CN113234707A - 一种蛋白酶k突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白酶K突变体及其制备方法，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明提供热稳定性提高的蛋白酶K突变体，并优化了编码该突变体的基因。将该突变体或基因用于构建重组表达载体、和重组表达细胞，可在表达量无明显降低的情况下，获得蛋白酶K活性和稳定性均提高的突变体，将本发明的蛋白酶K突变体在不添加保护剂的条件下，于25℃储存12个月仍具有85％以上的酶活力，在60℃下半衰期保持在20min以上，有助于长时间的稳定储存和运输。

Description

一种蛋白酶K突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶K突变体及其制备方法，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，底物谱非常广泛且具有较高的蛋白水解活性。蛋白酶K不仅可用于生化实验中，如在核酸提取中，可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位杂交中，蛋白酶K具有降解包围靶DNA蛋白质的作用，可以用来处理杂交前的样本，提高检测的敏感性，还可以用于IVD生化检测试剂和分子诊断试剂中。

一般条件下蛋白酶K使用的pH范围是7.5-9.0之间。蛋白酶K在20-60℃之间活性都可以达到80％以上，蛋白酶K与其他蛋白酶的区别还在于该酶在含有Triton X-100、尿素、SDS、盐酸胍的环境中仍能稳定存在且具有活性，这一特性使它的应用很广泛。

早期商业化供应的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶K的产量较低，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。后来罗氏诊断等公司利用毕赤酵母表达体系实现了蛋白酶K的分泌表达，提高了蛋白酶K的产量，降低了其纯化成本，同时提升了蛋白酶K的品质。

2020年新冠病毒爆发后，世界对用于分子诊断的蛋白酶K需求越来越大，但野生型蛋白酶K在常温保存及运输时的稳定性差，采用低温冷链运输的方式在跨国时会带来更高的运输成本。常温运输使用的集装箱温度通常会在运输过程中出现温度升高的问题，据统计，集装箱自6℃的新泽西州出发，在海上航行运输过程中，沿大平洋航线的温度可达30～35℃之间，由亚洲到非洲，大西洋，印度洋，中东，红海航线的集装箱温度可达45～60℃。为了实现蛋白酶在不具备温控设备的集装箱中长时间运输后保持活力不变，急需筛选出热稳定性大幅度提高的蛋白酶K。

发明内容

本发明根据蛋白酶K的三维晶体结构，通过理性设计得到蛋白酶K的突变体，并优化了编码蛋白酶K的基因的核苷酸序列，提供了突变体在毕赤酵母表达体系表达和蛋白纯化的方法，为分子级别蛋白酶K的规模化生产奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种林伯氏白色念球菌(Tritirachium albumlimber)来源的蛋白酶K突变体，具有如下任一种突变：F356V，F356W，F356P。

在一种实施方式中，所述蛋白酶K突变体为(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，对第356位氨基酸进行了突变，

(b)与(a)具有至少98％序列同一性，且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述蛋白酶K突变体为(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，对第356位氨基酸进行了突变，

(b)与(a)的氨基酸序列第1～355位，第357～369位氨基酸序列具有至少98％序列同一性，且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述蛋白酶K突变体为(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，对第356位氨基酸进行了突变，

(b)与(a)具有至少98％序列同一性，在(a)中的第1-10位氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第356位苯丙氨酸突变为脯氨酸。

在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第356位苯丙氨酸突变为缬氨酸。

在一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第356位苯丙氨酸突变为色氨酸。

在一种实施方式中，所述突变体具有F356V/W/P位点突变，并具有如下一种或两种以上点的突变：Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N。

在一种实施方式中，所述突变体具有F356V/W/P位点突变，并具有Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R和S337N的突变，该突变体与SEQ ID NO.3所示的蛋白酶K突变体具有98.3％的序列同一性。

在一种实施方式中，所述突变体含有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述蛋白酶K突变体的N端还具有信号肽MRLSVLLSLLPLALG。

在一种实施方式中，所述蛋白酶K突变体含有信号肽、前导肽和成熟肽，所述蛋白酶K突变体具有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

本发明还提供编码所述蛋白酶K突变体的基因，所述基因的核苷酸序列可以根据表达系统对密码子的偏好性进行优化。

在一种实施方式中，所述基因具有SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10，或SEQ IDNO.11，或SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述基因是将SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的第1066～1068位的碱基由TTC替换为CCA、GTT或TGG。

本发明还提供携带所述蛋白酶K突变体成熟酶的多核苷酸序列。

本发明还提供携带所述蛋白酶K突变体基因核酸构建体。

在一种实施方式中，所述核酸构建体为连接有蛋白酶K突变体基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体上可含有表达元件，包括但不限于信号肽、启动子、复制子。

在一种实施方式中，所述表达载体选自：pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα或pPIC9K。

在一种实施方式中，所述表达载体为pPICZαA质粒。

在一种实施方式中，所述表达载体是将编码所述蛋白酶K突变体的基因连接至pPICZαA质粒的Eco RI和Not I之间构建获得的。

本发明还提供了包含所述表达载体的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物以巴斯德毕赤酵母为宿主。

