 시도에도 불구하고, PET 분해 활성은 여전히 낮다.

최근, PET를 탄소원으로 사용할 수 있는 새로운 박테리아 종인, 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis)가 분리되었다. I.사카이엔시스의 PETase(IsPETase)는 적당한 온도 (30℃)에서 PET를 분해할 수 있고, 큐티나아제 및 리파아제와 같은 다른 PET 분해효소 보다 상대적으로 더 높은 활성을 가짐이 알려져 있다(Yosida, S. et al. Science 351, 1196-1199, 2016.). 또한, IsPETase는 PET에 대한 더 높은 특이성을 보이므로, PET 분해를 위한 IsPETase의 탁월한 능력은 많은 주목을 받고 있다. 그러나, 자세한 효소 메커니즘이 밝혀지지 않아 추가 연구가 어려운 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 IsPETase의 결정 구조와 그 구조적 특징을 밝히고자 예의 노력 연구한 결과, IsPETase의 단백질 결정체를 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 규명하고, 이로부터 제조된 결정체를 획득하였다. 또한, 상기 결정체로부터 IsPETase의 3차 구조를 규명하여, 이러한 구조를 기반으로 PETase 활성이 증가된 변이체를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 IsPETase 변이체로서, R280A의 아미노산 치환을 포함하는, IsPETase 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 IsPETase 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 IsPETase 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 IsPETase 변이체 및 상기 단백질을 포함하도록 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 IsPETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는, Poly(ethylene terephthalate)(PET) 분해 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 i) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 10000, 비스-트리스(bis-tris) 및 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 포함하는 저수조 용액(reservoir solution)과 ii) IsPETase 단백질을 함유하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 증기 확산법(vapor diffusion technique)으로 결정화시키는 단계를 포함하는, IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) IsPETase 단백질의 입체구조를 이용하여 IsPETase 단백질 활성 조절 후보 펩티드 또는 IsPETase 단백질 결합 후보 화합물을 생성 또는 선별하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 생성 또는 선별된 후보 펩티드 또는 화합물이 IsPETase 단백질의 활성을 조절하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, IsPETase 단백질 활성 조절제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 IsPETase 단백질의 입체구조로부터 기질 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는, IsPETase 변이체의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 IsPETase 변이체로서, R280A의 아미노산 치환을 포함하는, IsPETase 변이체를 제공한다.

본 발명의 용어, "IsPETase"는 PET를 분해하는 효소인 PETase 중 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis) 유래의 PET-분해효소를 이용하여, 에스터 결합을 가수분해하는 에스터라제(esterase)의 일종이다. IsPETase는 PET를 비스(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트 (bis(2-hydroxyethyl) terephthalate; BHET), 모노(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트 (mono(2-hydroxyethyl) terephthalate; MHET), 및 테레프탈산 (terephthalic acid; TPA)(도 3)과 같은 단량체로 분해한다.

본 발명의 용어, "IsPETase 변이체"는 IsPETase 야생형과 비교하여 아미노산 서열에 하나 이상의 차이가 있는 펩티드; IsPETase 야생형 서열을 변형시킨 펩티드를 포함한다.

구체적으로, IsPETase 변이체는 IsPETase 야생형에서 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중 어느 하나의 방법 또는 이러한 방법들의 조합을 통하여 변형된 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서 IsPETase 변이체는 IsPETase 야생형에 비해 활성, 열안정성이 증가된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 활성은 BHET를 기질로 하여 측정된 활성이거나 PET 필름을 기질로 하여 측정된 활성일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 열안정성은 IsPETase의 녹는 온도(melting temperature, Tm)를 측정하거나 고온 (40℃ 이상)에서 PET 필름을 기질로 하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 R280A의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 보다 구체적으로 상기 IsPETase 변이체는 R280A의 아미노산 치환에 S121D 및 D186H로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 IsPETase 변이체 또는 R280A의 아미노산 치환에 S121E 및 D186H로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 IsPETase 변이체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

보다 구체적으로, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 본 명세서에서의 IsPETase 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 보조 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 용어 "상동성"은 두 개의 주어진 단백질 서열의 유사도, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며, 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, S160A, D206A, H237A, Y87A, M161A, W185A, I208A, W159A, S238A, N241A, S121D, S121E, D186H, D186F, D186I, D186L, D186V 및 R280A로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체, 보다 구체적으로 R280A의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체, R280A, S121D 및 D186H의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체, 및 R280A, S121E 및 D186H의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체를 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다(실시예 4 및 5). 또한, 상기 변이체의 활성을 측정한 결과, R280A의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체, R280A, S121D 및 D186H의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체, 및 R280A, S121E 및 D186H의 아미노산 치환을 포함하는 IsPETase 변이체의 경우 IsPETase 야생형에 비해 PETase 활성이 증가하고 높은 온도 (40℃)에서 장시간 동안 지속됨을 확인할 수 있었다(도 5, 6, 10 및 12).

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 IsPETase 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

이때, 상기 "IsPETase" 및 "IsPETase 변이체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 출원의 범위 내에 포함되며, 변이형 폴리뉴클레오티드 역시 유전 암호의 축퇴성에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 출원의 범위 내에 포함된다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 조합에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 서열번호 2, 3 또는 4의 염기서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드도 본 출원의 범위 내에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

또한 상기 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 IsPETase 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 구체적으로, 도입은 형질전환에 의해 이루어 질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 "IsPETase", "IsPETase 변이체", "폴리뉴클레오티드" 및 "벡터"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이든 사용할 수 있으며, 구체적으로 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 대장균(Escherichia coli; E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 IsPETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는, Poly(ethylene terephthalate)(PET) 분해 방법을 제공한다.

PET 분해 방법으로서, 상기 IsPETase 변이체를 포함하는 조성물을 이용할 수 있다. 또한, 상기 조성물을 포함하는 장치 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, IsPETase 변이체를 이용한 PET를 분해 방법이라면 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 i) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 10000, 비스-트리스(bis-tris) 및 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 포함하는 저수조 용액(reservoir solution)과 ii) IsPETase 단백질을 함유하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 증기 확산법(vapor diffusion technique)으로 결정화시키는 단계를 포함하는, IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법을 제공한다.

이때, 상기 "IsPETase"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

단백질 결정 구조를 규명하는 방법으로는 여러 종류가 있으나, NMR Spectroscopy를 이용한 방법과 X-선 결정화를 이용한 방법 등 크게 두 가지가 주로 사용되고 있다. NMR Spectroscopy는 분자의 NMR 스펙트럼에서 관찰할 수 있는 화학적인 원인에 의한 신호의 변화를 해석하여 분자의 특징 원자 사이의 거리를 예측하는 원리를 이용한 것으로, NMR 실험을 통해 얻은 화학적인 변화 데이터를 분석하여 한 단백질 내에 표지된 원자 사이의 거리에 대한 집합을 얻고 실험으로 결정된 모든 거리에 대한 정보와 충분히 들어맞는 모델이나 모델의 집합을 생성하는 것으로, 방대한 데이터의 수집 및 분석에 상당한 투자를 해야 한다는 맹점이 있다. 한편, X-선 결정화법은 물질의 결정체를 X-선 발생 장치에 넣고 결정체의 원자를 둘러싸고 있는 전자의 구름에 의해 반사되는 X-선을 분석해 결과를 얻는 원리를 이용한 것으로서, 단백질 결정체는 개별적인 단백질 분자가 규칙적인 격자 내에 정돈된 형태를 하고 있으므로 단백질 결정체에 의해 반사된 X-선이 규칙적인 패턴을 갖고 있음을 이용하여 단백질 결정체에서 산란되어 반사하는 X-선으로 단백질의 전자 밀도를 생성해 단백질 구조 분석을 하는 방법이나, 순수한 단백질 샘플이 필요하여 단백질의 결정화가 필요한 맹점이 있다. 본 발명에서는 IsPETase 단백질의 결정체를 최적으로 제조할 수 있는 방법을 규명하였고, 이로부터 IsPETase 단백질의 결정체를 획득하여 X-선 분석을 수행함으로써, IsPETase 단백질의 입체구조를 규명하였다.

본 발명의 용어, "결정화"를 이룰 수 있게 한다는 것 또는 "결정성"을 갖는다는 것은 단백질을 X-선 단백질 입체구조 분석을 위한 적합한 상태로 만들어 주기 위해 단백질 분자에 변이를 도입하는 등의 방법을 이용함으로 균일한 액상으로부터 일정한 모양과 크기를 갖는 고체입자를 형성하게 하거나 단백질의 결정 상태를 더욱 안정하게 하는 것을 말한다. 단백질의 입체 구조는 단백질의 생체 내 작용을 이해하는데 매우 중요하다. 즉, 고분자인 단백질을 구성하는 원자의 배열과 입체구조를 안다면, IsPETase 단백질의 입체구조 분석이 가능하며 이를 기반으로 PETase 활성이 높은 IsPETase 변이체를 제조할 수 있으므로 상기 단백질의 입체구조를 규명하는 것은 중요하다.