在一种实施方式中，所述微生物细胞包括细菌细胞或真菌细胞。

在一种实施方式中，所述细菌细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌；革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属；革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

在一种实施方式中，所述真菌细胞包括但不限于酵母细胞，例如毕赤酵母细胞、假丝酵母细胞、多型汉逊酵母细胞、球拟酵母细胞、裂殖酵母细胞和克鲁维酵母细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物以毕赤酵母X-33为宿主。

在一种实施方式中，所述重组微生物以毕赤酵母X-33为宿主，以pPICZαA质粒为表达载体，表达SEQ ID NO.9～12所示的核苷酸序列。

本发明还提供制备所述蛋白酶K突变体的方法。

在一种实施方式中，所述方法使用本领域已知的任何诱变程序(例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等)来制备本发明的蛋白酶K突变体。

本发明还提供所述重组微生物细胞在表达蛋白酶K突变体中的应用。

本发明还提供一种生产蛋白酶K突变体的方法，包括：

(a)在适合于表达所述蛋白酶K的条件下培养所述重组微生物细胞；以及

(b)任选地回收所述蛋白酶K。

在一种实施方式中，所述方法将所述重组微生物细胞接种至培养基中培养一定时间后，用诱导剂诱导蛋白酶K的表达。

在一种实施方式中，所述诱导剂为甲醇。

在一种实施方式中，所述方法是将重组毕赤酵母接种至培养基中，培养至OD为5～10，用终浓度为4～6mL/L的甲醇诱导至少24h，诱导过程控制温度为22～28℃。

在一种实施方式中，所述方法是将重组毕赤酵母接种至培养基中，培养至OD为5～10，用终浓度为5mL/L的甲醇在25℃诱导24～72h。

在一种实施方式中，所述培养基含有微生物生长所必需的碳源、氮源和无机盐。

在一种实施方式中，所述培养基为YP培养基或YPD培养基。

在一种实施方式中，所述方法还对发酵液离心，收集上清液后纯化蛋白。

在一种实施方式中，纯化所述蛋白酶K突变体的树脂为Ni亲和层析树脂或阳离子交换层析树脂。

在一种实施方式中，所述纯化包括如下步骤：

①将重组毕赤酵母的发酵液上清液用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统超滤浓缩至蛋白浓度为5mg/mL，并将蛋白所在的溶液体系置换成上样buffer；所述上样buffer含有10mM醋酸钠(NaAc),25mM NaCl,pH为5.0；

②将阳离子交换层析柱用上样buffer进行平衡；

③按1ml/min的流速进行蛋白上样，并收集流穿液；

④用洗杂液一进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；所述洗杂液一含有10mMNaAc,25mM NaCl，pH为5.0；

⑤用洗杂液二进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；所述洗杂液二含有10mMNaAc,50mM NaCl，pH为5.0；

⑥用洗脱液进行洗脱，洗脱5个柱体积，并收集洗脱液；所述洗脱液含有10mMNaAc,100mM NaCl,pH为5.0。

本发明还提供一种提高蛋白酶K热稳定性的方法，所述方法是通过将林伯氏白色念球菌来源的蛋白酶K进行如下至少一种突变：F356V，F356W，F356P。

在一种实施方式中，所述林伯氏白色念球菌来源的蛋白酶K具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，所述方法还对已突变后的突变体进行如下至少一种突变：Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N。

本发明还提供含有所述蛋白酶K突变体的组合物。

在一种实施方式中，所述组合物还含有酶的保护剂或延迟酶分解的物质。

本发明还提供所述蛋白酶K突变体在分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键中的应用。

有益效果：

(1)本发明将蛋白酶K突变体的与pPICZαA质粒连接，成功构建了重组表达载体pPICZαA-PRK，可在毕赤酵母X-33中实现蛋白酶K突变体的表达。

(2)本发明将重组表达载体电转化至毕赤酵母感受态细胞中，成功构建用于蛋白酶K突变体和蛋白酶K野生型表达的基因工程菌，该基因工程菌发酵72h的上清液中蛋白酶K的含量可达1.5～10.5U/mL。

(3)本发明将蛋白酶K外围距离活性中心较远的苯丙氨酸突变为脯氨酸，降低了蛋白质去折叠时的骨架熵，从而使其周围的构象更合理，提高了蛋白酶K的热稳定性。

(4)本发明提供的蛋白酶K突变体具有良好的pH稳定性：25℃下，在pH 4.5-10.5的pH范围内孵育16h都能保持85％以上的活力。

(5)本发明提供的蛋白酶K突变体PRK-7S相比野生型蛋白酶K，稳定性和比活力均有大幅度提高，蛋白比酶活大于45U/mg，60℃半衰期大于20min以上。在25℃储存12个月后残余酶活保持在90％以上。

附图说明

图1：蛋白酶K重组表达载体示意图；

图2：蛋白酶K三维空间结构；

图3：PRK-7S、PRK-1S、PRK-WT的比活性和半衰期的比较。

具体实施方式

技术术语

蛋白酶K：术语“蛋白酶K(proteinase K)”是指如酶命名法所定义的EC 3.4.21.14类中的酶。出于本发明的目的，根据具体实施方式中提及的方法确定蛋白酶K活性。在一方面，本发明的蛋白酶K突变体具有SEQ ID NO.1所示蛋白酶K活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了蛋白酶K变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