본 발명의 IsPETase 단백질 결정체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 구체적으로 공간군 P2₁2₁2₁에 속하고, a = 43.48 Å, b = 50.40 Å 및 c = 129.49 Å의 단위 셀 파라미터를 가지나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "공간군(space group)"은 결정의 단위 세포의 대칭으로서, 대칭요소들을 조합하면 군(group)을 형성한다. 상기 공간군은 공간 그룹과 혼용될 수 있다.

본 발명의 용어 "단위 셀 파라미터(unit cell parameter)"는 격자계수로도 불리며, 단위 셀은 공간군을 구성하는 가장 해석이 용이한 최소 반복 단위로, 세결정학적 축으로 정의될 수 있으며 이 세 벡터에 대한 길이(a, b, c)일 수 있다.

이와 같은 결정체의 제조는, 공지의 다양한 결정화 방법을 이용할 수 있으며, 구체적으로는 증기 확산법(vapor diffusion technique)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 증기 확산법은 시팅 드롭 증기 확산법(sitting drop vapor diffusion technique) 또는 방울 혼합 증기 확산법(hanging drop vapor diffusion techmique)을 포함하며, 구체적으로는 방울 혼합 증기 확산법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 증기 확산법에서는, 단백질 용액이 결정체를 생산하기에 적절한 농도의 침전제를 가진 큰 수용성 저수조 용액과 평형 상태가 되도록 한다. 보통, 정제된 단백질 용액을 동량 정도의 저수조 용액과 혼합하여, 침전제의 농도가 결정화에 필요한, 절반 정도로 되게 하고, 이 용액을 저수조 위쪽을 밀폐한 커버슬립 아래에 매달거나, 용기 상단에 부착한다. 그 다음, 밀폐한 용기를 1일 내지 1년, 대개 2 내지 6주간 두어 결정체가 커지도록 한다. 구체적으로, 증기 확산법은 밀폐된 공간에 모액의 작은 방울과 훨씬 큰 규모의 저수조 용액이 분리된 채 공존할 때, 이들 사이에 물 또는 다른 휘발성 물질의 이동이 일어나게 되고, 단백질의 용액조건에서 슈퍼포화상태가 되며, 그러한 열역학적 준안정 상태에서 침전제의 변화에 따라 단백질이 침전되는 것을 이용한 결정화 방법이다. 단백질이 침전될 때, 그 속도가 느리게 진행되면서 안정된 결정화 상태가 되고, 침전제로 알려져 있는 것은 농축상태의 단백질 용액의 용해도를 줄여 주는 역할을 하게 되며, 단백질 분자 주위의 상대적인 흡착층을 감소시키기 위하여 단백질들은 서로 모여들며 이것이 결정을 형성하게 된다.

저수조 용액은 이와 같은 침전제, 완충액, 염, 계면활성제 등이 여러 농도로 섞여 있게 되는데, 단백질 용액과 이런 다양한 조건의 저수조 용액이 보통의 경우 1:1의 비율로 섞여 방울을 형성하게 되고, 이렇게 얻어진 방울을 놓은 후 밀봉한다. 이때, 초기에는 방울 중 단백질의 농도가 저수조 용액의 농도와 차이가 있어서 단백질이 결정 상태로 존재하지 않는다. 이렇게 밀봉된 상태로 놓아두면 서서히 평형이 이루어지고, 상기 설명한 원리에 의해 특정상태의 조건에서 결정이 형성되는 것이다. 특히, 방울 혼합 증기 확산법은, 단백질 구조를 분석하기에 충분한 크기의 결정을 제공하는 방법이다. 방울 혼합 증기 확산법은 샘플이 포함된 시약과 액체 상태의 순수한 시약을 증기 평형 상태에 있는 용기 상단에 부착한다. 용기에 비해 시약의 함량이 적은 샘플이 평형에 도달하기 위해서, 샘플에 포함된 물이 용기로 떨어지게 하므로 액체 상태의 시약과 농도가 같아질 때까지 샘플에 함유된 물이 제거되고, 결과적으로 평형 상태에 도달한 단백질 결정을 얻을 수 있다.

이와 같은 증기 확산법에서 저수조 용액 중의 침전제뿐만 아니라, 염, 완충액 및 계면활성제의 종류와 적정 농도, 용액의 pH 및 실험 온도는 단백질의 종류에 따라 달리 선택되고 경우에 따라서는 단백질의 결정 형성에 있어서 아주 중요한 요소가 된다.

이에, 본 발명에서는 IsPETase 단백질의 결정형성을 가져올 수 있는 최적화된 IsPETase 단백질의 결정체 제조 방법을 제공한다.

구체적으로, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 10000, 비스-트리스(bis-tris) 및 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 포함하는 저수조 용액으로 IsPETase 단백질을 증기 확산법으로 결정화시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폴리에틸렌 글리콜 10000은 침전제로서 저수조 용액 내에 포함될 수 있으며, 수식되지 않은 형태 또는 수식된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 폴리에틸렌 글리콜 10000은 10 내지 20%(v/v)의 농도, 보다 구체적으로 17%의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 비스-트리스는 완충액으로서 저수조 용액 내에 포함될 수 있으며, 수식되지 않은 형태 또는 수식된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 0.01 내지 1 M의 농도, 보다 구체적으로 0.1 M의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 완충액의 pH는 4.0 내지 6.0, 보다 구체적으로 5.0일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암모늄 아세테이트는 염으로서 저수조 용액 내에 포함될 수 있으며, 수식되지 않은 형태 또는 수식된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 암모늄 아세테이트는 0.01 내지 1 M의 농도, 보다 구체적으로 0.1 M의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 조성을 가진 저수조 용액에 IsPETase 단백질을 포함하는 단백질 용액을 첨가하여 이를 혼합하고, 평형화하여 결정체를 제조할 수 있다.

여기서, 상기 IsPETase 단백질을 포함하는 단백질 용액은, 정제된 IsPETase 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 정제된 IsPETase 단백질은 단백질 용액 내에 20 내지 40 ㎎/㎖의 농도, 보다 구체적으로 28 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 IsPETase 단백질을 정제하고, IsPETase 단백질을 28 ㎎/㎖의 농도로 포함하는 단백질 용액을 17%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜 10000, pH 5.0의 0.1 M 비스-트리스 및 0.1 M 암모늄 아세테이트와 혼합한 다음, 방울 혼합 증기 확산법으로 결정체를 제조하였다(실시예 2-1).

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) IsPETase 단백질의 입체구조를 이용하여 IsPETase 단백질 활성 조절 후보 펩티드 또는 IsPETase 단백질 결합 후보 화합물을 생성 또는 선별하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 생성 또는 선별된 후보 펩티드 또는 화합물이 IsPETase 단백질의 활성을 조절하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, IsPETase 단백질 활성 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이때, 상기 "IsPETase"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 규명한 IsPETase 단백질의 입체구조를 바탕으로 기질 결합 부위를 포함하는 다양한 단백질 부위에 대한 정보를 제공받을 수 있다.

상기 스크리닝 방법의 (a) 단계는 IsPETase 단백질의 입체 구조를 규명하는 단계; 및 상기 입체구조를 이용하여 IsPETase 단백질 활성 조절 후보 펩티드 또는 IsPETase 단백질 결합 후보 화합물을 생성 또는 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, IsPETase 단백질의 결정체를 수득하고, 이를 X선 분석한 후 IsPETase 단백질의 구조 및 기질 결합 부위를 규명하였다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 IsPETase 결정체 구조가 α/β 가수분해효소 슈퍼패밀리에 속하며, 중심 트위스트 β-시트는 9개의 혼합된 β-가닥(β1-β9)에 의해 형성되고 7개의 α-나선(α1-α7)으로 둘러싸여 있고, IsPETase는 활성부위에 위치한 보존된 세린 가수분해효소 Gly-x1-Ser-x2-Gly 모티프(motif)(Gly158-Trp159-Ser160-Met161-Gly162)를 함유한다는 것을 알 수 있었다(실시예 2-3, 도 1). 또한, IsPETase는 β-시트 중 6번째 가닥(β6-시트) 내 Pro181 잔기가 주변 아미노산과의 수소 결합을 형성하지 않으며, Asp186 잔기와 인접한 α-나선의 Ser121 잔기가 서로 수소 결합을 형성하지 않는 것을 알 수 있었다(실시예 5-1, 도 7 및 8).

또한, 기질 결합 부위는 약 25 및 29 Å의 수치를 갖는 평평한 표면에 길고, 얕은 L자형 틈을 형성하며, 기질 결합 부위는 2개의 서브사이트로 구성된다는 것을 알 수 있었다(실시예 2-4, 도 3).

따라서, 상기와 같은 IsPETase 단백질의 활성부위 및 구조적 정보, 또는 서 열정보 등을 기초로 IsPETase 단백질의 활성을 조절하는 물질 또는 결합하는 물질 등을 설계 또는 선별할 수 있다.

또한, 상기 스크리닝 방법의 (b) 단계는 (a)단계에서 생성 또는 선별한 IsPETase 단백질 조절 후보 펩티드 또는 화합물이 IsPETase 단백질의 활성을 조절하는지 여부를 판단하는 단계를 포함하며, 상기 후보 물질이 IsPETase 단백질의 활성을 저해한다면, 이는 IsPETase 단백질 저해제로 판단할 수 있으며 후보 물질이 IsPETase 단백질의 활성을 높인다면, IsPETase 단백질 활성화제로 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 IsPETase 단백질의 입체구조로부터 기질 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는, IsPETase 변이체의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 IsPETase의 단백질 결정체를 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 규명하고, 이로부터 제조된 결정체를 획득하였다. 또한, 상기 결정체로부터 IsPETase의 3차 구조를 규명하여, 이러한 구조를 기반으로 PETase 활성이 증가된 변이체를 제조하였다. 상기 IsPETase 변이체는 PET 분해 분야에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 IsPETase의 결정 구조를 나타낸 도면으로, (a) PET-분해효소의 아미노산 서열의 얼라인먼트(alignment)를 나타낸 것이다. type I, type IIa, 및 type IIb 각각 2종의 여섯 개의 PET-분해효소의 아미노산 서열을 비교한다. 2차 구조 요소는 IsPETase 구조를 기반으로 나타내었고, 보라색 화살표(β-시트) 및 파란색 나선(α-나선)으로 표시하였다. Gly-x1-Ser-x2-Gly 모티프 및 확장된 루프는 보라색 및 빨간색 상자로 각각 강조하였다. 효소 촉매작용 및 서브사이트 I 및 서브사이트 II의 구성에 관련된 잔기는 각각 빨간색-, 파란색- 및 보라색- 삼각형으로 표시하였다. 여섯 개의 효소 모두에서 발견되는 디설피드 결합은 오렌지색 선과 '디설피드 결합 1'로 표시하였다. IsPETase에서만 발견되는 추가적인 디설피드 결합은 오렌지색 선과 '디설피드 결합 2'로 표시하였다. Is, Ad, Pp, Oa, Tf, 및 Sv는 각각 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis), 아시도보락스 델라피엘디(Acidovorax delafieldii), 슈도모나스 슈도알칼리제니스(Pseudomonas pseudoalcaligenes), 올레이스피라 안타르크티카(Oleispira Antarctica), 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca), 및 사카로모노스포라 비리디스(Saccharomonospora viridis)의 PET-분해효소를 나타낸다. (b) IsPETase의 구조를 나타낸 것이다. 모노머 구조를 리본 다이어그램으로 나타내었다. 촉매 삼중체를 형성하는 Ser160, Asp206 및 His237의 세 잔기는 청록색 스틱으로, 두 디설피드 결합은 밝은 파란색 스틱으로 나타내었다. 활성 부위에서 시뮬레이션된 2-HE(MHET)₄ 분자는 오렌지색 스틱으로 나타내었다. 오른쪽 도면은 수평방향으로 왼쪽 도면으로부터 90° 회전된 도면이다.
도 2는 IsPETase의 전자 밀도 지도를 나타낸 도면으로, wincoot을 통해 생성하였다. 1.5 σ에서 윤곽이 잡힌 2F₀-F_C 지도는 파란색 메쉬(mesh)로 나타났다. IsPETase의 정제된 원자 모델은 원자에 따라 다른 색 선으로 표시하였다; 노란색-탄소, 빨간색-산소, 파란색-질소, 및 초록색-황. (a) 결정학적 대칭이 없음은 IsPETase의 단량체 구조를 암시한다. (b) IsPETase 구조를 1.0 Å의 고해상도로 나타내었다.
도 3은 IsPETase의 활성 부위를 나타낸 도면으로, (a) IsPETase에서 촉매 삼중체 및 2-HE(MHET)₄의 반응 중간체의 도킹 모델을 나타낸 것이다. 촉매 삼중체를 형성하는 Ser160, Asp206 및 His237의 세 잔기는 청록색 스틱으로 나타내었고, 적절하게 표시하였다. 산소음이온 홀과 촉매 삼중체와 관련된 상호작용의 거리 또한 나타내었다. (b) IsPETase의 기질 결합 부위를 나타낸 것이다. IsPETase 구조는 전기 포텐셜(electrostatic potential) 표면 모델로 나타내었다. 2-HE(MHET)₄ 도킹 모델은 오렌지색 스틱으로 나타내었고, 절단 부위(cleavage site)는 빨간색 박스로 강조하였다. 기질 결합 부위의 서브사이트 I, IIa, IIb, 및 IIc는 각각 빨간색, 초록색, 청록색, 및 마젠타색 점선 원으로 표시하였다. 서브사이트 IIc의 끝에 위치한 Arg280 잔기도 표시하였다. (c), (d) (b)에서의 IsPETase의 기질 결합 모드의 측면도를 나타낸 것이다. (e) IsPETase 활성 부위와 관련된 잔기를 나타낸 것이다. IsPETase는 회색의 카툰 다이어그램(cartoon diagram)으로 나타내었다. 2-HE(MHET)₄의 결합과 관련된 잔기는 선 모델로 나타내었고, 서브사이트 I 및 서브사이트 II를 구성하는 잔기는 마젠타색 및 밝은 파란색으로 각각 구별하였으며, 효소에 의해 절단되는 에스터 결합은 별 마크로 표시하였다. 2-HE(MHET)₄ 도킹 모델은 오렌지색 스틱으로 나타내었다. 잔기와 기질 사이에 형성된 수소 결합은 빨간색 선으로 나타내었다.
도 4는 PET-관련 분자들의 화학 구조를 나타낸 도면이다.
도 5는 IsPETase 변이체의 PETase 활성을 나타낸 도면으로, (a) BHET를 기질로 이용하여 IsPETase 및 이의 변이체의 가수분해 활성을 나타낸 것이다. IsPETase 및 이의 변이체의 PETase 활성은 200 ㎎/ℓ의 BHET 농도 및 50 nM의 효소 농도로 측정하였다. 생성된 MHET의 양은 HPLC 분석을 통해 모니터링 하였다. IsPETase 변이체의 PETase 활성은 IsPETase 야생형의 PETase 활성과 비교하였다. (b) PET 필름을 기질로 이용하여 IsPETase 단백질의 PETase 활성을 나타낸 것이다. IsPETase 단백질의 PET 필름 분해 활성은 200 nM의 효소 농도로 측정하였다. 생성된 MHET 및 TPA의 양은 HPLC 분석을 통해 모니터링 하였다. IsPETase 변이체의 PETase 활성은 IsPETase 야생형의 PETase 활성과 비교하였다. 증가된 활성을 나타내는 IsPETase^R280A 변이체는 별 마크로 강조하였다. (c) IsPETase^R280A 구조의 전기 포텐셜 표면을 나타낸 것이다. 2-HE(MHET)₄ 분자를 표지하였다. IsPETase^W/T에서의 Arg280 잔기 및 IsPETase^R280A에서의 Arg280Ala(R280A) 변화는 점선 원으로 표시하였다. 오차 막대는 중복 실험에서 얻어진 표준편차(standard deviation) 값을 나타낸다.
도 6은 IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 PETase 활성을 나타낸 도면으로, PET 필름을 기질로 이용하여 IsPETase 및 이의 변이체의 가수분해 활성을 나타낸 것이다. IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 PETase 활성은 200 nM의 효소 농도로 측정하였다. 생성된 MHET의 양은 HPLC 분석을 통해 모니터링 하였다. IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 24시간 및 72시간 에서의 PETase 활성은 30℃ 및 40℃에서 IsPETase^W/T의 PETase 활성과 비교하였다.
도 7은 IsPETase의 결정 구조를 나타낸 도면으로, (a) IsPETase^W/T의 중심 트위스트 β-시트가 9개의 혼합된 β-가닥(β1-β9)으로 형성된 것을 나타낸 것이다. β-시트를 구성하는 아미노산 중 질소, 산소는 각각 파란색, 빨간색으로 표시하였고, 각 질소와 산소가 형성한 수소 결합을 빨간색, 노란색 점선으로 표시하였다. (b) IsPETase^P181A 변이체의 중심 트위스트 β-시트가 9개의 혼합된 β-가닥(β1-β9)으로 형성된 것을 나타낸 것이다. β-시트를 구성하는 아미노산 중 질소, 산소는 각각 파란색, 빨간색으로 표시하였고, 각 질소와 산소가 형성한 수소 결합은 빨간색, 노란색 점선으로 표시하였다. (c) IsPETase^W/T의 구조는 연두색 선으로 표시하였고, IsPETase^P181A의 구조는 마젠타색 선으로 표시하였다.
도 8은 IsPETase의 결정 구조를 나타낸 도면으로, (a) IsPETase^W/T의 β6-β7 연결 루프 (Asp186-Phe191)와 그 주변 α-나선의 Ser121 잔기를 나타낸 것이다. 아미노산 중 산소는 빨간색으로 표시하였다. (b) 써모비피다 푸스카 DSM43793(Thermobifida fusca DSM43793) 유래의 TfCut2의 β6-β7 연결 루프 (His156-Trp161)와 그 주변 α-나선의 Asp156 잔기를 나타낸 것이다. 아미노산 중 질소, 산소는 각각 파란색, 빨간색으로 표시하였고, 각 질소와 산소가 형성한 수소 결합은 빨간색 점선으로 표시하였다. (c) IsPETase^S121D/D186H 변이체의 β6-β7 연결 루프 (Asp186-Phe191)의 D186H와 그 주변 α-나선의 S121D를 나타낸 것이다. (d) IsPETase^S121E/D186H 변이체의 β6-β7 연결 루프 (Asp186-Phe191)의 D186H와 그 주변 α-나선의 S121E 잔기, Asn172 잔기를 나타낸 것이다. 아미노산 중 질소, 산소는 각각 파란색, 빨간색으로 표시하였고, 각 질소와 산소가 형성한 수소 결합은 빨간색 점선으로 표시하였다.
도 9는 IsPETase 변이체의 녹는 온도를 나타낸 도면으로, (a), (b) protein thermal shift dye를 이용하여 IsPETase 및 이의 변이체의 녹는 온도를 나타낸 것이다.
도 10은 IsPETase 변이체의 PETase 활성을 나타낸 도면으로, (a), (b) PET 필름을 기질로 이용하여 IsPETase 및 이의 변이체의 가수분해 활성을 나타낸 것이다. IsPETase 및 이의 변이체의 PETase 활성은 200 nM의 효소 농도로 측정하였다. 생성된 MHET의 양은 HPLC 분석을 통해 모니터링 하였다. IsPETase 변이체의 24시간 및 72시간에서의 PETase 활성은 30℃ 및 40℃에서 IsPETase^W/T의 PETase 활성과 비교하였다.
도 11은 IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 결정 구조의 표면을 나타낸 도면으로, β6-β7 연결 루프의 D186H, S121E, Asn172 잔기와 서브사이트 IIc의 R280A 잔기를 나타낸 것이다. 연결 루프 내 아미노산 중 질소, 산소는 각각 파란색, 빨간색으로 표시하였고, 수소 결합은 빨간색 점선으로 표시하였다.
도 12는 IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 PETase 활성을 나타낸 도면으로, PET 필름을 기질로 이용하여 IsPETase 및 IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 가수분해 활성을 나타낸 것이다. IsPETase 및 IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 PETase 활성은 200 nM의 효소 농도로 측정하였다. 생성된 MHET의 양은 HPLC 분석을 통해 모니터링 하였다. (a) IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체의 시간별 PETase 활성을 30℃ 및 40℃에서 IsPETase^W/T의 PETase 활성과 비교하였다. (b) IsPETase^{S121E/D186H/R280A} 변이체를 50℃에서 1 내지 60분 동안 열 불활성화 처리하여 PETase 활성을 IsPETase^W/T의 PETase 활성과 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Is PETase 단백질의 제조