表达：术语“表达”包括涉及蛋白酶K或蛋白酶K突变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码本发明的蛋白酶K变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

改善的热稳定性：术语“改善的热稳定性”意指与相对于亲本蛋白酶K有所改善的蛋白酶K突变体的特征。

成熟肽：术语“成熟肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，本发明中所述成熟肽即为蛋白酶K成熟酶，是SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第106至384位氨基酸所在区域。本领域中已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

突变体基因：意指编码突变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的蛋白酶K的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述蛋白酶K的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最基本地，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码本发明的蛋白酶K突变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

复制起点：术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

母本或母本蛋白酶K：术语“母本”或“母本蛋白酶K”意指进行改变以产生本发明的蛋白酶K突变体的蛋白酶K。本发明所述母本即SEQ ID NO.1所对应的氨基酸序列。所述母本蛋白酶K可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段，或者可以是合成产生的。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

稳定性：本发明的蛋白酶K变体的热稳定性可以表示为在暴露于不同测试条件期间或之后，所述蛋白酶K的残余活性或残余性能。可以相对于母本蛋白酶K(例如，如SEQ IDNO.1所示的母本蛋白酶K)的已知活性或性能。

突变体：意指具有蛋白酶K活性的、在一个或多个(例如若干个)位置包含改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本发明的突变体母本具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的多肽氨基酸序列，并在SEQ ID NO.2第356位发生取代，所取代的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示序列；在此基础上，可同时发生第151、208、273、293、332和337位发生取代，例如将第151位酪氨酸突变为丙氨酸，并将第208位赖氨酸突变为组氨酸，并将第273位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第293位甘氨酸突变为丙氨酸，并将第332位赖氨酸突变为精氨酸，并将第337位丝氨酸突变为天冬酰胺。本发明的蛋白酶K突变体的活性为母本蛋白酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。

野生型蛋白酶K：术语“野生型”蛋白酶K意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的蛋白酶K。

取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置356处的苯丙氨酸被脯氨酸取代表示为“Phe356Pro”或“K356P”。多个突变通过符号(“/”)分开，例如“Tyr151Ala/Lys208His/Ser273Thr/Gly293Ala/Lys332Arg/Ser337Asn/Phe356Pro”或“Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N/F356P”代表在位置151处的酪氨酸被丙氨酸取代，在位置208处的赖氨酸被组氨酸取代，在位置273处的丝氨酸被苏氨酸取代，在位置293处的甘氨酸被丙氨酸取代，在位置332处的赖氨酸被精氨酸取代，在位置337处的丝氨酸被天冬酰胺取代，并在位置356处的苯丙氨酸被脯氨酸取代。

发酵液：“发酵液”是指由细胞发酵产生的、未经回收或经过回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的内容物。例如，所述发酵液包含被微生物利用后的培养基成分以及可通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)后存在的细胞碎片。

具体实施方式中涉及的序列

林伯氏白色念球菌来源的野生型蛋白酶K的完整蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，序列第1到15位氨基酸为该蛋白的信号肽序列，第16到105位氨基酸为前导肽序列，第106到384位氨基酸是成熟肽序列，前导肽在蛋白酶K酶由核糖体转录翻译后在内质网处被切下，从而释放出蛋白酶K成熟肽。

不含有信号肽的蛋白酶K的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据毕赤酵母密码子偏好性优化的编码SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上将第356位苯丙氨酸突变为脯氨酸的蛋白酶K突变体F356P的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该突变体F356P的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上将第151位酪氨酸突变为丙氨酸，并将第208位赖氨酸突变为组氨酸，并将第273位丝氨酸突变为苏氨酸，并将第293位甘氨酸突变为丙氨酸，并将第332位赖氨酸突变为精氨酸，并将第337位丝氨酸突变为天冬酰胺，并将第356位苯丙氨酸突变为脯氨酸的蛋白酶K突变体Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N/F356P(简写为PRK-7S)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码该突变体PRK-7S的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上将第356位苯丙氨酸突变为缬氨酸的蛋白酶K突变体F356V的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码该突变体PRK-F356V的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的基础上将第356位苯丙氨酸突变为色氨酸的蛋白酶K突变体F356W的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码该突变体PRK-F356W的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明所涉及的培养基

YPD培养基(g/L)：酵母浸提物10，蛋白胨20，葡萄糖20。

YP培养基(g/L)：酵母浸提物10，蛋白胨20。

蛋白酶K的单位酶活定义

在37℃，pH 8.0条件下，每分钟水解酪蛋白生成1μmol酪氨酸所需的酶量。

蛋白酶K酶活测定的试剂准备

试剂I：底物：1％牛奶乳酪蛋白milk casein溶液。1g牛奶乳酪蛋白溶于50ml 0.1M磷酸钠盐溶液pH 8.0，65-70℃水域孵育15min搅拌溶解，自来水冷却，氢氧化钠调节pH8.0，定容100ml。