Escherichia coli 세포에서의 IsPETase 발현을 위해, 코돈 최적화된 합성 유전자를 주형으로 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 통해 IsPETase 유전자를 증폭시켰다. 신호 펩티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 합성 DNA로부터 제거하였다. 이 후, PCR 산물을 벡터 pET 15b에 서브클론하고, 생성된 발현 벡터 pET 15a: IsPETase로 E.coli 균주 Resettagami-B를 형질전환(transform)시켰다. 상기 E.coli 균주 Resettagami-B는 37℃에서 암피실린을 포함하는 1 L의 11l lysogeny broth 배지에서 성장시켰다. 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드의 첨가를 통해 단백질 발현을 유도한 후, 상기 배양 배지를 18℃에서 16시간 추가로 배양하였다. 그 후, 상기 배지를 20℃에서 10분간 4000Хg로 원심분리하여 회수하였다. 세포 펠렛을 버퍼 A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 재현탁시킨 후, 초음파처리를 통해 분쇄하였다. 세포 잔사(cell debris)를 25분간 13500Хg로 원심분리하여 제거하고, 상등액(supernatant)을 Ni-NTA 아가로스 컬럼(Qiagen)에 적용하였다. 30 mM 이미다졸을 포함하는 버퍼 A로 세척한 후, 결합 단백질을 버퍼 A 중의 300 mM 이미다졸로 용출시켰다. 마지막으로, 미량의 오염물질을 버퍼 A로 평형화된(equilibrated) Superdex 200 prep-grade column(320 ㎖, GE Healthcare)을 이용하여 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 통해 제거하였다. 모든 정제 단계는 4℃에서 수행하였다. 단백질의 순도는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(electrophoresis)로 확인하였다. 정제된 단백질은 50 mM Na2HPO4-HCl(pH 7.0) 및 100 mM NaCl에 28 ㎎/㎖로 농축시켰다.

실시예 2. Is PETase 단백질 결정체

실시예 2-1. Is PETase 단백질 결정체의 제조

정제된 IsPETase 단백질의 결정화는 20℃에서 방울 혼합 증기 확산법(hanging-drop vapor-diffusion technique)을 이용하여, 결정 스크리닝 키트: Index and PEG/Ion(Hampton Research) 및 Wizard I과 II(Rigaku)를 통해 수행하였다. 각각의 실험은 1.0 ㎕의 단백질 용액과 1.0 ㎕의 저수조 용액(reservoir solution)으로 구성되었으며, 이 후 50 ㎕의 저수조 용액에 대하여 평형화하였다.

최상 품질의 IsPETase 결정체는 0.1 M 암모늄 아세테이트, 0.1 M 비스-트리스(pH 5.0) 및 17% 폴리에틸렌 글리콜 10000에서 나타났다. 상기 결정체를 0.1 M 암모늄 아세테이트, 0.1 M 비스-트리스(pH 5.0), 20% 폴리에틸렌 글리콜 10,000 및 30%(v/v) 글리세롤을 포함하는 저온보호물질(cryoprotectant) 용액에 옮기고, 결정체보다 큰 루프로 추출하고, 액체 질소에 담가 급속-냉동하였다.

실시예 2-2. Is PETase 단백질 결정체의 X선 회절분석

IsPETase 단백질 결정체의 분석 데이터 수집을 위하여, 포항가속기연구소(Pohang Accelerator Laboratory, Pohang, Korea)의 Beamline 6D를 통해 100K에서 데이터를 수집하였다. 데이터는 HKL2000 소프트웨어 모음(software suite)을 이용하여 색인화하고, 통합하고, 스케일화하였다. 그 결과, IsPETase 결정체는 공간군 P2₁2₁2₁에 속하며, a = 43.48 Å, b = 50.40 Å 및 c = 129.49 Å의 단위 셀 파라미터를 갖는다. 비대칭 단위 당 IsPETase 한 분자로 가정하면, Metthews 계수는 2.64 Å³/Da로 나타났으며 이는 53.38%의 용매함량에 상응한다.

실시예 2-3. Is PETase 단백질 결정체의 구조결정

IsPETase 단백질 결정체의 구조적 특성을 규명하기 위하여, 검색 모델로서 Thermobifida alba(TaCut, PDB code 3VIS, 50% sequence identity) 유래의 큐티나아제(cutinase) 구조를 이용하여, CCP4 버전의 MOLREP로 분자 치환 방법을 통해 IsPETase의 구조를 규명하였다. WinCoot 프로그램을 이용하여 모델 제작(building)을 수행하였고, 정제는 REFMAC5를 이용하여 수행하였다. 상기 통계 데이터는 표 1에 나타내었다. IsPETase의 정제된 모델은 PDB 코드 5XJH로 Protein Data Bank에 보관되어 있다.

신호 펩티드 서열(Met1-Ala33)은 단백질 코어 도메인의 생성을 위해 제거하였다. 재조합 IsPETase 단백질은 pET 15b 벡터의 사용으로 인해 N 및 C 말단(Met13-Met33 및 Leu291-Gln312) 모두에 부가적인 아미노산 잔기를 갖는다.

그 결과, IsPETase 결정체 구조는 1.5 Å 해상도에서 결정되었다(도 1 및 도 2). 상기 구조는 전자밀도 맵에서 볼 수 있는 Ser31-Gln292 잔기를 포함한다. 정제된 구조는 결합 각, 결합 길이, 및 기타 기하학적 파라미터에 대한 X선 결정학적 통계와 일치한다(표 1). 공간군 P2₁2₁2₁의 비대칭 유닛은 한 분자의 IsPETase를 포함하며, 이는 IsPETase가 단량체로서 존재한다는 것을 나타낸다. IsPETase 결정체 구조는 α/β 가수분해효소 슈퍼패밀리에 속하며, 중심 트위스트 β-시트는 9개의 혼합된 β-가닥(β1-β9)에 의해 형성되고 7개의 α-나선(α1-α7; 도 1b)으로 둘러싸여 있다. 리파아제 및 에스터라제와 같은 다른 α/β 가수분해효소 슈퍼패밀리에 속하는 단백질에서 관찰되는 바와 같이, IsPETase는 활성부위에 위치한 보존된 세린 가수분해효소 Gly-x1-Ser-x2-Gly 모티프(motif)(Gly158-Trp159-Ser160-Met161-Gly162)를 함유한다(도 1a).

실시예 2-4. Is PETase 단백질 결정체의 활성 부위

IsPETase는 PET를 비스(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트 (bis(2-hydroxyethyl) terephthalate; BHET), 모노(2-하이드록시에틸) 테레프탈레이트(mono(2-hydroxyethyl) terephthalate; MHET), 및 테레프탈산 (terephthalic acid; TPA)(도 3)과 같은 단량체로 분해한다. 또한, IsPETase는 PET의 코어 구조와 유사하고 시판되는 단량체인, PET 연구에 널리 사용되는 BHET를 가수분해한다. BHET는 IsPETase에 의해 추가적 분해반응 없이 MHET로 분해된다. 2-하이드록시에틸-(모노하이드록시에틸 테레프탈레이트)₄, 2-HE(MHET)₄, PET를 모방한 4-MHET 분자를 이용한 공유결합적 도킹 계산을 통해 효소의 기질 결합 방식을 추측하였다(도 3).

2-HE(MHET)₄에서 IsPETase 구조로의 정사면체 중간체(tetrahedral intermediate) 분자 도킹은 AutoDock4.2 및 AutoDock Vina를 이용한 연질 및 공유 결합적 도킹의 혼합 접근법을 통해 수행하였다. IsPETase의 리간드 분자는 WinCoot 및 ProDrg으로 준비하였으며, 비극성 H 원자는 도킹을 수행하기 전 AutoDock Tools를 이용하여 리간드 및 타겟 모두에 병합하였다. 경질 및 연질 수용체 모두의 pdbqt 파일의 생성을 위해, 연질 잔기(Tyr87, Trp159, Ser160, Met161, Trp185, Ile208, His237, Ser238, 및 Asn241)를 선택하고, 회전을 위해 각각의 잔기의 곁사슬에서의 결합을 허용하였다. 격자 박스(grid box)는 x: -3.249, y: 25.239 및 z: -29.093에 중심이 있으며, 크기는 각각 90.7, 74.7, 및 122.7 Å이다. 공유결합적 도킹 이전에, AutoDock Vina를 이용하여 비-공유결합적 도킹 계산을 수행하였고, 9개의 출력 포즈(pose)가 그 자체의 스코어링 함수(scoring fuction)로부터 계산된 결합자유에너지로 발생하였다. 가장 낮은 결합에너지(-7.1 kcal/mol)를 가진 최상의 도킹 모델을 선택하였고, 상기 모델의 입체구조를 다음의 계산을 위한 평가 기준으로 사용하였다. 또한, 최상의 모델에서의 연질 잔기의 유도 입체구조를 공유결합적 도킹을 위한 수용체에 적용하였다. 산소음이온 홀의 적절한 거리를 기반으로 총 200개의 도킹 포즈를 평가하였으며, 결합에너지 -10.27 kcal/mol(AutoDock의 반-경험적 자유에너지 힘 필드로부터)를 가지는 최상의 포즈가 비-공유결합적 도킹 결과와 유사하였다. 마지막으로, 도킹 포즈는 Schrodinger suite에서 OPLS3 force field를 이용하여 최소화하였다.

IsPETase의 활성 부위에서, 세 잔기 Ser160, His237, 및 Asp206은 촉매 삼중체를 형성하고, Ser160은 카르복실에스터라제와 같이 절단 가능한 에스터 결합의 카르보닐 탄소 원자에 대한 공유결합적 친핵체로 기능하는 것으로 나타났다(도 3a). 정사면체 중간체의 산소음이온은 각각 2.90 및 2.83 Å 거리를 갖는 Tyr87 및 Met160의 질소 원자로 구성된 산소음이온 홀에 의해 안정화된다(도 3a). 기질 결합 부위는 약 25 및 29 Å의 수치를 갖는 평평한 표면에 길고, 얕은 L자형 틈을 형성하도록 시뮬레이션된다(도 3b-d). 기질 결합 틈의 표면은 주로 소수성이며 갈라진 틈의 길이는 ~40 Å이다(도 3b). 2-HE(MHET)₄의 절단 가능한 에스터 결합에 기초하여, 기질 결합 부위는 2개의 서브사이트, 각각 한 개 및 세 개의 MHET 모이어티가 결합된 서브사이트 I 및 서브사이트 II로 나눌 수 있다(도 3b, e). 서브사이트 I에서 첫 번째 MHET 모이어티의 결합에 대해, 벤젠 고리는 두 방향족 잔기 Tyr87 및 Trp185 사이의 골에 위치한다(도 3b, e). ~3.6 Å의 거리를 가진 Trp185 및 첫 MHET 모이어티의 벤젠 고리 사이의 σ-σ 상호작용이 리간드 안정화의 주요 요인으로 보인다(도 3e). 또한, Met161 및 Ile208은 각각 서브사이트 I의 바닥 및 측면에서 소수성 표면을 제공함으로써 첫 번째 MHET의 결합을 보조하는 것으로 예측된다(도 3e). 서브사이트 II는 서브사이트 I보다 더 길고 얕은 홈을 형성하는 경향이 있으며, 세 개의 MHET 모이어티(2-HE(MHET)₄의 두 번째, 세 번째 및 네 번째 MHET 모이어티)를 수용한다(도 3b-d). MHET 결합에 기초하여, 서브사이트 II는 추가로 세 부분, 서브사이트 IIa, IIb, 및 IIc로 나눠진다(도 3b, e). 서브사이트 II는 Thr88, Ala89, Trp159, Ile232, Asn233, Ser236, Ser238, Asn241, Asn244, Ser245, Asn246, 및 Arg280을 포함하는 잔기로 구성된다. 서브사이트 II 및 2 MHET 모이어티 사이의 상호작용은 주로 소수성 상호작용을 통해 매개되는 것으로 보이지만, 네 번째 MHET 모이어티의 카보닐 산소 원자는 서브사이트 IIc 내의 Ser236 주사슬 및 Asn246 곁사슬과 극성 상호작용을 형성한다(도 3b, e). Arg280은 서브사이트 IIc의 끝에 위치하고 있으며, 잔기는 양전하를 띄고 약간 돌출된 구조로 인해 기질 결합 부위의 확장을 방해하는 것으로 나타났다(도 3b, c, e).

실시예 3. Is PETase 변이체

실시예 3-1. Is PETase 변이체 단백질의 제조

효소 촉매 및 기질 결합과 관련된 잔기를 확인하기 위하여, 부위-특이적 변이(site-directed mutagenesis) 실험을 수행하였다. 부위-특이적 변이 실험은 Quick Change 키트(Stratagene)를 이용하여 수행하였다. IsPETase 변이체의 발현 및 정제는 IsPETase 단백질의 발현 및 정제와 동일한 조건하에서 수행하였다.

실시예 3-2. Is PETase 변이체 단백질 결정체의 제조

IsPETase 변이체의 단백질 결정화는 상기 실시예 2-1의 IsPETase의 단백질 결정화와 유사한 방법으로 수행하였다.

실시예 3-3. Is PETase 변이체 단백질 결정체의 X선 회절분석

데이터는 100K에서 포항가속기연구소(Pohang Accelerator Laboratory, Pohang, Korea)의 Beamline 7A를 통해 수집하였다. 그 결과, IsPETase^R280A 결정체는 공간군 P2₁2₁2₁에 속하며, 셀 파라미터는 IsPETase^W/T 결정체와 유사하였다.