试剂II：TCA溶液：0.1M三氯乙酸，0.2M乙酸钠，0.3M乙酸。1.64g三氯乙酸，1.64g乙酸钠，1.724ml乙酸，HCl调节pH 4.03，定容100ml。

试剂III：0.4M碳酸钠溶液。4.24g溶解于100ml水中。

试剂IV：福林酚试剂：用水5倍稀释。

试剂V：酶稀释液：0.1M磷酸钠盐溶液，pH 8.0。

试剂VI：酪氨酸溶液：1μg/ml酪氨酸，0.2M HCI溶解。

蛋白酶K的酶活测定方法

①0.5ml试剂I 37℃孵育10min，加入0.5ml酶液，混匀，37℃反应10min；

②加入1ml试剂II终止反应，混匀，继续孵育30min；

③离心反应液；

④取0.5ml上清液，加入2.5ml 0.4M试剂III，0.5ml试剂IV，混匀后37℃孵育30min；

⑤660nm测定OD 1；空白对照组：0.5ml试剂V代替酶液，测定OD 2；

⑥0.5ml试剂VI，2.5ml试剂III，0.5ml试剂IV，混匀后37℃孵育30min。660nm测定OD 3；空白对照组：0.5ml 0.2M HCI代替试剂VI，测值为OD 4。

酶活计算公式为：

其中，

Weight activity(U/mg)＝Volume activity×1/C

2：反应液总体积(mL)；

0.5：酶液体积(mL)；

10：反应时间(min)；

df：稀释倍数；

181.2：酪氨酸分子量；

C：酶浓度(mg/mL)。

蛋白酶K的半衰期的测定

取20mM磷酸钠缓冲液，加入实施例3中得到的浓度为1mg/mL的酶液分别置于60℃温度下水浴0min、20min、40min、60min、80min，测定残留酶活。制作孵育时间和残余酶活的曲线，并计算出半衰期。

多核苷酸的实施方式

本发明提供了编码蛋白酶K的分离的多核苷酸。在某些方面，本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体。在某些方面，本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的表达载体。在某些方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些方面，本发明还涉及产生蛋白酶K的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述蛋白酶K的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述蛋白酶K。

核酸构建体的实施方式

本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶K的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸的核酸构建体，所述一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。

可选地，可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供蛋白酶K的表达。本领域技术人员可根据需要在多核苷酸插入载体之间对控制序列进行合适的操作，利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的操作。

可选地，控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导蛋白酶K变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

表达载体的实施方式

本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶K的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合适的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码蛋白酶K变体的多核苷酸。可选地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的载体中以表达所述多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，可使编码序列与控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可经重组DNA操作方法制备获得的的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择可取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可选地，载体可以在被引入宿主细胞中后被整合到基因组中，并与其整合的一个或多个染色体一起复制。

可选地，载体具有便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

可选地，载体含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中，或在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

可选地，为了自主复制，载体还可以包含复制起点。所述复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是酵母中2微米质粒的复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。

可选地，可以将多个拷贝的蛋白酶K突变体的多核苷酸插入宿主细胞中以增加蛋白酶K突变体的产生。或将多核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中的多拷贝位点以增加的拷贝数目。

在上述实施方式中，用于连接以上所述的元件来构建本发明的重组表达载体的方法或操作均是本领域普通技术人员熟知的。

宿主细胞的实施方式

宿主细胞可以是能够用于蛋白酶K重组生产的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

蛋白酶K的生产方法

本发明还涉及生产本发明的蛋白酶K的方法，所述方法包括：(a)在适合于表达所述蛋白酶K的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收所述蛋白酶K。

使用本领域已知的方法在适合于产生蛋白酶K的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许蛋白酶K表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果蛋白酶K变体被分泌到营养介质中，则所述蛋白酶K可以直接从培养基中回收。如果蛋白酶K没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对蛋白酶K特异的方法检测蛋白酶K。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。

可以使用本领域已知的方法回收蛋白酶K。例如，可以通过常规程序从营养介质中回收蛋白酶K，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化蛋白酶K以获得基本上纯的蛋白酶K，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取。

在可替代的方面，没有回收蛋白酶K，而是将表达蛋白酶K的本发明的宿主细胞用作所述蛋白酶K的来源。

发酵液配制品或细胞组合物的实施方式

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。所述发酵液产物进一步包含在发酵过程产生的成分，例如细胞(包括含有编码本发明的突变体基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、灭活或失活了的细胞和/或细胞碎片以及灭菌后的全培养液。

在一些实施例中，发酵液含有被细胞利用后的培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一些实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种酶的保护剂或延迟酶分解的物质。

在一些实施例中，这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

如本文所述的全培养液或细胞组合物通常以液体形式存在，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

组合物的实施方式

本发明还涉及包括本发明的蛋白酶K的组合物。

这些组合物可以包含本发明的蛋白酶K作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，例如选自由以下组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：蛋白酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶。

实施例1野生型蛋白酶K和突变体蛋白酶K编码基因的设计

将SEQ ID NO.2所示的的氨基酸序列进行反转录后按照毕赤酵母密码子进行优化，得到SEQ ID NO.8所示核苷酸序列，合成SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，即母本蛋白酶K的编码序列。