실시예 3-4. Is PETase 변이체 단백질 결정체의 구조결정

검색 모델로서 IsPETase^W/T 구조를 이용하여, 분자 치환 방법을 통해 IsPETase^R280A의 구조를 규명하였다. 모델 제작 및 정제는 상기 실시예 2-3의 IsPETase^W/T에서와 같이 수행하였다. 상기 통계 데이터는 표 1에 나타내었다. IsPETase^R280A의 정제된 모델은 PDB 코드 5YNs로 Protein Data Bank에 보관되어 있다.

실시예 4. 활성 분석

실시예 4-1. 비스-하이드록시에틸 테레프탈레이트를 이용한 in vitro 분석

활성을 비교하기 위하여, 비스-하이드록시에틸 테레프탈레이트(BHET)를 효소 분석을 위한 기질로 사용하였다. BHET 스톡 용액은 디메틸 설폭사이드에 BHET를 용해(2.5 g/ℓ)하여 제조하였다. 분석 프로토콜은 이전에 보고된 논문(Yosida, S. et al. Science 351, 1196-1199, 2016.)을 기반으로 하였다. 효소 분석은 pH 7.0의 버퍼 용액(80 mM Na2HPO4-HCl, 40 mM NaCl)에서 200 ㎎/ℓ의 BHET로 수행하였다. 효소 반응은 50 nM 효소의 첨가로 시작되었으며, 30℃에서 30분 동안 계속되었다. 이후, 85℃에서 15분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물은 10분 동안 13,200 r.p.m.에서 원심분리 하였다. 마지막으로, 상등액을 액체크로마토그래피(liquid chromatography; LC) 분석하였다.

in vitro 분석 샘플은 MS(LC/MSD VL, Agilent)가 장착된 HPLC(1100 Series HPLC, Agilent)를 통해 분석하였다. Eclipse Plus-C18 컬럼(5 ㎛, 4.6 Υ 150 mm, Agilent)를 사용하였다. 모든 분석은 실온(25℃)에서 수행하였다. 이동상의 경우, 버퍼 A(증류수 중 0.1% 포름산) 및 버퍼 B(아세토니트릴)를 0.8 ㎖/min의 유속으로 사용하였다. 이동상은 95% 버퍼 A에서 20분에 30% 버퍼 A로 점진적으로 변화시켰다(모두 부피%를 의미). 화학물질(BHET, MHET 및 TPA)은 260 nm에서 검출되었다.

촉매 잔기, Ser160, Asp206 및 His237을 Ala로 치환하고 BHET를 기질로서 사용하여 가수분해 활성을 측정하였다. 세 변이체, IsPETase^S160A, IsPETase^D206A 및 IsPETase^H237A 모두는 활성의 거의 완전한 상실을 나타내며(도 5a), 이는 이러한 세 잔기가 촉매작용에 관여함을 의미한다.

다음으로, 서브사이트 I을 구성하는, Tyr87, Trp185, Met161, 및 Ile208 잔기를 Ala로 치환하였다. IsPETase^Y87A 및 IsPETase^W185A 변이체는 IsPETase^W/T와 비교하여 5% BHET 가수분해 활성을 나타낸다(도 5a). 이 결과는 이들 잔기와 첫 MHET 모이어티의 벤젠 고리의 σ-σ 상호작용의 차단이 첫 번째 MHET 모이어티의 안정성을 감소시킨다는 것을 의미한다. IsPETase^M161A 및 IsPETase^I208A 변이체는 IsPETase^W/T와 비교하여 각각 52% 및 46%의 활성을 나타내었다(도 5a). 이는 이러한 잔기가 Tyr87 및 Trp185 잔기만큼 중요하지는 않지만 서브사이트 I의 구성에 기여한다는 것을 의미한다.

서브사이트 II를 구성하는 Trp159, Ser238, 및 Asn241 잔기를 Ala로 치환하였다. IsPETase^W159A 및 IsPETase^N241A는 IsPETase^W/T와 비교하여 8% 및 18% BHET 가수분해 활성을 나타내며(도 5a), 이는 이러한 잔기가 서브사이트 II의 구성에서 중요하다는 것을 의미한다. 그러나, IsPETase^S238A는 IsPETase^W/T와 비교하여 거의 비슷한 BHET 가수분해 활성을 나타내었다(도 5a). 이 결과는 Ser238을 Ala로 치환하는 것이 효소의 BHET 가수분해 활성에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

실시예 4-2. PET 필름을 이용한 in vitro 분석

분석은 이전에 보고된 논문(Yosida, S. et al. Science 351, 1196-1199, 2016.)을 기반으로 약간 변형(하기 기재)하여 수행하였다. PETase에 의한 PET의 분해율을 분석하기 위하여, 시판되는 PET 필름(UBIGEO, Korea)을 효소 분석을 위한 기질로 사용하였다. PET 필름은 직경 6 mm의 원형 형태로 준비하였다. PET 필름을 300 ㎕의 pH 9.0 글리신-NaOH 버퍼와 200 nM의 효소로 적셨다. 반응 혼합물을 30℃에서 18 및 36 시간/24 및 72시간 동안 배양하였다. 85℃에서 15분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 이 후, 샘플을 13,200 r.p.m.에서 원심분리 하였고, 상등액은 LC를 통해 분석하였다. 효소 반응 후, 필름을 증류수 중 1% SDS 및 20% 에탄올로 세척하였다.

상기 변이체의 PETase 활성을 PET 필름을 기질로서 이용하여 측정하였다. Ala를 가진 촉매 삼중체의 변이체는 효소 활성의 거의 상실한 것으로 나타났고, 기질 결합 부위의 구성에 관여하는 변이체는 IsPETase^W/T와 비교하여 PETase 활성이 감소한 것으로 나타났다(도 5b). Arg280을 Ala로 치환하고, BHET 가수분해 및 PETase 활성을 측정한 결과, IsPETase^R280A는 IsPETase^W/T와 비교하여 거의 비슷한 활성을 나타내었으며(도 5a), IsPETase^R280A는 기질로서 PET 필름을 이용할 때, IsPETase^W/T와 비교하여 18 시간에 22.4%, 36시간에 32.4% PETase 활성이 증가함을 알 수 있었다(도 5b)(IsPETase의 높은 PET 특이성을 나타냄). 즉, Arg280을 작은 소수성 잔기로 치환하는 것이 더 긴 기질의 더 안정적인 결합을 가능하게 하고, 이어서 PETase 활성의 증가시킴을 알 수 있었다. 보다 구체적으로, Arg280을 Ala로 치환함으로써 실제로 기질 결합 부위(서브사이트 IIc)의 입체구조가 변경되어 더 긴 기질 결합을 가능하게 하는지를 조사하기 위하여, IsPETaseR280A의 구조가 1.36 Å 해상도에서 결정되었다. 예상대로, IsPETaseR280A의 구조는 IsPETaseW/T와 비교하여 소수성 및 비-돌출 틈을 제공함으로써 확장된 서브사이트 IIc를 나타내었다(도 5c). 22.8 Å의 거리를 가진 촉매 부위로부터 말단에 위치한 Arg280의 Ala로의 치환이 효소 활성을 증가시킴을 알 수 있었다. 이 결과는 IsPETase의 고유한 기질 결합 특성을 확인한 신뢰할 수 있는 도킹 계산 없이 얻을 수 없는 것이었다.

추가로 Ser121을 Glu로, Asp186을 His로, Arg280 Ala로 치환하여 PETase 활성을 측정하였다. IsPETase^{S121E/D186H/R280A}는 기질로서 PET 필름을 이용할 때, IsPETase^W/T와 비교하여 24 시간에 30℃에서 1.25배 및 40℃에서 2.23배, 72시간에 30℃에서 2.03배 및 40℃에서 3.39배 PETase 활성이 증가하였다(도 6). 상기 치환으로 인해 발생한 수소 결합이 효소의 안정성을 증가시켜 결과적으로 PETase 활성 또한 증가하였다. 효소의 안정성이 증가되었다는 것은 효소의 녹는점(Tm)이 증가하였다는 것으로 확인할 수 있다. 이로부터, IsPETase 변이체에 있어 S121E 및 D186H 치환은 개별적으로 또는 다른 치환과 조합하여 상승적으로 PETase 활성을 증가시킴을 알 수 있었다.