根据蛋白酶K三维晶体结构，通过理性设计，确定SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的氨基酸序列的第356位氨基酸作为关键位点，设计单点突变，将第356位苯丙氨酸突变为脯氨酸，具体步骤为：将SEQ ID NO.3的氨基酸序列进行反转录后，按照毕赤酵母密码子进行优化得到如SEQ ID NO.9所示的蛋白酶K突变体的编码序列；

在SEQ ID NO.3的基础上，设计具有Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R和S337N突变的蛋白酶K的氨基酸序列，如SEQ ID NO.4所示，并将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列进行反转录后，按照毕赤酵母密码子进行优化得到如SEQ ID NO.10所示的蛋白酶K突变体的编码序列；

分别合成SEQ ID NO.8～10所示的核苷酸序列。

实施例2重组质粒的构建

分别将实施例合成的如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的基因片段插入到pPICZαA载体的Eco RI和Not I之间(图1所示PRK所在位置)，分别获得重组表达质粒pPICZαA-PRK-WT、pPICZαA-PRK-1S和pPICZαA-PRK-7S。

实施例3重组微生物细胞的构建

将实施例2构建的重组表达载体分别经过内切酶BglII线性化后，通过电转化的方式将线性化片段分别转化到毕赤酵母X-33感受态细胞中，挑选阳性克隆，在YPD培养基中培养，检测蛋白酶K的酶活，获得表达蛋白酶K野生型和突变体的重组菌株，将表达野生型蛋白酶K的重组毕赤酵母命名为PRK-WT，将表达蛋白酶K突变体F356P的重组毕赤酵母命名为PRK-1S，将表达蛋白酶K突变体Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N/F356P的重组毕赤酵母命名为PRK-7S。

实施例4重组毕赤酵母发酵生产蛋白酶K

将步骤3构建的重组毕赤酵母分别接种于含20mLYPD液体培养基的试管中，30℃，培养24h至菌浓为OD₆₀₀＝5-10；将培养物以1:100的比例接种于含100mL YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养24h至菌浓为OD₆₀₀＝35-40；将培养物静置3-4h后，倒掉上清液后用100mL YP液体培养基重悬；加入0.5％甲醇，25℃诱导表达24h-72h，每隔24h向培养基中加入0.5％甲醇进行诱导；第72h于4℃，5000rpm，离心5min，收集离心后的发酵液上清液。经检测，表达野生型蛋白酶K的毕赤酵母发酵液上清液中的蛋白酶K含量为0.8-4.5U/mL，表达蛋白酶K突变体F356P、Y151A/K208H/S273T/G293A/K332R/S337N/F356P的毕赤酵母发酵液上清液中的蛋白酶K含量分别为1.5-10.5U/mL。

实施例5蛋白酶K的纯化

用于纯化的溶液：

上样buffer：10mM NaAc,25mM NaCl,pH5.0；

洗杂液一：10mM NaAc,25mM NaCl,pH5.0；

洗杂液二：10mM NaAc,50mM NaCl,pH5.0；

洗脱液：10mM NaAc,100mM NaCl,pH5.0；

洗柱液：10mM NaAc,500mM NaCl,pH5.0；

收集实施例4制备的含蛋白酶K的发酵液上清液，用阳离子交换层析进行蛋白酶K的纯化，步骤如下：

①将实施例4得到的发酵液上清液用赛多利斯(Sartorius)切向流超滤系统超滤浓缩至蛋白浓度为5mg/mL，并将蛋白所在的溶液体系置换成上样buffer；

②将阳离子交换层析柱用上样buffer进行平衡；

③按1ml/min的流速进行蛋白上样，并收集流穿液；

④用洗杂液一进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；

⑤用洗杂液二进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；

⑥用洗脱液进行洗脱，洗脱5个柱体积，并收集含蛋白的洗脱液；

⑦用10个柱体积的洗柱液进行洗柱，将残留柱子上的杂蛋白全部冲洗干净；

⑧用10个柱体积的超纯水进行冲洗层析柱；

⑨用20％的乙醇保存阳离子交换层析柱。

对步骤⑥收集获得的纯化后的蛋白进行检测，结果显示，85％的目的蛋白被收集在洗脱液中。

实施例6突变体PRK-F356V和PRK-F356W的制备

根据蛋白酶K三维晶体结构，通过理性设计，确定SEQ ID NO.2所示蛋白酶K的氨基酸序列的第356位氨基酸作为关键位点，设计单点突变，具体步骤为：

设计引物，以实施例2构建的重组质粒pPICZαA-PRK-WT为模板进行全质粒PCR，得到相应的突变体重组表达质粒pPICZαA-PRK-F356V、pPICZαA-PRK-F356W。

F356V-F：ATTCCAGTTGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356V-R：AGTACCAACTGGAATGTTGGACAGGTC；

F356W-F：ATTCCATGGGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356W-R：AGTACCCCATGGAATGTTGGACAGGTC；

将重组表达质粒pPICZαA-PRK-F356V和pPICZαA-PRK-F356W分别经过内切酶BglII线性化后，在通过电转化的方式将线性化片段分别转化到毕赤酵母X-33感受态细胞中，获得表达蛋白酶K突变体F356V或F356W的重组毕赤酵母。按照实施例4的方法诱导重组毕赤酵母表达蛋白酶K，结果显示，表达蛋白酶K突变体F356V的毕赤酵母发酵液上清液中的蛋白酶K含量为5.5-8.0U/mL，表达蛋白酶K突变体F356W的毕赤酵母发酵液上清液中的蛋白酶K含量为5.0-9.0U/mL。

按照实施例5的方法纯化蛋白，结果显示85％的目的蛋白被收集在洗脱液中。

实施例7蛋白酶K突变体的酶学性质验证

将实施例5制备的突变体PRK-1S、PRK-7S、PRK-F356V和PRK-F356W分别在pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0、pH9.5、pH10.0、pH10.5条件下反应0h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h。

结果显示，25℃下，在pH 4.5-10.5的pH范围内孵育16h都能保持85％以上的活力。

实施例8蛋白酶K突变体和野生型蛋白酶K的比酶活和半衰期对比

检测实施例5制备的蛋白酶K野生酶PRK-WT和突变体PRK-1S、PRK-7S、PRK-F356V和PRK-F356W的比酶活和半衰期进行检测和计算，结果如表1所示。PRK-1S、PRK-7S、PRK-F356V和PRK-F356W与PRK-WT相比，具有改善的热稳定性，其中，PRK-1S在60℃的半衰期相比于PRK-WT延长了2.28倍，PRK-7S相比于PRK-WT延长了1.85倍，PRK-F356V和PRK-F356W相比于PRK-WT分别延长了1.17倍和1.44倍。

表1各突变体和野生型比酶活和半衰期的对比

实施例9：蛋白酶K突变体和野生型蛋白酶K在25℃的储存稳定性对比

将实施例5制备的突变体PRK-WT、PRK-1S、PRK-7S分别在25℃水浴12个月，每隔一周测定残留酶活，结果显示，12个月后PRK-WT、PRK-1S、PRK-7S的残余酶活分别为30.3％，92.5％，95.6％。

对比例：

设计引物，以重组质粒pPICZαA-PRK-WT为模板进行全质粒PCR，得到相应的突变体质粒，将356位苯丙氨酸分别突变为其它氨基酸。

F356G-F：ATTCCAGGTGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356G-R：AGTACCACCTGGAATGTTGGACAGGTC；

F356S-F：ATTCCATCTGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356S-R：AGTACCAGATGGAATGTTGGACAGGTC；

F356A-F：ATTCCAGCTGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356A-R：AGTACCAGCTGGAATGTTGGACAGGTC；

F356R-F：ATTCCAAGAGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356R-R：AGTACCTCTTGGAATGTTGGACAGGTC；

F356E-F：ATTCCAGAAGGTACTGTTAACCTGCTG；

F356E-R：AGTACCTTCTGGAATGTTGGACAGGTC；

按照实施例2～5相同的策略构建重组菌株，并表达、纯化获得的蛋白酶K，测定突变体的比酶活和半衰期，结果如表2所示。

表2不同突变体的比酶活和半衰期的对比

注：“-”表示蛋白极容易沉淀无法测出蛋白半衰期。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉瀚海新酶生物科技有限公司

<120> 一种蛋白酶K突变体及其制备方法

<130> BAA210580A

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 384

<212> PRT

<213> Tritirachium album limber

<400> 1

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65 70 75 80

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Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp

130 135 140

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Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly

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Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala

325 330 335

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<211> 369

<212> PRT

<213> Tritirachium album limber

<400> 2

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Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

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<213> 人工序列

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290 295 300

Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val

305 310 315 320

Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Arg Thr Thr Ala Ala

325 330 335

Asn Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser

340 345 350

Asn Ile Pro Pro Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln

355 360 365

Ala

<210> 5

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ala

1 5 10 15

Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala Arg

20 25 30

Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly Ser

35 40 45

Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys Pro

50 55 60

Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu Asp

65 70 75 80

Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr Ile

85 90 95

Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro

100 105 110

Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr

115 120 125

Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp

130 135 140

Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met

145 150 155 160

Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

165 170 175

His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys

180 185 190

Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln

195 200 205

Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys Asn

210 215 220

Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly

225 230 235 240

Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser

245 250 255

Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg

260 265 270

Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala Ser

275 280 285

Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu

290 295 300

Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly

305 310 315 320

Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala

325 330 335

Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala Ser

340 345 350

Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn

355 360 365

Ile Pro Pro Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala

370 375 380

<210> 6

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala

1 5 10 15

Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys

35 40 45

Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu

50 55 60

Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr

65 70 75 80

Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala

85 90 95

Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr

100 105 110

Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile

115 120 125

Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln

130 135 140

Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly

145 150 155 160

Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys

165 170 175

Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly

180 185 190

Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys

195 200 205

Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly

210 215 220

Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser

225 230 235 240

Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala

245 250 255

Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala

260 265 270

Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val

275 280 285

Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly

290 295 300

Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val

305 310 315 320

Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala

325 330 335

Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser

340 345 350

Asn Ile Pro Val Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln

355 360 365

Ala

<210> 7

<211> 369

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Pro Ala Val Glu Gln Arg Ser Glu Ala Ala Pro Leu Ile Glu Ala