실시예 5. 열안정성에 대한 Is PETase 단백질의 활성 분석

실시예 5-1. Is PETase 단백질 결정체의 열안정성 부위

IsPETase는 다른 PET-분해효소에 비해 PET 분해 활성이 우수한 반면, 낮은 열안정성 때문에 적당한 온도 (30℃)에서만 PET를 분해하는데 이용 가능하다는 단점이 있었다. 그래서 IsPETase의 열안정성은 PETase를 이용하여 효율적으로 PET를 분해하는데 결정적인 요인으로 예측된다. 따라서, IsPET 단백질 결정체의 열안정성에 영향을 미치는 구조적 특성을 확인하였다(도 7).

첫 번째 구조적 특성으로, IsPETase 결정체는 β6-시트의 비정상 입체구조를 가진다. 즉, IsPETase 결정체 내 β6-시트의 중심에 위치한 Pro181 잔기는 주변 아미노산들과 수소 결합을 형성하지 않아, 연속적인 β-시트 형성을 방해한다. IsPETase 결정체의 구조에서, Pro181 잔기의 질소와 Leu199 잔기의 산소 간의 거리는 3.6 Å이고, Gly158 잔기의 질소와 Ala180 잔기의 산소 간의 거리가 4.2 Å인 것으로, Pro181 잔기가 IsPETase 단백질의 2차 구조 형성을 방해하는 것으로 보인다(도 7a).

두 번째 구조적 특성으로, IsPETase 결정체 내 β6-β7 연결 루프 (Asp186-Phe191)는 단백질 전체의 b-factor 값 (16.1)에 비해 높은 값 (22.2)을 가지며, 상당히 유연한 구조를 가진다(도 8a). 반면, 높은 열안정성을 가지는 써모비피다 푸스카 DSM43793(Thermobifida fusca DSM43793) 유래의 큐티나아제2(cutinase2, TfCut2)에서, β6-β7 연결 루프 (His156-Trp161)는 단백질 전체의 b-factor와 비슷한 값을 가지며, 상당히 유연한 구조를 가진다(도 8b). 이때, His156 잔기가 α2-나선에 존재하는 Asp156 잔기와 수소 결합을 형성함으로써 연결 루프의 구조적 안정성에 기여하는 것으로 보인다. 따라서, IsPETase 결정체의 Asp186, Ser121 잔기를 TfCut2와 같이 각각 히스티딘, 아스파르트산으로 치환함으로써 β6-β7 연결 루프 내 수소 결합이 형성되어 향상된 구조적 안정성을 나타낼 것으로 예측할 수 있다.

실시예 5-2. Is PETase 변이체 단백질의 제조

열안정성과 관련된 IsPETase의 아미노산 잔기를 확인하기 위하여, 부위-특이적 변이 실험을 수행하였다. 부위-특이적 변이 실험은 상기 실시예 3-1과 동일한 조건하에서 수행하여 IsPETase^S121D, IsPETase^S121E, IsPETase^D186H, IsPETase^D186F, IsPETase^D186I, IsPETase^D186L, IsPETase^D186V, IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H, IsPETase^{P181A/S121D/D186H}, IsPETase^{P181A/S121E/D186H}, IsPETase^{S121D/D186H/R280A}, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}를 제조하였다. 또한, IsPETase 변이체의 단백질 결정화는 상기 실시예 3-2와 동일한 조건하에서 수행하였다.

검색 모델로서 IsPETase^W/T 구조를 이용하여, 분자 치환 방법을 통해 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 구조를 규명하였다. 모델 제작 및 정제는 상기 실시예 2-3의 IsPETase^W/T와 동일한 조건하에서 수행하였다. 통계 데이터는 하기 표 2에 나타내었다. IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 정제된 모델은 각각 PDB 코드 6IJ3, 6IJ4, 6IJ6로 Protein Data Bank에 보관되어 있다.

실시예 5-3. Is PETase 변이체 단백질의 열안정성 분석

열안정성을 비교하기 위하여, IsPETase 변이체의 구조를 분석하고 녹는 온도(Tm)를 측정하였다.

녹는 온도는 Protein thermal shift dye (Applied Biosystems)를 이용하여 StepOnePlus Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific)로 용융 곡선을 측정하였다. 구체적으로는, IsPETase 5 ㎍를 protein thermal shift dye 20 ㎕와 혼합한 후 단백질 변성이 반영된 신호 변화를 25 내지 99℃의 온도 증가 구간에서 모니터링하였다. 용융 곡선을 바탕으로, IsPETase 및 이의 변이체의 녹는 온도를 결정하였다(도 9).

IsPETase 변이체의 구조 및 녹는 온도를 IsPETase^W/T와 비교하였다.

도 9a를 참조하면, IsPETase^S121D 및 IsPETase^S121E의 녹는 온도는 IsPETase^W/T와 비슷한 수준이였다.

한편, Asp186 잔기를 소수성 잔기 His, Phe, Ile, Leu, Val으로 치환한 결과, IsPETase^D186H, IsPETase^D186F, IsPETase^D186I, IsPETase^D186L 및 IsPETase^D186V의 녹는 온도가 IsPETase^W/T의 녹는 온도와 비슷하거나 더 높았다. 특히, IsPETase^D186H 및 IsPETase^D186V가 높은 녹는 온도를 가지는 것으로 나타났다.

IsPETase^S121D/D186H의 구조는 β6-β7 연결 루프 (Asp186-Phe191)의 b-factor 값이 18.5이고, 녹는 온도가 54.85℃인 것으로, IsPETase^W/T에 비해 더 안정적인 구조를 가졌다. 그러나, IsPETase^S121D/D186H는 Asp121 잔기와 His186 잔기의 거리가 멀어 (3.9 Å) 수소 결합을 형성하지 않았다(도 8c).

Ser121 잔기를 Asp에 비해 아미노산의 길이가 긴 Glu로 치환하여 IsPETase^S121E/D186H의 구조를 분석하였다. IsPETase^S121E/D186H는 여전히 Glu121 잔기와 His186 잔기 사이에 수소 결합을 형성하지 않는 반면, Glu121 잔기가 인접한 Asn172와 수소 결합을 형성하였다(도 8d). 도 9b를 참조하면, IsPETase^S121E/D186H의 녹는 온도는 56.02℃로, IsPETase^W/T, IsPETase^S121D/D186H에 비해 높았다. 따라서, IsPETase^S121E/D186H는 연결 루프 내 수소 결합을 형성함으로써 IsPETase^S121D/D186H에 비해 높은 열안정성이 부여된 것을 알 수 있었다.

β-시트 내 정상 입체구조와 안정된 연결 루프를 가지는 PETase의 열안정성을 확인하기 위하여, 추가로 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H에 P181A를 도입하여 PETase 활성을 측정하였다. IsPETase^{P181A/S121D/D186H}, IsPETase^{P181A/S121E/D186H}의 녹는 온도는 각각 52.69℃, 53.56℃로 IsPETase^W/T에 비해 높으나, P181A가 도입되지 않은 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H에 비해 낮았다. 따라서, Pro181 잔기가 오히려 IsPETase의 효소 활성 및 열안정성의 증가를 방해함을 알 수 있었다.

상기 실시예 4에서 효소 활성이 우수한 것을 확인된 IsPETase^R280A를 참고하여, 추가로 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H에 R280A를 도입하여 PETase 활성을 측정하였다. IsPETase^{S121D/D186H/R280A}, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 녹는 온도는 R280A가 도입되지 않은 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H에 비해 높았다.

실시예 5-4. Is PETase 변이체 단백질의 활성 분석

활성을 비교하기 위하여, 상기 실시예 4-2와 동일한 조건하에서 PETase에 의한 PET의 분해율을 분석하였다.

IsPETase 변이체의 열안정성 증가에 따른 PETase 활성을 PET 필름을 기질로서 이용하여 측정하였다.

도 10b를 참조하면, IsPETase^S121D, IsPETase^S121E는 30℃에서 IsPETase^W/T에 비해 효소 활성이 높은 반면, 40℃에서 IsPETase^W/T와 효소 활성이 비슷한 수준으로 나타났다. 이들 변이체는 40℃에서 효소 활성을 잃어버린 것으로 보인다.

한편, IsPETase^D186H, IsPETase^D186F, IsPETase^D186I, IsPETase^D186L, IsPETase^D186V는 30℃에서 IsPETase^W/T와 효소 활성이 비슷한 수준이거나 낮았다. 반면, IsPETase^D186H, IsPETase^D186F는 40℃에서 IsPETase^W/T에 비해 효소 활성이 높으며, 특히 IsPETase^D186H가 고온에서 장시간 동안 효소 활성이 유지되는 것으로 나타났다.

도 10b를 참조하면, IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H는 24시간 및 72시간에서의 효소 활성이 IsPETase^W/T에 비해 높으며, 30 및 40℃에서도 높게 유지되는 것으로 나타났다. 특히, IsPETase^S121E/D186H의 효소 활성이 IsPETase^S121D/D186H에 비해 크게 증가하였다.

IsPETase^{P181A/S121D/D186H}, IsPETase^{P181A/S121E/D186H}는 예상대로 P181A 잔기에 의해 IsPETase^W/T와 효소 활성이 비슷한 수준으로 나타났다.

IsPETase^{S121D/D186H/R280A}, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}는 녹는 온도의 결과와 같이 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H에 비해 효소 활성이 높은 것으로 나타났다. 특히, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}는 40℃에서의 효소 활성이 IsPETase^S121D/D186H, IsPETase^S121E/D186H에 비해 2배 이상 높은 것으로 나타났다. IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 구조를 살펴보면, IsPETase^S121E/D186H와 같이 Glu121 잔기와 Asn172 잔기가 물 매개 수소결합을 형성하고, 기질 결합 부위의 서브사이트 IIc가 확장되는 것으로 나타났다(도 11).

결과적으로, β6-β7 연결 루프와 서브사이트 IIc는 서로 반대면에 위치하여 서로 영향을 미치지 않는다. 따라서, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}는 β6-β7 연결 루프와 확장된 서브사이트 IIc에 의해 구조적 안정성을 나타내며, 이를 통해 열안정성과 효소 활성이 모두 증가하는 상승 효과(synergetic effect)를 보인다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5-5. Is PETase 변이체 단백질의 내구성 분석

효소 활성의 지속 정도를 비교하기 위해, 상기 실시예 4-2와 동일한 조건하에서 PETase에 의한 PET의 분해율을 10일 동안 분석하였다.

IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 시간에 따른 효소 활성을 IsPETase^W/T와 비교하였다. IsPETase^W/T의 활성은 큰 변화없이 10일째까지 지속되지만, 40℃에서의 효소 활성이 30℃에서의 효소 활성이 비해 낮은 것으로 나타났다. 반면, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 활성은 3일째 급격히 증가하여 10일 동안 지속되며, 40℃에서의 효소 활성이 30℃에 비해 높은 것으로 나타났다(도 12a).

고온에 대한 열안정성을 비교하기 위하여, 추가로 열 불활성화(heat inactivation) 시험을 수행하였다. IsPETase^W/T, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}를 50℃에서 1 내지 60분 동안 열 불활성화 처리하여 상기 실시예 4-2와 동일한 조건하에서 PETase에 의한 PET의 분해율을 분석하였다.

IsPETase^W/T는 녹는 온도가 48.81℃로, 50℃에서 10분 동안 불활성화 처리한 경우 효소 활성이 사라졌다. 반면, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}는 녹는 온도가 57.67℃로, 20분 동안 불활성화 처리한 경우 기존 효소 활성의 50%를 나타내며, 60분 동안 불활성화 처리한 경우 기존 효소 활성의 10%를 나타냈다(도 12b). 결과적으로, 고온에 대한 PETase의 열안정성은 PET를 효율적으로 분해하는데 매우 중요한 요인으로, IsPETase^{S121E/D186H/R280A}의 높은 열안정성은 PET 분해율을 증가시킴을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for crystallization of IsPETase protein and IsPETase variants <130> PN180279-1 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PETase of Ideonella sakaiensis <400> 1 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Arg Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified PETase of Ideonella sakaiensis_IsPETaseR280A <400> 2 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Ser Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp Asp Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Ala Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290 <210> 3 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified PETase of Ideonella sakaiensis_IsPETaseS121D/D186H/R280A <400> 3 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Asp Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp His Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Ala Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290 <210> 4 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified PETase of Ideonella sakaiensis_IsPETaseS121E/D186H/R280A <400> 4 Met Asn Phe Pro Arg Ala Ser Arg Leu Met Gln Ala Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Gly Leu Met Ala Val Ser Ala Ala Ala Thr Ala Gln Thr Asn Pro Tyr 20 25 30 Ala Arg Gly Pro Asn Pro Thr Ala Ala Ser Leu Glu Ala Ser Ala Gly 35 40 45 Pro Phe Thr Val Arg Ser Phe Thr Val Ser Arg Pro Ser Gly Tyr Gly 50 55 60 Ala Gly Thr Val Tyr Tyr Pro Thr Asn Ala Gly Gly Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ile Ala Ile Val Pro Gly Tyr Thr Ala Arg Gln Ser Ser Ile Lys Trp 85 90 95 Trp Gly Pro Arg Leu Ala Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp 100 105 110 Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gln Pro Glu Ser Arg Ser Ser Gln Gln Met 115 120 125 Ala Ala Leu Arg Gln Val Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Ser Ser Pro 130 135 140 Ile Tyr Gly Lys Val Asp Thr Ala Arg Met Gly Val Met Gly Trp Ser 145 150 155 160 Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ile Ser Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu 165 170 175 Lys Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Trp His Ser Ser Thr Asn Phe Ser 180 185 190 Ser Val Thr Val Pro Thr Leu Ile Phe Ala Cys Glu Asn Asp Ser Ile 195 200 205 Ala Pro Val Asn Ser Ser Ala Leu Pro Ile Tyr Asp Ser Met Ser Arg 210 215 220 Asn Ala Lys Gln Phe Leu Glu Ile Asn Gly Gly Ser His Ser Cys Ala 225 230 235 240 Asn Ser Gly Asn Ser Asn Gln Ala Leu Ile Gly Lys Lys Gly Val Ala 245 250 255 Trp Met Lys Arg Phe Met Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Ser Thr Phe Ala 260 265 270 Cys Glu Asn Pro Asn Ser Thr Ala Val Ser Asp Phe Arg Thr Ala Asn 275 280 285 Cys Ser 290

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 IsPETase 변이체로서, 서열번호 1의 N-말단으로부터 280번째 아미노산의 알라닌으로 치환을 포함하는, IsPETase 변이체.
제1항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 121번째 아미노산의 아스파르트산으로 치환, 186번째 아미노산의 히스티딘으로 치환, 186번째 아미노산의 페닐알라닌으로 치환, 186번째 아미노산의 이소루신으로 치환, 186번째 아미노산의 루신으로 치환, 186번째 아미노산의 발린으로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, IsPETase 변이체.
제1항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 121번째 아미노산의 아스파르트산으로 치환, 186번째 아미노산의 히스티딘으로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, IsPETase 변이체.
제1항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 121번째 아미노산의 글루탐산으로 치환, 186번째 아미노산의 히스티딘으로 치환, 186번째 아미노산의 페닐알라닌으로 치환, 186번째 아미노산의 이소루신으로 치환, 186번째 아미노산의 루신으로 치환, 186번째 아미노산의 발린으로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, IsPETase 변이체.
제1항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 121번째 아미노산의 글루탐산으로 치환, 186번째 아미노산의 히스티딘으로 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, IsPETase 변이체.
제1항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, IsPETase 변이체.
제3항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, IsPETase 변이체.
제5항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것인, IsPETase 변이체.
제1항에 있어서, 상기 IsPETase 변이체는 IsPETase 야생형과 비교하여 PETase 활성이 증가하는 것인, IsPETase 변이체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IsPETase 변이체를 처리하는 단계를 포함하는, Poly(ethylene terephthalate)(PET) 분해 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 IsPETase 변이체를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터.
제12항의 재조합 벡터로 형질 전환된, 미생물.
제13항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli) 또는 코리네박테 리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 균주인 것인, 미생물.
i) 10 내지 20%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 10000, pH 4.0 내지 6.0의 0.01 내지 1 M 비스-트리스(bis-tris) 및 0.01 내지 1 M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 포함하는 저수조 용액(reservoir solution)과 ii) IsPETase 단백질을 함유하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 증기 확산법(vapor diffusion technique)으로 결정화시키는 단계를 포함하는, 하기의 결정형태를 가지는 IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법:
[결정형태]
공간군(space group)이 P2₁2₁2₁이고, 단위 셀 파라미터(unit cell parameter)는 a = 43.48 Å, b = 50.40 Å 및 c = 129.49 Å이다.
제15항에 있어서, 상기 저수조 용액은 17%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 10000, pH 5.0의 0.1 M 비스-트리스(bis-tris) 및 0.1 M 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 포함하는 것인, 방법.
(a) 제15항의 IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법에 따라 제조된 IsPETase 단백질의 입체구조를 이용하여 IsPETase 단백질 활성 조절 후보 펩티드 또는 IsPETase 단백질 결합 후보 화합물을 생성 또는 선별하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 생성 또는 선별된 후보 펩티드 또는 화합물이 IsPETase 단백질의 활성을 조절하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, IsPETase 단백질 활성 조절제의 스크리닝 방법.
제15항의 IsPETase 단백질 결정체의 제조 방법에 따라 제조된 IsPETase 단백질의 입체구조로부터 기질 결합 부위를 확인하는 단계를 포함하는, IsPETase 변이체의 스크리닝 방법.