1 5 10 15

Arg Gly Glu Met Val Ala Asn Lys Tyr Ile Val Lys Phe Lys Glu Gly

20 25 30

Ser Ala Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ala Met Glu Lys Ile Ser Gly Lys

35 40 45

Pro Asp His Val Tyr Lys Asn Val Phe Ser Gly Phe Ala Ala Thr Leu

50 55 60

Asp Glu Asn Met Val Arg Val Leu Arg Ala His Pro Asp Val Glu Tyr

65 70 75 80

Ile Glu Gln Asp Ala Val Val Thr Ile Asn Ala Ala Gln Thr Asn Ala

85 90 95

Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr Ser Pro Gly Thr Ser Thr

100 105 110

Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly Gln Gly Ser Cys Val Tyr Val Ile

115 120 125

Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu Phe Glu Gly Arg Ala Gln

130 135 140

Met Val Lys Thr Tyr Tyr Tyr Ser Ser Arg Asp Gly Asn Gly His Gly

145 150 155 160

Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys

165 170 175

Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu Asp Asp Asn Gly Ser Gly

180 185 190

Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp Phe Val Ala Ser Asp Lys

195 200 205

Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val Ala Ser Leu Ser Leu Gly

210 215 220

Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala Ala Ala Arg Leu Gln Ser

225 230 235 240

Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly Asn Asn Asn Ala Asp Ala

245 250 255

Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser Val Cys Thr Val Gly Ala

260 265 270

Ser Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val

275 280 285

Leu Asp Ile Phe Gly Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly

290 295 300

Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val

305 310 315 320

Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu Gly Lys Thr Thr Ala Ala

325 330 335

Ser Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala Asn Lys Gly Asp Leu Ser

340 345 350

Asn Ile Pro Trp Gly Thr Val Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln

355 360 365

Ala

<210> 8

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60

gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120

gctatggaaa aaatctctgg taagccagac cacgtctaca agaacgtttt ctctggtttc 180

gctgctaccc tggacgagaa catggttaga gttttgagag cccatccaga cgtcgagtac 240

attgaacaag acgccgttgt tactatcaac gctgctcaaa ctaacgcccc ttggggtctt 300

gctagaattt cttctacttc cccaggtact tccacctact actacgatga atctgctggt 360

cagggttcct gtgtttacgt tatcgacact ggtatcgagg cttctcaccc agaatttgaa 420

ggtagagccc agatggtcaa gacttactac tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt 480

actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540

ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600

atggacttcg ttgcctccga caagaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgtcgcctct 660

ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720

tccggtgtta tggttgctgt tgctgctggt aacaacaacg ctgacgctag aaactactct 780

ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgcttctg acagatacga cagaagatcc 840

tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcggtc ctggaacttc catcctgtcc 900

acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960

gctggattgg ctgcttactt gatgactctg ggtaagacta ctgctgcttc cgcctgtaga 1020

tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccattcgg tactgttaac 1080

ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107

<210> 9

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60

gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120

gctatggaaa aaatctctgg taagccagac cacgtctaca agaacgtttt ctctggtttc 180

gctgctaccc tggacgagaa catggttaga gttttgagag cccatccaga cgtcgagtac 240

attgaacaag acgccgttgt tactatcaac gctgctcaaa ctaacgcccc ttggggtctt 300

gctagaattt cttctacttc cccaggtact tccacctact actacgatga atctgctggt 360

cagggttcct gtgtttacgt tatcgacact ggtatcgagg cttctcaccc agaatttgaa 420

ggtagagccc agatggtcaa gacttactac tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt 480

actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540

ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600

atggacttcg ttgcctccga caagaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgtcgcctct 660

ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720

tccggtgtta tggttgctgt tgctgctggt aacaacaacg ctgacgctag aaactactct 780

ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgcttctg acagatacga cagaagatcc 840

tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcggtc ctggaacttc catcctgtcc 900

acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960

gctggattgg ctgcttactt gatgactctg ggtaagacta ctgctgcttc cgcctgtaga 1020

tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccaccagg tactgttaac 1080

ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107

<210> 10

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60

gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120

gctatggaaa aaatctctgg taagccagac cacgtctaca agaacgtttt ctctggtttc 180

gctgctaccc tggacgagaa catggttaga gttttgagag cccatccaga cgtcgagtac 240

attgaacaag acgccgttgt tactatcaac gctgctcaaa ctaacgcccc ttggggtctt 300

gctagaattt cttctacttc cccaggtact tccacctact actacgatga atctgctggt 360

cagggttcct gtgtttacgt tatcgacact ggtatcgagg cttctcaccc agaatttgaa 420

ggtagagccc agatggtcaa gacttactac gcttcttcca gagatggtaa cggtcacggt 480

actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540

ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600

atggacttcg ttgcttccga ccacaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgttgcctct 660

ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720

tccggtgtta tggttgctgt tgctgctggt aacaacaacg ctgacgctag aaactactct 780

ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgctactg acagatacga cagaagatcc 840

tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcgctc ctggaacttc catcctgtcc 900

acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960

gctggattgg ctgcttactt gatgactttg ggtagaacta ctgctgccaa cgcctgtaga 1020

tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccaccagg tactgttaac 1080

ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107

<210> 11

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60

gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120

gctatggaaa aaatctctgg taagccagac cacgtctaca agaacgtttt ctctggtttc 180

gctgctaccc tggacgagaa catggttaga gttttgagag cccatccaga cgtcgagtac 240

attgaacaag acgccgttgt tactatcaac gctgctcaaa ctaacgcccc ttggggtctt 300

gctagaattt cttctacttc cccaggtact tccacctact actacgatga atctgctggt 360

cagggttcct gtgtttacgt tatcgacact ggtatcgagg cttctcaccc agaatttgaa 420

ggtagagccc agatggtcaa gacttactac tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt 480

actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540

ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600

atggacttcg ttgcctccga caagaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgtcgcctct 660

ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720

tccggtgtta tggttgctgt tgctgctggt aacaacaacg ctgacgctag aaactactct 780

ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgcttctg acagatacga cagaagatcc 840

tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcggtc ctggaacttc catcctgtcc 900

acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960

gctggattgg ctgcttactt gatgactctg ggtaagacta ctgctgcttc cgcctgtaga 1020

tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccagttgg tactgttaac 1080

ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107

<210> 12

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctccagctg ttgaacaacg atctgaggct gctccattga tcgaagctag aggtgaaatg 60

gtcgccaaca agtacatcgt caagttcaaa gagggttccg ctttgtctgc tttggacgct 120

gctatggaaa aaatctctgg taagccagac cacgtctaca agaacgtttt ctctggtttc 180

gctgctaccc tggacgagaa catggttaga gttttgagag cccatccaga cgtcgagtac 240

attgaacaag acgccgttgt tactatcaac gctgctcaaa ctaacgcccc ttggggtctt 300

gctagaattt cttctacttc cccaggtact tccacctact actacgatga atctgctggt 360

cagggttcct gtgtttacgt tatcgacact ggtatcgagg cttctcaccc agaatttgaa 420

ggtagagccc agatggtcaa gacttactac tactcctcca gagatggtaa cggtcacggt 480

actcattgtg ctggtactgt tggttccaga acttacggtg ttgccaagaa aacccagctg 540

ttcggtgtta aggttctgga cgataacggt tccggtcagt actccactat tatcgctggt 600

atggacttcg ttgcctccga caagaacaac agaaactgtc caaagggtgt tgtcgcctct 660

ttgtctcttg gtggtggtta ctcttcttcc gttaactctg ctgctgctag attgcagtcc 720

tccggtgtta tggttgctgt tgctgctggt aacaacaacg ctgacgctag aaactactct 780

ccagcttctg aaccatccgt ctgtacagtt ggtgcttctg acagatacga cagaagatcc 840

tccttctcca actacggttc cgtcttggat attttcggtc ctggaacttc catcctgtcc 900

acttggattg gtggttccac tagatccatt tccggtactt ctatggctac tccacacgtt 960

gctggattgg ctgcttactt gatgactctg ggtaagacta ctgctgcttc cgcctgtaga 1020

tatatcgctg acactgctaa caagggtgac ctgtccaaca ttccatgggg tactgttaac 1080

ctgctggcct acaacaacta ccaagct 1107

Claims (10)

1.一种林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)来源的蛋白酶K突变体，其特征在于，具有如下任一种突变：F356V，F356W，F356P。

2.根据权利要求1所述的蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体为(a)、(b)或(c)：

(a)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，突变了第356位氨基酸，

(b)与(a)具有至少98％序列同一性，且具有蛋白酶K活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)在(a)或(b)的基础上，还具有如下至少一种突变：Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N。

3.编码权利要求1或2所述蛋白酶K突变体的成熟肽的多核苷酸。

4.包含权利要求3所述多核苷酸的核酸构建体、载体或宿主细胞。

5.一种重组毕赤酵母，其特征在于，以毕赤酵母为宿主，表达权利要求1或2所述的蛋白酶K突变体。

6.产生权利要求1或2所述蛋白酶K突变体的方法，其特征在于，包括：

(a)在适合于表达所述蛋白酶K的条件下培养所述重组微生物细胞；以及

(b)任选地回收所述蛋白酶K。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将权利要求5所述的重组毕赤酵母在培养基中培养一定时间后，用诱导剂诱导蛋白酶K的表达。

8.含有权利要求1或2所述的蛋白酶K突变体的组合物。

9.一种提高蛋白酶K热稳定性的方法，其特征在于，包括(a)或(b)：

(a)将林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)来源的蛋白酶K突变体进行如下至少一种突变：F356V，F356W，F356P；

(b)在(a)的基础上，还进行如下至少一种突变：Y151A、K208H、S273T、G293A、K332R、S337N。

10.权利要求1或2所述的蛋白酶K突变体在分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和/或肽键中的应用。

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